CN107474129B

CN107474129B - 特异性增强crispr-cas系统基因编辑效率的方法

Info

Publication number: CN107474129B
Application number: CN201710948764.7A
Authority: CN
Inventors: 韩之波
Original assignee: Jiangxi Han's Joint Stem Cell Technology Co Ltd
Current assignee: Jiangxi Han's joint stem cell technology Co., Ltd.
Priority date: 2017-10-12
Filing date: 2017-10-12
Publication date: 2018-10-19
Anticipated expiration: 2037-10-12
Also published as: CN107474129A

Abstract

本发明提供了一些新的增效蛋白CREnhancer1.0，能够显著提高细胞内CRISPR/Cas9基因编辑效率，为提高细胞中基因编辑效率提供了新的途径；还提供了一种更高效的基因组编辑系统，当本发明所述增效蛋白在与CRISPR/Cas9共同使用时，可以显著提升CRISPR/Cas9的基因组编辑的效率。

Description

特异性增强CRISPR-CAS系统基因编辑效率的方法

技术领域

本发明提供一种提高CRISPR-cas系统基因编辑效率的方法，特别是涉及一种新的能够显著提高同源重组概率的增效因子，将所述增效因子与CRISPR-cas系统结合可显著提高基因组编辑效率。

背景技术

CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，其序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。前导区一般位于CRISPR簇上游，是富含AT长度为300～500bp的区域，被认为可能是CRISPR簇的启动子序列。重复序列区长度为21～48bp，含有回文序列，可形成发卡结构。重复序列之间被长度为26～72bp的间隔区隔开。Spacer区域由俘获的外源DNA组成，类似免疫记忆，当含有同样序列的外源DNA入侵时，可被细菌机体识别，并进行剪切使之表达沉默，达到保护自身安全的目的。

通过对CRISPR簇的侧翼序列分析发现，在其附近存在一个多态性家族基因。该家族编码的蛋白质均含有可与核酸发生作用的功能域(具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性)，并且与CRISPR区域共同发挥作用，因此被命名为CRISPR关联基因(CRISPRassociated)，缩写为Cas。目前发现的Cas包括Cas1～Cas10等多种类型。Cas基因与CRISPR共同进化，共同构成一个高度保守的系统。

当细菌抵御噬菌体等外源DNA入侵时，在前导区的调控下，CRISPR被转录为长的RNA前体(Pre RISPR RNA，pre-crRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA，最终识别并结合到与其互补的外源DNA序列上发挥剪切作用。

目前发现的CRISPR/Cas系统有三种不同类型即I型、II型和III型，它们存在于大约40％已测序的真细菌和90％已测序的古细菌中。其中II型的组成较为简单，以Cas9蛋白以及向导RNA(gRNA)为核心组成，也是目前研究中最深入的类型。

在II型系统中pre-crRNA的加工由Cas家族中的Cas9单独参与。Cas9含有在氨基末端的RuvC和蛋白质中部的HNH2个独特的活性位点，在crRNA成熟和双链DNA剪切中发挥作用。此外，pre-crRNA转录的同时，与其重复序列互补的反式激活crRNA(Trans-activatingcrRNA，tracrRNA)也转录出来，并且激发Cas9和双链RNA特异性RNase III核酸酶对pre-crRNA进行加工。加工成熟后，crRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体，识别并结合于crRNA互补的序列，然后解开DNA双链，形成R-loop，使crRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链，最终引入DNA双链断裂(DSB)。CRISPR/Cas9的剪切位点位于crRNA互补序列下游邻近的PAM区(Protospacer Adjacent Motif)的5'-GG-N18-NGG-3'特征区域中的NGG位点，而这种特征的序列在每128bp的随机DNA序列中就重复出现一次。研究结果表明，Cas9还可以剪切线性和超螺旋的质粒，其剪切效率堪比限制性内切酶。

人类多能干细胞(Humanpluripotent stem cells,hPSCs)和基因组编辑技术结合所建立的细胞模型，为疾病研究提供了一个独特的实验平台。利用这个平台体系，研究人员可以研究特定基因突变甚至染色体结构变异对人类多种细胞类型和组织器官功能的影响及其详细的分子机制，并可建立携带不同遗传突变的“个性化”疾病模型用于大规模药物筛选。该模型体系的建立得益于基因组编辑技术，尤其是CRISPR/Cas9(Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins9,CRISPR/Cas9)技术的飞速发展。

最近研究人员利用CRISPR/Cas9技术，建立了在人多能干细胞中进行基因敲除或者敲入的基因组编辑体系。研究以位于人2号染色体上的LINC00116基因组区域为例，利用CRISPR/Cas9技术对人多能干细胞中的该基因组区域进行了基因敲除、FLAG短肽序列定点插入和基因组大片段删除，获得的多个突变干细胞株为下一步对该基因组区域进行功能分析提供了特有的细胞平台。

这项研究的重要性表现在：通过在基因编码框中引入移码突变进行基因敲除；通过单链DNA提供外源模板经由同源重组定点敲入FLAG序列；通过同时靶向多个位点诱导基因组大片段删除。研究结果表明CRISPR/Cas9可以对多能干细胞进行高效基因编辑,获得的突变干细胞株有助于对基因和基因组区域的功能进行分析和干细胞疾病模型的建立。

利用CRISPR对多能干细胞中多个基因组区域进行靶向的研究结果显示，经由NHEJ引入碱基插入或缺失突变的效率为大于50％，提示利用CRISPR技术可以进行高效的基因敲除，甚至多个基因的同时敲除。

这项研究在由同源重组敲入特定点突变或者外源序列方面，通过单链核苷酸模板定点敲入FLAG小肽序列的效率偏低，仅为1.1％。研究还利用同时导入两条gRNA对基因组区域进行了大片段靶向删除，效率约为5％。靶向删除基因组大片段的效率不仅和每条gRNA的基因编辑活性相关，同时也和片段长度相关。靶向删除片段长度的增加可能带来效率的降低。此外，导入两条或者多条gRNAs，不仅可以引入基因组区域缺失，同时还可以引发其他多种染色体结构变异，包括染色体区域插入(Insertion)、重复(Duplication)、易位(Translocation)和倒位(Inversion)等。基因靶向潜在的问题是脱靶效应。这充分说明，在现有技术中，针对基因编辑技术的效果提高以及靶向性的提高有巨大的需求。

CRISPR基因组编辑技术平台由于载体构建简单、靶向位点选择灵活、靶向效率稳定，目前已经被广泛用于各类细胞和模式动物的基因组编辑，它在干细胞平台中的应用潜力也远远超出了这篇文章涉及的这几个方面，但是基因编辑效率的低下严重影响后续的科研研究，因此开发一种增加基因编辑效率的新方法变得迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高CRISPR-cas系统基因编辑效率的方法，有效克服了现有技术在动物体内发生同源重组概率低进而影响精确编辑的技术缺陷，特别是针对干细胞进行基因编辑的缺陷。

为实现上述目的，本发明提供一种提高CRISPR-cas系统同源重组概率的方法，包括向宿主细胞中引入增效蛋白，所述增效蛋白CREnhancer1.0是由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列编码的蛋白质。

进一步地，所述增效蛋白包含a)或b)：

a)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列编码的蛋白质的多核苷酸序列；

b)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

进一步地，克隆增效蛋白CREnhancer1.0基因，构建EGFP标记的增效蛋白CREnhancer1.0慢病毒表达载体，用GP2－293T细胞包装慢病毒，修饰干细胞。镜下观察绿色荧光蛋白表达，WesternBlot检测增效蛋白CREnhancer1.0的表达情况。

更进一步地，提供一种在细胞中采用CRISPR/Cas9进行基因编辑的系统，其特征在于所述系统包括：(1)用于表达SEQ ID NO：1所述的CREnhancer1.0基因的质粒；(1)用于表达sgRNA的质粒；(2)用于表达Cas9的质粒；(3)用于测试CRISPR/Cas9基因编辑效率的报告系统；所述报告系统是将能够编码有效蛋白的核苷酸片段的C-端与报告基因的N-端拼接，拼接处插入两个限制性核酸内切酶酶切位点。

更进一步地，提供一种在细胞中采用CRISPR/Cas9进行基因编辑的系统，组成为：用于表达SEQ ID NO：1所述的CREnhancer1.0基因的质粒；(1)用于表达sgRNA的质粒；(2)用于表达Cas9的质粒；

为实现上述目的，本发明还提供一种实现高效基因组编辑的方法，包括在生物体中表达所述基因组编辑系统。

为实现上述目的，本发明还提供一种高效编辑靶位点序列的方法，包括将所述基因编辑系统导入细胞中。

本发明提供了一种提高CRISPR/Cas9基因编辑效率的方法，具有以下优点：

1、本发明提供了一些新的增效蛋白CREnhancer1.0，能够显著提高细胞内CRISPR/Cas9基因编辑效率，为提高细胞中基因编辑效率提供了新的途径；

2、本发明提供了一种更高效的基因组编辑系统，当本发明所述增效蛋白在与CRISPR/Cas9共同使用时，可以显著提升CRISPR/Cas9的基因组编辑的效率。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为CRISPR/Cas9工作流程图；

图2骨髓间质干细胞中CRISPR/Cas9编辑效率图；

图3人U2OS细胞中CRISPR/Cas9编辑效率图；

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步说明本发明提高基因组编辑效率的方法的技术方案。

实施例1、克隆增效蛋白CREnhancer1.0及构建载体

克隆增效蛋白CREnhancer1.0基因，通过全基因合成的方法，获得SEQ ID NO：1所述的基因序列，以该序列为模板，根据上下游引物序列分别为5'-ATGCAGGAGAACCTGGCCCCCTG-3'，5'-CAGGCAGCTCACGCTCCTCTCG-3'，引物和全基因组由上海生工有限公司合成。PCR反应扩增CREnhancer1.0基因目的基因片段，扩增反应体系如下:95℃、40s，57℃、1min，72℃、1min，72℃、10min，循环35次，PCR产物由上海生工有限公司进行测序，通过测序，结合与SEQ ID NO：1完全匹配。随后，将PCR扩增的目的基因连接在空载体慢病毒载体pHIV-CS-CDF-CG-PRE上，通过PCR扩增、酶切、测序等方法鉴定重组慢病毒载体。结合证明重组慢病毒载体构建成功。随后将该重组慢病毒载体质粒同辅助质粒一起共感染骨髓间质干细胞(rMSCs)(购买自吉赛生物)，通过重组而包装成能表达CREnhancer1.0基因的骨髓间质干细胞。通过PCR筛选鉴定，将稳定转染的干细胞用于后续基因编辑应用。

实施例2CRISPR/Cas9在骨髓间质干细胞中的应用分析

基于含BSD-fsEGFP融合基因pBGN质粒的CRISPR/Cas9编辑载体

(1)BSD-fsEGFP融合基因：利用常规PCR，扩增公知的BSD基因，5’-PCR引物带HindIII位点，3’-PCR引物引入I-SceI和EcoRI位点。将PCR产物(BSD)插入EGFP质粒(EGFP核苷酸序列为本领域公知的序列,例如CN105647968A中的序列1和序列2所示)中CMV驱动子和EGFP编码区的之间的HindIII和EcoRI位点，生成含BSD-fsEGFP融合基因的质粒pBGN，BSD-fsEGFP融合基因核苷酸序列为如CN105647968A中的序列3和序列4所示)。该融合基因由CMV驱动子或PGK驱动子驱动，但EGFP由于移码而无活性，因此称fsEGFP。

5’-PCR引物为

CTCAAGCTTAACTAAACCATGGCCAAGCCTTTGTCTCAAGAAG，

3’-PCR引物为

AGAATTCCAGTAGGGATAACAGGGTAATGCCAGGTCCGCCCTCCCACACATAACCAGAG。

(2)选择针对人细胞次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶HPRT的基因敲除的sgRNA，靶序列5’to 3’GCCCTCTGTGTGCTCAAGGGGGG,通过分子克隆，根据sgRNA的23碱基对目标序列，合成两条互补的对应于sgRNA目标序列正反链的寡核苷酸，退火后插入质粒pBGN的I-SceI和EcoRI位点之间，生成3个带有对应目标序列的CRISPR/Cas9基因编辑效率测试质粒pBGN-T。sgRNA目标序列的插入尽管造成额外2对碱基对的移码，但仍未能纠正移码的报告基因，因而不能编码正常蛋白，在sgRNA介导基因编辑前无活性可以检测。同时，利用常规操作和公知的sgRNA的表达质粒。

(3)将测试质粒pBGN-T，sgRNA表达质粒，公知的Cas9表达质粒共转染骨髓间质干细胞。以未转染实施例1的增效基因的干细胞作为阳性对照，同时，将常规用的GFP表达质粒平行转染细胞以测定转染效率，利用转染效率校正获取的CRISPR/Cas9基因编辑相对效率。

(4)转染2-3天后，利用流式细胞仪测量GFP⁺细胞的频率。

(5)计算特定sgRNA介导的CRISPR/Cas9基因编辑相对效率。这个相对效率由GFP阳性细胞频率与转染效率的比值代表，结果如图2所示。我们发现未转染实施例1的增效蛋白的干细胞中GFP阳性细胞频率约为9.2％，在导入了实施例1的增效蛋白的干细胞中GFP阳性细胞频率分别约为69.8％，阴性对照没有GFP阳性细胞，其P值均小于0.01，具有统计学意义。这充分说明，本发明提供的增效蛋白能够显著的增加基因编辑效率。

实施例3实施例2的系统在人U2OS细胞中的效率分析

按照实施例2制备得到的系统，转入人U2OS细胞，其中人U2OS细胞分别采用导入或不导入实施例1所述的增效蛋白作为对照。由于在人U2OS细胞中修复引起的移码或突变会使HPRT失活，HPRT失活的细胞将产生6-巯基鸟嘌呤(6-TG)抗性。利用公知的6-TG筛选方法筛选4周后，抗6-TG的细胞克隆将形成，该形成频率与在无6-TG筛选下的细胞克隆形成频率之比值代表真正的6-TG抗性细胞克隆形成效率。这个效率代表内源HPRT基因被编辑的效率。结果如图3所示，在U2OS细胞内，未导入增效蛋白的细胞内sgRNA介导的内源HPRT基因编辑效率为52.6％，在导入了实施例1增效蛋白的U2OS细胞内HPRT基因编辑效率为79.8％，其中P值均小于0.01，具有统计学意义。由此可见，本发明的增效蛋白具有较好的增加基因编辑效率的结果，而且具有在人类细胞的普遍适用性。

综上所述，本发明首次提供了一些新的增效蛋白，能够显著提高细胞内基因编辑效率。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 洛阳轩智生物科技有限公司

<120> 特异性增强CRISPR-CAS系统基因编辑效率的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1578

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

atgcaggaga acctggcccc ctggggcgag ctggccaccg acaacatcat cctgaccgtg 60

cccaccacca acctgcaggc cctgaaggac cccgagcccg tgctgaggct gtgggacgag 120

atgatgcagg ccgtggccag gctggccgcc gagcccttcc ccttcaggag gcccgagagg 180

atcgtggccg acgtgcagat cagcgccggc tggatgcaca gcggctaccc catcatgtgc 240

cacctggaga gcgtgaagga gatcatcaac gagatggaca tgaggagcag gggcgtgtgg 300

ggccccatcc acgagctggg ccacaaccag cagaggcacg gctgggagtt ccccccccac 360

accaccgagg ccacctgcaa cctgtggagc gtgtacgtgc acgagaccgt gctgggcatc 420

cccagggccc aggcccacga ggccctgagc ccccccgaga gggagaggag gatcaaggcc 480

cacctgggca agggcgcccc cctgtgcgac tggaacgtgt ggaccgccct ggagacctac 540

ctgcaggtgc tgagcaggaa cagcggcagg aggggcgtgg acggcaggct ggtgcacacc 600

tgcatcaagg ccggcgccgt gaggtggctg gccaggggcc agaccggcaa ggtgggcgtg 660

aacaccaacc tgaaggacct gtgccccctg ctgagcgagc acggcctgca gtgcagcctg 720

gagccccacc tgaacagcga cctgtgcgtg tactgctgca aggcctacag cgacaaggag 780

gccaagcagc tgcaggagtt cgtggccgag ggcggcggcc tgctgatcgg cggccaggcc 840

tggtggtggg ccagccagaa ccccggccac tgccccctgg ccggcttccc cggcaacatc 900

atcctgaact gcttcggcct gagcatcctg ccccagaccc tgaaggccgg ctgcttcccc 960

gtgcccaccc ccgagatgag gagctaccac ttcaggaagg ccctgagcca gttccaggcc1020

atcctgaacc acgagaacgg caacctggag aagagctgcc tggccaagct gagggtggac1080

ggcgccgcct tcctgcagat ccccgccgag ggcgtgcccg cctacatcag cctgcacagg1140

ctgctgagga agatgctgag gggcagcggc ctgcccgccg tgagcaggga gaaccccgtg1200

gccagcgaca gctacgaggc cgccgtgctg agcctggcca ccggcctggc ccacagcggc1260

accgactgca gccagctggc ccagggcctg ggcacctgga cctgcagcag cagcctgtac1320

cccagcaagc accccatcac cgtggagatc aacggcatca accccggcaa caacgactgc1380

tgggtgagca ccggcctgta cctgctggag ggccagaacg ccgaggtgag cctgagcgag1440

gccgccgcca gcgccggcct gagggtgcag atcggctgcc acaccgacga cctgaccaag1500

gccaggaagc tgagcagggc ccccatggtg acccaccagt gctggatgga caggaccgag1560

aggagcgtga gctgcctg 1578

<210> 2

<211> 526

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

Met Gln Glu Asn Leu Ala Pro Trp Gly Glu Leu Ala Thr Asp Asn Ile

1 5 10 15

Ile Leu Thr Val Pro Thr Thr Asn Leu Gln Ala Leu Lys Asp Pro Glu

20 25 30

Pro Val Leu Arg Leu Trp Asp Glu Met Met Gln Ala Val Ala Arg Leu

35 40 45

Ala Ala Glu Pro Phe Pro Phe Arg Arg Pro Glu Arg Ile Val Ala Asp

50 55 60

Val Gln Ile Ser Ala Gly Trp Met His Ser Gly Tyr Pro Ile Met Cys

65 70 75 80

His Leu Glu Ser Val Lys Glu Ile Ile Asn Glu Met Asp Met Arg Ser

85 90 95

Arg Gly Val Trp Gly Pro Ile His Glu Leu Gly His Asn Gln Gln Arg

100 105 110

His Gly Trp Glu Phe Pro Pro His Thr Thr Glu Ala Thr Cys Asn Leu

115 120 125

Trp Ser Val Tyr Val His Glu Thr Val Leu Gly Ile Pro Arg Ala Gln

130 135 140

Ala His Glu Ala Leu Ser Pro Pro Glu Arg Glu Arg Arg Ile Lys Ala

145 150 155 160

His Leu Gly Lys Gly Ala Pro Leu Cys Asp Trp Asn Val Trp Thr Ala

165 170 175

Leu Glu Thr Tyr Leu Gln Val Leu Ser Arg Asn Ser Gly Arg Arg Gly

180 185 190

Val Asp Gly Arg Leu Val His Thr Cys Ile Lys Ala Gly Ala Val Arg

195 200 205

Trp Leu Ala Arg Gly Gln Thr Gly Lys Val Gly Val Asn Thr Asn Leu

210 215 220

Lys Asp Leu Cys Pro Leu Leu Ser Glu His Gly Leu Gln Cys Ser Leu

225 230 235 240

Glu Pro His Leu Asn Ser Asp Leu Cys Val Tyr Cys Cys Lys Ala Tyr

245 250 255

Ser Asp Lys Glu Ala Lys Gln Leu Gln Glu Phe Val Ala Glu Gly Gly

260 265 270

Gly Leu Leu Ile Gly Gly Gln Ala Trp Trp Trp Ala Ser Gln Asn Pro

275 280 285

Gly His Cys Pro Leu Ala Gly Phe Pro Gly Asn Ile Ile Leu Asn Cys

290 295 300

Phe Gly Leu Ser Ile Leu Pro Gln Thr Leu Lys Ala Gly Cys Phe Pro

305 310 315 320

Val Pro Thr Pro Glu Met Arg Ser Tyr His Phe Arg Lys Ala Leu Ser

325 330 335

Gln Phe Gln Ala Ile Leu Asn His Glu Asn Gly Asn Leu Glu Lys Ser

340 345 350

Cys Leu Ala Lys Leu Arg Val Asp Gly Ala Ala Phe Leu Gln Ile Pro

355 360 365

Ala Glu Gly Val Pro Ala Tyr Ile Ser Leu His Arg Leu Leu Arg Lys

370 375 380

Met Leu Arg Gly Ser Gly Leu Pro Ala Val Ser Arg Glu Asn Pro Val

385 390 395 400

Ala Ser Asp Ser Tyr Glu Ala Ala Val Leu Ser Leu Ala Thr Gly Leu

405 410 415

Ala His Ser Gly Thr Asp Cys Ser Gln Leu Ala Gln Gly Leu Gly Thr

420 425 430

Trp Thr Cys Ser Ser Ser Leu Tyr Pro Ser Lys His Pro Ile Thr Val

435 440 445

Glu Ile Asn Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Asp Cys Trp Val Ser Thr

450 455 460

Gly Leu Tyr Leu Leu Glu Gly Gln Asn Ala Glu Val Ser Leu Ser Glu

465 470 475 480

Ala Ala Ala Ser Ala Gly Leu Arg Val Gln Ile Gly Cys His Thr Asp

485 490 495

Asp Leu Thr Lys Ala Arg Lys Leu Ser Arg Ala Pro Met Val Thr His

500 505 510

Gln Cys Trp Met Asp Arg Thr Glu Arg Ser Val Ser Cys Leu

515 520 525

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

atgcaggaga acctggcccc ctg 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

caggcagctc acgctcctct cg 22

Claims

1.一种增效蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种用于骨髓间质干细胞基因编辑的CRISPR-CAS系统，其特征在于：系统的组成包括：(1)用于表达SEQ ID NO：1所示的CREnhancer1.0基因的质粒；(2)用于表达sgRNA的质粒；(3)用于表达Cas9的质粒。

3.如权利要求2所述的系统，其特征在于：(1)的质粒提前导入到基因编辑细胞中，筛选得到阳性细胞后，再转入(2)和(3)的质粒。

4.权利要求2或3所述的系统在制备用于骨髓间质干细胞基因编辑的试剂中的用途。