CN109136258A

CN109136258A - 小麦中基因编辑效率的优化

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Publication number: CN109136258A
Application number: CN201811034318.6A
Authority: CN
Inventors: 耿立召; 许建平
Original assignee: Syngenta Participations AG; Syngenta Biotechnology China Co Ltd
Current assignee: Syngenta Crop Protection AG Switzerland; Syngenta Biotechnology China Co Ltd
Priority date: 2018-09-06
Filing date: 2018-09-06
Publication date: 2019-01-04

Abstract

本申请涉及基因编辑领域，特别地涉及小麦中的基因编辑。本申请提高了小麦中的基因编辑效率。

Description

小麦中基因编辑效率的优化

技术领域

背景技术

小麦是世界上主要的粮食作物，具有重要的经济地位。从染色体和基因组分析，小麦具有比玉米、水稻等作物更为复杂的特征。首先，小麦是异源六倍体，具有三套染色体组(AABBDD)；其次，小麦基因组为大约17Gb。而玉米和水稻均为二倍体(AA)，基因组比小麦要小很多，玉米基因组为2.5Gb，水稻基因组仅为430Mb。同时小麦基因组具有更多的重复序列和可转座原件。这些特性在一定程度上增加了小麦基因组改良的难度^[1]。

成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(CRISPR/Cas system,Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated)是细菌和古细菌中的免疫系统，主要功能是抵抗入侵的病毒及外源DNA。其中CRISPR由一系列高度保守的重复序列(Repeat)与间隔序列(Spacer)相间排列组成，在体内被转录为长的RNA前体(pre-crRNA)；在CRISPR序列附近存在高度保守CRISPR相关基因(CRISPR-associated gene，Cas gene)，这些基因编码的蛋白具有核酸酶功能，可以对DNA序列进行特异性切割，产生DNA的双链断裂DSB(double stranded break)；pre-crRNA转录的同时，与其重复序列互补的反式激活crRNA(Trans-activating crRNA，tracrRNA)也转录出来。2012年，Jennifer实验室首次阐明了化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)SF370中Class2,type II CRISPR/Cas9系统的作用机理^[2]。细菌中，pre-crRNA、tracrRNA和Cas9形成三元复合体，在其他酶的共同作用下，最终会形成多个成熟的复合体，每个复合体包含crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白。crRNA是由一个间隔区和一段高度保守的重复序列组成，间隔区是可变的，大约20个核苷酸，可以根据目标基因进行设计，通过该间隔区和外源DNA互补配对，从而促使三元复合体发挥功能。进一步的优化表明，crRNA和tracrRNA可以连接形成一个嵌合的RNA分子，称为sgRNA(single guided RNA)，sgRNA在体外和Cas9蛋白形成有活性的二元复合体(sgRNA/Cas9)，造成目标DNA的断裂，大大简化了该系统的应用。2013年两篇文章相继报道了CRISPR/Cas9系统作为基因编辑的工具在哺乳细胞的应用^[3],[4]，随后CRISPR/Cas9系统被广泛应用于各种生物体的基因编辑，成为第三代基因编辑的工具。

在农业生物技术方面，CRISPR/Cas9广泛应用于各种农作物基因的改良。目前被报道的农作物包括玉米、水稻、大豆和小麦等^{[5],[6],[7],[8],[9],[10],[11],[12],[13],[14],[15],[16],[17]}。在实际应用中，CRISPR/Cas9都是基于优化的单分子导向RNA(sgRNA)进行设计^[27]。目前，在单子叶作物中，如玉米和水稻，Cas9基因一般是由来自于花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子驱动，或者是来自于玉米多聚泛素蛋白基因的启动子ZmUbi驱动；sgRNA一般是由细胞核内小RNA(snRNA)的启动子驱动，通常是产生U3或U6snRNA的启动子，简称U3或U6启动子，目前水稻和玉米来源的U3和U6被广泛应用于单子叶作物的编辑。根据发表的数据，CRISPR/Cas9系统以DNA的形式转化外植体，在筛选标记阳性的T0代玉米中，不同目标基因的编辑效率(编辑的植株数目/筛选标记阳性的植株数目)从60％到98％不等，大部分目标基因的编辑效率在80％以上^[6],[18]。在水稻的研究中，也取得了类似甚至更高的编辑效率。

目前，由于小麦基因组的复杂性，对小麦基因编辑的研究相对较少。大部分发表的文章来自于少数几个实验室。2013年高彩霞实验室首次报道^[28]，采用35S启动子驱动水稻密码子优化的SpCas9，小麦U6启动子驱动sgRNA，在小麦原生质体中实现了对TaMLO基因的编辑。2014年报道^[19]，采用玉米ZmUbi启动子驱动水稻密码子优化的spCas9，小麦U6启动子驱动sgRNA，获得了TaMLO基因突变的T0代植株，编辑效率为5.6％；在随后的报道中，高彩霞实验室一般采用在转化过程中不添加任何筛选试剂，即不筛选转化植株，直接从再生出来的植株中检测目标基因发生突变的植株。采用突变植株的数目对比起始转化的外植体的数目，即突变频率来衡量CRISPR/Cas9系统的有效性。目前，CRISPR/Cas9系统以DNA的形式转化外植体，不同突变位点的突变频率一般在1.0％到9.5％，大部分位点的突变频率在2.0％左右^[20]。另一个对小麦研究的是美国的Daniel F.Voytas实验室，采用小麦的原生质体进行CRISPR/Cas9系统的优化^[21],[22]。在低筋小麦的研究中，采用CRISPR/Cas9对相应的基因进行片段缺失突变，获得21株转基因的T0植物，并没有报道T0代植株基因突变的结果，而是在T1代的植株进行目标基因的突变分析^[23]，这可能和小麦中低的编辑效率有关。

另外，就目前我们所查阅到的所有对小麦编辑的文章中，sgRNA都由小麦内源TaU6启动子驱动，还没有使用小麦内源TaU3的启动子的报道；Cas9基因在早期的文章中使用35S启动子驱动，最近的文章大多用玉米ZmUbi启动子驱动，这种改变主要是由于玉米ZmUbi启动子在小麦未成熟胚中表达更稳定和高效。然而基因编辑效率仍然不尽人意。

和其他单子叶作物玉米和水稻相比，CRISPR/Cas9系统在小麦中产生的编辑效率偏低，还需要进一步提高编辑效率；目前没有报道用小麦U3的启动子驱动sgRNA进行基因编辑的研究，需要评估小麦U3启动子表达的sgRNA的活性，这样在设计多位点编辑的sgRNA中，可以有更多的选择，降低在同一个载体上多次使用同一个启动子引起载体不稳定的风险。

发明内容

在一个方面，本发明涉及一种表达盒，其包含与植物内源高表达启动子有效连接的Cas9基因，以及添加在所述植物内源高表达启动子前面的有效连接的增强子。在此处所述的“有效连接”意指，所连接的相关元件能够有效地发挥各自的相关功能或活性。优选地，所述植物内源高表达启动子为植物泛素启动子或植物肌动蛋白启动子。更优选地，所述植物泛素启动子为玉米泛素启动子prZmUbi1、甘蔗泛素启动子prSoUbi4或二穗短柄草泛素启动子prBdUbi10。更优选地，所述玉米泛素启动子prZmUbi1的序列如SEQ ID NO:4所示；所述甘蔗泛素启动子prSoUbi4的序列如SEQ ID NO:5所示；所述二穗短柄草泛素启动子prBdUbi10的序列如SEQ ID NO:6所示。更优选地，所述植物肌动蛋白启动子为水稻肌动蛋白启动子prOsAct1。更优选地，所述水稻肌动蛋白启动子prOsAct1的序列如SEQ ID NO:20所示。优选地，所述增强子为植物病毒来源的增强子。更优选地，所述植物病毒来源的增强子为玄参花叶病毒FMV增强子、花椰菜花叶病毒CaMV35S增强子或者玄参花叶病毒FMV增强子和花椰菜花叶病毒CaMV35S增强子这两者。更优选地，所述玄参花叶病毒FMV增强子的序列如SEQ ID NO:1所示；所述花椰菜花叶病毒CaMV 35S增强子的序列如SEQ ID NO:2所示。优选地，所述Cas9基因的序列如SEQ ID NO:7或8所示。

在另一个方面，本发明涉及一种表达盒，其包含与小麦U3启动子有效连接的编码sgRNA的DNA序列。优选地，所述小麦U3启动子的序列如SEQ ID NO:13所示。优选地，所述编码sgRNA的DNA序列如SEQ ID NO:16、17、18或19所示。

在另一个方面，本发明涉及一种表达载体，其包含前述的包含与植物内源高表达启动子有效连接的Cas9基因以及添加在所述植物内源高表达启动子前面的有效连接的增强子的表达盒，或者前述的包含与小麦U3启动子有效连接的编码sgRNA的DNA序列的表达盒，或者包含前述的两种表达盒。

在另一个方面，本发明涉及一种细胞，其包含前述的表达载体。优选地，所述细胞为农杆菌细胞或小麦细胞。

在另一个方面，本发明涉及前述的包含与植物内源高表达启动子有效连接的Cas9基因以及添加在所述植物内源高表达启动子前面的有效连接的增强子的表达盒，和/或前述的包含与小麦U3启动子有效连接的编码sgRNA的DNA序列的表达盒，用于在小麦中进行基因编辑或者用于提高小麦中的基因编辑效率的用途。

在另一个方面，本发明涉及一种在小麦中进行基因编辑或者提高小麦中的基因编辑效率的方法，其包括：(1)用在前面添加有有效连接的增强子的植物内源高表达启动子驱动Cas9基因的表达；和/或(2)用小麦U3启动子驱动编码sgRNA的DNA序列的表达。优选地，所述植物内源高表达启动子为植物泛素启动子或植物肌动蛋白启动子。更优选地，所述植物泛素启动子为玉米泛素启动子prZmUbi1、甘蔗泛素启动子prSoUbi4或二穗短柄草泛素启动子prBdUbi10。更优选地，所述玉米泛素启动子prZmUbi1的序列如SEQ ID NO:4所示；所述甘蔗泛素启动子prSoUbi4的序列如SEQ ID NO:5所示；所述二穗短柄草泛素启动子prBdUbi10的序列如SEQ ID NO:6所示。更优选地，所述植物肌动蛋白启动子为水稻肌动蛋白启动子prOsAct1。更优选地，所述水稻肌动蛋白启动子prOsAct1的序列如SEQ ID NO:20所示。优选地，所述增强子为植物病毒来源的增强子。更优选地，所述植物病毒来源的增强子为玄参花叶病毒FMV增强子、花椰菜花叶病毒CaMV 35S增强子或者玄参花叶病毒FMV增强子和花椰菜花叶病毒CaMV 35S增强子这两者。更优选地，所述玄参花叶病毒FMV增强子的序列如SEQ IDNO:1所示；所述花椰菜花叶病毒CaMV 35S增强子的序列如SEQ ID NO:2所示。优选地，所述Cas9基因的序列如SEQ ID NO:7或8所示。优选地，所述小麦U3启动子的序列如SEQ ID NO:13所示。优选地，所述编码sgRNA的DNA序列如SEQ ID NO:16、17、18或19所示。

附图说明

图1显示了四个双元载体23748、24052、24066和24067的主要区别。PMI*表示PMI(6-磷酸甘露糖异构酶)基因表达盒。

图2显示了双元载体23748的图谱。

图3显示了双元载体24052的图谱。

图4显示了双元载体24066的图谱。

图5显示了双元载体24067的图谱。

序列表信息

SEQ ID NO:1为eFMV(玄参花叶病毒增强子)。

SEQ ID NO:2为e35S(花椰菜花叶病毒35S增强子)。

SEQ ID NO:3为pr35S(花椰菜花叶病毒35S启动子)。

SEQ ID NO:4为prZmUbi1(玉米泛素启动子)。

SEQ ID NO:5为prSoUbi4(甘蔗泛素启动子)。

SEQ ID NO:6为prBdUbi10(二穗短柄草泛素启动子)。

SEQ ID NO:7为cCas9-Zm(玉米密码子优化Cas9基因)。

SEQ ID NO:8为cCas9-Ta(小麦密码子优化Cas9基因)。

SEQ ID NO:9为tNOS(农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子)。

SEQ ID NO:10为tZmMTL(玉米类金属硫蛋白基因终止子)。

SEQ ID NO:11为tZmABP3(玉米肌动蛋白结合蛋白3终止子)。

SEQ ID NO:12为prTaU6(小麦U6启动子)。

SEQ ID NO:13为prTaU3(小麦U3启动子)。

SEQ ID NO:14为prOsU3(水稻U3启动子)。

SEQ ID NO:15为cPMI(6-磷酸甘露糖异构酶基因)。

SEQ ID NO:16为rsgRNATaDEP1(sgRNA靶标TaDEP1)。

SEQ ID NO:17为rsgRNATaLOX2(sgRNA靶标TaLOX2)。

SEQ ID NO:18为rsgRNATaGASR7(sgRNA靶标TaGASR7)。

SEQ ID NO:19为rsgRNAOsDep1(sgRNA靶标OsDep1)。

SEQ ID NO:20为prOsAct1(水稻肌动蛋白启动子)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1.经优化的双元载体的构建以及其在小麦中的编辑效率的验证

1.材料与方法

1.1.双元载体构建

实验中用到的SpCas9表达盒的各个元件，以及sgRNA表达盒的各个元件均在金斯瑞(GenScript)进行合成，载体的构建方法采用标准的酶切连接的方法。所有的载体均含有6-磷酸甘露糖异构酶基因表达盒作为植物中的筛选标记。最终构建形成四个双元载体23748、24052、24066和24067用于遗传转化。23748载体上的cCas9-Zm在3’端包括核定位信号，采用为玉米密码子优化，其余三个载体上的cCas9-Ta在5’端和3’端包括核定位信号，采用小麦密码子进行优化。小麦U3和U6启动子序列参考文献^[26],[28]。

1.2.小麦的农杆菌转化

实验中小麦转化品种为Fielder。采用农杆菌转化方法，具体操作见参考文献^[24]。

1.3.目标基因的序列及检测方法

分别选小麦中的DEP1基因、LOX2基因及GASR7基因作为目标基因进行编辑，采用PCR/RE方法对T0代转基因植株进行检测。具体靶标序列，PCR/RE方法，PCR扩增引物，以及所用的限制性内切酶见参考文献^[25]。

1.4.NGS(二代测序；Next-generation sequencing)检测方法

高通量测序文库的构建和基于Illumina MiSeq平台的测序由GENEWIZ公司(苏州,中国)完成。使用Qubit 2.0Fluorometer(Invitrogen,Carlsbad,CA)检测DNA样品的浓度，使用MetaVx^TM文库构建试剂盒(GENEWIZ,Inc.,South Plainfield,NJ,USA)构建测序文库。

以30-50ng DNA为模板，PCR扩增小麦LOX2基因的片段，采用5’端添加了5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’序列的上游引物(5’-TATGGCTGGCGCAGAGCC-3’)和5’端添加了5’-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’序列的下游引物(5’-CGTAGAGCTTGAGGATGTCGGC-3’)扩增包含靶标序列的289bp序列。以第一轮扩增产物为模板进行第二轮PCR，在PCR产物5’和3’端分别引入测序引物结合位点和P5,P7序列；在3’端引入Index序列用于后续数据拆分。采用MiSeq PE300，单一文库产生50K reads。

使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies,Palo Alto,CA,USA)检测文库质量，并且通过Qubit2.0Fluorometer(Invitrogen,Carlsbad,CA)检测文库浓度。DNA文库混合后，按Illumina MiSeq(Illumina,San Diego,CA,USA)仪器使用说明书进行PE300双端测序，由MiSeq自带的MiSeq Control Software(MCS)读取序列信息。

2.实验结果

2.1.优化载体的设计

本实验设计选取三种泛素启动子来驱动Cas9表达，同时在三种泛素启动子前面分别添加两种转录增强子(玄参花叶病毒增强子eFMV和花椰菜花叶病毒增强子e35S)来进一步提高启动子的活性。cCas9-Ta基因采用小麦密码子优化。对于sgRNA的表达，分别选用小麦的U6和U3启动子来驱动不同的sgRNA，从而靶向突变不同的基因组位点(载体24052、24066和24067)，三个载体之间的比较可以确定优化的设计。同时，35S启动子驱动的玉米密码子优化的cCas9-Zm作为对照载体也可以比较编辑效率的变化(载体23748)。

本实验所用的小麦品种为Fielder，对目标基因测序分析，三个基因靶标位点的序列与参考文献一致。LOX2的靶标序列在Fielder A、B和D基因组上均有分布。

四个载体设计图1所示，其中24052、24066和24067主要区别在于表达Cas9的启动子和终止子不同，载体上的其余元件均相同。每个优化载体可以表达产生4个不同的sgRNA，前三个sgRNA分别靶向小麦的基因，其中g1(rsgRNATaDEP1)由小麦U6启动子驱动，可以靶向小麦的DEP1基因，g2(rsgRNATaLOX2)由小麦U3启动子驱动，可以靶向小麦的LOX2基因，g3(rsgRNATaGASR7)由小麦U6启动子驱动，可以靶向小麦的GASR7基因。三个小麦的靶标序列分别来自文献^[25]。最后一个导向RNA(g4)(rsgRNAOsDep1)靶向水稻的DEP1基因。通过与23748在g1靶标序列产生的编辑效率比较，可以分析出三个优化载体的编辑效率高低。通过对比24052，24066和24067这三个载体在g1靶标序列的突变，可以得出在小麦中高表达Cas9的启动子。分析U3启动子驱动的sgRNA所靶标的目标序列的突变，可以分析小麦U3启动子产生的sgRNA是否有活性，从而推断小麦U3启动子是否可用于基因编辑。

2.2.优化的Cas9表达盒

采用农杆菌转化方法，小麦幼胚作为外植体，分别转化双元载体23748、24052、24066和24067，通过甘露糖筛选和Taqman分析，最终获得分别获得126、63、102和86株转基因T0代植株。采用PCR/RE分析T0代转基因植株B染色体组上g1靶标序列的突变，23748载体的编辑效率是1.6％，24052载体的编辑效率是22.22％，而24066和24067载体均获得了80％以上的编辑效率。和23748载体相比，24052的编辑效率提高了12倍，24066和24067的编辑效率大约提高了50倍。具体数据见表1。说明优化的Cas9表达基因盒均提高了小麦中的编辑效率。通过对比小麦密码子优化的三个Cas9基因表达盒，甘蔗的泛素启动子prSoUbi4和二穗短柄草泛素启动子prBdUbi10控制Cas9的表达，可以显著提高小麦基因组的编辑效率。

表1.四个双元载体在小麦B基因组的DEP1靶标序列产生的编辑效率对比

选取部分转基因植株，进一步对比分析23748和24066产生的T0转基因植株，分别分析在小麦A、B和D染色体上产生的编辑效率，结果见表2。表明甘蔗的泛素启动子prSoUbi4驱动的Cas9基因表达盒，不仅在B染色体组的靶标序列产生高的编辑效率，同时也在A和D染色体组的同一靶标序列产生了高的编辑效率。因此优化的Cas9基因表达盒在小麦三个染色体组中均显著提高了目标基因的编辑效率。

表2.两个双元载体在小麦A、B和D基因组的DEP1靶标序列产生的编辑效率对比

2.3.小麦U3启动子活性分析

采用扩增子二代测序，对24066双元载体产生的部分(47株)T0转基因植株的LOX2的靶标序列进行分析。结果表明(表3)，A、B和D三个基因组的总体编辑效率为93.62％，在三个基因组上的编辑效率分别为87.23％、89.36％和68.09％。说明小麦的U3启动子可以有效的产生活性的靶向RNA分子，并且与高表达的Cas9基因盒同时使用对于在小麦中的靶标序列产生了高的编辑效率。

表3. 24066在小麦A、B和D基因组的LOX2靶标序列产生的编辑效率对比

3.讨论

本研究主要针对CRISPR/Cas9系统在小麦中编辑效率较低的问题，进行了系统的优化。结果表明，提高Cas9基因的表达量可以提高小麦的编辑效率。本实验中采用高表达的组成型启动子，通过对比试验表明，甘蔗的泛素启动子prSoUbi4和二穗短柄草泛素启动子prBdUbi10均可以显著提高小麦的编辑效率在80％以上。高效稳定的Cas9表达盒保证了在外植体转化的早期阶段，细胞中有大量的Cas9蛋白存在，在同时有靶向RNA产生时，CRISPR/Cas9系统就可以在细胞中发挥编辑作用，产生DNA的双链断裂(DSB)，随后细胞自身的非同源末端连接(NHEJ)的修复途径会将DSB重新连接起来，这一修复过程不是精准的，会引入随机的少数碱基的缺失或插入，从而导致基因失活。这一优化可以大大减少转化过程中起始外植体的数量，并且很容易筛选到不同项目想要的突变类型。相对于二倍体的作物，小麦是异源六倍体作物，各染色体间高度同源，在小麦中完全敲除一个基因，意味中同时要敲除每个基因的6个拷贝，高效稳定的编辑系统对小麦尤其重要。低的编辑效率很容易造成基因的部分拷贝失活，对于研究基因的功能是有局限的。

同时本研究证明了小麦U3启动子同样可以在小麦中产生高的编辑效率。在目前的研究报道中，尚无小麦U3启动子控制的靶向RNA产生突变的数据。这主要的原因可能是因为小麦中的编辑效率较低，同时大家普遍认为U3的启动效率比U6的启动效率要低，因此小麦的报道均采用U6启动子。本实验数据拓宽了在小麦中启动靶向RNA的启动子的选择，在高表达的Cas9前提下，小麦U6和U3均可以产生高效编辑效率的靶向RNA。这对在小麦中进行多个靶标位点编辑是非常有帮助的，多个启动子的使用，可以减少T-DNA区域中的同源序列，降低在整个转化过程中同源重组的风险。

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序列表

<110> 先正达参股股份有限公司(Syngenta Participations AG)

先正达生物科技（中国）有限公司(Syngenta Biotechnology China Co., Ltd.)

<120> 小麦中基因编辑效率的优化

<130> 81623-CN-REG-ORG-NAT-1

<141> 2018-09-05

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 194

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 玄参花叶病毒增强子eFMV

<400> 1

agctgcttgt ggggaccaga caaaaaagga atggtgcaga attgttaggc gcacctacca 60

aaagcaactt tgcctttatt gcaaagataa agcagattcc tctagtacaa gtggggaaca 120

aaataacgtg gaaaagagct gtcctgacag cccactcact attgcgtttg acgaacgcag 180

tgacgaccac aaaa 194

<210> 2

<211> 293

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 花椰菜花叶病毒35S增强子e35S

<400> 2

acttttcaac aaagggtatt atccggaaac ctcctcggat tccattgccc agctatctgt 60

cactttattg tgaagatagt ggaaaaggaa ggtggctcct acaaatgcca tcattgcgat 120

aaaggaaagg ctatcgttga agatgcctct gccgacagtg gtcccaaaga tggaccccca 180

cccacgagga gcatcgtgga aaaagaagac gttccaacca cgtcttcaaa gcaagtggat 240

tgatgtgata tctccactga cgtaagggtt gacgaacaat cccactatcc ttc 293

<210> 3

<211> 521

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 花椰菜花叶病毒35S启动子pr35S

<400> 3

agtcaaagat tcaaatagag gacctaacag aactcgccgt aaagactggc gaacagttca 60

tacagagtct cttacgactc aatgacaaga agaaaatctt cgtcaacttg gtggagcacg 120

acacgctagt ctactccaaa aatatcaaag atacagtctc agaagaccaa agggcaattg 180

agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct 240

gtcacttaat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg 300

ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc 360

cacccacgag gagcatcgtg gtaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg 420

attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag 480

acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag g 521

<210> 4

<211> 1993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 玉米泛素启动子prZmUbi1

<400> 4

ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta 60

agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta 120

tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa 180

tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga 240

gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt 300

ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg 360

gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt 420

agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata 480

taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa 540

aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga 600

cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga 660

cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg 720

acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac 780

ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca ccggcagcta cgggggattc ctttcccacc 840

gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag acaccccctc cacaccctct 900

ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca 960

cccgtcggca cctccgcttc aaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccc cctctctacc 1020

ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt agttctactt ctgttcatgt 1080

ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag cgttcgtaca cggatgcgac 1140

ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt ttctctttgg ggaatcctgg 1200

gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga ttttttttgt ttcgttgcat 1260

agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc gtgcacttgt ttgtcgggtc 1320

atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg gtctggttgg gcggtcgttc 1380

tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat ttattaattt tggatctgta 1440

tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg atggatggaa atatcgatct 1500

aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat atacagagat gctttttgtt 1560

cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc attcgttcta gatcggagta 1620

gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg gaactgtatg tgtgtgtcat 1680

acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat 1740

gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata tgcagcatct attcatatgc 1800

tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg ttttataatt attttgatct 1860

tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg gattttttta gccctgcctt 1920

catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga tgctcaccct gttgtttggt 1980

gttacttctg cag 1993

<210> 5

<211> 1802

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 甘蔗泛素启动子prSoUbi4

<400> 5

gaattcatta tgtggtctag gtaggttcta tatataagaa aacttgaaat gttctaaaaa 60

aaaattcaag cccatgcatg attgaagcaa acggtatagc aacggtgtta acctgatcta 120

gtgatctctt gcaatcctta acggccacct accgcaggta gcaaacggcg tccccctcct 180

cgatatctcc gcggcgacct ctggcttttt ccgcggaatt gcgcggtggg gacggattcc 240

acgagaccgc gacgcaaccg cctctcgccg ctgggcccca caccgctcgg tgccgtagcc 300

tcacgggact ctttctccct cctcccccgt tataaattgg cttcatcccc tccttgcctc 360

atccatccaa atcccagtcc ccaatcccat cccttcgtag gagaaattca tcgaagctaa 420

gcgaatcctc gcgatcctct caaggtactg cgagttttcg atccccctct cgacccctcg 480

tatgtttgtg tttgtcgtag cgtttgatta ggtatgcttt ccctgtttgt gttcgtcgta 540

gcgtttgatt aggtatgctt tccctgttcg tgttcatcgt agtgtttgat taggtcgtgt 600

gaggcgatgg cctgctcgcg tccttcgatc tgtagtcgat ttgcgggtcg tggtgtagat 660

ctgcgggctg tgatgaagtt atttggtgtg atctgctcgc ctgattctgc gggttggctc 720

gagtagatat gatggttgga ccggttggtt cgtttaccgc gctagggttg ggctgggatg 780

atgttgcatg cgccgttgcg cgtgatcccg cagcaggact tgcgtttgat tgccagatct 840

cgttacgatt atgtgatttg gtttggactt tttagatctg tagcttctgc ttatgtgcca 900

gatgcgccta ctgctcatat gcctgatgat aatcataaat ggctgtggaa ctaactagtt 960

gattgcggag tcatgtatca gctacaggtg tagggactag ctacaggtgt agggacttgc 1020

gtctaattgt ttggtccttt actcatgttg caattatgca atttagttta gattgtttgt 1080

tccactcatc taggctgtaa aagggacact gcttagattg ctgtttaatc tttttagtag 1140

attatattat attggtaact tattacccct attacatgcc atacgtgact tctgctcatg 1200

cctgatgata atcatagatc actgtggaat taattagttg attgttgaat catgtttcat 1260

gtacatacca cggcacaatt gcttagttcc ttaacaaatg caaattttac tgatccatgt 1320

atgatttgcg tggttctcta atgtgaaata ctatagctac ttgttagtaa gaatcaggtt 1380

cgtatgctta atgctgtatg tgccttctgc tcatgcctga tgataatcat atatcactgg 1440

aattaattag ttgatcgttt aatcatatat caagtacata ccatgccaca atttttagtc 1500

acttaaccca tgcagattga actggtccct gcatgttttg ctaaattgtt ctattctgat 1560

tagaccatat atcatgtatt tttttttggt aatggttctc ttattttaaa tgctatatag 1620

ttctggtact tgttagaaag atctgcttca tagtttagtt gcctatccct cgaattagga 1680

tgctgagcag ctgatcctat agctttgttt catgtatcaa ttcttttgtg ttcaacagtc 1740

agtttttgtt agattcattg taacttatgg tcgcttactc ttctggtcct caatgcttgc 1800

ag 1802

<210> 6

<211> 2500

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 二穗短柄草泛素启动子prBdUbi10

<400> 6

gaagaactcg agagggaatt gcagatcatg aggcagatgg ctatttttgt gtcacatatg 60

cgcaaaaaga gaggctatat ttgtgtccct aggttcttcg ttgtattgca gtttccatat 120

caatctgact tggtcgcatg agaaattgat ggttaaataa tttgaatctc tcatgtagta 180

tcaactatta gatattattt tcaccaaata tatttccatc ggagaagaag aggctacaga 240

ggaagcagaa gagaggggtg ggagaatttt tacacttttg tacacccact taaacagcaa 300

aatccgtatg aaaacaggcc caccaaaaca atgccacgat aacaatccgt agaaacaaaa 360

gcttcattta acagcggcgc aacaaagcac gcttatccta ggtagttgta gtccgtatgc 420

gatccaaaga tcacgattca cgcgtgacgg acggacgacg cgtgccacac cacaactaac 480

ggcatcctag gtagttgtag tccgtatgcg atccaaagat cacgattcac gcgtgacgga 540

cggacgacgc gcgccacacc acaactaaca gcgtgagcca gcgtccaaac tccggatggc 600

aacggggacg aaacccgtcg ggtagtcact gcccaaaccc gtccccgcaa ccttcatccc 660

aaacccgtcc ccgtttccgg tcgcgggttt cagttttcta ccagacccgt ccccatcggg 720

tttttcatcc ccgtcgggaa atccgaaccc gccagcattt cagcaccaag ccaaagttgc 780

agcagcaaca tgaataaaaa acaacccgtt tcaacaccaa gataaaacaa aacattataa 840

tttagacaac atttcacacg tataacaata acatatagtt ctcacatata acaacaccat 900

ttcacacata aaacaacacc atttgggata aaaatatggg ctatatcagg ccatttttat 960

gggccatatt gagttttcgt gggtttcaca ggtaccggat ttgtagaatg ctgaaccggg 1020

tttgaaccgt aaaatccgcg ggtattgaat ttgacccaat cccgtcgtcc cctggtgggg 1080

taaaaacacc atcttgagtc caaacggcca ccaaccaaac tccgacggca acaaacaaac 1140

ggcgttgctt tgctcctcgg tatctccgtg accgctcaat ctcccggctg tttccccgga 1200

attgcgtgga ctctctcatc cacacgcaaa ccgcctctcc ctcctctctc gtcctatccg 1260

ccccggtgcc gtagcctcac gggactcttc ttcctccctt gctataaaat ccccgccccc 1320

tcccgtctcc tctccacaca tccaaactct caatcgcacc gagaaaaatc tcctagcgat 1380

cgaagcgaag cctctcccga tcctctcaag gtacgcccgt ttcccgtcga tcctcctcct 1440

tccgttcgtg ttctgtagcc gatcgattcg attcccttac acccgttcgt gttctctcgt 1500

ggatcgatcg attgtttgtt gctagaagga actcgtagat ctggcgttta tgaactgtga 1560

ttcgggttag tccagatcga ttcaggtcgg tcgtcgttga gcctctcggc tatgtctgga 1620

ttatcgtgta gatctgctgg ttcagttgat tatgttcttc taggagtaat ttcgttgggt 1680

cagcgcgatt tctgcttaat ctatgctgct tattgcgcct gtacctatct actaagctat 1740

gtgcacctgt aattttgcta gattattcgt tcatcctcgt agttggtttg tcacagtaat 1800

ccgtatgggt tctgacgatg ttattgttgg tcatacctag gcttctccag attttatttt 1860

gttaaaattg gatagatctg ctactgatag ttgatgatgg aatttggtgc tgaatctatg 1920

ctatttattg cgcctatacc tgatctatcg ggctatgtac ggctgtagtt tactggatta 1980

ttcgttcatc ctcggtagtt ggttcatcgt ttgggttctg acgataatat tgttgattat 2040

gcgtaggctt ctgcagattg ttgttaaaat tggatacatc ggttactgat ggttgatgat 2100

agatttgtgc tgaacctatc tgtttattgc tcctatacct gatctatagg gctatgtatg 2160

cctgtaattt accagattat tcgttcatcc tcgtagttgg ttcatctcta taattcgtat 2220

gggttcttat gatgttatcg ttgattatgc ctagtcttat acagattatt gtgtcaagat 2280

tgaatatacc tgctactgat cggtgataat ttggttagta gtttgcaatc tgctaggaac 2340

acgttaccac tgtaatctgt aaacatggtt tgccagagta gtttgttcta ctactcttga 2400

tatggttgct gattttagtc gcctcctttt ggatcatgta ttgatgtcct tgcagatttc 2460

cgtgtactta ccccggcttt tgtgtacttc gtgttaacag 2500

<210> 7

<211> 4170

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 玉米密码子优化Cas9基因cCas9-Zm

<400> 7

atggacaaga agtacagcat cggcctggac atcggcacca acagcgtggg ctgggccgtg 60

atcaccgacg agtacaaggt gccgagcaag aagttcaagg tgctgggcaa caccgacagg 120

cacagcatca agaagaacct gatcggcgcc ctgctgttcg acagcggcga gaccgccgag 180

gccaccaggc tgaagaggac cgccaggagg aggtacacca ggaggaagaa caggatctgc 240

tacctgcagg agatcttcag caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccacagg 300

ctggaggaga gcttcctggt ggaggaggac aagaagcacg agaggcaccc gatcttcggc 360

aacatcgtgg acgaggtggc ctaccacgag aagtacccga ccatctacca cctgaggaag 420

aagctggtgg acagcaccga caaggccgac ctgaggctga tctacctggc cctggcccac 480

atgatcaagt tcaggggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaacccgga caacagcgac 540

gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggagaacccg 600

atcaacgcca gcggcgtgga cgccaaggcc atcctgagcg ccaggctgag caagagcagg 660

aggctggaga acctgatcgc ccagctgccg ggcgagaaga agaacggcct gttcggcaac 720

ctgatcgccc tgagcctggg cctgaccccg aacttcaaga gcaacttcga cctggccgag 780

gacgccaagc tgcagctgag caaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc 840

cagatcggcg accagtacgc cgacctgttc ctggccgcca agaacctgag cgacgccatc 900

ctgctgagcg acatcctgag ggtgaacacc gagatcacca aggccccgct gagcgccagc 960

atgatcaaga ggtacgacga gcaccaccag gacctgaccc tgctgaaggc cctggtgagg 1020

cagcagctgc cggagaagta caaggagatc ttcttcgacc agagcaagaa cggctacgcc 1080

ggctacatcg acggcggcgc cagccaggag gagttctaca agttcatcaa gccgatcctg 1140

gagaagatgg acggcaccga ggagctgctg gtgaagctga acagggagga cctgctgagg 1200

aagcagagga ccttcgacaa cggcagcatc ccgcaccaga tccacctggg cgagctgcac 1260

gccatcctga ggaggcagga ggacttctac ccgttcctga aggacaacag ggagaagatc 1320

gagaagatcc tgaccttccg catcccgtac tacgtgggcc cgctggccag gggcaacagc 1380

aggttcgcct ggatgaccag gaagagcgag gagaccatca ccccgtggaa cttcgaggag 1440

gtggtggaca agggcgccag cgcccagagc ttcatcgaga ggatgaccaa cttcgacaag 1500

aacctgccga acgagaaggt gctgccgaag cacagcctgc tgtacgagta cttcaccgtg 1560

tacaacgagc tgaccaaggt gaagtacgtg accgagggca tgaggaagcc ggccttcctg 1620

agcggcgagc agaagaaggc catcgtggac ctgctgttca agaccaacag gaaggtgacc 1680

gtgaagcagc tgaaggagga ctacttcaag aagatcgagt gcttcgacag cgtggagatc 1740

agcggcgtgg aggacaggtt caacgccagc ctgggcacct accacgacct gctgaagatc 1800

atcaaggaca aggacttcct ggacaacgag gagaacgagg acatcctgga ggacatcgtg 1860

ctgaccctga ccctgttcga ggacagggag atgatcgagg agaggctgaa gacctacgcc 1920

cacctgttcg acgacaaggt gatgaagcag ctgaagagga ggaggtacac cggctggggc 1980

aggctgagca ggaagctgat caacggcatc agggacaagc agagcggcaa gaccatcctg 2040

gacttcctga agagcgacgg cttcgccaac aggaacttca tgcagctgat ccacgacgac 2100

agcctgacct tcaaggagga catccagaag gcccaggtga gcggccaggg cgacagcctg 2160

cacgagcaca tcgccaacct ggccggcagc ccggccatca agaagggcat cctgcagacc 2220

gtgaaggtgg tggacgagct ggtgaaggtg atgggcaggc acaagccgga gaacatcgtg 2280

atcgagatgg ccagggagaa ccagaccacc cagaagggcc agaagaacag cagggagagg 2340

atgaagagga tcgaggaggg catcaaggag ctgggcagcc agatcctgaa ggagcacccg 2400

gtggagaaca cccagctgca gaacgagaag ctgtacctgt actacctgca gaacggcagg 2460

gacatgtacg tggaccagga gctggacatc aacaggctga gcgactacga cgtggaccac 2520

atcgtgccgc agagcttcct gaaggacgac agcatcgaca acaaggtgct gaccaggagc 2580

gacaagaaca ggggcaagag cgacaacgtg ccgagcgagg aggtggtgaa gaagatgaaa 2640

aactactgga ggcagctgct gaacgccaag ctgatcaccc agaggaagtt cgacaacctg 2700

accaaggccg agaggggcgg cctgagcgag ctggacaagg ccggcttcat taaaaggcag 2760

ctggtggaga ccaggcagat caccaagcac gtggcccaga tcctggacag caggatgaac 2820

accaagtacg acgagaacga caagctgatc agggaggtga aggtgatcac cctgaagagc 2880

aagctggtga gcgacttcag gaaggacttc cagttctaca aggtgaggga gatcaataat 2940

taccaccacg cccacgacgc ctacctgaac gccgtggtgg gcaccgccct gattaaaaag 3000

tacccgaagc tggagagcga gttcgtgtac ggcgactaca aggtgtacga cgtgaggaag 3060

atgatcgcca agagcgagca ggagatcggc aaggccaccg ccaagtactt cttctacagc 3120

aacatcatga acttcttcaa gaccgagatc accctggcca acggcgagat caggaagagg 3180

ccgctgatcg agaccaacgg cgagaccggc gagatcgtgt gggacaaggg cagggacttc 3240

gccaccgtga ggaaggtgct gtccatgccg caggtgaaca tcgtgaagaa gaccgaggtg 3300

cagaccggcg gcttcagcaa ggagagcatc ctgccgaaga ggaacagcga caagctgatc 3360

gccaggaaga aggactggga tccgaagaag tacggcggct tcgacagccc gaccgtggcc 3420

tacagcgtgc tggtggtggc caaggtggag aagggcaaga gcaagaagct gaagagcgtg 3480

aaggagctgg tgggcatcac catcatggag aggagcagct tcgagaagaa cccagtggac 3540

ttcctggagg ccaagggcta caaggaggtg aagaaggacc tgatcattaa actgccgaag 3600

tacagcctgt tcgagctgga gaacggcagg aagaggatgc tggccagcgc cggcgagctg 3660

cagaagggca acgagctggc cctgccgagc aagtacgtga acttcctgta cctggccagc 3720

cactacgaga agctgaaggg cagcccggag gacaacgagc agaagcagct gttcgtggag 3780

cagcacaagc actacctgga cgagatcatc gagcagatca gcgagttcag caagagggtg 3840

atcctggccg acgccaacct ggacaaggtg ctgagcgcct acaacaagca cagggacaag 3900

ccgatcaggg agcaggccga gaacatcatc cacctgttca ccctgaccaa cctgggcgcc 3960

ccggccgcct tcaagtactt cgacaccacc atcgacagga agaggtacac cagcaccaag 4020

gaggtgctgg acgccaccct gatccaccag agcatcaccg gcctgtacga gaccaggatc 4080

gacctgagcc agctgggcgg cgacagcagc ccgccgaaga agaagaggaa ggtgagctgg 4140

aaggacgcca gcggctggag caggatgtga 4170

<210> 8

<211> 4221

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 小麦密码子优化Cas9基因cCas9-Ta

<400> 8

atggccccaa agaagaagag gaaggtcggc atccacggcg tcccagctgc gatggacaag 60

aagtactcca tcggcctcga catcggcacc aacagcgtgg gctgggccgt catcaccgac 120

gagtacaagg tgccatccaa gaagttcaag gtcctgggca acaccgaccg ccacagcatc 180

aagaagaacc tcatcggcgc tctcctgttc gactccggcg agacggctga ggctaccagg 240

ctcaagcgca ccgccaggag gaggtacacc aggaggaaga acaggatctg ctacctccaa 300

gagatcttct ccaacgagat ggccaaggtg gacgactcct tcttccaccg cctggaggag 360

agcttcctcg tcgaggagga caagaagcac gagaggcacc caatcttcgg caacatcgtg 420

gacgaggtcg cctaccacga gaagtaccca accatctacc acctgaggaa gaagctcgtg 480

gactccaccg acaaggccga cctccgcctg atctacctcg ccctggccca catgatcaag 540

ttcaggggcc acttcctgat cgagggcgac ctcaacccag acaacagcga cgtggacaag 600

ctgttcatcc aactcgtcca gacctacaac cagctcttcg aggagaaccc gatcaacgct 660

tccggcgtgg acgctaaggc tatcctgagc gctaggctct ccaagagcag gaggctcgag 720

aacctgatcg cccagctccc aggcgagaag aagaacggcc tgttcggcaa cctcatcgct 780

ctctccctgg gcctcacccc aaacttcaag agcaacttcg acctcgccga ggacgccaag 840

ctgcaactct ccaaggacac ctacgacgac gacctggaca acctcctggc ccagatcggc 900

gaccaatacg ccgacctgtt cctcgccgcc aagaacctgt ccgacgccat cctcctgagc 960

gacatcctcc gcgtgaacac cgagatcacc aaggccccac tctccgccag catgatcaag 1020

cgctacgacg agcaccacca ggacctgacc ctcctgaagg ccctggtcag gcaacagctc 1080

ccagagaagt acaaggagat cttcttcgac cagagcaaga acggctacgc tggctacatc 1140

gacggcggcg cctcccaaga ggagttctac aagttcatca agccaatcct ggagaagatg 1200

gacggcaccg aggagctcct ggtgaagctc aacagggagg acctcctgag gaagcagcgc 1260

accttcgaca acggcagcat cccacaccaa atccacctcg gcgagctgca cgctatcctg 1320

aggaggcaag aggacttcta cccattcctc aaggacaaca gggagaagat cgagaagatc 1380

ctgaccttcc gcatccccta ctacgtcggc ccactcgcta ggggcaactc caggttcgct 1440

tggatgaccc gcaagagcga ggagacgatc accccgtgga acttcgagga ggtcgtcgac 1500

aagggcgctt ccgctcagag cttcatcgag aggatgacca acttcgacaa gaacctgcca 1560

aacgagaagg tgctcccaaa gcactccctc ctgtacgagt acttcaccgt ctacaacgag 1620

ctcaccaagg tgaagtatgt gaccgagggc atgcgcaagc cagccttcct gagcggcgag 1680

cagaagaagg ccatcgtgga cctcctgttc aagaccaaca ggaaggtgac cgtcaagcaa 1740

ctcaaggagg actacttcaa gaagatcgag tgcttcgact ccgtggagat cagcggcgtc 1800

gaggaccgct tcaacgcctc cctcggcacc taccacgacc tcctgaagat catcaaggac 1860

aaggacttcc tggacaacga ggagaacgag gacatcctcg aggacatcgt gctgaccctc 1920

accctgttcg aggacaggga gatgatcgag gagcgcctga agacctacgc ccacctcttc 1980

gacgacaagg tcatgaagca actcaagagg aggaggtaca ccggctgggg caggctgagc 2040

cgcaagctca tcaacggcat ccgcgacaag cagtccggca agaccatcct cgacttcctg 2100

aagagcgacg gcttcgccaa caggaacttc atgcaactga tccacgacga ctccctcacc 2160

ttcaaggagg acatccaaaa ggctcaggtg tccggccagg gcgacagcct gcacgagcac 2220

atcgctaacc tcgctggcag cccagccatc aagaagggca tcctgcagac cgtgaaggtc 2280

gtcgacgagc tcgtgaaggt catgggcagg cacaagccag agaacatcgt catcgagatg 2340

gcccgcgaga accagaccac ccagaagggc caaaagaact ccagggagcg catgaagcgc 2400

atcgaggagg gcatcaagga gctgggcagc caaatcctca aggagcaccc agtggagaac 2460

acccaactgc agaacgagaa gctctacctg tactacctcc agaacggcag ggacatgtat 2520

gtggaccaag agctggacat caaccgcctc tccgactacg acgtggacca catcgtccca 2580

cagtccttcc tgaaggacga cagcatcgac aacaaggtgc tcaccaggag cgacaagaac 2640

cgcggcaagt ccgacaacgt cccaagcgag gaggtggtca agaagatgaa aaactactgg 2700

aggcagctcc tgaacgccaa gctgatcacc caaaggaagt tcgacaacct caccaaggct 2760

gagaggggcg gcctctccga gctggacaag gccggcttca ttaaaaggca gctggtggag 2820

acgcgccaaa tcaccaagca cgtcgcccaa atcctcgaca gccgcatgaa caccaagtac 2880

gacgagaacg acaagctgat cagggaggtg aaggtcatca ccctgaagtc caagctcgtg 2940

agcgacttca ggaaggactt ccagttctac aaggtccgcg agatcaataa ttaccaccac 3000

gcccacgacg cttacctcaa cgctgtggtc ggcaccgccc tgattaaaaa gtacccaaag 3060

ctcgagtccg agttcgtgta cggcgactac aaggtgtacg acgtccgcaa gatgatcgcc 3120

aagtccgagc aagagatcgg caaggccacc gccaagtact tcttctacag caacatcatg 3180

aacttcttca agaccgagat caccctggcc aacggcgaga tcaggaagcg cccactcatc 3240

gagacgaacg gcgagacggg cgagatcgtg tgggacaagg gcagggactt cgccaccgtg 3300

cgcaaggtcc tctccatgcc acaggtgaac atcgtcaaga agaccgaggt ccaaaccggc 3360

ggcttctcca aggagagcat cctgccaaag aggaacagcg acaagctcat cgcccgcaag 3420

aaggactggg atccaaagaa gtacggcggc ttcgactccc caaccgtggc ctacagcgtc 3480

ctcgtggtcg ccaaggtgga gaagggcaag tccaagaagc tgaagagcgt gaaggagctc 3540

gtcggcatca ccatcatgga gaggtccagc ttcgagaaga acccagtgga cttcctcgag 3600

gccaagggct acaaggaggt caagaaggac ctgatcatta aactcccaaa gtacagcctc 3660

ttcgagctgg agaacggcag gaagcgcatg ctggcttccg ctggcgagct ccaaaagggc 3720

aacgagctcg ccctgccatc caagtatgtg aacttcctct acctggcctc ccactacgag 3780

aagctcaagg gcagcccaga ggacaacgag caaaagcagc tgttcgtcga gcagcacaag 3840

cactacctcg acgagatcat cgagcaaatc tccgagttca gcaagcgcgt gatcctcgcc 3900

gacgccaacc tggacaaggt cctctccgcc tacaacaagc acagggacaa gccaatccgc 3960

gagcaggccg agaacatcat ccacctcttc accctgacca acctcggcgc tccagctgcc 4020

ttcaagtact tcgacaccac catcgacagg aagcgctaca cctccaccaa ggaggtgctg 4080

gacgccaccc tcatccacca gtccatcacc ggcctctacg agacgaggat cgacctgagc 4140

caactcggcg gcgactccag cccaccaaag aagaagagga aggtcagctg gaaggacgct 4200

tccggctgga gccgcatgtg a 4221

<210> 9

<211> 253

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子tNOS

<400> 9

gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60

atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120

atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180

gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240

atgttactag atc 253

<210> 10

<211> 1002

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 玉米类金属硫蛋白基因终止子tZmMTL

<400> 10

tcacatcgat cgacgaccaa ggatatgatt attatctatc tagcttgtgg tggtggttga 60

acaataataa gcgaggccga gctggctgcc atacataggt attgtgtggt gtgtgtgaga 120

gagagagaaa cagagttctt cagtttgcta tctctctctg catgtttggc gtcagtcttt 180

gtgctcatgt acgtacgtgt gtctacctgc atgttggttg atccgattgc atctgctgta 240

accatatatt aattggtcca cgatgatatg atttgatact atatatatac taaaaccgga 300

cttcttatta taatacttgt agtatataag tttcttacgc ccgcaattga tcgattcaga 360

aggagttcta gctagctaaa acatgcagat tcagaatatc agatttttag gactactgga 420

gatccagaac cttcgtgtcc ttgtacccgt gattttggat cccctttctc cccactacaa 480

tcgttggcgc aatcttgttc tgctcgccta gaatggtacg ccctcaccga ccatgtcctc 540

gccgatgcct accccgccac gccatctgga tggtgcatga atgtcgtcgt tttgtcctgg 600

atgctaggca cactctcccc cgagttgatg gagcctcctc gcacctctgg tggcactgcg 660

ccgcgcctgg cttgccatcg aggagcaatt cctcggcaat cgcgaagctc gcacacttcg 720

tctcgacgcc gagttccatg tcttcatgta ggcgatctct tcgtcagcga ctattgtcta 780

ttgacgcaag atgaagggga tggacgaggc ccttggtgat cttggtgagg tcatccatga 840

ccgtaccctt gtcctaaacg tgttgtgtgg tctgaatgag aggtttgccc acataaaggt 900

ccacttcaag cactcgaatc cgttcccctc cttcaccgac gtttgtaatg atctcatcct 960

tgaggagatc gactccagcg cgcctcctcc gcctccgacc ac 1002

<210> 11

<211> 1013

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 玉米肌动蛋白结合蛋白3终止子tZmABP3

<400> 11

cgcatcatga tcatgcatca tggactcggc ctactactgt ggatttgtat gccattatag 60

acttggtgct gtgaaagact gcttgatgat ttgcgggttt gttgctgtgt aaaaaaaggt 120

cccttggctc ccagaagacc atgaaggttc ggatctatca tgtaattcct tgttatctgc 180

caattatgta tggactatgg acatgtgttg cgctgttcaa cttactacta caaataagta 240

atcgatatgt tcccttccca tgtctcggtg acaattgtct ggagaagctt aggggtcgtt 300

tgtttgggat tatgtctgga gaaacttatt ttaaactaag tgtgagttca agttaagtta 360

gattatataa tctaggcaga ttataattcc aagcgaacag gtccttagtg tttttggaaa 420

atcctaggtg ttcttttggc tacattgttg tgtgtgcaga tcccttgttg gtctgtaagc 480

gtggggaagt aagaatcgtc cgtttctact gaagacctgc tcgagttagg caccgaggat 540

gccggtaacc aaacagagca atagtgtctc tgtgggcaca gtggagtgtg aatctgtgtg 600

atgcaaatcc gtcatttgtt tagcaaaatt tccagcgttg catgatgcag tttctttaac 660

acggacttaa gggaagggaa aaaaatgttg agccaggaga tccttcaatg tgttagactg 720

acgtgatagc caactaaacc acgacgcaat gttgtcgtta atgacaaaaa aactatttgt 780

tcctaaatcc ttggcgacat tgcatggctg tctcatgaga taatggtctc atctcttatt 840

tatctcttat ttatagccgg aagtggtagt gacccctgct tgattgctcg tatgccatct 900

caagttctca accgtgtcga gcagccattt tcccatctca agcgcatcat cgtttcgttt 960

gacctcatct gctatcctgc tcctagtgca aatcacatgc gacagaaagt gtg 1013

<210> 12

<211> 362

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 小麦U6启动子prTaU6

<400> 12

gaccaagccc gttattctga cagttctggt gctcaacaca tttatattta tcaaggagca 60

cattgttact cactgctagg agggaatcga actaggaata ttgatcagag gaactacgag 120

agagctgaag ataactgccc tctagctctc actgatctgg gtcgcatagt gagatgcagc 180

ccacgtgagt tcagcaacgg tctagcgctg ggcttttagg cccgcatgat cgggcttttg 240

tcgggtggtc gacgtgttca cgattgggga gagcaacgca gcagttcctc ttagtttagt 300

cccacctcgc ctgtccagca gagttctgac cggtttataa actcgcttgc tgcatcagac 360

tt 362

<210> 13

<211> 857

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 小麦U3启动子prTaU3

<400> 13

gaattcatcc tcacgttcaa caccacatag ggggcatacc tcagtatcct cgaggtgccg 60

tgaagccttg ttggcccaag tagcaagtga atttgtgaca acccttcatg catatacggt 120

agttttattt attttactct ctacattgtt ctcatgatat tcatccatgc agcctctctt 180

tcctggggaa aattcagttg atcaactggt tgagattatc aaggtgaaat cttgtagtat 240

gtacgacatt tggaactgct ttctcctgcg acatgcattc tttacaatga catgttcagc 300

catagtactc caagaaggga agagaccaag tgcatgaatc caaaccacac ggagttcaaa 360

ttcccacaga ttaaggctcg tccgtcgcac aaggtaatgt gtgaatatta tatctgtcgt 420

gcaaaattgc ctggcctgca caattgctgt tatagttggc ggcagggaga gttttaacat 480

tgactagcgt gctgataatt tgtgagaaat aataattgac aagtagatac tgacatttga 540

gaagagcttc tgaactgtta ttagtaacaa aaatggaaag ctgatgcacg gaaaaaggaa 600

agaaaaagcc atactttttt ttaggtagga aaagaaaaag ccatacgaga ctgatgtctc 660

tcagatgggc cgggatctgt ctatctagca ggcagcagcc ctaccaacct cacgggccag 720

caattacgag tccttctaaa acgtcccgcc gagggcgcgt ggccgtgctg tgcagcagca 780

cgtctaacat tagtcccacc tcgccagttt acagggagca gaaccagctt ataagcggag 840

gcgcggcacc aagaagc 857

<210> 14

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 水稻U3启动子prOsU3

<400> 14

gggatcttta aacatacgaa cagatcactt aaagttcttc tgaagcaact taaagttatc 60

aggcatgcat ggatcttgga ggaatcagat gtgcagtcag ggaccatagc acaggacagg 120

cgtcttctac tggtgctacc agcaaatgct ggaagccggg aacactgggt acgttggaaa 180

ccacgtgatg tggagtaaga taaactgtag gagaaaagca tttcgtagtg ggccatgaag 240

cctttcagga catgtattgc agtatgggcc ggcccattac gcaattggac gacaacaaag 300

actagtatta gtaccacctc ggctatccac atagatcaaa gctggtttaa aagagttgtg 360

cagatgatcc gtggc 375

<210> 15

<211> 1176

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 6-磷酸甘露糖异构酶基因cPMI

<400> 15

atgcaaaaac tcattaactc agtgcaaaac tatgcctggg gcagcaaaac ggcgttgact 60

gaactttatg gtatggaaaa tccgtccagc cagccgatgg ccgagctgtg gatgggcgca 120

catccgaaaa gcagttcacg agtgcagaat gccgccggag atatcgtttc actgcgtgat 180

gtgattgaga gtgataaatc gactctgctc ggagaggccg ttgccaaacg ctttggcgaa 240

ctgcctttcc tgttcaaagt attatgcgca gcacagccac tctccattca ggttcatcca 300

aacaaacaca attctgaaat cggttttgcc aaagaaaatg ccgcaggtat cccgatggat 360

gccgccgagc gtaactataa agatcctaac cacaagccgg agctggtttt tgcgctgacg 420

cctttccttg cgatgaacgc gtttcgtgaa ttttccgaga ttgtctccct actccagccg 480

gtcgcaggtg cacatccggc gattgctcac tttttacaac agcctgatgc cgaacgttta 540

agcgaactgt tcgccagcct gttgaatatg cagggtgaag aaaaatcccg cgcgctggcg 600

attttaaaat cggccctcga tagccagcag ggtgaaccgt ggcaaacgat tcgtttaatt 660

tctgaatttt acccggaaga cagcggtctg ttctccccgc tattgctgaa tgtggtgaaa 720

ttgaaccctg gcgaagcgat gttcctgttc gctgaaacac cgcacgctta cctgcaaggc 780

gtggcgctgg aagtgatggc aaactccgat aacgtgctgc gtgcgggtct gacgcctaaa 840

tacattgata ttccggaact ggttgccaat gtgaaattcg aagccaaacc ggctaaccag 900

ttgttgaccc agccggtgaa acaaggtgca gaactggact tcccgattcc agtggatgat 960

tttgccttct cgctgcatga ccttagtgat aaagaaacca ccattagcca gcagagtgcc 1020

gccattttgt tctgcgtcga aggcgatgca acgttgtgga aaggttctca gcagttacag 1080

cttaaaccgg gtgaatcagc gtttattgcc gccaacgaat caccggtgac tgtcaaaggc 1140

cacggccgtt tagcgcgtgt ttacaacaag ctgtaa 1176

<210> 16

<211> 106

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rsgRNATaDEP1

<400> 16

gaccaataaa gacggcagga cgttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt 60

ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcttt tttttt 106

<210> 17

<211> 106

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rsgRNATaLOX2

<400> 17

agtgccgcgc gacgagctct tgttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt 60

ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcttt tttttt 106

<210> 18

<211> 103

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rsgRNATaGASR7

<400> 18

gttgccgtag gtgcccgggt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg 60

ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt ttt 103

<210> 19

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rsgRNAOsDep1

<400> 19

aactgcagtg cgtgctgcgc gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttttt 105

<210> 20

<211> 2181

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 水稻肌动蛋白启动子prOsAct1

<400> 20

tgcagcccat ccctcagccg cctttcacta tcttttttgc ccgagtcatt gtcatgtgaa 60

ccttggcatg tataatcggt gaattgcgtc gattttcctc ttataggtgg gccaatgaat 120

ccgtgtgatc gcgtctgatt ggctagagat atgtttcttc cttgttggat gtattttcat 180

acataatcat atgcatacaa atatttcatt acactttata gaaatggtca gtaataaacc 240

ctatcactat gtctggtgtt tcattttatt tgcttttaaa cgaaaattga cttcctgatt 300

caatatttaa ggatcgtcaa cggtgtgcag ttactaaatt ctggtttgta ggaactatag 360

taaactattc aagtcttcac ttattgtgca ctcacctctc gccacatcac cacagatgtt 420

attcacgtct taaatttgaa ctacacatca tattgacaca atattttttt taaataagcg 480

attaaaacct agcctctatg tcaacaatgg tgtacataac cagcgaagtt tagggagtaa 540

aaaacatcgc cttacacaaa gttcgcttta aaaaataaag agtaaatttt actttggacc 600

acccttcaac caatgtttca ctttagaacg agtaatttta ttattgtcac tttggaccac 660

cctcaaatct tttttccatc tacatccaat ttatcatgtc aaagaaatgg tctacataca 720

gctaaggaga tttatcgacg aatagtagct agcatactcg aggtcattca tatgcttgag 780

aagagagtcg ggatagtcca aaataaaaca aaggtaagat tacctggtca aaagtgaaaa 840

catcagttaa aaggtggtat aaagtaaaat atcggtaata aaaggtggcc caaagtgaaa 900

tttactcttt tctactatta taaaaattga ggatgttttt gtcggtactt tgatacgtca 960

tttttgtatg aattggtttt taagtttatt cgcttttgga aatgcatatc tgtatttgag 1020

tcgggtttta agttcgtttg cttttgtaaa tacagaggga tttgtataag aaatatcttt 1080

aaaaaaaccc atatgctaat ttgacataat ttttgagaaa aatatatatt caggcgaatt 1140

aattctcaca atgaacaata ataagattaa aatagctttc ccccgttgca gcgcatgggt 1200

attttttcta gtaaaaataa aagataaact tagactcaaa acatttacaa aaacaacccc 1260

taaagttcct aaagcccaaa gtgctatcca cgatccatag caagcccagc ccaacccaac 1320

ccaacccaac ccaccccagt ccagccaact ggacaatagt ctccacaccc ccccactatc 1380

accgtgagtt gtccgcacgc accgcacgtc tcgcagccaa aaaaaaaaaa agaaagaaaa 1440

aaaagaaaaa gaaaaaacag caggtgggtc cgggtcgtgg gggccggaaa cgcgaggagg 1500

atcgcgagcc agcgacgagg ccggccctcc ctccgcttcc aaagaaacgc cccccatcgc 1560

cactatatac ataccccccc ctctcctccc atccccccaa ccctaccacc accaccacca 1620

ccacctccac ctcctccccc ctcgctgccg gacgacgagc tcctcccccc tccccctccg 1680

ccgccgccgc gccggtaacc accccgcccc tctcctcttt ctttctccgt tttttttttc 1740

cgtctcggtc tcgatctttg gccttggtag tttgggtggg cgagaggcgg cttcgtgcgc 1800

gcccagatcg gtgcgcggga ggggcgggat ctcgcggctg gggctctcgc cggcgtggat 1860

cgatccggcc cggatctcgc ggggaatggg gctctcggat gtagatctgc gatccgccgt 1920

tgttggggga gatgatgggg ggtttaaaat ttccgccatg ctaaacaaga tcaggaagag 1980

gggaaaaggg cactatggtt tatattttta tatatttctg ctgcttcgtc aggcttagat 2040

gtgctagatc tttctttctt ctttttgtgg gtagaatttg aatccctcag cattgttcat 2100

cggtagtttt tcttttcatg atttgtgaca aatgcagcct cgtgcggagc ttttttgtag 2160

gtagaagctg gctgacgccg g 2181

Claims

1.一种表达盒，其包含与植物内源高表达启动子有效连接的Cas9基因，以及添加在所述植物内源高表达启动子前面的有效连接的增强子。

2.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述植物内源高表达启动子为植物泛素启动子或植物肌动蛋白启动子。

3.根据权利要求2所述的表达盒，其中所述植物泛素启动子为玉米泛素启动子prZmUbi1、甘蔗泛素启动子prSoUbi4或二穗短柄草泛素启动子prBdUbi10。

4.根据权利要求3所述的表达盒，其中所述玉米泛素启动子prZmUbi1的序列如SEQ IDNO:4所示。

5.根据权利要求3所述的表达盒，其中所述甘蔗泛素启动子prSoUbi4的序列如SEQ IDNO:5所示。

6.根据权利要求3所述的表达盒，其中所述二穗短柄草泛素启动子prBdUbi10的序列如SEQ ID NO:6所示。

7.根据权利要求2所述的表达盒，其中所述植物肌动蛋白启动子为水稻肌动蛋白启动子prOsAct1。

8.根据权利要求7所述的表达盒，其中所述水稻肌动蛋白启动子prOsAct1的序列如SEQID NO:20所示。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的表达盒，其中所述增强子为植物病毒来源的增强子。

10.根据权利要求9所述的表达盒，其中所述植物病毒来源的增强子为玄参花叶病毒FMV增强子、花椰菜花叶病毒CaMV 35S增强子或者玄参花叶病毒FMV增强子和花椰菜花叶病毒CaMV 35S增强子这两者。

11.根据权利要求10所述的表达盒，其中所述玄参花叶病毒FMV增强子的序列如SEQ IDNO:1所示。

12.根据权利要求10所述的表达盒，其中所述花椰菜花叶病毒CaMV 35S增强子的序列如SEQ ID NO:2所示。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的表达盒，其中所述Cas9基因的序列如SEQ IDNO:7或8所示。

14.一种表达盒，其包含与小麦U3启动子有效连接的编码sgRNA的DNA序列。

15.根据权利要求14所述的表达盒，其中所述小麦U3启动子的序列如SEQ ID NO:13所示。

16.根据权利要求14或15所述的表达盒，其中所述编码sgRNA的DNA序列如SEQ ID NO:16、17、18或19所示。

17.一种表达载体，其包含根据权利要求1-13中任一项所述的表达盒，或者包含根据权利要求14-16中任一项所述的表达盒，或者包含根据权利要求1-13中任一项所述的表达盒和根据权利要求14-16中任一项所述的表达盒。

18.一种细胞，其包含根据权利要求17所述的表达载体。

19.根据权利要求18所述的细胞，其中所述细胞为农杆菌细胞或小麦细胞。

20.根据权利要求1-13中任一项所述的表达盒和/或根据权利要求14-16中任一项所述的表达盒用于在小麦中进行基因编辑或者用于提高小麦中的基因编辑效率的用途。

21.一种在小麦中进行基因编辑或者提高小麦中的基因编辑效率的方法，其包括：

(1)用在前面添加有有效连接的增强子的植物内源高表达启动子驱动Cas9基因的表达；和/或

(2)用小麦U3启动子驱动编码sgRNA的DNA序列的表达。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述植物内源高表达启动子为植物泛素启动子或植物肌动蛋白启动子。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述植物泛素启动子为玉米泛素启动子prZmUbi1、甘蔗泛素启动子prSoUbi4或二穗短柄草泛素启动子prBdUbi10。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述玉米泛素启动子prZmUbi1的序列如SEQ IDNO:4所示。

25.根据权利要求23所述的方法，其中所述甘蔗泛素启动子prSoUbi4的序列如SEQ IDNO:5所示。

26.根据权利要求23所述的方法，其中所述二穗短柄草泛素启动子prBdUbi10的序列如SEQ ID NO:6所示。

27.根据权利要求22所述的方法，其中所述植物肌动蛋白启动子为水稻肌动蛋白启动子prOsAct1。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述水稻肌动蛋白启动子prOsAct1的序列如SEQID NO:20所示。

29.根据权利要求21-28中任一项所述的方法，其中所述增强子为植物病毒来源的增强子。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述植物病毒来源的增强子为玄参花叶病毒FMV增强子、花椰菜花叶病毒CaMV 35S增强子或者玄参花叶病毒FMV增强子和花椰菜花叶病毒CaMV 35S增强子这两者。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述玄参花叶病毒FMV增强子的序列如SEQ IDNO:1所示。

32.根据权利要求30所述的方法，其中所述花椰菜花叶病毒CaMV 35S增强子的序列如SEQ ID NO:2所示。

33.根据权利要求21-32中任一项所述的方法，其中所述Cas9基因的序列如SEQ ID NO:7或8所示。

34.根据权利要求21-33中任一项所述的方法，其中所述小麦U3启动子的序列如SEQ IDNO:13所示。

35.根据权利要求21-34中任一项所述的方法，其中所述编码sgRNA的DNA序列如SEQ IDNO:16、17、18或19所示。