CN111278276A - 用于转基因表达的植物启动子 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及用于使用来自柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因的启动子来促进植物或植物细胞中核苷酸序列转录的组合物和方法。一些实施例涉及来自在植物中起作用以促进可操作地连接的核苷酸序列的转录的来自柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因的启动子。其他实施例涉及来自在植物中起作用以促进可操作地连接的核苷酸序列的转录的来自柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因的3'UTR。

Description

用于转基因表达的植物启动子
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年6月28日提交的美国临时专利申请序列号65/525896的权益的优先权，所述临时申请的披露内容通过引用以其全文特此并入。
通过引用以电子方式递交的材料并入
通过引用整体并入的是与此同时提交并标识如下的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表：创建于2017年8月16日文件名为“79402-US-PSP-20170628-Sequence-Listing-ST25.txt”的20.0KB ACII(文本)。
背景技术
许多植物物种能够被转基因转化以引入农学上希望的性状或特征。开发和/或修饰所得植物物种使其具有特定的希望的性状。通常，希望的性状包括，例如，改善营养价值质量、增加产量、赋予有害生物抗性或疾病抗性、增加干旱和胁迫耐受性、改善园艺品质(例如色素沉着和生长)、赋予除草剂耐受性、使得能够由植物产生工业上有用的化合物和/或材料、和/或使得能够产生药物。
通过植物转化技术产生包含堆叠在单个基因组基因座的多个转基因的转基因植物物种。植物转化技术导致将转基因引入植物细胞，回收在植物基因组中包含稳定整合的转基因拷贝的可育转基因植物，并随后通过转录和翻译的转基因表达得到具有希望的性状和表型的转基因植物。然而，希望允许产生转基因植物物种以高表达多个工程化为性状堆叠的转基因的新颖基因调节元件。
同样，希望允许转基因在植物的特定组织或器官内表达的新颖基因调节元件。例如，增加植物对土壤传播的病原体感染的抵抗力，可以通过用病原体抗性基因转化植物基因组，从而使病原体抗性蛋白在植物根部内稳健表达来实现。可替代的，可能希望在处于特定生长或发育阶段(例如比如细胞分裂或伸长)的植物组织中表达转基因。此外，可能希望在植物的叶和茎组织中表达转基因以提供对除草剂的耐受性或对地面上昆虫和有害生物的抗性。
因此，需要能够驱动特定植物组织中转基因表达所需水平的新基因调节元件。
发明内容
在本公开的实施例中，本公开涉及包含可操作地连接到以下的启动子的核酸载体：a)多接头序列；b)非柳枝稷(Panicum virgatum)(Pavir.Cb02009)卵细胞基因；或c)a)和b)的组合，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的多核苷酸序列。在该实施例的一方面，所述启动子的长度为1,400bp。在进一步的方面，所述启动子由与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的多核苷酸序列组成。在另一方面，所述启动子包含编码可选择标记的序列。在又另一方面，所述启动子与转基因可操作地连接。在一些情况下，所述转基因编码赋予杀昆虫抗性、除草剂耐受性、氮利用效率、水利用效率、RNAi的表达或营养品质的可选择标记或基因产品。在一个另外的方面，所述核酸载体包含3'非翻译多核苷酸序列。在一个另外的方面，所述核酸载体包含5'非翻译多核苷酸序列。在一个另外的方面，所述核酸载体包含内含子序列。在进一步的方面，所述启动子具有胚胎细胞表达。在另外的方面，与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的多核苷酸序列可操作地连接到转基因。
在又另一个实施例中，本公开涉及包含核酸载体的转基因植物。在一方面，所述植物选自下组，该组由以下组成：玉蜀黍(Zea mays)、小麦、稻、高粱、燕麦、黑麦、香蕉、甘蔗、大豆、棉花、拟南芥、烟草、向日葵和低芥酸菜籽。在进一步的方面，将所述转基因插入所述植物的基因组中。在另一方面，所述转基因植物包括启动子，该启动子包含与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的多核苷酸序列，并且所述启动子与转基因可操作地连接。在进一步的方面，所述转基因植物包含3'非翻译序列。在其他方面，所述转基因启动子驱动转基因植物中转基因的胚胎细胞组织特异性表达。在又另一方面，所述转基因植物包含长度为1,400bp的启动子。
在本公开的实施例中，本公开涉及一种产生转基因植物细胞的方法，该方法包括以下步骤：a)用基因表达盒转化植物细胞，所述基因表达盒包含与至少一个目的多核苷酸序列可操作地连接的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞启动子；b)分离包含所述基因表达盒的经转化的植物细胞；以及c)产生转基因植物细胞，所述转基因植物细胞包含与至少一个目的多核苷酸序列可操作地连接的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞启动子。在一方面，用植物转化方法进行植物细胞的转化。这些转化方法可以包括选自下组的植物转化方法，该组由以下组成：农杆菌属介导的转化方法、基因枪转化方法、碳化硅转化方法、原生质体转化方法和脂质体转化方法。在进一步的方面，所述目的多核苷酸序列在植物细胞中表达。在其他方面，所述目的多核苷酸序列被稳定整合到转基因植物细胞的基因组中。在另外的方面，所述方法进一步包括以下步骤：d)将转基因植物细胞再生为转基因植物；以及e)获得转基因植物，其中所述转基因植物包含基因表达盒，所述基因表达盒包含与至少一个目的多核苷酸序列可操作地连接的如权利要求1所述的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞启动子。在一个进一步的方面，所述转基因植物细胞是单子叶转基因植物细胞或双子叶转基因植物细胞。因此，所述双子叶转基因植物细胞可以包括拟南芥植物细胞、烟草植物细胞、大豆植物细胞、低芥酸菜籽植物细胞和棉花植物细胞。同样，所述单子叶转基因植物细胞可以包括玉蜀黍植物细胞、稻植物细胞和小麦植物细胞。在另一方面，所述柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞启动子包含SEQ ID NO:1的多核苷酸。在随后的方面，目的第一多核苷酸序列可操作地连接到SEQ ID NO:1的3′末端。在另外的方面，所述方法包括将可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞启动子的目的多核苷酸序列引入植物细胞。在进一步的方面，通过植物转化方法将可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞启动子的目的多核苷酸序列引入植物细胞。这种植物转化方法的实例包括农杆菌属介导的转化方法、基因枪转化方法、碳化硅转化方法、原生质体转化方法和脂质体转化方法。在进一步的方面，所述目的多核苷酸序列在胚胎细胞组织中表达。在另外的方面，所述目的多核苷酸序列被稳定地整合到植物细胞的基因组中。在又另一方面，所述转基因植物细胞是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞。示例性的双子叶植物细胞包括拟南芥植物细胞、烟草植物细胞、大豆植物细胞、低芥酸菜籽植物细胞和棉花植物细胞。同样，示例性的单子叶植物细胞包括玉蜀黍植物细胞、稻植物细胞和小麦植物细胞。
在本公开的实施例中，本公开涉及转基因植物细胞，所述转基因植物细胞包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞启动子。在一方面，所述转基因植物细胞包含转基因事件。在进一步的方面，所述转基因事件包括农学性状。此类农学性状可以包括杀昆虫抗性性状、除草剂耐受性性状、氮利用效率性状、水利用效率性状、营养品质性状、DNA结合性状、可选择标记性状、小RNA性状或其任何组合。例如，耐除草剂性状可以包含aad-1编码序列。在一个随后的方面，所述转基因植物细胞产生商品产品。此类商品产品可以包括蛋白质浓缩物、蛋白质分离物、谷物、粗粉、面粉、油或纤维。在其他方面，所述转基因植物细胞选自由双子叶植物细胞或单子叶植物细胞组成的组。示例性的双子叶植物细胞包括拟南芥植物细胞、烟草植物细胞、大豆植物细胞、低芥酸菜籽植物细胞和棉花植物细胞。同样，示例性的单子叶植物细胞包括玉蜀黍植物细胞、稻植物细胞和小麦植物细胞。在一方面，所述柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞启动子包含与SEQ ID NO:1的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸。在随后的方面，所述柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞启动子的长度为1,400bp。在进一步的方面，所述柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞启动子由SEQ ID NO:1组成。在又另一方面，目的第一多核苷酸序列可操作地连接到SEQ ID NO:1的3′末端。在随后的方面，所述农学性状在胚胎细胞组织中表达。
在本公开的实施例中，本公开涉及分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含与SEQ ID NO:1的多核苷酸具有至少90％序列同一性的核酸序列。在一方面，所述分离的多核苷酸在胚胎细胞组织中特异性表达。在另一方面，所述分离的多核苷酸在植物细胞内表达。在其他方面，所述分离的多核苷酸包含编码多肽和终止序列的可读框多核苷酸。在一方面，SEQ ID NO:1的多核苷酸的长度为1,400bp。
在本公开的实施例中，本公开涉及基因表达盒，所述基因表达盒包含与异源编码序列可操作地连接的启动子，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的多核苷酸。在一些实施例中，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性。在另外的实施例中，所述基因表达盒包含内含子。在进一步的实施例中，所述基因表达盒包含5’UTR。在随后的实施例中，所述启动子具有组织偏好性表达。在其他实施例中，所述启动子与编码多肽或小RNA基因的异源编码序列可操作地连接。编码的多肽或小RNA基因的实例包括赋予杀昆虫抗性、除草剂耐受性的异源编码序列、赋予氮利用效率的核酸、赋予水利用效率的核酸、赋予营养品质的核酸、编码DNA结合蛋白的核酸、和编码可选择标记的核酸。在另外的实施例中，所述基因表达盒包含3'非翻译区。在另外的实施例中，所述基因表达盒包含5'非翻译区。在另外的实施例中，所述基因表达盒包含终止子区域。在其他实施例中，本公开涉及包含基因表达盒的重组载体，其中所述载体选自由质粒、黏粒、细菌人工染色体、病毒和噬菌体组成的组。在其他实施例中，本公开涉及包含基因表达盒的转基因细胞。在该实施例的一方面，所述转基因细胞是转基因植物细胞。在该实施例的其他方面，所述转基因植物包含转基因植物细胞。在进一步的方面，所述转基因植物是单子叶植物或双子叶植物。单子叶植物的实例包括玉米植物、稻植物和小麦植物。在实施例的进一步的方面，所述转基因植物产生包含基因表达盒的种子。在其他实施例中，所述启动子是组织偏好性启动子。在一些实施例中，所述组织偏好性启动子是胚胎细胞偏好性启动子。
通过以下几个实施例的详细描述，前述和其他特征将变得更加明显。
具体实施方式
I.若干个实施例的概述
转基因植物产品的开发变得越来越复杂。商业上可行的转基因植物现在需要将多个转基因/异源编码序列堆叠到单个基因座中。用于基础研究或生物技术应用的植物启动子和3’UTR通常是单向的，仅指导已在其3'端(下游)(对于启动子)或在其5'端(上游)(对于3’UTR)融合的一个基因。因此，每个转基因/异源编码序列通常需要启动子和3'UTR才能表达，其中需要多个调节元件来表达一个基因堆叠物内的多个转基因/异源编码序列。随着基因堆叠物中转基因数量的增加，通常使用相同的启动子和/或3'UTR来获得不同转基因/异源编码序列的表达模式的最佳水平。获得最佳水平的转基因/异源编码序列表达对于产生单个多基因性状是必要的。不幸的是，已知由相同启动子和/或3'UTR驱动的多基因构建体会导致基因沉默，从而导致田野中的有效转基因产品较少。重复的启动子和/或3'UTR元件可能导致基于同源性的基因沉默。另外，转基因内的重复序列可导致基因座内基因同源重组，从而导致多核苷酸重排。转基因的沉默和重排将可能对产生以表达转基因/异源编码序列的转基因植物的性能具有不希望的影响。此外，由于启动子重复而引起的过量的转录因子(TF)结合位点可引起内源性TF的耗尽，从而导致转录失活。考虑到需要将多个基因/异源编码序列引入植物中以进行代谢工程和性状堆叠，需要多种启动子和/或3'UTR来开发驱动多个基因/异源编码序列表达的转基因作物。
启动子和/或3'UTR鉴定中的一个特殊问题是需要鉴定与其他植物组织中未表达的植物中特定细胞类型、发育阶段和/或功能有关的组织特异性启动子。组织特异性(即组织偏好性)或器官特异性启动子驱动基因在某些组织中的表达，例如在植物的籽粒(kernel)、根、叶或绒毡层中。可以从观察基因/异源编码序列的表达来初步鉴定组织和发育阶段特异性启动子和/或3'UTR，所述基因/异源编码序列在植物发育过程中的特定组织或特定时间段表达。这些组织特异性启动子和/或3'UTR对于转基因植物工业中的某些应用是必需的，并且是理想的，因为它们允许异源基因在组织中和/或以发育阶段选择性方式特异性表达，表明异源基因在多种器官、组织和/或时间差异表达，但不在其他不希望的组织中表达。例如，增加植物对土壤传播的病原体感染的抵抗力，可以通过用病原体抗性基因转化植物基因组，从而使病原体抗性蛋白在植物根部内稳健表达来实现。可替代的，可能希望在处于特定生长或发育阶段(例如比如细胞分裂或伸长)的植物组织中表达转基因。另一应用是希望使用组织特异性启动子和/或3'UTR来限制转基因/异源编码序列的表达，所述转基因/异源编码序列编码特定组织类型(如发育中的薄壁组织细胞)中的农学性状。同样地，在鉴定启动子和/或3'UTR中的一个具体问题是如何鉴定启动子，以及如何将鉴定的启动子与细胞的发育特性联系起来以进行特定的组织表达。
有关启动子鉴定的另一个问题是需要克隆所有相关的顺式作用和反式激活转录控制元件，使克隆的DNA片段以所需的特异性表达模式驱动转录。假定这样的控制元件位于翻译起始或起始位点的远侧，则选择包含启动子的多核苷酸的大小对于提供启动子多核苷酸序列的表达水平和表达模式是重要的。已知启动子长度包括功能信息，并且已经显示不同基因/异源编码序列具有比基因组中其他基因的启动子更长或更短的启动子。阐明启动子的转录起始位点并预测启动子区域中的功能基因元件具有挑战性。进一步增加了挑战的是调节基序以及顺式和反式调节元件的复杂性、多样性和固有的简并性质(Blanchette,Mathieu等人,“Genome-wide computational prediction of transcriptionalregulatory modules reveals new insights into human gene expression.[转录调节模块的全基因组计算预测揭示了对人类基因表达的新见解]”Genome research[基因组研究]16.5(2006):656-668)。顺式和反式调节元件位于启动子的远端，它们调节基因的空间和时间表达，使其仅在所需的位点和特定的时间出现(Porto,Milena Silva等人,“Plantpromoters:an approach of structure and function.[植物启动子：一种结构和功能的方法]”Molecular biotechnology[分子生物技术]56.1(2014):38-49)。因此，鉴定启动子调节元件需要获得含有必需的顺式和反式调节元件的特定大小的合适序列，其将导致以希望的方式驱动可操作连接到转基因/异源编码序列的表达。
提供了通过使用柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因调节元件在植物中表达转基因/异源编码序列来克服此类问题的方法和组合物。
II.术语和缩写
在整个申请中，使用了许多术语。为了提供对说明书和权利要求(包括给出这些术语的范围)的清楚和一致的理解，提供以下定义。
如本文所使用的，术语“内含子”是指转录但未翻译的基因(或表达的目的多核苷酸序列)中包含的任何核酸序列。内含子包括在表达的DNA序列内的未翻译的核酸序列，以及从其转录的RNA分子中的相应序列。本文所述的构建体还可含有增强翻译和/或mRNA稳定性的序列，例如内含子。一个这种内含子的实例是拟南芥组蛋白H3变体的基因II的第一内含子或任何其他通常已知的内含子序列。内含子可以与启动子序列组合使用以增强翻译和/或mRNA的稳定性。
如本文所使用的，术语“分离的”意指已经从其自然环境中除去，或从首次形成该化合物时存在的其他化合物中除去。术语“分离的”涵盖从自然来源分离的材料以及通过在宿主细胞中重组表达制备后回收的材料(例如，核酸和蛋白质)，或化学合成的化合物，例如核酸分子、蛋白质和肽。
如本文所使用的，术语“纯化的”涉及分子或化合物的分离，所述分子或化合物以基本上不含通常与在天然或自然环境中的分子或化合物相关的污染物，或者基本上在相对于化合物初次形成时存在的其他化合物的浓缩中富集的，并且意指由于与原始组合物中的其他组分分离而纯度提高了。本文使用的术语“纯化的核酸”来描述已经与其他生物化合物分离的、分离产生的或纯化的核酸序列，所述其他生物化合物包括但不限于多肽、脂质和碳水化合物，同时影响组分中的化学或功能改变组分(例如，可以通过去除蛋白质污染物并断开将核酸与染色体中其余DNA连接的化学键，从染色体上纯化核酸)。
如本文所使用的，术语“合成的”是指通过化学合成作为体外过程产生的多核苷酸(即，DNA或RNA)分子。例如，可以在EppendorfTM管内的反应期间产生合成DNA，使得合成DNA由DNA或RNA的天然链酶促产生。可以利用其他实验室方法来合成多核苷酸序列。寡核苷酸可以在寡核苷酸合成仪上通过使用亚磷酰胺的固相合成化学合成。合成的寡核苷酸可以作为复合物彼此退火，从而产生“合成的”多核苷酸。化学合成多核苷酸的其他方法是本领域已知的，并且可以容易地实现以用于本公开。
如本文所使用的，术语“约”是指大于或小于所陈述的值或值的范围的百分之十，但并非旨在仅针对此更宽泛的定义来指定任何值或值的范围。术语“约”之后的每个值或值的范围也旨在涵盖所述绝对值或值的范围的实施例。
为了本公开的目的，“基因”包括编码基因产物的DNA区域(参见下文)，以及调节该基因产物的产生的所有DNA区域，无论此类调节序列是否与编码和/或转录序列相邻。因此，基因包括但不限于启动子序列、终止子、翻译调节序列(如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点)、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点、内含子和基因座控制区。
如本文所使用的，术语“天然的”或“自然的”定义了天然存在的状况。“天然DNA序列”是自然界中存在的DNA序列，其是通过自然手段或传统育种技术产生的，但不是通过基因工程产生的(例如，使用分子生物学/转化技术)。
如本文所使用的，“转基因”或“异源编码序列”被定义为编码基因产物的核酸序列，所述基因产物包括例如但不限于mRNA。在一个实施例中，所述转基因/异源编码序列是外源核酸，其中通过基因工程将转基因/异源编码序列引入宿主细胞(或其后代)，其中通常找不到转基因/异源编码序列。在一个实例中，转基因/异源编码序列编码工业上或药学上有用的化合物，或编码希望的农业性状(例如，除草剂抗性基因)的基因/异源编码序列。在又另一个实例中，转基因/异源编码序列是反义核酸序列，其中反义核酸序列的表达抑制靶核酸序列的表达。在一个实施例中，所述转基因/异源编码序列是内源核酸，其中希望的是内源核酸的另外的基因组拷贝，或相对于宿主生物体中靶核酸的序列处于反义方向的核酸。如本文所使用的，“异源编码序列”是指除自然编码玉蜀黍卵细胞基因的编码序列以外的任何编码序列，或表达的玉蜀黍卵细胞蛋白的任何同源物。在本发明的上下文中，术语“异源的”用于通常发现在自然界中没有紧密联系的核酸序列的任何组合。
如本文所使用的，术语“非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞转基因”或“非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因”是与柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因编码序列具有少于80％序列同一性的任何转基因(SEQ ID NO:6带有Pavir.3NG027800的Phytozome基因座名称和Pavir.3NG027800.1的转录物名称(主要)，其位于Chr03N:2179636..2180523反向，并且也通过以下别名描述(别名；Pavir.Cb02009、Pavir.Cb02009.v1.1、和/或Pavir.Cb02009.1.v1.1)。)。
如本文所定义的“基因产品”是由基因产生的任何产品。例如，基因产物可以是基因(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、干扰RNA、核糖酶、结构RNA或任何其他类型的RNA)或通过mRNA翻译产生的蛋白质的直接转录产物。基因产物还包括通过加帽、聚腺苷酸化、甲基化和编辑等方法修饰的RNA，以及通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、肉豆蔻化和糖基化修饰的蛋白质。基因表达会受到外部信号的影响，例如，细胞、组织或生物体暴露于增加或减少基因表达的药剂。基因的表达也可以在从DNA到RNA到蛋白质的途径中的任何地方受到调节。调节基因表达的方式是，例如，通过控制转录、翻译、RNA转运和加工、中间分子(例如mRNA)的降解或特定蛋白质分子在制备后的激活、失活、区室化或降解，或其组合。可以通过本领域已知的任何方法在RNA水平或蛋白质水平测量基因表达，包括但不限于RNA印迹、RT-PCR、蛋白质印迹或体外、原位或体内蛋白活性测定。
如本文所使用的，术语“基因表达”涉及这样的过程，通过该过程，核酸转录单位(包括例如基因组DNA)的编码信息通常被转化为细胞的可操作的、不可操作的、或结构的部分，经常包括蛋白质的合成。基因表达会受到外部信号的影响；例如，细胞、组织或生物体暴露于增加或减少基因表达的药剂。基因的表达也可以在从DNA到RNA到蛋白质的途径中的任何地方受到调节。调节基因表达的方式是，例如，通过控制转录、翻译、RNA转运和加工、中间分子(例如mRNA)的降解或特定蛋白质分子在制备后的激活、失活、区室化或降解，或其组合。可以通过本领域已知的任何方法在RNA水平或蛋白质水平测量基因表达，包括但不限于RNA印迹、RT-PCR、蛋白质印迹或体外、原位或体内蛋白活性测定。
如本文所使用的，“基于同源性的基因沉默”(HBGS)是通用术语，其包括转录基因沉默和转录后基因沉默。由于与启动子或转录序列相对应的双链RNA(dsRNA)的产生，转录抑制(转录基因沉默；TGS)或mRNA降解(转录后基因沉默；PTGS)可导致未连锁沉默基因座对靶基因座的沉默。每个方法中不同细胞成分的参与表明，dsRNA诱导的TGS和PTGS可能是由古老的共同机制的多样化导致的。但是，很难对TGS和PTGS进行严格比较，因为它通常依赖于不同沉默基因座的分析。在一些情况下，由于产生对应于不同靶基因的启动子和转录序列的dsRNA，单个转基因基因座可触发TGS和PTGS。Mourrain等人(2007)Planta[植物学]225:365-79。siRNA可能是在同源序列上触发TGS和PTGS的实际分子：所述siRNA在此模型中会通过将转基因序列的甲基化扩散到内源性启动子中引发顺式和反式同源序列的沉默和甲基化。
如本文所使用的，术语“核酸分子”(或“核酸”或“多核苷酸”)可以指核苷酸的聚合形式，其可以包括RNA、cDNA、基因组DNA和上述的合成形式和混合聚合物的有义链和反义链。核苷酸可以指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或任何一种核苷酸的修饰形式。如本文所使用的，“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”同义。除非另有说明，否则核酸分子的长度通常至少为10个碱基。所述术语可以指长度不确定的RNA或DNA分子。所述术语包括DNA的单链和双链形式。核酸分子可以包括通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸键连接在一起的天然存在的核苷酸和修饰的核苷酸之一或二者。
如本领域技术人员将容易理解的，核酸分子可以被化学或生物化学修饰，或可以含有非自然或衍生的核苷酸碱基。此类修饰包括例如标记、甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰(例如，不带电荷的键：例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、亚磷酰胺、氨基甲酸酯等；带电荷的键：例如，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等；下垂部分：例如，肽；嵌入剂：例如吖啶、补骨脂素等；螯合剂；烷基化剂；和修改的键：例如，α异头核酸等)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑构象，包括单链、双链、部分双链体、三链体、发夹、环状和挂锁构型。
转录沿着DNA链以5'到3'的方式进行。这意味着RNA是通过在生长链的3′末端顺序添加核糖核苷酸5′-三磷酸(必需消除焦磷酸盐)而制备的。在线性或环状核酸分子中，如果离散元件(例如特定的核苷酸序列)已结合或将在该元件的5′方向结合至另一个元件，则离散元件相对于那个元件可称为“上游”或“5'”。类似地，如果离散元件是或将要从另一个元件在3′方向上与相同的核酸结合，则离散元件相对于那个元件可以是“下游”或“3′”。
如本文所使用的，碱基“位置”是指给定碱基或核苷酸残基在指定核酸内的位置。可以通过与参考核酸比对(参见下文)来定义指定的核酸。
杂交涉及通过氢键结合两个多核苷酸链。寡核苷酸及其类似物通过互补碱基之间的氢键合杂交，包括沃森-克里克(Watson-Crick)、胡斯坦(Hoogsteen)或反向胡斯坦(Hoogsteen)氢键合。通常，核酸分子由含氮碱基组成，所述含氮碱基是嘧啶(胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T))或嘌呤(腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))。这些含氮碱基在嘧啶和嘌呤之间形成氢键，并且嘧啶与嘌呤的键合称为“碱基配对”。更具体地说，A将氢键合至T或U，而G将键合至C。“互补的”是指发生在两个不同的核酸序列或同一核酸序列的两个不同的区域之间的碱基配对。
“特异性可杂交”和“特异性互补”是表示足够程度的互补性的术语，使得在寡核苷酸与DNA或RNA靶标之间发生稳定且特异性的结合。寡核苷酸不必与其靶序列100％互补即可特异性杂交。当寡核苷酸与靶DNA或RNA分子的结合干扰靶DNA或RNA的正常功能时，寡核苷酸可特异性杂交，并且具有足够程度的互补性以避免寡核苷酸与非靶序列在希望特异性结合的条件下(例如在体内测定或系统的情况中在生理条件下)的非特异性结合。这种结合称为特异性杂交。
导致特定严格程度的杂交条件将根据所选择的杂交方法的性质以及杂交核酸序列的组成和长度而变化。通常，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其是Na+和/或Mg2+浓度)将有助于杂交的严格性，尽管洗涤时间也会影响严格性。在Sambrook等人(编辑),Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第2版,第1-3卷,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),冷泉港,纽约,1989,第9和11章中讨论了达到特定严格程度所需的杂交条件的计算。
如本文所使用的，“严格条件”涵盖仅在杂交分子与DNA靶之间的错配小于50％时才发生杂交的条件。“严格条件”包括进一步的严格的特定水平。因此，如本文所使用的，“中严格性”条件是指在所述条件下序列错配率超过50％的分子不会杂交；“高严格性”条件是指在所述条件下错配率超过20％的序列不会杂交；以及“非常高严格性”条件是指在所述条件下错配率超过10％的序列不会杂交。
在特定的实施例中，严格条件可以包括在65℃下杂交，然后在65℃下用0.1x SSC/0.1％SDS洗涤40分钟。
以下是代表性的非限制性的杂交条件：
非常高严格性：在5x SSC缓冲液中在65℃下杂交16小时；在2x SSC缓冲液中在室温下洗涤两次，每次15分钟；并在0.5x SSC缓冲液中在65℃下洗涤两次，每次20分钟。
高严格性：在5x-6x SSC缓冲液中在65℃-70℃下杂交16-20小时；在2x SSC缓冲液中在室温下洗涤两次，每次5-20分钟；并在1x SSC缓冲液中在55℃-70℃下洗涤两次，每次30分钟。
中严格性：在6x SSC缓冲液中在室温至55℃下杂交16-20小时；在2x-3x SSC缓冲液中在室温至55℃下至少洗涤两次，每次20-30分钟。
在特定的实施例中，特异性杂交的核酸分子可以在非常高严格性杂交条件下保持结合。在这些和进一步的实施例中，特异性杂交的核酸分子可以在高严格性杂交条件下保持结合。在这些和进一步的实施例中，特异性杂交的核酸分子可以在中严格性杂交条件下保持结合。
寡核苷酸：寡核苷酸是短核酸聚合物。寡核苷酸可以通过切割更长的核酸片段或通过聚合单个核苷酸前体来形成。自动化合成仪允许合成长度长达数百个碱基对的寡核苷酸。因为寡核苷酸可以结合互补的核苷酸序列，所以它们可以用作检测DNA或RNA的探针。由DNA组成的寡核苷酸(寡脱氧核糖核苷酸)可用于PCR(扩增小DNA序列的技术)。在PCR中，寡核苷酸通常称为“引物”，它允许DNA聚合酶延伸寡核苷酸并复制互补链。
术语“序列同一性百分比”或“同一性百分比”或“同一性”可互换使用，是指基于在两个或更多个氨基酸或核苷酸序列之间进行比较的序列中相应相同位置之间的相同匹配的序列比较。百分比同一性是指两个最佳比对的多核苷酸或肽序列在组分例如核苷酸或氨基酸的比对窗口中不变的程度。本领域已知的杂交实验和数学算法可用于确定百分比同一性。存在许多数学算法作为本领域已知的计算序列百分比同一性的序列比对计算机程序。这些程序可以分为全局序列比对程序或局部序列比对程序。
全局序列比对程序通过端对端比较比对以找到精确匹配，将精确匹配的数目除以较短序列的长度，然后乘以100，计算出两个序列的百分比同一性。基本上，当两个序列最佳比对(具有适当的核苷酸插入、缺失或缺口)时，参考(“查询”)多核苷酸分子的线性多核苷酸序列与测试(“受试者”)多核苷酸分子相比，相同核苷酸的百分比。
本地序列比对程序在计算上相似，但是仅比较序列的比对片段，而不是利用端到端分析。例如BLAST的局部序列比对程序可用于比较两个序列的特定区域。两个序列的BLAST比较会产生E值或期望值，该值表示具有得分等于或优于原始比对得分(S)的不同比对的数量，可能偶然在数据库搜索中发生。E值越低，匹配越显著。因为数据库大小是E值计算中的一个元素，所以对于任何给定的查询/条目匹配，通过BLASTing针对公共数据库(例如GENBANK)获得的E值通常随着时间的推移而增加。在设定多肽功能预测的置信度标准时，“高”BLAST匹配在本文中被认为具有对于最高BLAST命中而言的E值小于1E-30；中等的BLASTX E值为1E-30至1E-8；并且低的BLASTX E值大于1E-8。使用E值、百分比同一性、查询覆盖率和命中覆盖率的组合来确定本发明中的蛋白质功能分配。查询覆盖率是指查询序列以BLAST比对表示的百分比。命中覆盖率是指以BLAST比对方式表示的数据库条目的百分比。在本发明的一个实施例中，从蛋白同源物的功能推断查询多肽的功能，其中(1)hit[命中]_p<1e-30或％identity[同一性]>35％且query[查询]_coverage[覆盖率]>50％且hit[命中]_coverage[覆盖率]>50％，或(2)hit[命中]_p<1e-8且query[查询]_coverage[覆盖率]>70％且hit[命中]_coverage[覆盖率]>70％。在序列的BLAST分析过程中会产生以下缩写。
Figure BDA0002374719260000141
Figure BDA0002374719260000151
用于比较的序列的比对方法是本领域熟知的。描述了多种程序和比对算法。在实施例中，本公开涉及使用Vector NTI套件的AlignX比对程序(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性。AlignX比对程序是针对多核苷酸或蛋白质的全局序列比对程序。在实施例中，本公开涉及使用LASERGENE生物信息学计算设备套件的MegAlign程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(MegAlignTM
Figure BDA0002374719260000152
DNASTAR.麦迪逊，威斯康星州)。MegAlign程序是针对多核苷酸或蛋白质的全局序列比对程序。在实施例中，本公开涉及使用比对程序(包括但不限于ClustalW和ClustalV)的Clustal套件计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Higgins和Sharp(1988)Gene.[基因]12月15日；73(1):237-44；Higgins和Sharp(1989)CABIOS 5:151-3；Higgins等人(1992)Comput.Appl.Biosci.[计算机应用生物技术]8:189-91)。在实施例中，本公开涉及使用程序的GCG套件(威斯康星软件包版本9.0，遗传学计算机组(Genetics Computer Group(GCG))，麦迪逊，威斯康星州)计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性。在实施例中，本公开涉及使用比对程序(包括但不限于BLASTP、BLASTN、BLASTX等)的BLAST套件计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-10)。在实施例中，本公开涉及使用比对程序(包括但不限于FASTA、TFASTX、TFASTY、SSEARCH、LALIGN等)的FASTA套件计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Pearson(1994)Comput.Methods Genome Res.[基因组研究中的计算方法][Proc.Int.Symp.],会议日期1992(Suhai和Sandor编辑),普莱南出版公司(Plenum):纽约市，纽约州,第111-20页)。在实施例中，本公开涉及使用T-Coffee比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Notredame,等人(2000)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]302,205-17)。在实施例中，本公开涉及使用比对程序(包括但不限于DIALIGN、CHAOS、DIALIGN-TX、DIALIGN-T等)的DIALIGN套件计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Al Ait,等人(2013)DIALIGN at GOBICS[在GOBICS的DIALIGN]Nuc.Acids Research[核酸研究]41,W3-W7)。在实施例中，本公开涉及使用比对程序的MUSCLE套件计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Edgar(2004)Nucleic Acids Res.[核酸研究]32(5):1792-1797)。在实施例中，本公开涉及使用MAFFT比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Katoh,等人(2002)Nucleic Acids Research[核酸研究]30(14):3059-3066)。在实施例中，本公开涉及使用Genoogle程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Albrecht,Felipe.arXiv150702987v1[cs.DC]2015年7月10日)。在实施例中，本公开涉及使用程序的HMMER套件计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Eddy.(1998)Bioinformatics[生物信息学],14:755-63)。在实施例中，本公开涉及使用比对程序(包括但不限于TPLASTN、PLASTP、KLAST、和PLASTX)的PLAST套件计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Nguyen和Lavenier.(2009)BMC Bioinformatics,[BMC生物信息学]10:329)。在实施例中，本公开涉及使用USEARCH比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Edgar(2010)Bioinformatics[生物信息学]26(19),2460-61)。在实施例中，本公开涉及使用比对程序的SAM套件计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Hughey和Krogh(1995年1月)Technical Report UCSC0CRL-95-7,[技术报告UCSC0CRL-95-7]University of California,[加利福尼亚大学]圣克鲁兹)。在实施例中，本公开涉及使用IDF检索器计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(O'Kane,K.C.,The Effect of Inverse Document Frequency Weights on Indexed SequenceRetrieval,[反向文档频率权重对索引序列检索的影响]Online Journal ofBioinformatics,[生物信息学在线杂志]第6卷(2)162-173,2005)。在实施例中，本公开涉及使用Parasail比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性。(Daily,Jeff.Parasail:SIMD C library for global,semi-global,and local pairwisesequence alignments.[SIMD C文库用于全局、半全局和局部成对序列比对]BMCBioinformatics.[BMC生物信息学]17:18.2016年2月10日)。在实施例中，本公开涉及使用ScalaBLAST比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Oehmen C,Nieplocha J."ScalaBLAST:A scalable implementation of BLAST for high-performance data-intensive bioinformatics analysis.[ScalaBLAST：BLAST的可扩展实现，用于高性能数据密集型生物信息学分析。]"IEEE Transactions on Parallel&Distributed Systems[IEEE并行和分布式系统事务]17(8):740-749 2006年8月)。在实施例中，本公开涉及使用SWIPE比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Rognes,T.Faster Smilth-Waterman database searches with inter-sequence SIMDparallelization.[通过序列间SIMD并行化，可以更快地进行Smilth-Waterman数据库搜索。]BMC Bioiinformatics.[BMC生物信息学]12,221(2011))。在实施例中，本公开涉及使用ACANA比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Weichun Huang,David M.Umbach,和Leping Li,Accurate anchoring alignment of divergentsequences.[不同序列的精确锚定比对。]Bioinformatics[生物信息学]22:29-34,2006年1月1日)。在实施例中，本公开涉及使用DOTLET比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Junier,T.和Pagni,M.DOTLET:diagonal plots in a web browser.[DOTLET：网络浏览器中的对角线图。]Bioinformatics[生物信息学]16(2):178-9 2000年2月)。在实施例中，本公开涉及使用G-PAS比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Frohmberg,W.,等人。如本文所使用的，术语“可操作地连接到”涉及当第一核酸序列与第二核酸序列具有功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，当启动子影响编码序列的转录或表达时，该启动子可操作地连接到编码序列。当重组产生时，可操作地连接的核酸序列通常是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，它们在同一阅读框中。但是，元件不必连续地可操作地连接。G-PAS 2.0-一种蛋白质比对工具的改进版本，在多个GPU上具有有效的回溯例程。Bulletin of the PolishAcademy of Sciences Technical Sciences,[波兰科学院技术科学通报]第60卷,4912012年11月)。在实施例中，本公开涉及使用GapMis比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Flouri,T.等人,Gap Mis:A tool for pairwise sequencealignment with a single gap.[Gap Mis：一种用于与单间隙成对序列比对工具]RecentPat DNA Gene Seq.[DNA和基因序列的最新专利]7(2):84-952013年8月)。在实施例中，本公开涉及使用比对程序(包括但不限于Matcher、Needle、Stretcher、Water、Wordmatch等)的EMBOSS套件计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Rice,P.,Longden,I.和Bleasby,A.EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite.[EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件]Trends in Genetics[遗传学趋势]16(6)276-77(2000))。在实施例中，本公开涉及使用Ngila比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Cartwright,R.Ngila:global pairwise alignments withlogarithmic and affine gap costs.[全局成对比对具有对数和仿射空位成本]Bioinformatics.[生物信息学]23(11):1427-28.2007年6月1日)。在实施例中，本公开涉及使用probA(也称为propA)比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Mückstein,U.,Hofacker,IL,和Stadler,PF.Stochastic pairwise alignments.[随机成对比对]Bioinformatics[生物信息学]18增刊2:S153-60.2002)。在实施例中，本公开涉及使用比对程序的SEQALN套件计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Hardy,P.和Waterman,M.The Sequence Alignment Software Library at USC.[USC的序列比对软件库]1997)。在实施例中，本公开涉及使用比对程序(包括但不限于GAP、NAP、LAP等)的SIM套件计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Huang,X和Miller,W.ATime-Efficient,Linear-Space Local Similarity Algorithm.[一种省时的线性空间局部相似性算法]Advances in Applied Mathematics,[应用数学进展]第12卷(1991)337-57)。在实施例中，本公开涉及使用UGENE比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Okonechnikov,K.,Golosova,O.和Fursov,M.Unipro UGENE:a unifiedbioinformatics toolkit.[Unipro UGENE：统一的生物信息学工具包。]Bioinformatics.[生物信息学]2012 28:1166-67)。在实施例中，本公开涉及使用BAli-Phy比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Suchard,MA和Redelings,BD.BAli-Phy:simultaneous Bayesian inference of alignment and phylogeny.[BAli-Phy：比对和系统发育的贝叶斯同时推断。]Bioinformatics.[生物信息学]22:2047-48.2006)。在实施例中，本公开涉及使用Base-By-Base比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Brodie,R.,等人Base-By-Base:Single nucleotide-level analysis of wholeviral genome alignments,[Base-By-Base：整个病毒基因组比对的单核苷酸水平分析]BMC Bioinformatics,[BMC生物信息学]5,96,2004)。在实施例中，本公开涉及使用DECIPHER比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(ES Wright(2015)"DECIPHER:harnessing local sequence context to improve protein multiplesequence alignment.[DECIPHER：利用局部序列背景来改善蛋白质多序列比对。]"BMCBioinformatics,[BMC生物信息学]doi:10.1186/s12859-015-0749-z.)。在实施例中，本公开涉及使用FSA比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Bradley,RK,等人(2009)Fast Statistical Alignment.[快速统计比对]PLoS ComputationalBiology.[PLoS计算生物学]5：e1000392)。在实施例中，本公开涉及使用Geneious比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Kearse,M.,等人(2012).GeneiousBasic:an integrated and extendable desktop software platform for theorganization and analysis of sequence data.[Geneious Basic：一个集成且可扩展的桌面软件平台，用于组织和分析序列数据。]Bioinformatics,[生物信息学]28(12),1647-49)。在实施例中，本公开涉及使用Kalign比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Lassmann,T.和Sonnhammer,E.Kalign-an accurate and fast multiplesequence alignment algorithm.[Kalign-一种准确、快速的多序列比对算法。]BMCBioinformatics[BMC生物信息学]2005 6:298)。在实施例中，本公开涉及使用MAVID比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Bray,N.和Pachter,L.MAVID:Constrained Ancestral Alignment of Multiple Sequences.[MAVID：多个序列的约束祖先比对。]Genome Res.[基因组研究]2004年4月；14(4):693-99)。在实施例中，本公开涉及使用MSA比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Lipman,DJ,等人Atool for multiple sequence alignment.[多序列比对的工具。]Proc.Nat’lAcad.Sci.USA.[美国国家科学院学报]1989；86:4412-15)。在实施例中，本公开涉及使用MultAlin比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Corpet,F.,Multiple sequence alignment with hierarchial clustering.[具有系统聚类法的多序列比对。]Nucl.Acids Res.,[核酸研究]1988,16(22),10881-90)。在实施例中，本公开涉及使用LAGAN或MLAGAN比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Brudno,等人LAGAN and Multi-LAGAN:efficient tools for large-scale multiplealignment of genomic DNA.[LAGAN和Multi-LAGAN：用于基因组DNA的大规模多重比对的有效的工具。]Genome Research[基因组研究]2003年4月；13(4):721-31)。在实施例中，本公开涉及使用Opal比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Wheeler,T.J.,和Kececiouglu,J.D.Multiple alignment by aligning alignments.[通过对齐比对方式进行多重对齐。]Proceedings of the 15th ISCB conference onIntelligent Systems for Molecular Biology.[第十五届ISCB分子生物学智能系统会议论文集]Bioinformatics.[生物信息学]23,i559-68,2007)。在实施例中，本公开涉及使用程序的PicXAA套件(包括但不限于PicXAA、PicXAA-R、PicXAA-Web等)计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Mohammad,S.,Sahraeian,E.和Yoon,B.PicXAA:greedyprobabilistic construction of maximum expected accuracy alignment of multiplesequences.[多个序列的最大预期准确性比对的贪婪概率构建。]Nucleic AcidsResearch.[核酸研究]38(15):4917-28.2010)。在实施例中，本公开涉及使用PSAlign比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(SZE,S.-H.,Lu,Y.,和Yang,Q.(2006)A polynomial time solvable formulation of multiple sequence alignment[多序列比对的多项式时间可解公式]Journal of Computational Biology,[计算生物学杂志]13,309-19)。在实施例中，本公开涉及使用StatAlign比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Novák,
Figure BDA0002374719260000211
等人(2008)StatAlign:an extendablesoftware package for joint Bayesian estimation of alignments and evolutionarytrees.[StatAlign：可扩展软件包，用于比对和进化树的联合贝叶斯估计。]Bioinformatics,[生物信息学]24(20):2403-04)。在实施例中，本公开涉及使用Needleman和Wunsch的Gap比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Needleman和Wunsch,Journal of Molecular Biology[分子生物学杂志]48:443-453,1970)。在实施例中，本公开涉及使用Smith和Waterman的BestFit比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Smith和Waterman,Advances in Applied Mathematics,[应用数学进展]2:482-489,1981,Smith等人,Nucleic Acids Research[核酸研究]11:2205-2220,1983)。这些程序产生发散序列的生物学上有意义的多重序列比对。将针对所选序列计算的最佳匹配比对排列起来，以便可以看到同一性、相似性和差异。
术语“相似性”是指氨基酸序列之间的比较，并且不仅考虑对应位置的相同氨基酸，而且考虑对应位置的功能上相似的氨基酸。因此，除了序列相似性之外，多肽序列之间的相似性还指示功能相似性。
术语“同源性”有时用于表示两个或多个核酸或氨基酸序列之间的相似性水平，以位置同一性(即序列相似性或同一性)的百分比表示。同源性也指进化相关性的概念，通常通过共享相似序列的不同核酸或蛋白质之间的相似功能特性来证明。
如本文所使用的，术语“变体”是指基本相似的序列。就核苷酸序列来说，可使用本领域熟知的分子生物学技术来鉴定天然存在的变体，例如，用本文概述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术来鉴定。
对于核苷酸序列，变体包含在天然多核苷酸中的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的取代。如本文所用，“天然”核苷酸序列包括天然存在的核苷酸序列。就核苷酸序列来说，可使用本领域熟知的分子生物学技术来鉴定天然存在的变体，例如，用以下概述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术来鉴定。核苷酸序列变体还包括人工合成的核苷酸序列，比如那些采用定点诱变技术产生的核苷酸序列。通常，如通过本文别处所描述的序列比对程序和参数确定的，本发明的具体核苷酸序列的变体将与该具体的核苷酸具有至少约40％、45％、50％>、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％o、99％或更高的序列同一性。本发明的核苷酸序列的生物活性变体与该序列不同的核酸残基数可能只有1至15个，只有1至10个，例如6至10个，只有5个，只有4、3、2个，或甚至只有1个。
如本文所使用的，术语“可操作地连接到”涉及当第一核酸序列与第二核酸序列具有功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，当启动子影响编码序列的转录或表达时，该启动子可操作地连接到编码序列。当重组产生时，可操作地连接的核酸序列通常是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，它们在同一阅读框中。但是，元件不必连续地可操作地连接。
如本文所使用的，术语“启动子”是指通常位于基因上游(朝向基因的5'区域)的DNA区域，并且是启动和驱动基因转录所需要的。启动子可以允许其控制的基因的适当激活或抑制。启动子可以含有被转录因子识别的特定序列。这些因子可能与启动子DNA序列结合，导致募集RNA聚合酶，RNA聚合酶是一种从基因编码区合成RNA的酶。启动子通常是指位于基因上游的所有基因调节元件，包括上游启动子、5'UTR、内含子和前导序列。
如本文所使用的，术语“上游启动子”是指足以指导转录起始的连续多核苷酸序列。如本文所使用的，上游启动子涵盖具有几个序列基序的转录起始位点，这些序列基序包括TATA Box、启动子序列、TFIIB识别元件和其他启动子基序(Jennifer,Ef等人,(2002)Genes&Dev.[基因和发育],16:2583-2592)。上游启动子为RNA聚合酶II提供了作用位点，RNA聚合酶II是具有基础或一般的转录因子(例如TFIIA、B、D、E、F和H)的多亚基酶。这些因子组装成转录前起始复合物，催化从DNA模板合成RNA。
上游启动子激活是通过多种蛋白质结合并随后与转录起始复合物相互作用以激活基因表达的调节DNA序列元件的附加序列完成的。这些基因调节元件序列与特定DNA结合因子相互作用。这些序列基序有时可称为顺式元件。此类顺式元件，结合至其组织特异性或发育特异性的转录因子单独或组合，可以在转录水平决定启动子的时空表达模式。这些顺式元件对可操作连接的基因施加的控制类型差异很大。一些元件的作用是增加可操作连接的基因的转录响应环境响应(例如，温度、湿度和伤害)。其他顺式元件可能对发育线索(例如，发芽、种子成熟和开花)或空间信息(例如，组织特异性)有反应。参见例如，Langridge等人,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]86:3219-23。这些顺式元件位于距转录起点不同距离的位置，某些顺式元件(称为近端元件)与最小核心启动子区域相邻，而其他元件可位于启动子(增强子)上游或下游几千碱基处。
如本文所使用的，术语“5'非翻译区”或“5'UTR”定义为前mRNA或成熟mRNA的5'末端中的非翻译区段。例如，在成熟的mRNA上，一个5'UTR通常在其5'末端带有一个7-甲基鸟苷帽，并参与许多过程，例如剪接、聚腺苷酸化、mRNA向细胞质的输出，通过翻译机制鉴定mRNA的5'末端，以及保护mRNA免受降解。
如本文所使用的，术语“转录终止子”定义为前mRNA或成熟mRNA的3'末端中的转录区段。例如，超过“聚腺苷酸化信号”位点的更长的一段DNA被转录为前mRNA。该DNA序列通常含有转录终止信号，用于将前mRNA正确加工成成熟的mRNA。
如本文所使用的，术语“3'非翻译区”或“3'UTR”定义为前mRNA或成熟mRNA的3'末端中的非翻译区段。例如，在成熟的mRNA上，该区域带有聚-(A)尾巴，并且已知在mRNA稳定性、翻译起始和mRNA输出中具有许多作用。另外，认为3'UTR包括聚腺苷酸化信号和转录终止子。
如本文所使用的，术语“聚腺苷酸化信号”表示存在于mRNA转录物中的核酸序列，当存在聚-(A)聚合酶时，其允许转录物在聚腺苷酸化位点上被聚腺苷酸化，例如位于聚-(A)信号下游的10至30个碱基。许多聚腺苷酸化信号是本领域已知的，并且可用于本发明。示例性序列包括AAUAAA及其变体，如Loke J.等人，(2005)Plant Physiology[植物生理学]138(3)；1457-1468中所述。
“DNA结合转基因”是编码DNA结合蛋白的多核苷酸编码序列。所述DNA结合蛋白随后能够结合另一个分子。结合蛋白可以与例如DNA分子(DNA结合蛋白)、RNA分子(RNA结合蛋白)和/或蛋白质分子(蛋白质结合蛋白)结合。如果是蛋白质结合蛋白，它可以结合自身(以形成同型二聚体、同型三聚体等)和/或结合不同蛋白质的一个或多个分子。结合蛋白可以具有超过一种类型的结合活性。例如，锌指蛋白具有DNA结合、RNA结合和蛋白质结合活性。
DNA结合蛋白的实例包括；大范围核酸酶、锌指、CRISPR、和TALEN结合结构域可以被“工程化”以结合预定的核苷酸序列。通常，工程化的DNA结合蛋白(例如，锌指、CRISPR或TALEN)是非天然存在的蛋白质。设计和选择用于工程化DNA结合蛋白的方法的非限制性实例。设计的DNA结合蛋白是自然界中不存在的蛋白，其设计/组成主要来自合理的标准。设计的合理标准包括应用替换规则和计算机算法，以处理数据库中存储现有ZFP、CRISPR和/或TALEN设计信息和结合数据的信息。参见，例如美国专利6,140,081；6,453,242；和6,534,261；还参见WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496和美国公开号20110301073、20110239315和20119145940。
“锌指DNA结合蛋白”(或结合结构域)是一种蛋白质，或者是较大蛋白质中的一个结构域，其可以通过一个或多个锌指按序列特异性方式结合DNA，所述锌指是结合结构域内氨基酸序列的区域，其结构通过锌离子的配位而稳定。术语锌指DNA结合蛋白通常缩写为锌指蛋白或ZFP。锌指结合结构域可以被“工程化”以结合预定的核苷酸序列。设计和选择用于工程化锌指蛋白的方法的非限制性实例。设计的锌指蛋白是自然界中不存在的蛋白，其设计/组成主要来自合理的标准。设计的合理标准包括应用替换规则和计算机算法，以处理数据库中存储现有ZFP设计信息和结合数据的信息。参见，例如美国专利号6,140,081；6,453,242；6,534,261和6,794,136；还参见WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496。
在其他实例中，一种或多种核酸酶的DNA结合结构域包含天然存在或工程化的(非天然存在的)TAL效应子DNA结合结构域。参见，例如美国专利公开号20110301073，其通过引用整体并入本文。已知黄单胞菌属(Xanthomonas)的植物致病细菌在重要的作物植物中引起许多疾病。黄单胞菌属的致病性取决于保守的III型分泌(T3S)系统，该系统向植物细胞中注入的蛋白质超过了不同的效应子蛋白。在这些注射的蛋白质中有转录激活子样(TALEN)效应子，它们模仿植物转录激活子并操纵植物转录组(参见Kay等人，(2007)Science[科学]318:648-651)。这些蛋白质含有DNA结合结构域和转录激活结构域。表征最充分的TAL效应子之一是来自疱病野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestgrispv.Vesicatoria)的AvrBs3(参见Bonas等人,(1989)Mol Gen Genet[分子和普通遗传学]218:127-136和WO 2010079430)。TAL效应子含有串联重复的集中结构域，每个重复含有约34个氨基酸，这是这些蛋白质的DNA结合特异性的关键。另外，它们含有核定位序列和酸性转录激活结构域(综述参见Schornack S等人，(2006)J Plant Physiol[植物生理学]163(3):256-272)。此外，在植物病原细菌青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)两个基因，指定brg11和hpx17已经发现与青枯雷尔氏菌生物变体菌株GMI1000和生物变体4菌株RS1000的黄单胞菌属AvrBs3家族同源(参见Heuer等人(2007)Appl and Enviro Micro[应用与环境微生物学]73(13):4379-4384)。这些基因在核苷酸序列上彼此具有98.9％的同一性，但在hpx17的重复结构域中相差1,575bp的缺失。然而，两种基因产物与黄单胞菌属的AvrBs3家族蛋白具有少于40％序列同一性。参见，例如美国专利公开号20110301073，其通过引用整体并入。
这些TAL效应子的特异性取决于在串联重复序列中发现的序列。重复序列包含约102bp，重复序列通常与彼此为91％-100％同源(Bonas等人，同上)。重复序列的多态性通常位于位置12和13，并且似乎有位置12和13上的高变二残基的身份与TAL效应子的靶序列中连续核苷酸的身份之间的一种一一对应关系(参见Moscou和Bogdanove,(2009)Science[科学]326:1501和Boch等人(2009)Science[科学]326:1509-1512)。实验上，这些TAL效应子的DNA识别的自然密码已经确定了使得位置12和13的HD序列导致与胞嘧啶(C)结合，NG与T结合，NI与A、C、G或T结合，NN与A或G结合，而ING与T结合。这些DNA结合重复序列已被组装成具有新的重复序列的组合和数量的蛋白质，以制造能够与新序列相互作用并激活植物细胞中的非内源性报道基因表达的人工转录因子(Boch等人，同上)。工程化的TAL蛋白已与FokI切割半结构域连接，以产生TAL效应子结构域核酸酶融合蛋白(TALEN)，其在酵母报告基因测定(基于质粒的靶标)中具有活性。
CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)/Cas(CRISPR相关的)核酸酶系统是基于细菌系统的一种最近工程化的核酸酶系统，可用于基因组工程。它基于许多细菌和古细菌的适应性免疫反应的一部分。当病毒或质粒入侵细菌时，入侵者的DNA片段会通过“免疫”反应转化为CRISPR RNA(crRNA)。然后，该crRNA通过部分互补区域与另一种称为tracrRNA的RNA结合，以将Cas9核酸酶引导至与靶DNA中与crRNA同源的区域，称为“前间区序列”。Cas9切割DNA以在双链断裂末端(DSB)在由crRNA转录物中含有的20核苷酸指导序列指定的位点处产生平末端。Cas9需要crRNA和tracrRNA才能进行位点特异性DNA识别和切割。现在已经对该系统进行了工程化，以便可以将crRNA和tracrRNA组合至一个分子(“单个指导RNA”)，并且可以对单个指导RNA的crRNA等效部分进行工程化，以指导Cas9核酸酶靶向任何所希望的序列。(参见Jinek等人,(2012)Science[科学]337,第816-821页,Jinek等人,(2013),eLife 2:e00471,和David Segal,(2013)eLife 2:e00563)。在其他实例中，crRNA与tracrRNA结合，以将Cpf1核酸酶引导至与crRNA同源的区域，以切割末端交错的DNA(参见Zetsche，Bernd等人，Cell[细胞]163.3(2015):759-771。)。因此，可以对CRISPR/Cas系统工程化以在基因组中的希望的靶标上产生DSB，并且可以通过使用修复抑制剂来影响DSB的修复，从而导致易于出错的修复增加。
在其他实例中，DNA结合转基因是位点特异性核酸酶，其包含工程化的(非天然存在的)大范围核酸酶(也称为归巢核酸内切酶)。归巢核酸内切酶或大范围核酸酶的识别序列，例如I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII是已知的。还参见美国专利号5,420,032；美国专利号6,833,252；Belfort等人,(1997)Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3379-303388；Dujon等人,(1989)Gene[基因]82:115-118；Perler等人,(1994)Nucleic Acids Res.[核酸研究]22,11127；Jasin(1996)Trends Genet.[遗传学趋势]12:224-228；Gimble等人,(1996)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]263:163-180；Argast等人,(1998)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]280:345-353和新英格兰生物实验室目录。另外，归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的DNA结合特异性可以被工程化以结合非自然靶标位点。参见，例如，Chevalier等人(2002)Molec.Cell[分子细胞]10:895-905；Epinat等人,(2003)Nucleic Acids Res.[核酸研究]531:2952-2962；Ashworth等人,(2006)Nature[自然]441:656-659；Paques等人,(2007)Current Gene Therapy[目前基因疗法]7:49-66；美国专利公开号20070117128。归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的DNA结合结构域可以在整个核酸酶的背景下改变(即，使得核酸酶包括同源切割结构域)，或者可以与异源切割结构域融合。
如本文所使用的，术语“转化”涵盖可以将核酸分子引入这种细胞的所有技术。实例包括但不限于：用病毒载体转染；用质粒载体转化；电穿孔；脂质转染；显微注射(Mueller等人,(1978)Cell[细胞]15:579-85)；农杆菌属介导的转移；直接DNA摄取；WHISKERSTM-介导的转化；和微粒轰击。这些技术可用于植物细胞的稳定转化和瞬时转化。“稳定转化”是指将核酸片段引入宿主生物体的基因组中，导致遗传稳定的遗传。一旦经稳定转化，核酸片段稳定地整合入宿主生物体和任何后代的基因组中。含有经转化的核酸片段的宿主生物体被称为“转基因的”生物体。“瞬时转化”是指将核酸片段引入宿主生物体的细胞核或含DNA的细胞器中，导致不具遗传稳定遗传的基因表达。
外源核酸序列。在一个实例中，转基因是基因序列(例如，除草剂抗性基因)，编码工业上或药学上有用的化合物的基因或编码理想的农业性状的基因。在又另一个实例中，转基因是反义核酸序列，其中反义核酸序列的表达抑制靶核酸序列的表达。转基因可以含有与转基因可操作地连接的调节序列(例如启动子)。在一些实施例中，目的多核苷酸序列是转基因。然而，在其他实施例中，目的多核苷酸序列是内源核酸序列，其中希望的是内源核酸序列的另外的基因组拷贝，或相对于宿主生物体中靶核酸分子的序列处于反义方向的核酸序列。
如本文所使用的，通过以下来产生术语转基因“事件”：用异源DNA转化植物细胞，所述异源DNA为包含目的转基因的核酸构建体；再生由该转基因插入该植物的基因组中所产生的植物群体；并且选择表征为插入特定基因组位置的特定植物。术语“事件”是指包括异源DNA的原始转化体和该转化体的后代。术语“事件”还指由转化体与包括基因组/转基因DNA的另一种变体之间的有性杂交产生的后代。即使在与轮回亲本反复回交后，插入的转基因DNA和来自经转化的亲本的侧翼基因组DNA(基因组/转基因DNA)也存在于杂交的后代中相同的染色体位置。术语“事件”也指来自原始转化体的DNA，其后代包含插入的DNA和与插入的DNA直接相邻的侧翼基因组序列，插入的DNA预期将被转移到接受包括目的转基因的插入的DNA的后代中，得到包括插入的DNA(例如，自交所产生的原始转化子和后代)的亲本系和不含有插入的DNA的亲本系发生性杂交的结果。
如本文所使用的，术语“聚合酶链式反应”或“PCR”定义了一种程序或技术，其中如1987年7月28日授权的美国专利号4,683,195中所述扩增了微量的核酸、RNA和/或DNA。通常，需要从目的区域的末端或以外的区域获得序列信息，以便可以设计寡核苷酸引物；这些引物在序列上与待扩增模板的相反链相同或相似。两个引物的5'末端核苷酸可以与扩增的材料的末端一致。PCR可用于从总的基因组DNA扩增特定的RNA序列、特定的DNA序列，以及从总的细胞RNA、噬菌体或质粒序列转录的cDNA等。一般参见Mullis等人,Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol.[冷泉港定量生物学研讨会],51:263(1987)；Erlich,编辑,PCRTechnology[PCR技术],(Stockton Press[斯托克顿出版社],纽约州,1989)。
如本文所使用的，术语“引物”是指当条件适合于引物延伸产物的合成时能够充当沿着互补链的合成起始点的寡核苷酸。合成条件包括存在四种不同的脱氧核糖核苷酸三磷酸和至少一种聚合诱导剂，例如逆转录酶或DNA聚合酶。它们存在于合适的缓冲液中，其可以包括作为辅因子的成分或在多种合适的温度下影响诸如pH等条件的成分。引物优选地是单链序列，使得扩增效率最优化，但是可以使用双链序列。
如本文所使用的，术语“探针”是指与靶序列杂交的寡核苷酸。在
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或
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样测定过程中，探针与位于两个引物的退火位点之间的靶标的一部分杂交。探针包括约八个核苷酸、约十个核苷酸、约十五个核苷酸、约二十个核苷酸、约三十个核苷酸、约四十个核苷酸或约五十个核苷酸。在一些实施例中，探针包括约八个核苷酸至约十五个核苷酸。探针还可以包括可检测标记，例如荧光团(
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异硫氰酸荧光素等)。可检测标记可以直接共价附接于探针寡核苷酸，例如位于探针的5'末端或探针的3'末端。包括荧光团的探针还可以进一步包括淬灭剂，例如Black Hole QuencherTM，Iowa BlackTM等。
如本文所使用的，术语“限制性内切核酸酶”和“限制酶”是指细菌酶，每种这样的酶在特定核苷酸序列上或附近切割双链DNA。2型限制酶在同一位点识别并切割DNA，包括但不限于XbaI、BamHI、HindIII、EcoRI、XhoI、SalI、KpnI、AvaI、PstI和SmaI。
如本文所使用的，术语“载体”与术语“构建体”、“克隆载体”和“表达载体”可互换使用，并且意指可将DNA或RNA序列(例如外源基因)引入宿主细胞，以转化宿主并促进所引入的序列的表达(例如转录和翻译)的载体。“非病毒载体”旨在意指不包含病毒或逆转录病毒的任何载体。在一些实施例中，“载体”是包含至少一个DNA复制起点和至少一个可选择标记基因的DNA序列。实例包括但不限于将外源DNA带入细胞的质粒、黏粒、噬菌体、细菌人工染色体(BAC)或病毒。载体还可以包括一个或多个基因、反义分子和/或可选择标记基因以及本领域已知的其他遗传元件。载体可以转导、转化或感染细胞，从而使细胞表达由载体编码的核酸分子和/或蛋白质。术语“质粒”定义了能够在原核或真核宿主细胞中常染色体复制的核酸的环状链。该术语包括可以是DNA或RNA并且可以是单链或双链的核酸。该定义的质粒还可以包括对应于细菌复制起点的序列。
如本文所使用的，如本文所使用的术语“可选择标记基因”定义了编码蛋白质的基因或其他表达盒，所述蛋白质有助于鉴定插入了可选择标记基因的细胞。例如，“可选择标记基因”涵盖报道基因以及用于植物转化以例如保护植物细胞免于选择剂或对选择剂提供抗性/耐受性的基因。在一个实施例中，仅那些接受功能可选择标记的细胞或植物能够在具有选择剂的条件下分裂或生长。选择剂的实例可包括例如抗生素，包括大观霉素、新霉素、卡那霉素、巴龙霉素、庆大霉素和潮霉素。这些可选择标记包括表达赋予对卡那霉素具有抗性的酶的新霉素磷酸转移酶(npt II)，以及相关抗生素新霉素、巴龙霉素、庆大霉素和G418的基因，或潮霉素磷酸转移酶(hpt)的基因，其表达赋予对潮霉素抗性的酶。其他可选择标记基因可以包括编码除草剂抗性的基因，包括bar或pat(对草胺磷或草丁膦的抗性)、乙酰乳酸合酶(ALS，对例如磺酰脲类(SU)、咪唑啉酮类(IMI)、三唑并嘧啶类(TP)、嘧啶基氧基苯甲酸酯类(POB)、以及阻止合成支链氨基酸第一步的磺酰氨基羰基三唑啉酮的抑制剂的抗性)、草甘膦、2,4-D和金属的抗性或敏感性。可用作可选择标记基因的“报道基因”的实例包括目视观察表达的报道基因蛋白，例如编码β-葡糖醛酸糖苷酸酶(GUS)、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、DsRed、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、碱性磷酸酶等。短语“标记阳性”是指已经被转化为包括可选择标记基因的植物。
如本文所使用的，术语“可检测标记”是指能够检测的标记，例如放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。可检测标记的实例包括但不限于以下：荧光标记(例如FITC、若丹明、镧系元素荧光粉)、酶标记(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光、生物素基、由二级报告分子识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合域、表位标签)。在实施例中，可检测标记可以通过多种长度的间隔臂附接以减少潜在的空间位阻。
如本文所使用的，术语“盒”、“表达盒”和“基因表达盒”是指可在特定限制位点处或通过同源重组插入核酸或多核苷酸中的DNA片段。如本文所使用的，DNA的片段包含编码目的多肽的多核苷酸，并且盒和限制位点被设计为确保将盒插入适当的阅读框中以进行转录和翻译。在实施例中，表达盒可以包括编码目的多肽的多核苷酸，并且除了促进特定宿主细胞转化的多核苷酸外还具有元件。在实施例中，基因表达盒还可以包括允许在宿主细胞中增强表达编码目的多肽的多核苷酸的元件。这些元件包括但不限于：启动子、最小启动子、增强子、响应元件、终止子序列、聚腺苷酸化序列等。
如本文所使用的，“接头”或“间隔子”是将两个分开的实体彼此结合的键、分子或分子的组。接头和间隔基可以提供两个实体的最佳间隔，或者可以进一步提供允许两个实体彼此分离的不稳定的连接。不稳定键包括光可裂解基团、酸不稳定部分、碱基不稳定部分和酶可裂解基团。如本文所使用的，术语“多接头”或“多个克隆位点”定义了位于核酸序列上彼此10个核苷酸内的三个或更多个2型限制酶位点的簇。在其他情况下，如本文所使用的“多接头”是指通过任何已知的无缝克隆方法(即Gibson
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NEBuilder HiFiDNA
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Golden Gate Assembly、
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Assembly等)靶向连接两个序列的一段核苷酸。包含多接头的构建体用于核酸序列例如基因的编码区的插入和/或切除。
如本文所使用的，术语“对照”是指在分析程序中用于比较目的的样品。对照可以是“阳性”或“阴性”。例如，在分析程序的目的是检测细胞或组织中差异表达的转录物或多肽的情况下，通常优选包括阳性对照(例如来自已知植物的显示所希望表达的样品)和阴性对照(例如来自已知植物的缺少所希望表达的样品)。
如本文所使用的，术语“植物”包括整株植物以及任何后代，细胞、组织或植物的一部分。可用于本发明的植物种类通常包括适合变异发生的高等及低等植物，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物和多细胞藻类。因此，“植物”包括双子叶植物和单子叶植物。术语“植物部位”包括植物的任何部位，包括例如且不限于：种子(包括成熟种子和未成熟种子)；植物切段；植物细胞；植物细胞培养物；植物器官(例如花粉、胚、花朵、果实、枝、叶、根、茎和外植体)。植物组织或植物器官可以是种子、原生质体、愈伤组织或组织成结构或功能单元的任何其他组的植物细胞。植物细胞或组织培养物可能能够再生具有从其获得细胞或组织的植物的生理和形态特征的植物，并且能够再生具有与该植物基本相同的基因型的植物。相反，一些植物细胞不能再生以产生植物。植物细胞或组织培养物中的可再生细胞可以是胚胎、原生质体、分生组织细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、花丝、花、籽粒、耳朵、穗、苞叶或茎秆。
植物部分包括可收获部分和可用于后代植物繁殖的部分。可用于繁殖的植物部分包括例如且不限于：种子；果实；切段；秧苗；块茎；和根茎。植物的可收获部分可以是植物的任何有用的部分，包括例如且不限于：花；花粉；秧苗；块茎；叶；茎；果实；种子；和根。
植物细胞是植物的结构和生理单位，包括原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离的单个细胞或细胞聚集物(例如，易碎的愈伤组织和培养的细胞)的形式，并且可以是更高组织的单元(例如，植物组织、植物器官、和植物)的部分。因此，植物细胞可以是原生质体、产生配子的细胞或可以再生为整株植物的细胞或细胞集合。这样，包含多个植物细胞并且能够再生为完整植物的种子在本文的实施例中被认为是“植物细胞”。
如本文所使用的，术语“小RNA”是指几类非编码核糖核酸(ncRNA)。术语小RNA描述在细菌细胞、动物、植物和真菌中产生的ncRNA的短链。这些ncRNA的短链可以在细胞内自然产生，也可以通过引入表达该短链或ncRNA的外源序列来产生。小RNA序列不直接编码蛋白质，并且在功能上不同于其他RNA，因为小RNA序列仅被转录而不被翻译。小RNA序列参与其他细胞功能，包括基因表达和修饰。小RNA分子通常由约20至30个核苷酸组成。所述小RNA序列可以源自更长的前体。前体形成自我互补区域中彼此折叠的结构；然后由动物中的核酸酶Dicer或植物中的DCL1处理它们。
许多类型的小RNA天然存在或人工产生，包括微RNA(miRNA)、短干扰RNA(siRNA)、反义RNA、短发夹RNA(shRNA)和核仁小RNA(snoRNA)。某些类型的小RNA，例如微RNA和siRNA，在基因沉默和RNA干扰(RNAi)中很重要。基因沉默是遗传调节的过程，其中通常会表达的基因被细胞内元件(在这种情况下为小RNA)“关闭”。由于干扰而不能形成通常由该遗传信息形成的蛋白质，并且该基因中编码的信息被阻止表达。
如本文所使用的，术语“小RNA”涵盖文献中描述为“微小RNA”的RNA分子(Storz,(2002)Science[科学]296:1260-3；Illangasekare等人,(1999)RNA 5:1482-1489)；原核“小RNA”(sRNA)(Wassarman等人,(1999)Trends Microbiol.[微生物学趋势]7:37-45)；真核“非编码RNA(ncRNA)”；“微RNA(miRNA)”；“小非mRNA(snmRNA)”；“功能性RNA(fRNA)”；“转移RNA(tRNA)”；“催化RNA”[例如，核酶，包括自我-酰化核酶(Illangaskare等人,(1999)RNA5:1482-1489)；“核仁小RNA(snoRNA)”、“tmRNA”(又名“10S RNA,”Muto等人,(1998)TrendsBiochem Sci.[生物化学科学趋势]23:25-29；和Gillet等人,(2001)Mol Microbiol.[分子微生物学]42:879-885)；RNAi分子包括但不限于“小干扰RNA(siRNA)”、“内切核糖核酸酶制备的siRNA(e-siRNA)”、“短发夹RNA(shRNA)”和“小时序RNA(stRNA)”，“切粒的siRNA(d-siRNA)”和包含至少一个尿嘧啶碱基的适配子、寡核苷酸和其他合成核酸。
除非具体解释，否则在此所使用的所有技术和科学术语均具有与本披露所属领域普通技术人员所通常理解的相同含义。子生物学中常用术语的定义可以在例如：Lewin,Genes V[基因V],Oxford University Press[牛津大学出版社],1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(编辑),The Encyclopedia of Molecular Biology[分子生物学百科全书],Blackwell Science Ltd.[布莱克威尔科学有限公司],1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Meyers(编辑),Molecular Biology and Biotechnology:A Comprehensive DeskReference,[分子生物学和生物技术：综合办公桌参考]VCH Publishers,Inc.,[VCH出版公司]1995(ISBN 1-56081-569-8)中找到。
如本文所使用的，冠词“一种/一个(a/an)”和“所述(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确且不含糊地指明。
III.柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因调节元件和包含其的核酸
提供了用于使用来自玉蜀黍属(Zea)卵细胞基因的启动子在植物中表达非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞转基因的方法和组合物。在实施例中，启动子可以是SEQ ID NO:1的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子。
在实施例中，提供了包含启动子的多核苷酸，其中所述启动子与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％同一性。在实施例中，启动子是柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子，其包含与SEQ ID NO:1的多核苷酸具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％同一性的多核苷酸。在实施例中，提供了分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:1的多核苷酸至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％同一性。在实施例中，提供了一种核酸载体，所述核酸载体包含SEQ ID NO:1的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子。在实施例中，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子，其可操作地连接到多接头。在实施例中，提供了一种基因表达盒，所述基因表达盒包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子，其可操作地连接到非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞转基因。在实施例中，提供了一种核酸载体，所述核酸载体包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子，其可操作地连接到非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞转基因。在一个实施例中，所述启动子由SEQ ID NO:1组成。在一个说明性实施例中，核酸载体包含与转基因可操作连接的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子，其中所述转基因可以是杀昆虫抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、小RNA转基因、可选择标记转基因或其组合。
在实施例中，核酸载体包含如本文公开的基因表达盒。在实施例中，载体可以是用于直接转化或基因靶向例如供体DNA的质粒、黏粒、细菌人工染色体(BAC)、噬菌体、病毒或切除的多核苷酸片段。
转基因表达也可以由位于启动子序列下游的5'UTR区域调节。启动子和5'UTR均可调节转基因表达。虽然启动子是驱动转录所必需的，但5'UTR的存在可以增加表达水平，从而产生用于翻译和蛋白质合成的mRNA转录物。5'UTR基因区域有助于转基因的稳定表达。在一个进一步的实施例中，5’UTR可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子。在实施例中，5’UTR可以是SEQ ID NO:7的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR。
在实施例中，提供了包含5’UTR的多核苷酸，其中所述5’UTR与SEQ ID NO:7具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％同一性。在实施例中，5’UTR是柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR，其包含与SEQ ID NO:7的多核苷酸具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％同一性的多核苷酸。在实施例中，提供了分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:7的多核苷酸至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％同一性。在实施例中，提供了一种核酸载体，所述核酸载体包含SEQ ID NO:7的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR。在实施例中，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR，其可操作地连接到多接头。在实施例中，提供了一种基因表达盒，所述基因表达盒包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR，其可操作地连接到非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞转基因。在实施例中，提供了一种核酸载体，所述核酸载体包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR，其可操作地连接到非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞转基因。在一个实施例中，所述5’UTR由SEQ ID NO:7组成。在一个说明性实施例中，核酸载体包含与转基因可操作连接的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR，其中所述转基因可以是杀昆虫抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、小RNA转基因、可选择标记转基因或其组合。
转基因表达也可以由位于启动子序列下游的内含子区域调节。启动子和内含子均可调节转基因表达。虽然启动子是驱动转录所必需的，但内含子的存在可以增加表达水平，从而产生用于翻译和蛋白质合成的mRNA转录物。内含子基因区域有助于转基因的稳定表达。在一个进一步的实施例中，内含子可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子。
根据一个实施例，提供了一种核酸载体，所述核酸载体包含重组基因表达盒，其中所述重组基因表达盒包含可操作地连接到多接头序列的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子、非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因或柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞转基因或其组合。在一个实施例中，所述重组基因盒包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子，其可操作地连接到非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因或转基因。在一个实施例中，所述重组基因盒包含如本文公开的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子，其可操作地连接到多接头序列。所述多接头以一种方式可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子，所述方式使得将编码序列插入多接头的限制性位点之一将可操作地连接编码序列，从而当载体被转化或转染到宿主细胞中时允许编码序列的表达。
根据一个实施例，提供了一种核酸载体，其包含基因盒，所述基因盒由柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因组成启动子和非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因组成。在实施例中，SEQ ID NO:1的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子可操作地连接到非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因或转基因的5'末端。在一个进一步的实施例中，所述柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子序列包含SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的序列。根据一个实施例，提供了一种包含基因盒的核酸载体，所述基因盒由柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子、非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因组成，其中所述柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子可操作地连接到非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因的5'末端，且所述柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子序列包含SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的序列。在一个进一步的实施例中，所述柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子序列由SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有80％、85％、90％、95％、或99％序列同一性的1,400bp序列组成。
根据一个实施例，提供了一种核酸载体，所述核酸载体包含重组基因表达盒，其中所述重组基因表达盒包含可操作地连接到多接头序列的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR、非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因或柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞转基因或其组合。在一个实施例中，所述重组基因盒包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR，其可操作地连接到非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因或转基因。在一个实施例中，所述重组基因盒包含如本文公开的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR，其可操作地连接到多接头序列。所述多接头以一种方式可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR，所述方式使得将编码序列插入多接头的限制性位点之一将可操作地连接编码序列，从而当载体被转化或转染到宿主细胞中时允许编码序列的表达。
根据一个实施例，提供了一种核酸载体，其包含基因盒，所述基因盒由柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因组成5’UTR和非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因组成。在实施例中，SEQ ID NO:7的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR可操作地连接到非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因或转基因的5'末端。在一个进一步的实施例中，所述柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR序列包含SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:7具有80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的序列。根据一个实施例，提供了一种包含基因盒的核酸载体，所述基因盒由柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR、非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因组成，其中所述柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR可操作地连接到非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因的5'末端，且所述柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR序列包含SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:7具有80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的序列。在一个进一步的实施例中，所述柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR序列由SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:7具有80％、85％、90％、95％、或99％序列同一性的163bp序列组成。
柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子还可以包含一种或多种另外的序列元件。在一些实施例中，柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子可以包含外显子(例如前导或信号肽，例如叶绿体转运肽或ER保留信号)。例如但不限于，柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子可能编码掺入柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子的外显子作为进一步的实施方案。
进一步提供了用于使用来自玉蜀黍属(Zea)卵细胞基因的3’UTR在植物中终止非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞转基因的方法和组合物。在实施例中，3’UTR终止子可以是SEQ ID NO:2的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR。
在实施例中，提供了包含3’UTR的多核苷酸，其中所述3’UTR与SEQ ID NO:2具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％同一性。在实施例中，3’UTR是柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR，其包含与SEQ ID NO:2的多核苷酸具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％同一性的多核苷酸。在实施例中，提供了分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:2的多核苷酸至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％同一性。在实施例中，提供了一种核酸载体，所述核酸载体包含SEQ ID NO:2的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR。在实施例中，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR，其可操作地连接到多接头。在实施例中，提供了一种基因表达盒，所述基因表达盒包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR，其可操作地连接到非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞转基因。在实施例中，提供了一种核酸载体，所述核酸载体包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR，其可操作地连接到非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞转基因。在一个实施例中，所述3’UTR由SEQ ID NO:2组成。在一个说明性实施例中，核酸载体包含与转基因可操作连接的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR，其中所述转基因可以是杀昆虫抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、小RNA转基因、可选择标记转基因或其组合。
根据一个实施例，提供了一种核酸载体，所述核酸载体包含重组基因表达盒，其中所述重组基因表达盒包含可操作地连接到多接头序列的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR、非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因或柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞转基因或其组合。在一个实施例中，所述重组基因盒包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR，其可操作地连接到非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因或转基因。在一个实施例中，所述重组基因盒包含如本文公开的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR，其可操作地连接到多接头序列。所述多接头以一种方式可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR，所述方式使得将编码序列插入多接头的限制性位点之一将可操作地连接编码序列，从而当载体被转化或转染到宿主细胞中时允许编码序列的表达。
根据一个实施例，提供了一种核酸载体，其包含基因盒，所述基因盒由柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因组成3’UTR和非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因组成。在实施例中，SEQ ID NO:2的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR可操作地连接到非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因或转基因的3'末端。在一个进一步的实施例中，所述柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR序列包含SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的序列。根据一个实施例，提供了一种包含基因盒的核酸载体，所述基因盒由柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR、非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因组成，其中所述柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR可操作地连接到非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因的3'末端，且所述柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR序列包含SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的序列。在一个进一步的实施例中，所述柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR序列由SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有80％、85％、90％、95％、或99％序列同一性的931bp序列组成。
在一个实施例中，提供了一种核酸构建体，所述核酸构建体包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子和非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因以及任选的以下一个或多个元件：
a)5'非翻译区；
b)内含子；和
c)3'非翻译区，
其中，
所述柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子由SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有95％序列同一性的序列组成；
所述柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR由SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:7具有95％序列同一性的序列组成；和
3'非翻译区由已知的3'非翻译区、SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有95％序列同一性的序列组成；进一步地，其中所述的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子与所述转基因可操作地连接，并且每个任选的元件(当存在时)也与启动子和转基因两者可操作地连接。在一个进一步的实施例中，提供了转基因细胞，所述转基因细胞包含以上刚刚公开的核酸构建体。在一个实施例中，所述转基因细胞是植物细胞，在一个进一步的实施例中，提供了植物，其中所述植物包含所述转基因细胞。
根据一个实施例，所述核酸载体进一步包含编码可选择标记的序列。根据一个实施例，所述重组基因盒可操作地连接到农杆菌属T-DNA边界。根据一个实施例，所述重组基因盒进一步包含第一和第二T-DNA边界，其中第一T-DNA边界可操作地连接到基因构建体的一端，而第二T-DNA边界可操作地连接到基因构建体的另一端。第一和第二农杆菌属T-DNA边界可独立地选自源自细菌菌株的T-DNA边界序列，所述细菌菌株选自由以下组成的组：胭脂碱合成的农杆菌属T-DNA边界、章鱼碱合成的农杆菌属T-DNA边界、甘露碱合成的农杆菌属T-DNA边界、农杆碱合成农杆菌属T-DNA边界或其任何组合。在一个实施例中，提供了一种农杆菌属菌株，其选自由以下组成的组：胭脂碱合成菌株、甘露碱合成菌株、农杆碱合成菌株、章鱼碱合成菌株，其中所述菌株包含质粒，其中所述质粒包含可操作地连接到选自SEQID NO:1的序列或与SEQ ID NO:1具有80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。在另一个实施例中，第一和第二农杆菌属T-DNA边界可以独立地选自源自细菌菌株的T-DNA边界序列，所述细菌菌株选自由以下组成的组：胭脂碱合成的农杆菌属T-DNA边界、章鱼碱合成的农杆菌属T-DNA边界、甘露碱合成的农杆菌属T-DNA边界、农杆碱合成农杆菌属T-DNA边界或其任何组合。在实施例中，提供了一种农杆菌属菌株，其选自由以下组成的组：胭脂碱合成菌株、甘露碱合成菌株、农杆碱合成菌株、章鱼碱合成菌株，其中所述菌株包含质粒，其中所述质粒包含可操作地连接到选自SEQ ID NO:7的序列或与SEQ ID NO:7具有80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。在一个实施例中，提供了一种农杆菌属菌株，其选自由以下组成的组：胭脂碱合成菌株、甘露碱合成菌株、农杆碱合成菌株、章鱼碱合成菌株，其中所述菌株包含质粒，其中所述质粒包含可操作地连接到选自SEQ ID NO:2的序列或与SEQ ID NO:2具有80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。
适用于本公开的构建体的目的转基因包括但不限于赋予如下的编码序列：(1)有害生物抗性或疾病抗性、(2)对除草剂的耐受性、(3)添加农学性状的价值，例如；产量提高、氮利用效率、水利用效率和营养品质，(4)蛋白质以位点特异性方式与DNA结合，(5)表达小RNA；以及(6)可选择标记。根据一个实施例，所述转基因编码可选择标记或赋予杀昆虫抗性、除草剂耐受性、小RNA表达、氮利用效率、水利用效率、或营养品质的基因产品。
1.昆虫抗性
多种昆虫抗性基因可以可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子，所述启动子包含SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。另外，昆虫抗性基因可以可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR，所述5’UTR包含SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:7具有80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。同样，昆虫抗性基因可以可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。然后可将可操作地连接的序列掺入选择的载体中以允许鉴定和选择经转化的植物(“转化体”)。示例性昆虫抗性编码序列是本领域已知的。作为可与本公开的调节元件可操作地连接的昆虫抗性编码序列的实施方案，提供以下性状。提供示例性鳞翅目昆虫抗性的编码序列包括：cry1A；cry1A.105；cry1Ab；cry1Ab(截短的)；cry1Ab-Ac(融合蛋白)；cry1Ac(作为
Figure BDA0002374719260000401
销售)；cry1C；cry1F(作为
Figure BDA0002374719260000402
销售)；cry1Fa2；cry2Ab2；cry2Ae；cry9C；mocry1F；pinII(蛋白酶抑制剂蛋白)；vip3A(a)；和vip3Aa20。提供示例性鞘翅目昆虫抗性的编码序列包括：cry34Ab1(作为
Figure BDA0002374719260000403
销售)；cry35Ab1(作为
Figure BDA0002374719260000404
销售)；Cry3A；cry3Bb1；dvsnf7；和mcry3A。提供示例性多昆虫抗性的编码序列包括ecry31.Ab。以上昆虫抗性基因的列表并不意味着具有限制性。本公开涵盖任何昆虫抗性基因。
2.除草剂耐受性
多种除草剂耐受性基因可以可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子，所述启动子包含SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。同样，除草剂耐受性基因可以可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR，所述5’UTR包含SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:7具有80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。同样，除草剂耐受性基因可以可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。然后可将可操作地连接的序列掺入选择的载体中以允许鉴定和选择经转化的植物(“转化体”)。示例性除草剂耐受性编码序列是本领域已知的。作为可与本公开的调节元件可操作地连接的除草剂耐受性编码序列的实施方案，提供以下性状。草甘膦除草剂通过抑制EPSPS酶(5-烯醇式丙酮酸莽草酸酯-3-磷酸合酶)而发挥作用。该酶参与植物的生长和发育必不可少的芳香氨基酸的生物合成。本领域已知的多种酶促机制可用于抑制该酶。可以将编码此类酶的基因可操作地连接到本公开的基因调节元件。在实施例中，可选择标记基因包括但不限于编码草甘膦抗性基因的基因，包括：突变的EPSPS基因，例如2mEPSPS基因、cp4 EPSPS基因、mEPSPS基因、dgt-28基因；aroA基因；和草甘膦降解基因，例如草甘膦乙酰基转移酶基因(gat)和草甘膦氧化酶基因(gox)。这些性状目前作为Gly-TolTM、
Figure BDA0002374719260000411
Figure BDA0002374719260000413
GT和Roundup
Figure BDA0002374719260000412
销售。草铵膦和/或双丙氨磷化合物的抗性基因包括dsm-2、bar和pat基因。bar和pat性状目前作为
Figure BDA0002374719260000414
销售。还包括提供对2,4-D的抗性的耐受性基因，例如aad-1基因(应注意aad-1基因对芳氧基苯氧基丙酸酯除草剂具有进一步的活性)和aad-12基因(应注意aad-12基因对乙酰氧基乙酸酯合成植物生长素具有进一步的活性)。这些性状作为
Figure BDA0002374719260000415
作物保护技术销售。ALS抑制剂(磺酰脲类、咪唑啉酮类、三唑并嘧啶类、嘧啶基硫代苯甲酸酯类、和磺酰基氨基-羰基-三唑啉酮类)的抗性基因是本领域已知的。这些抗性基因最通常是由点突变为ALS编码基因序列引起的。其他的ALS抑制剂抗性基因包括hra基因、csr1-2基因、Sr-HrA基因和surB基因。一些性状以商品名
Figure BDA0002374719260000416
销售。抑制HPPD的除草剂包括吡唑啉酮，如苄草唑，吡草酮和苯吡唑草酮；三酮，例如硝磺草酮、磺草酮、环磺酮、苯并双环酮；和二酮腈，如异噁唑草酮。已知性状可以耐受这些示例性HPPD除草剂可。HPPD抑制剂的实例包括hppdPF_W336基因(用于抗异噁唑草酮)和avhppd-03基因(用于抗甲基磺草酮)。奥昔尼除草剂耐受性状的实例包括bxn基因，该基因已被证明对除草剂/抗生素溴苯腈具有抗性。麦草畏的抗性基因包括麦草畏单加氧酶基因(dmo)，如国际PCT公开号WO 2008/105890中所公开的。PPO或PROTOX抑制剂型除草剂的抗性基因(例如氟锁草醚、氟丙嘧草酯、氟丙草酯、戊基恶唑酮、唑草酮、异丙吡草酯、吡草醚、苯草醚、唑啶草酮、丙炔氟草胺、氟烯草酸、治草醚、乙氧氟草醚、乳氟禾草灵、氟磺胺草醚、乙羧氟草醚、和甲磺草胺)是本领域已知的。赋予对PPO抗性的示例性基因包括野生型拟南芥PPO酶的过表达(Lermontova I和Grimm B,(2000)Overexpression of plastidic protoporphyrinogen IX oxidase leads to resistanceto the diphenyl-ether herbicide acifluorfen.[质体原卟啉原IX氧化酶的过表达导致对二苯醚除草剂氟锁草醚的抗性。]Plant Physiol[植物生理学]122:75-83)、枯草芽孢杆菌PPO基因(Li,X.和Nicholl D.2005.Development of PPO inhibitor-resistantcultures and crops.[抗PPO抑制剂的培养物和农作物的开发]Pest Manag.Sci.[有害生物管理科学]61:277-285以及Choi KW、Han O、Lee HJ、Yun YC、Moon YH、Kim MK、Kuk YI、Han SU和Guh JO,(1998)Generation of resistance to the diphenyl etherherbicide,oxyfluorfen,via expression of the Bacillus subtilisprotoporphyrinogen oxidase gene in transgenic tobacco plants.[通过枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶基因在转基因烟草植物中的表达，产生对二苯醚除草剂抗氧氟芬的抗性。]Biosci Biotechnol Biochem[生物科学、生物技术和生物化学]62:558-560)。吡啶氧基或苯氧基丙酸和环己酮的抗性基因包括编码ACCase抑制剂的基因(例如Acc1-S1、Acc1-S2和Acc1-S3)。赋予对环己二酮和/或芳氧基苯氧基丙酸的抗性的示例性基因包括吡氟氯禾灵、禾草灵、精恶唑禾草灵酸、吡氟禾草灵和喹禾灵。最后，除草剂可以抑制光合作用，包括三嗪或苄腈，通过psbA基因(对三嗪的耐受性)、1s+基因(对三嗪的耐受性)和腈水解酶基因(对苯甲腈的耐受性)提供了耐受性。以上除草剂耐受性基因的列表并不意味着具有限制性。本公开涵盖任何除草剂耐受性基因。
3.农学性状
多种农学性状基因可以可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子，所述启动子包含SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。另外，农学性状基因可以可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR，所述5’UTR包含SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:7具有80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。同样，农学性状基因可以可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。然后可将可操作地连接的序列掺入选择的载体中以允许鉴定和选择经转化的植物(“转化体”)。示例性农学性状编码序列是本领域已知的。作为可与本公开的调节元件可操作地连接的农学性状编码序列的实施方案，提供以下性状。pg基因提供的延迟的果实软化抑制了导致细胞壁中果胶分子分解的聚半乳糖醛酸酶的产生，从而导致了果实的延迟软化。此外，延迟的acc基因果实成熟/衰老抑制了天然acc合酶基因的正常表达，导致乙烯产量减少和果实成熟延迟。而accd基因代谢果实成熟激素乙烯的前体，导致果实成熟延迟。可替代地，sam-k基因通过减少S-腺苷甲硫氨酸(SAM)(乙烯生产的底物)而导致延迟成熟。cspB基因提供的干旱胁迫耐受表型通过保持RNA稳定性和翻译来维持水分胁迫条件下的正常细胞功能。另一个实例包括EcBetA基因，其催化渗透保护剂化合物甘氨酸甜菜碱的产生，赋予了对水分胁迫的耐受性。另外，RmBetA基因催化渗透保护剂化合物甘氨酸甜菜碱的产生，赋予了对水分胁迫的耐受性。bbx32基因提供光合作用和增产，该基因表达一种蛋白质，该蛋白质与一种或多种内源性转录因子相互作用以调节植物的昼/夜生理过程。可以通过表达编码热稳定的α-淀粉酶的amy797E基因来增加乙醇产量，该酶可以通过增加用于降解淀粉的淀粉酶的热稳定性来增强生物乙醇的产量。最后，修饰的氨基酸组合物可以通过编码二氢二吡啶甲酸合酶的cordapA基因的表达而产生，该酶增加了氨基酸赖氨酸的产生。农学性状编码序列的列表并不意指是限制性的。本公开涵盖任何农学性状编码序列。
4.DNA结合蛋白质
多种DNA结合转基因基因可以可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子，所述启动子包含SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。另外，DNA结合转基因基因可以可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR，所述5’UTR包含SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:7具有80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。同样，DNA结合转基因基因可以可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO:2或与SEQ IDNO:2具有80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。然后可将可操作地连接的序列掺入选择的载体中以允许鉴定和选择经转化的植物(“转化体”)。示例性DNA结合蛋白质编码序列是本领域已知的。作为可与本公开的调节元件有效连接的DNA结合蛋白编码序列的实施例，以下类型的DNA结合蛋白可包括：锌指、TALEN、CRISPR和大范围核酸酶。DNA结合蛋白质编码序列的列表并不意指是限制性的。本公开涵盖任何DNA结合蛋白质编码序列。
5.小RNA
多种小RNA序列可以可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子，所述启动子包含SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。同样，小RNA序列可以可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。然后可将可操作地连接的序列掺入选择的载体中以允许鉴定和选择经转化的植物(“转化体”)。示例性小RNA性状是本领域已知的。作为可与本公开的调节元件可操作地连接的小RNA编码序列的实施方案，提供以下性状。例如，通过沉默编码乙烯形成酶的ACO基因的表达，抑制了乙烯的产生，抗efe小RNA的延迟果实成熟/衰老延迟了成熟。通过抑制内源性S-腺苷-L-蛋氨酸，改变了ccomt小RNA的木质素产生，从而降低了胍基(G)木质素的含量：反式咖啡酰氧基CoA 3-O-甲基转移酶(CCOMT基因)。此外，可通过Ppo5小RNA减少疣状茄(Solanum verrucosum)中缺乏B的斑点瘀伤耐受性，这会触发Ppo5转录物的降解，从而阻止黑点瘀伤的发展。还包括dvsnf7小RNA，其dsRNA包含西方玉米根虫(Western CornRootworm)Snf7基因的240bp片段，可抑制西方玉米根虫。修饰的淀粉/碳水化合物可以由小RNA产生，例如pPhL小RNA(降解PhL转录物以限制通过淀粉降解形成还原糖)和pR1小RNA(降解R1转录物以限制通过淀粉降解形成还原糖)。另外，好处还包括asn1小RNA引起的丙烯酰胺含量降低，从而触发Asn1降解从而损害天冬酰胺的形成并降低了聚丙烯酰胺含量。最后，pgas ppo抑制小RNA的非褐色表型导致抑制PPO以产生具有非褐色表型的苹果。以上小RNA的列表并不意指是限制性的。本公开涵盖任何小RNA编码序列。
6.可选择标记
多种可选择标记(也称为报告基因)可以可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子，所述启动子包含SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。另外，可选择标记(也称为报告基因)可以可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR，所述5’UTR包含SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:7具有80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。同样，可选择标记(也称为报告基因)可以可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR，所述3’UTR包含SEQ IDNO:2或与SEQ ID NO:2具有80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。然后可将可操作地连接的序列掺入选择的载体中以允许鉴定和选择经转化的植物(“转化体”)。有许多方法可用于确认可选择标记在转化植物中的表达，包括例如DNA测序和PCR(聚合酶链反应)、DNA印迹、RNA印迹、用于检测从载体表达的蛋白质的免疫学方法。但是，通常通过目测观察蛋白质时观察到的报告基因，这些蛋白质在表达时会产生有色产物。示例性的报告基因是本领域已知的，并编码β-葡萄糖醛酸苷酶(GUS)、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP、Phi-YFP)、红色荧光蛋白(DsRFP、RFP等)、β-半乳糖苷酶等(参见Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第三版,冷泉港出版社,纽约,2001，其内容通过引用整体并入本文)。
利用可选择标记基因来选择经转化的细胞或组织。可选择标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)、壮观霉素/链霉素抗性(AAD)和潮霉素磷酸转移酶(HPT或HGR)的基因，以及赋予对除草化合物抗性的基因。除草剂抗性基因通常编码对除草剂不敏感的修饰目标蛋白，或编码在其起作用之前能降解植物中的除草剂或使其解毒的酶。例如，已经通过使用编码突变目标酶5-烯醇式丙酮酸莽草酸酯-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因获得了对草甘膦的抗性。EPSPS的基因和突变体是众所周知的，并在下面进一步描述。通过使用编码PAT或DSM-2、腈水解酶、AAD-1或AAD-12的细菌基因分别获得了对草铵膦、溴苯腈和2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性这些都是使各自除草剂去毒的蛋白质的实例。
在实施例中，除草剂可抑制生长点或分生组织，包括咪唑啉酮或磺酰脲，并且对这些除草剂具有乙酰羟酸合酶(AHAS)和乙酰乳酸合酶(ALS)的抗性/耐受性的基因是众所周知的。草甘膦抗性基因包括突变型5-烯醇式丙酮酸莽草酸酯-3-磷酸合酶(EPSPs)和dgt-28基因(通过引入重组核酸和/或对天然EPSPs基因进行多种体内诱变)、aroA基因和草甘膦乙酰基转移酶(GAT)基因。其他膦酰基化合物的抗性基因包括来自链霉菌种的bar和pat基因，包括吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)和Streptomyces viridichromogenes，以及吡啶氧基或苯氧基丙酸和环己酮(编码ACCase抑制剂的基因)。赋予对环己二酮和/或芳氧基苯氧基丙酸的抗性的示例性基因(包括吡氟氯禾灵、禾草灵、精恶唑禾草灵酸、吡氟禾草灵和喹禾灵)包括乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的基因；Acc1-S1、Acc1-S2和Acc1-S3。在实施例中，除草剂可以抑制光合作用，包括三嗪(psbA和1s+基因)或苄腈(硝化酶基因)。此外，此类可选择标记可以包括阳性选择标记，例如磷酸甘露糖异构酶(PMI)酶。
在实施例中，可选择标记基因包括但不限于编码如下的基因：2,4-D；新霉素磷酸转移酶II；氰酰胺水合酶；天冬氨酸激酶；二氢吡啶二羧酸合成酶；色氨酸脱羧酶；二氢吡啶二羧酸合成酶和脱敏天冬氨酸激酶；bar基因；色氨酸脱羧酶；新霉素磷酸转移酶(NEO)；潮霉素磷酸转移酶(HPT或HYG)；二氢叶酸还原酶(DHFR)；草丁膦乙酰转移酶；2,2-二氯丙酸脱卤素酶；乙酰羟酸合成酶；5-烯醇式丙酮酸-莽草酸酯-磷酸合酶(aroA)；卤代芳基腈水解酶；乙酰辅酶A羧化酶；二氢蝶呤合酶(sul I)；和32kD光系统II多肽(psbA)。一个实施例还包括可选择标记基因，其编码对以下的抗性：氯霉素；甲氨蝶呤；潮霉素；壮观霉素；溴草腈；草甘膦；和草丁膦。以上可选择标记基因的列表并不意味着具有限制性。本公开涵盖任何报告基因或可选择标记基因。
在一些实施例中，合成编码序列以在植物中最佳表达。例如，在实施例中，已经通过密码子优化修饰了基因的编码序列以增强在植物中的表达。可以优化杀昆虫抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因或可选择标记转基因，以在特定植物物种中表达，或可替代地可以修饰上述转基因以在双子叶植物或单子叶植物中最佳表达。植物偏好性密码子可以从特定目的植物物种中以最大量表达的蛋白质中频率最高的密码子确定。在实施例中，编码序列、基因或转基因被设计成在植物中以更高的水平表达，从而导致更高的转化效率。植物基因优化的方法是众所周知的。关于合成DNA序列的优化和产生的指导可以在例如WO 2013016546、WO2011146524、WO 1997013402、美国专利号6166302和美国专利号5380831中找到，其通过引用并入本文。
转化
合适的植物转化方法包括可以将DNA导入细胞的任何方法，例如且不限于：电穿孔(参见，例如，美国专利5,384,253)；微粒轰击(参见，例如，美国专利5,015,580、5,550,318、5,538,880、6,160,208、6,399,861、和6,403,865)；农杆菌属介导的转化(参见，例如，美国专利5,635,055、5,824,877、5,591,616；5,981,840、和6,384,301)；和原生质体转化(参见，例如，美国专利5,508,184)。
可以使用诸如用碳化硅纤维搅拌的技术将DNA构建体直接引入植物细胞的基因组DNA中(参见，例如，美国专利5,302,523和5,464,765)，或者可以使用基因枪方法将DNA构建体直接引入植物组织中，诸如DNA颗粒轰击(参见，例如，Klein等人(1987)Nature[植物]327:70-73)。可替代地，可以通过纳米颗粒转化将DNA构建体引入植物细胞中(参见，例如，美国专利公开号20090104700，通过引用将其全部内容并入本文)。
另外，可以使用非农杆菌属细菌或病毒如根瘤菌属物种(Rhizobium sp.)NGR234、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizoboium meliloti)、中慢生型百脉根根瘤菌(Mesorhizobiumloti)、马铃薯病毒X、花椰菜花叶病毒和木薯叶脉花叶病毒和/或烟草花叶病毒来实现基因转移，参见，例如Chung等人(2006)Trends Plant Sci.[植物科学趋势]11(1):1-4。
通过应用转化技术，几乎任何植物种类的细胞都可以稳定地转化，并且可以通过众所周知的技术将这些细胞发育成转基因植物。例如，在美国专利号5,846,797、5,159,135、5,004,863和6,624,344在棉花转化中可能特别有用的技术；例如在美国专利5,750,871中特别描述了用于转化芸苔属植物的技术；例如在美国专利6,384,301中描述了用于转化大豆的技术；例如，在美国专利7,060,876和5,591,616以及国际PCT公开WO 95/06722中描述了用于转化玉蜀黍的技术。
在实现外源核酸向受体细胞的递送后，通常鉴定经转化的细胞用于进一步培养和植物再生。为了提高鉴定转化体的能力，人们可能希望将可选择标记基因与用于产生转化体的转化载体一起使用。在说明性的实施例中，可以通过将细胞暴露于一种或多种选择剂来测定经转化的细胞群，或者可以针对所希望的标记基因性状筛选细胞。
可以在暴露于选择剂的条件下存活的细胞，或在筛选测定中被评分为阳性的细胞，培养在支持植物再生的培养基中。在实施例中，可以通过包括其他物质例如生长调节剂来修饰任何合适的植物组织培养基。可以将组织用生长调节剂维持在基本培养基上，直到有足够的组织可用于开始植物再生努力，或者经过反复的手动选择回合，直到组织的形态适合于再生(例如，至少2周)，然后转移到有利于芽形成的培养基上。定期转移培养物，直到形成足够的芽。芽形成后，将其转移到有助于根形成的培养基中。一旦形成足够的根，就可以将植物转移到土壤中以进一步生长和成熟。
分子确认
可以通过选择或筛选工程化植物材料中存在于转化DNA上的标记基因编码的性状来鉴定和分离经转化的植物细胞、愈伤组织、组织或植物。例如，可以通过在含有抑制量的抗生素或除草剂的培养基上使工程化的植物材料生长来进行选择，所述转化基因构建体赋予其抗性。此外，还可以通过筛选可能存在于重组核酸构建体上任何可见标记基因(例如，β-葡萄糖醛酸酶、萤光素酶或绿色荧光蛋白基因)的活性来鉴定经转化的植物和植物细胞。这种选择和筛选方法是本领域技术人员众所周知的。可用于鉴定转基因植物的分子确认方法是本领域技术人员已知的。下面进一步描述几种示例性方法。
已经描述了分子信标用于序列检测。简而言之，设计了一种FRET寡核苷酸探针，该探针与侧翼基因组和插入DNA连接重叠。FRET探针的独特结构导致它含有一个二级结构，该二级结构使荧光和猝灭部分保持紧密相邻。FRET探针和PCR引物(插入DNA序列中的一个引物和侧翼基因组序列中的一个引物)在热稳定的聚合酶和dNTP存在下循环。成功进行PCR扩增后，一种或多种FRET探针与靶序列的杂交导致探针二级结构的去除以及荧光和淬灭部分的空间分离。荧光信号表明由于成功的扩增和杂交，存在侧翼基因组/转基因插入序列。用于检测扩增反应的这种分子信标测定法是本公开的一个实施例。
水解探针测定法，或者称为
Figure BDA0002374719260000492
(生命技术公司(Life Technologies)，福斯特城，加利福尼亚州)，是检测和定量DNA序列的存在的方法。简而言之，设计了一种FRET寡核苷酸探针，在转基因中有一个寡核苷酸，在侧翼基因组序列中有一个寡核苷酸，用于事件特异性检测。FRET探针和PCR引物(插入DNA序列中的一个引物和侧翼基因组序列中的一个引物)在热稳定的聚合酶和dNTP存在下循环。FRET探针的杂交导致荧光部分的裂解和释放，使其远离FRET探针上的淬灭部分。荧光信号表明由于成功的扩增和杂交，侧翼/转基因插入序列的存在。用于检测扩增反应的这种水解探针测定是本公开的实施例。
Figure BDA0002374719260000493
测定是一种检测和定量DNA序列存在的方法。简单地说，包含集成的基因表达盒的多核苷酸的基因组DNA样品，使用聚合酶链式反应(PCR)为基础的测定(被称为
Figure BDA0002374719260000494
测定系统)筛选。在本公开的实践中使用的
Figure BDA0002374719260000495
测定可以利用其中包含多个引物的
Figure BDA0002374719260000496
PCR测定混合物。PCR测定混合物中使用的引物可包含至少一种正向引物和至少一种反向引物。正向引物含有对应于DNA多核苷酸的特定区域的序列，而反向引物含有对应于基因组序列的特定区域的序列。此外，在PCR测定混合物中使用的引物可以包含至少一种正向引物和至少一种反向引物。例如，
Figure BDA0002374719260000497
PCR测定混合物可使用对应于两个不同的等位基因和一个反向引物的两种正向引物。正向引物之一含有对应于内源基因组序列的特定区域的序列。第二正向引物含有对应于DNA多核苷酸的特定区域的序列。反向引物含有对应于基因组序列的特定区域的序列。用于检测扩增反应的这种
Figure BDA0002374719260000498
测定法是本公开的一个实施例。
在一些实施例中，荧光信号或荧光染料选自下组，该组由以下组成：HEX荧光染料、FAM荧光染料、JOE荧光染料、TET荧光染料、Cy 3荧光染料、Cy 3.5荧光染料、Cy 5荧光染料、Cy 5.5荧光染料、Cy 7荧光染料、和ROX荧光染料。
在其他实施例中，使用合适的第二荧光DNA染料进行扩增反应，所述第二荧光DNA染料能够以流式细胞术可检测的浓度范围染色细胞DNA，并且具有可被实时热循环仪检测的荧光发射光谱。本领域普通技术人员应该理解，其他核酸染料是已知的并且正在不断被鉴定。可以使用具有合适的激发和发射光谱的任何合适的核酸染料，例如
Figure BDA0002374719260000491
SYTOX
Figure BDA0002374719260000501
SYBR Green
Figure BDA0002374719260000502
Figure BDA0002374719260000503
和
Figure BDA0002374719260000504
在一个实施例中，第二荧光DNA染料是以小于10μM、小于4μM或小于2.7μM使用的
Figure BDA0002374719260000505
在进一步的实施例中，下一代测序(NGS)可以用于检测。如Brautigma等人2010所述，DNA序列分析可用于确定分离和扩增片段的核苷酸序列。可将扩增的片段分离并亚克隆到载体中，并使用链终止子方法(也称为Sanger测序)或染料终止子测序进行测序。另外，扩增子可以用下一代测序进行测序。NGS技术不需要亚克隆步骤，并且可以在单个反应中完成多个测序读取。可商购获得三个NGS平台，来自454生命科学公司(Life Sciences)/罗氏公司(Roche)的基因组测序仪FLXTM，来自Solexa的Illumina Genome AnalyserTM和应用生物系统公司(Applied Biosystems)的SOLiDTM(缩写：“通过寡核苷酸连接和检测进行测序”)。另外，目前正在开发两种单分子测序方法。这些包括来自Helicos BioscienceTM的真正的单分子测序(tSMS)和来自太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences)的Single MoleculeReal TimeTM测序(SMRT)。
由454生命科学公司(Life Sciences)/罗氏公司(Roche)销售的基因组测序仪FLXTM是长读NGS，它使用乳液PCR和焦磷酸测序来生成测序读段。可以使用300-800bp的DNA片段或含有3-20kb的文库。该反应每次运行可产生超过一百万个约250至400个碱基的读段，总产量为250至400兆碱基。与其他NGS技术相比，该技术可产生最长的读段，但每次运行的总序列输出较低。
SolexaTM销售的Illumina Genome AnalyserTM是短读NGS，其使用荧光染料标记的可逆终止子核苷酸通过合成方法并基于固相桥式PCR测序。可以使用含有最多10kb DNA片段的配对末端测序文库的构建。反应产生超过1亿个短读段，长度为35-76个碱基。每次运行可产生3到6个千兆字节的数据。
Applied BiosystemsTM销售的寡核苷酸连接和检测测序(SOLiD)系统是一种短读段技术。这种NGS技术使用的片段双链DNA最长10kb。该系统通过连接染料标记的寡核苷酸引物和乳液PCR进行测序，以产生10亿个短读段，每次运行的总序列输出高达30个千兆位。
Helicos BioscienceTM的tSMS和Pacific BiosciencesTM的SMRT采用了不同的方法，其使用单个DNA分子进行序列反应。tSMS HelicosTM系统可产生多达8亿个短读段，每次运行可产生21个千兆字节。这些反应使用荧光染料标记的虚拟终止子核苷酸完成，所述核苷酸被称为“合成测序”方法。
Pacific BiosciencesTM销售的SMRT下一代测序系统使用合成实时测序。由于不受可逆终止子的限制，该技术可以产生高达1000bp的读段长度。每天使用该技术可以产生相当于二倍体人类基因组覆盖率一倍的原始读段吞吐量。
在另一个实施例中，可以使用印迹测定法完成检测，包括蛋白质印迹、RNA印迹和DNA印迹。此类印迹测定法是生物学研究中用于鉴定和定量生物样品的常用技术。这些测定包括首先通过电泳分离凝胶中的样品成分，然后将电泳分离的成分从凝胶中转移至由硝化纤维、聚偏二氟乙烯(PVDF)或尼龙等材料制成的转移膜上。也可以通过施加真空、毛细作用或压力将分析物直接点样在这些载体上，或直接定向到载体上的特定区域，而无需事先分离。然后通常对转移膜进行转移后处理，以增强被分析物彼此区分的能力并通过视觉或自动读取器进行检测。
在一个进一步的实施例中，可以使用ELISA测定法完成检测，所述ELISA测定法使用固相酶免疫测定法来检测液体样品或湿样品中物质的存在，通常是抗原的存在。来自样品的抗原附接到板的表面。然后，将另一种特异性抗体涂在表面上，使其可以与抗原结合。该抗体与酶连接，在最后一步中，添加了含有酶底物的物质。随后的反应产生可检测的信号，最常见的是底物的颜色变化。
转基因植物
在实施例中，植物、植物组织或植物细胞包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子。在一个实施例中，植物、植物组织或植物细胞包含如下序列的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子，所述序列选自SEQ ID NO:1的序列或与选自SEQ IDNO:1的序列具有80％、85％、90％、95％或99.5％序列同一性的序列。在实施例中，植物、植物组织或植物细胞包含基因表达盒，所述基因表达盒包含选自SEQ ID NO:1的序列或与选自SEQ ID NO:1的序列具有80％、85％、90％、95％或99.5％序列同一性的序列，所述序列可操作地连接到非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因。在一个说明性实施例中，植物、植物组织、或植物细胞包含基因表达盒，所述基因表达盒包含与转基因可操作连接的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子，其中所述转基因可以是杀昆虫抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、可选择标记转基因或其组合。
根据一个实施例，提供了一种植物、植物组织或植物细胞，其中所述植物、植物组织或植物细胞包含可操作地连接到转基因的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子衍生的序列，其中所述柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子衍生的序列包含序列SEQID NO:1或与SEQ ID NO:1具有80％、85％、90％、95％或99.5％序列同一性的序列。在一个实施例中，提供了一种植物、植物组织或植物细胞，其中所述植物、植物组织或植物细胞包含SEQ ID NO:1、或与SEQ ID NO:1具有80％、85％、90％、95％或99.5％序列同一性的序列，所述序列可操作地连接到非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因。在一个实施例中，所述植物、植物组织或植物细胞是双子叶或单子叶植物或衍生自双子叶或单子叶植物的细胞或组织。在一个实施例中，所述植物选自下组，该组由以下组成：玉蜀黍、小麦、稻、高粱、燕麦、黑麦、香蕉、甘蔗、大豆、棉花、向日葵和低芥酸菜籽。在一个实施例中，所述植物是玉蜀黍。根据一个实施例，所述植物、植物组织或植物细胞包含SEQ ID NO:1、或与SEQ ID NO:1具有80％、85％、90％、95％或99.5％序列同一性的序列，所述序列可操作地连接到非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因。在一个实施例中，所述植物、植物组织或植物细胞包含可操作地连接到转基因的启动子，其中所述启动子由SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有80％、85％、90％、95％或99.5％序列同一性的序列组成。根据一个实施例，所述基因构建体包含可操作地连接到转基因的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子序列，所述启动子序列被掺入植物、植物组织或植物细胞的基因组中。
在实施例中，植物、植物组织或植物细胞包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR。在一个实施例中，植物、植物组织或植物细胞包含如下序列的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR，所述序列选自SEQ ID NO:7的序列或与选自SEQ IDNO:7的序列具有80％、85％、90％、95％或99.5％序列同一性的序列。在实施例中，植物、植物组织或植物细胞包含基因表达盒，所述基因表达盒包含选自SEQ ID NO:7的序列或与选自SEQ ID NO:7的序列具有80％、85％、90％、95％或99.5％序列同一性的序列，所述序列可操作地连接到非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因。在一个说明性实施例中，植物、植物组织、或植物细胞包含基因表达盒，所述基因表达盒包含与转基因可操作连接的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR，其中所述转基因可以是杀昆虫抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、可选择标记转基因或其组合。
根据一个实施例，提供了一种植物、植物组织或植物细胞，其中所述植物、植物组织或植物细胞包含可操作地连接到转基因的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR衍生的序列，其中所述柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR衍生的序列包含序列SEQ IDNO:7或与SEQ ID NO:7具有80％、85％、90％、95％或99.5％序列同一性的序列。在一个实施例中，提供了一种植物、植物组织或植物细胞，其中所述植物、植物组织或植物细胞包含SEQID NO:7、或与SEQ ID NO:7具有80％、85％、90％、95％或99.5％序列同一性的序列，所述序列可操作地连接到非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因。在一个实施例中，所述植物、植物组织或植物细胞是双子叶或单子叶植物或衍生自双子叶或单子叶植物的细胞或组织。在一个实施例中，所述植物选自下组，该组由以下组成：玉蜀黍、小麦、稻、高粱、燕麦、黑麦、香蕉、甘蔗、大豆、棉花、向日葵和低芥酸菜籽。在一个实施例中，所述植物是玉蜀黍。根据一个实施例，所述植物、植物组织或植物细胞包含SEQ ID NO:7、或与SEQ ID NO:7具有80％、85％、90％、95％或99.5％序列同一性的序列，所述序列可操作地连接到非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因。在一个实施例中，所述植物、植物组织或植物细胞包含可操作地连接到转基因的5’UTR，其中所述5’UTR由SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:7具有80％、85％、90％、95％或99.5％序列同一性的序列组成。根据一个实施例，将包含可操作地连接到转基因的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR序列的基因构建体掺入植物、植物组织或植物细胞的基因组中。
在实施例中，植物、植物组织或植物细胞包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR。在一个实施例中，植物、植物组织或植物细胞包含如下序列的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR，所述序列选自SEQ ID NO:2的序列或与选自SEQ IDNO:2的序列具有80％、85％、90％、95％或99.5％序列同一性的序列。在实施例中，植物、植物组织或植物细胞包含基因表达盒，所述基因表达盒包含选自SEQ ID NO:2的序列或与选自SEQ ID NO:2的序列具有80％、85％、90％、95％或99.5％序列同一性的序列，所述序列可操作地连接到非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因。在一个说明性实施例中，植物、植物组织、或植物细胞包含基因表达盒，所述基因表达盒包含与转基因可操作连接的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR，其中所述转基因可以是杀昆虫抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、可选择标记转基因或其组合。
根据一个实施例，提供了一种植物、植物组织或植物细胞，其中所述植物、植物组织或植物细胞包含可操作地连接到转基因的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR衍生的序列，其中所述柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR衍生的序列包含序列SEQ IDNO:2或与SEQ ID NO:2具有80％、85％、90％、95％或99.5％序列同一性的序列。在一个实施例中，提供了一种植物、植物组织或植物细胞，其中所述植物、植物组织或植物细胞包含SEQID NO:2、或与SEQ ID NO:2具有80％、85％、90％、95％或99.5％序列同一性的序列，所述序列可操作地连接到非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因。在一个实施例中，所述植物、植物组织或植物细胞是双子叶或单子叶植物或衍生自双子叶或单子叶植物的细胞或组织。在一个实施例中，所述植物选自下组，该组由以下组成：玉蜀黍、小麦、稻、高粱、燕麦、黑麦、香蕉、甘蔗、大豆、棉花、向日葵和低芥酸菜籽。在一个实施例中，所述植物是玉蜀黍。根据一个实施例，所述植物、植物组织或植物细胞包含SEQ ID NO:2、或与SEQ ID NO:2具有80％、85％、90％、95％或99.5％序列同一性的序列，所述序列可操作地连接到非柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因。在一个实施例中，所述植物、植物组织或植物细胞包含可操作地连接到转基因的3’UTR，其中所述3’UTR由SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有80％、85％、90％、95％或99.5％序列同一性的序列组成。根据一个实施例，将包含可操作地连接到转基因的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR序列的基因构建体掺入植物、植物组织或植物细胞的基因组中。
在实施例中，根据本文公开的方法的植物、植物组织或植物细胞可以是双子叶植物。双子叶植物、植物组织或植物细胞可以是但不限于苜蓿、油菜籽、低芥酸菜籽、印度芥菜、埃塞俄比亚芥菜、大豆、向日葵、棉花、豆类、西兰花、卷心菜、花椰菜、芹菜、黄瓜、茄子、生菜；瓜、豌豆、胡椒、花生、马铃薯、南瓜、萝卜、菠菜、甜菜、向日葵、烟草、番茄和西瓜。
本领域技术人员将认识到，在将外源序列稳定地掺入转基因植物中并确认是可操作的之后，可以通过有性杂交将其引入其他植物中。可以使用许多标准育种技术中的任何一种，这取决于要杂交的物种。
本公开还涵盖上述转基因植物的种子，其中所述种子具有含有本公开内容的基因调节元件的转基因或基因构建体。本公开进一步涵盖上述转基因植物的后代、克隆、细胞系或细胞，其中所述后代、克隆、细胞系或细胞具有含有本公开的基因调节元件的转基因或基因构建体。
本公开还涵盖上述转基因植物的培养，其中所述转基因植物具有含有本公开的基因调节元件的转基因或基因构建体。因此，此类转基因植物可被工程化以尤其具有一个或多个所希望的性状或含有本公开的基因调节元件的转基因事件，通过与根据本发明的核酸分子被转化，并且可以通过本领域技术人员已知的任何方法被裁剪或培养。
表达转基因的方法
在实施例中，在植物中表达至少一个转基因的方法，所述方法包括使包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子的植物生长，所述启动子可操作地连接到至少一个转基因或多接头序列。在实施例中，所述柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子由选自SEQ ID NO:1的序列或与选自SEQ ID NO:1的序列具有80％、85％、90％、95％或99.5％序列同一性的序列组成。在实施例中，在植物中表达至少一个转基因的方法，所述方法包括使包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因基因启动子的植物生长，所述启动子可操作地连接到至少一个转基因或多接头序列。在实施例中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法，所述方法包括培养包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子的植物组织或植物细胞，所述启动子可操作地连接到至少一个转基因。
在实施例中，在植物中表达至少一个转基因的方法，所述方法包括使包含基因表达盒(其包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子)的植物生长，所述启动子可操作地连接到至少一个转基因。在一个实施例中，所述柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子由选自SEQ ID NO:1的序列或与选自SEQ ID NO:1的序列具有80％、85％、90％、95％或99.5％序列同一性的序列组成。在实施例中，在植物中表达至少一个转基因的方法，所述方法包括使包含基因表达盒(其包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子)的植物生长，所述启动子可操作地连接到至少一个转基因。在实施例中，在植物中表达至少一个转基因的方法，所述方法包括使包含基因表达盒(其包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子)的植物生长，所述启动子可操作地连接到至少一个转基因。在实施例中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法，所述方法包括培养包含基因表达盒(其含有柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子)的植物组织或植物细胞，所述启动子可操作地连接到至少一个转基因。在实施例中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法，所述方法包括培养包含基因表达盒(柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子)的植物组织或植物细胞，所述启动子可操作地连接到至少一个转基因。
在实施例中，在植物中表达至少一个转基因的方法，所述方法包括使包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR的植物生长，所述启动子可操作地连接到至少一个转基因或多接头序列。在实施例中，所述柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR由选自SEQID NO:7的序列或与选自SEQ ID NO:7的序列具有80％、85％、90％、95％或99.5％序列同一性的序列组成。在实施例中，在植物中表达至少一个转基因的方法，所述方法包括使包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因基因5’UTR的植物生长，所述启动子可操作地连接到至少一个转基因或多接头序列。在实施例中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法，所述方法包括培养包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR的植物组织或植物细胞，所述启动子可操作地连接到至少一个转基因。
在实施例中，在植物中表达至少一个转基因的方法，所述方法包括使包含基因表达盒(其包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR)的植物生长，所述启动子可操作地连接到至少一个转基因。在一个实施例中，所述柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR由选自SEQ ID NO:7的序列或与选自SEQ ID NO:7的序列具有80％、85％、90％、95％或99.5％序列同一性的序列组成。在实施例中，在植物中表达至少一个转基因的方法，所述方法包括使包含基因表达盒(其包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR)的植物生长，所述启动子可操作地连接到至少一个转基因。在实施例中，在植物中表达至少一个转基因的方法，所述方法包括使包含基因表达盒(其包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR)的植物生长，所述启动子可操作地连接到至少一个转基因。在实施例中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法，所述方法包括培养包含基因表达盒(其含有柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR)的植物组织或植物细胞，所述启动子可操作地连接到至少一个转基因。在实施例中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法，所述方法包括培养包含基因表达盒(柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因5’UTR)的植物组织或植物细胞，所述启动子可操作地连接到至少一个转基因。
在实施例中，在植物中表达至少一个转基因的方法，所述方法包括使包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR的植物生长，所述启动子可操作地连接到至少一个转基因或多接头序列。在实施例中，所述柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR由选自SEQID NO:2的序列或与选自SEQ ID NO:2的序列具有80％、85％、90％、95％或99.5％序列同一性的序列组成。在实施例中，在植物中表达至少一个转基因的方法，所述方法包括使包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因基因3’UTR的植物生长，所述启动子可操作地连接到至少一个转基因或多接头序列。在实施例中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法，所述方法包括培养包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR的植物组织或植物细胞，所述启动子可操作地连接到至少一个转基因。
在实施例中，在植物中表达至少一个转基因的方法，所述方法包括使包含基因表达盒(其包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR)的植物生长，所述启动子可操作地连接到至少一个转基因。在一个实施例中，所述柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR由选自SEQ ID NO:2的序列或与选自SEQ ID NO:2的序列具有80％、85％、90％、95％或99.5％序列同一性的序列组成。在实施例中，在植物中表达至少一个转基因的方法，所述方法包括使包含基因表达盒(其包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR)的植物生长，所述启动子可操作地连接到至少一个转基因。在实施例中，在植物中表达至少一个转基因的方法，所述方法包括使包含基因表达盒(其包含柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR)的植物生长，所述启动子可操作地连接到至少一个转基因。在实施例中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法，所述方法包括培养包含基因表达盒(其含有柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR)的植物组织或植物细胞，所述启动子可操作地连接到至少一个转基因。在实施例中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法，所述方法包括培养包含基因表达盒(柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3’UTR)的植物组织或植物细胞，所述启动子可操作地连接到至少一个转基因。
提供以下实例以说明某些特定特征和/或实施例。这些实例不应被解释为将本公开限制为示例的特定特征或实施例。
实例
实例1：来自柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因优化调节元件组合的新颖设计
来自柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因(SEQ ID NO:1)的启动子和来自柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因(SEQ ID NO:2)的3’UTR是从柳枝稷基因组DNA(gDNA)序列中鉴定的。这些调节元件序列通过BLASTing the Phytozome数据库(Goodstein DM,Shu S,Howson R,Neupane R,Hayes RD,Fazo J,Mitros T,Dirks W,Hellsten U,Putnam N,Rokhsar DS(2012)Nucleic Acids Res.[核酸研究]40:D1178-1186)用拟南芥卵细胞基因DD45/EC1.2(Genbank登录号At2g21740)鉴定。分析所得命中，并选择单个编码序列用于进一步分析。为了鉴定新颖启动子区域，在翻译起始位点(ATG密码子)的上游检索了1至3kb的核苷酸，并进行了另外的计算机模拟分析。为了鉴定新颖3'UTR区，在终止位点的下游检索了0.5至2kb的核苷酸，并进行了另外的计算机模拟分析。计算机模拟分析包括根据需要从其他周围基因中鉴定出多核苷酸序列，检查是否存在可能导致基因表达沉默的重复序列，或者是否存在可能含有非编码外显子和内含子的5'UTR。基于这些分析，合成了柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞启动子序列，并将其向前移动以进一步用于驱动转基因表达。从对跨越数百万个碱基对的连续染色体序列的评估中，鉴定并分离出1,400bp的多核苷酸序列(SEQ ID NO:1)，用于表达异源编码序列。分析了该新颖多核苷酸序列，用作驱动基因表达的调节序列，并提供在SEQ ID NO:3的碱基对1-1,400中。同样，从对跨越数百万个碱基对的连续染色体序列的评估中，鉴定并分离出163bp的多核苷酸序列(SEQ ID NO:7)，用于终止异源编码序列。分析了该新颖多核苷酸序列，用作驱动基因表达的作为5’UTR的调节序列，并提供在SEQ ID NO:3的碱基对1,401-1,563中。最后，从对跨越数百万个碱基对的连续染色体序列的评估中，鉴定并分离出931bp的多核苷酸序列(SEQ ID NO:2)，用于终止异源编码序列。分析了该新颖多核苷酸序列，用作中止基因表达的调节序列，并提供在SEQ ID NO:3的碱基对2,126-3,056中。
实例2：载体构建(pDAB129557)
构建pDAB129557载体以掺入侧接转基因的调节多核苷酸序列的新颖组合。所述载体构建体pDAB129557含有一个基因表达盒，其中PhiYFP转基因由SEQ ID NO:1的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞启动子驱动，且含有SEQ ID NO:7的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞5’UTR的侧翼是SEQ ID NO:2的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞3’UTR。该基因表达盒的序列表提供为SEQ ID NO:4。所述载体还含有一个可选择标记基因表达盒，所述表达盒含有aad-1转基因(美国专利号7,838,733)，所述转基因由稻(Oryza sativa)Actin1启动子驱动(美国专利号5,641,876)，并被玉蜀黍脂肪酶3'UTR终止(美国专利号7,179,902)。该基因表达盒的序列表提供为SEQ ID NO:5。该构建体是通过合成新设计的启动子和来自柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因的3'UTR，并使用第三方提供者将启动子克隆到GeneArtSeamless CloningTM(生命技术公司(Life Technologies))进入载体中而构建的。产生的进入载体被标记为pDAB129546，其含有柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子，驱动PhiYFP转基因，该转基因用于玉蜀黍组织的粒子轰击。获得了进入载体pDAB129546的克隆，并分离了质粒DNA，并通过限制酶消化和测序证实。此外，使用GatewayTM克隆系统(生命技术公司)将pDAB129546进入载体整合到目的载体中。获得所得二元质粒pDAB129557的克隆，并分离质粒DNA，并通过限制酶消化和测序确认。所得的构建体含有驱动转基因表达并终止转基因表达的调节元件的组合。
实例3：玉蜀黍转化
通过粒子轰击转化玉蜀黍
通过分离的未成熟胚的粒子轰击转化将实验性pDAB129546构建体转化为玉蜀黍栽培品种(c.v.)B104。例如，从八穗中随机分离出玉蜀黍栽培品种(c.v.)B104未成熟胚，胚大小平均为1.8-2.4mm。将未成熟胚收集在感染培养基和置于强光下渗透裂解(osmolysis)培养基，用50um的光子通量，在27℃的温度下孵育过夜。分离后的第二天，将每块板36个未成熟的胚排列在靶圈内，并用于粒子轰击(PB)。每个构建体使用三块板，其中一个具有大小在2.2-2.4之间的未成熟胚，而两个具有大小在1.8-2.2mm之间的未成熟胚。使用CaCl2/亚精胺沉淀法，用5μl DNA(1.0μg/μl原液)包被金粒子。用于轰击的参数为：1.0微米金粒子，1100psi爆破片，27英寸真空汞柱和6cm轰击距离。
轰击完成后，将板放入一个透明的盒子中，并恢复到如上所述的相同培养条件。72小时后收获未成熟的胚，用于表达YFP蛋白的显微图像分析。使用配备Leica Planapo 2.0x物镜的Leica M165 FC荧光立体显微镜和Leica DFC310 FX 1.4百万像素相机进行图像分析。
轰击的未成熟胚中YFP表达的图像分析表明，新颖柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因启动子和柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因3'UTR成功与未经转化的未成熟胚(其不导致玉米中YFP蛋白的表达)相比驱动了玉米中的YFP表达。
实例4：可操作地连接到在作物中的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞调节因子的基因的表达谱
SEQ ID NO:1的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞启动子调节元件，其含有SEQ IDNO:7的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞5’UTR和SEQ ID NO:2的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞3’UTR调节元件，如pDAB129546中提供的，导致在玉蜀黍未成熟胚中YFP转基因表达。因此，鉴定并表征新颖的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因调节元件(SEQ ID NO:1的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞启动子、SEQ ID NO:7的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞5’UTR和SEQ ID NO:2的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞3’UTR)。首次公开了用于基因表达构建体的新颖启动子调节元件。
实例5：水解探针(qPCR)转基因拷贝数分析
多种类型的分子分析被用来筛选低拷贝、简单事件。使用QIAGEN MagAttractTM试剂盒，使用THERMO FISHER KingFisherTM磁性颗粒处理器和供应商推荐的方案提取DNA。使用针对phiyfp和aad1基因的特定水解探针测定法进行整合的转基因拷贝数分析。另外，通过对二元载体主链上携带的壮观霉素(Spec)抗性基因特异的水解探针测定法检测到由于二元载体质粒主链的无意整合造成的污染。已开发出用于内源玉米基因转化酶(Invertase)(GenBankTM登录号U16123)和Cullin(GenBankTM登录号XM_008664750)的水解探针测定法作为内部参考标准。表1列出了水解探针测定组分的寡核苷酸序列(引物和BHQ探针由集成DNA技术公司(INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES)，科勒尔维尔，艾奥瓦州合成，MGB探针由应用生物系统公司(APPLIED BIOSYSTEMS)，格兰德岛，纽约州合成)。根据表2建立约10ng DNA的双链水解探针PCR反应，并在表3列出了测定条件。
为了进行扩增，在10μL体积的多重反应物(含有0.1％的PVP、0.4μM的每种引物、和0.2μM的每种探针)中以1X最终浓度制备Fast AdvancedTMMaster混合物(生命技术公司(Life Technologies)，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州)。FAM(6-羧基荧光素酰胺)荧光部分在465nm处激发，并在510nm处测量荧光；用于HEX(六氯荧光素)的荧光部分对应的值分别为533nm和580nm，以及用于
Figure BDA0002374719260000611
的值分别为538nm和554nm。使用罗氏分子(Roche)的
Figure BDA0002374719260000612
实时PCR系统根据生产商的建议分析每个反应中产生的荧光的水平。通过将未知样品的靶标/参考基因值的
Figure BDA0002374719260000613
输出与已知拷贝数标准的靶标/参考基因值进行比较来确定转基因拷贝数(1-Copy代表半合子植物，2-Copy代表纯合子植物)。
CP得分，即，在该荧光信号越过使用拟合点算法(
Figure BDA0002374719260000614
软件释放1.5)的背景阈值的分数，并且使用相对定量模块(基于ΔΔCT方法)进行实时PCR数据的分析。
表1：用于目的基因拷贝数和相对表达检测的正向和反向核苷酸引物和荧光探针(由应用生物系统公司(Applied Biosystems)合成)的列表。
Figure BDA0002374719260000621
表2：用于DNA拷贝数分析的PCR混合物。
Figure BDA0002374719260000622
表3：用于水解探针PCR扩增的热循环仪条件。
Figure BDA0002374719260000631
实例6：相对转录(RNA)分析
水解探针PCR用于检测phiyfp转录物的相对水平。收集含有未受精卵细胞的幼穗组织样品。用KingFisher总RNA试剂盒(赛默科技公司(Thermo Scientific)，目录号97020196)提取RNA。使用随机引物(TVN寡核苷酸-SEQ ID NO:20:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN)，在20μL反应液(含有2.5单位/μl的MultiScribe逆转录酶、200nM的TVN寡核苷酸和4mM的dNTP)中，用高容量cDNA合成试剂盒(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，目录号：4368814)从约500ng RNA制备cDNA。在25℃下10分钟开始该反应进行预孵育，然后在37℃下120分钟进行合成，并在85℃下5分钟进行灭活。
然后将新合成的cDNA用于扩增。qPCR的设置、运行条件和信号捕获与DNA拷贝数分析相同，只是使用Cullin作为玉米的参考基因。使用相对于Cullin水平的2-ΔΔCt计算目的基因表达数据。
实例7：显微分析未受精玉米胚珠中卵细胞特异性启动子表达模式
含有卵细胞特异性启动子构建体pDAB129557的T0玉米转基因植物在温室中生长。野生型植物在同一温室中生长。从出丝到丝长度为7cm阶段的不同发育阶段期间，将植物去雄，收获幼穗。从幼穗上除去周围的苞叶，并切成6-8个籽粒的切片。用氰基丙烯酸酯胶将这些切片籽粒面朝上附接到样品台上，并在Leica VT1200 vibratome上以250微米厚切片。将这些切片安装在一滴水中在载玻片上，并在Leica DM5000立式复合显微镜上进行检查，并使用YFP滤光镜套件用Leica DFC T7000数码相机捕获图像。
转基因系pDAB129559的籽粒切片显示了胚囊中表达YFP的细胞/组织。但是，从非转基因对照植物获得的籽粒的胚囊中未观察到YFP荧光。
SEQ ID NO:1的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞启动子调节元件，其含有SEQ IDNO:7的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞5’UTR和SEQ ID NO:2的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞3’UTR调节元件，如pDAB129559中提供的，导致在玉蜀黍未成熟胚中YFP转基因表达。因此，鉴定并表征新颖的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因调节元件(SEQ ID NO:1的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞启动子、SEQ ID NO:7的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞5’UTR和SEQ ID NO:2的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞3’UTR)。首次公开了用于基因表达构建体的新颖启动子调节元件。
实例8：显微和转录丰度分析受精玉米胚珠中卵细胞特异性启动子表达模式
含有卵细胞特异性启动子构建体pDAB129557的T0玉米转基因植物在温室中生长。野生型植物在同一温室中生长。使用非转基因玉米植物的花粉将植物去雄，并对穗交叉授粉。授粉后4天收获受精的穗。从幼穗上除去周围的苞叶，并切成6-8个籽粒的切片。用氰基丙烯酸酯胶将这些切片籽粒面朝上附接到样品台上，并在Leica VT1200 vibratomeTM上以250微米厚切片。将这些切片安装在一滴水中在载玻片上，并在Leica DM5000TM立式复合显微镜上进行检查，并使用YFP滤光镜套件用Leica DFC T7000TM数码相机捕获图像。
从转基因系pDAB129557拍摄的受精胚珠在胚胎/胚囊中显示出表达YFP的细胞/组织。
对含有从pDAB129557转基因植物获得的未受精胚的籽粒的转录本分析显示YFP转录本，而从非转基因对照植物未检测到转录物。
SEQ ID NO:1的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞启动子调节元件，其含有SEQ IDNO:7的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞5’UTR和SEQ ID NO:2的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞3’UTR调节元件，如pDAB129557中提供的，导致在玉蜀黍未成熟胚中YFP转基因表达。因此，鉴定并表征新颖的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因调节元件(SEQ ID NO:1的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞启动子、SEQ ID NO:7的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞5’UTR和SEQ ID NO:2的柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞3’UTR)。首次公开了用于基因表达构建体的新颖启动子调节元件。
实例9：农杆菌属介导的可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞启动子、柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞5’UTR和/或柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞3’UTR的基因转化
大豆可以用可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞启动子、柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞5’UTR和/或柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞3’UTR的基因通过利用与先前在专利申请WO 2007/053482的实例#11或实例#13中描述的相同的技术转化。
棉花可以用可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞启动子、柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞5’UTR和/或柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞3’UTR的基因通过利用与先前在美国专利号7,838,733的实例#14或专利申请WO 2007/053482(Wright等人)的实例#12中描述的相同的技术转化。
低芥酸菜籽可以用可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞启动子、柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞5’UTR和/或柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞3’UTR的基因通过利用与先前在美国专利号7,838,733的实例#26或专利申请WO 2007/053482(Wright等人)的实例#22中描述的相同的技术转化。
小麦可以用可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞启动子、柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞5’UTR和/或柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞3’UTR的基因通过利用与先前在专利申请WO 2013/116700A1(Lira等人)的实例#23中描述的相同的技术转化。
稻可以用可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞启动子、柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞5’UTR和/或柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞3’UTR的基因通过利用与先前在专利申请WO 2013/116700 A1(Lira等人)的实例#19中描述的相同的技术转化。
实例10：农杆菌属介导的可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞调节元件的基因的转化
根据本公开，可以使用本领域已知的技术根据本公开的实施例转化另外的作物。对于农杆菌属介导的黑麦转化，参见例如Popelka JC,Xu J,Altpeter F.,“Generation ofrye with low transgene copy number after biolistic gene transfer andproduction of(Secale cereale L.)plants instantly marker-free transgenic rye,”[“在进行基因枪基因转移后产生具有低转基因拷贝数的黑麦，并立即产生无标记的转基因黑麦(黑麦(Secale cereale L.))植物。”]Transgenic Res.[转基因研究]2003年10月；12(5):587-96.)。对于农杆菌属介导的高粱转化，参见例如，Zhao等人,“Agrobacterium-mediated sorghum transformation,”[“农杆菌属介导的高粱转化”]Plant Mol Biol.[植物分子生物学]2000年12月；44(6):789-98。对于农杆菌属介导的大麦转化，参见例如，Tingay等人,“Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformation,”[根癌农杆菌属(Agrobacterium tumefaciens)介导的大麦转化]The Plant Journal[植物杂志],(1997)11:1369-1376。对于农杆菌属介导的小麦转化，参见例如，Cheng等人,“GeneticTransformation of Wheat Mediated by Agrobacterium tumefaciens,”[通过根癌农杆菌属介导的小麦基因转化]Plant Physiol.[植物生理学]1997年11月；115(3):971-980。对于农杆菌属介导的稻转化，参见例如，Hiei等人,“Transformation of rice mediated byAgrobacterium tumefaciens,”[通过根癌农杆菌属介导的稻转化]Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]1997年9月；35(1-2):205-18。
这些植物和其他植物的拉丁文名称如下。应当清楚的是，可以使用其他(非农杆菌属)转化技术将可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞启动子或柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞5’UTR的基因转化至例如这些植物和其他植物中。实例包括但不限于：玉米(玉蜀黍)、小麦(小麦属物种(Triticum spp.))、稻(稻属物种(Oryza spp.)和菰属物种(Zizania spp.))、大麦(大麦属物种(Hordeum spp.))、棉花(水麻(Abroma augusta)和棉属物种(Gossypium spp.))、大豆(Soybean)(大豆(Glycine max))、糖和甜菜(甜菜属物种(Beta spp.))、甘蔗(砂糖椰子(Arenga pinnata))、番茄(Tomato)(番茄(Lycopersicon esculentum))及其他物种、粘果酸浆(Physalis ixocarpa)、黄水茄(Solanum incanum)及其他物种、和树番茄(Cyphomandra betacea))、马铃薯(Potato)(马铃薯(Solanum tuberosum))、甘薯(Sweet potato)(甘薯(Ipomoea batatas))、黑麦(黑麦属物种(Secale spp.))、辣椒(Peppers)(辣椒(Capsicum annuum)、中华辣椒(chinense)、和小米辣(frutescens))、莴苣(Lettuce)(莴苣(Lactuca sativa)、山莴菊(perennis)、和野莴苣(pulchella))、卷心菜(芸苔属物种(Brassica spp.))、芹菜(旱芹(Apiumgraveolens))、茄子(Eggplant)(茄子(Solanum melongena))、花生(落花生(Arachishypogea))、高粱(高粱属物种(Sorghum spp.))、苜蓿(紫花苜蓿(Medicago sativa))、胡萝卜(野胡萝卜(Daucus carota))、豆类(菜豆属物种(Phaseolus spp.)、及其他属)、燕麦(Oats)(燕麦(Avena sativa)和糙伏毛燕麦(strigosa))、豌豆(豌豆属(Pisum)、豇豆属(Vigna)、和翅荚豌豆属(Tetragonolobus)物种)、向日葵(Sunflower)(向日葵(Helianthusannuus))、南瓜(南瓜属物种(Cucurbita spp.))、黄瓜(Cucumber)(黄瓜(Cucumissativa))、烟草(烟草属物种(Nicotiana spp.))、拟南芥属(拟南芥(Arabidopsisthaliana))、草坪草(黑麦草属(Lolium)、翦股颖属(Agrostis)、早熟禾属(Poa)、狗芽根属(Cynodon)、及其他属)、三叶草(三叶草属(Trifolium))、野豌豆(野豌豆属(Vicia))。例如，在本公开的实施例中考虑了用可操作地连接到柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞基因的3'UTR的基因来转化此类植物。
可以在许多落叶植物和常绿植物的用材物种中部署使用柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞启动子、柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞5’UTR和/或柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞3’UTR以驱动可操作地连接的基因。此类应用也在本公开的实施例的范围内。这些物种包括但不限于：桤木(桤木属物种(Alnus spp.))、白蜡(白蜡属物种(Fraxinus spp.))、山杨和白杨物种(杨属物种(Populus spp.))、山毛榉(山毛榉属物种(Fagus spp.))、桦木(桦木属物种(Betula spp.))、樱桃树(李属物种(Prunus spp.))、桉树(桉属物种(Eucalyptusspp.))、山核桃木(山核桃属物种(Carya spp.))、槭树(槭属物种(Acer spp.))、栎树(栎属物种(Quercus spp.))、和松树(松属物种(Pinus spp.))。
可以在观赏植物和结果植物物种中部署使用柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞启动子、柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞5’UTR和/或柳枝稷(Pavir.Cb02009)卵细胞3’UTR以驱动可操作地连接的基因。此类应用也在本公开的实施例的范围内。实例包括但不限于：玫瑰(蔷薇属物种(Rosa spp.))、紫果卫矛(卫矛属物种(Euonymus spp.))、矮牵牛(茄科物种Petunia spp.))、秋海棠(秋海棠属物种(Begonia spp.))、杜鹃(杜鹃花属物种(Rhododendron spp.))、红果或苹果(苹果属物种(Malus spp.))、梨(梨属物种(Pyrusspp.))、桃(李属物种(Prunus spp.))、和万寿菊(万寿菊属物种(Tagetes spp.))。
尽管上面已经讨论了许多示例性方面和实施例，但是本领域技术人员将认识到某些修改、置换、添加和其亚组合。因此，旨在将以下所附权利要求和此后引入的权利要求解释为包括所有此类修改、置换、添加和亚组合，如在其真实精神和范围内。
序列表
<110> 陶氏益农有限公司（Dow AgroSciences LLC）
Kumar, Sandeep
Barone, Pierluigi
Hemingway, Daren
Etchison, Emily
Asberry, Andrew
Pence, Heather
Bowling, Andrew
<120> 用于转基因表达的植物启动子
<130> 79402-US-PSP
<160> 7
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 1400
<212> DNA
<213> 柳枝稷
<400> 1
cctttatgta ttgtgaattg cctcatgact ctgttttaca tcaggacctt gtcagactag 60
ttggcaacag tgtataaatg aaagcagcag tgtgcaggtg acttctaata ttgaagtgct 120
caatcaaaat catgaggaag gcaaccaaaa tagtgaaggc caaattactc ctattcgaag 180
cattgtgtct gaagatgcag atactgaaag atcagaaagg gaaataggtc tgacccctcc 240
tgcaggaccg tcagcattgc cggatgagca gcttaacacg aaggtggagt gccacgaagc 300
tgaacgcaac tgttgctatg atgaggacac ttcgagctta tttgatactg aatcgctgta 360
cagcaaagca tccagtttgc acgaagacac tcgtaaggat acttctccaa gtgatctatc 420
tgctccgaga tctcccgagg aatctacagt ttttctgaac tcttctgttc cgggatcagt 480
aggtatcatt gctgattctg attttgttca cgttgctctg acataatgtc ttgttcaatc 540
ttttattgta gtatctgtga gagcctcctg actacatctt tcattttgct ttttcattag 600
gaatctgtcg aagcagcagg agaagaggta tagacgaact ccgcgccaag ctgcagagtt 660
tcaaagtctc cagcactgta aaaggaagct acattgctat gagtgcccct cgcccgaagc 720
aaggtgacaa tctgagccaa tctgcaatcg cgttgctccg gaacagcgag aacgcacctg 780
ctgttaaagt aggccatcct ggcaagccgg accctgatct tccggtcgac aagcgctgca 840
gcccatcagt ggaagatcaa gggatcactg ataggcagta gggcgtacgc cgtagtttat 900
tattgtggac agttagcgtt tgtgctcaac attagttggt ggtggtggtg ttcaaccttt 960
ggctgaaggt tattaggtgt gcatctgacc ggaaactatc cgtgtgtttg cgcagcgtgt 1020
agtgacgaag ctgctctgtg catttgttat tagcagttaa catattgtgg gtgtggtggc 1080
cgtggtggaa atgttaagca actggcagcc gtacagttgg ttaattggtt atgcaggcgt 1140
ttggttttgg cttttttgta atcctgttat cgtgaacaga tccgttgtgc cccgtgctgt 1200
tattcgtaca cgtgctcact tgtttaatct cttgcaatgg cttacccatg tactgggtcc 1260
agaagacagg cgaggagcat ggctattcgg aacagaagag ccgcaggtcg tttggcgttc 1320
catgagcaga cactgcagtg agtggatagc aatcaatagc gatgctcttt ggccttccat 1380
gaaacgcacg cactcatgta 1400
<210> 2
<211> 931
<212> DNA
<213> 柳枝稷
<400> 2
cccgtgtcgg ggcccaataa gcttataagc ttcgcttttg tttctacacg atgcacgttt 60
tgctagagta gagcttgatg ctgaatggtt cagccaataa aatcgactca gtgtactcgt 120
ggcccgtttc tctgaatctt ccattttaat ttacagcacc agcccacgca agacgatttg 180
ggccaagccc ttccaattta tgcgaggaga actcagccct tggacaccaa gcagtaggag 240
gggaagcttg gaaagtgtaa cctgaaggtg tctcctctga agaaagatca ccaacaccac 300
atgttttttt aaaaaaaaaa agaacaataa aaaacaagtg caaattatag acactaaatt 360
ctctccagta atgaaatttg cgctttgccc acggtggaaa caaataaata ttaaattctg 420
cagccatata ttgtgcacat ccttatcaca tttctctacg ggggaaaaaa aagaatcaat 480
cctgctaacc aaccggtcgc acagagccca gtacgttcac aggtggcaac gtgcaggcgg 540
agtccggcat cccagtacgc ggacgcgggc accacggaca atctcccatc ctgctactag 600
cttctgcctt gtgccatgga tgatcatcct cgtccatgtg cagctttcct gttggcagat 660
cggtctctgc atgagcatgg tgcctgtcca tctgtactgc ggctagctgt taagtgctcc 720
cctggcacga tccgatgcaa cgccattagg gtagggctca cccatccata tctatcaact 780
aggaaaattg gcgcgctatc gctgcgcctg tatgtgttgt acgtgtatgc taatgtggcc 840
tgtttgggct ccttggctgt agtgcaaaag gtgacggaag gatgatgttg gcccatttat 900
agttgctgat atgggagcca ttgcagaggg a 931
<210> 3
<211> 3056
<212> DNA
<213> 柳枝稷
<400> 3
cctttatgta ttgtgaattg cctcatgact ctgttttaca tcaggacctt gtcagactag 60
ttggcaacag tgtataaatg aaagcagcag tgtgcaggtg acttctaata ttgaagtgct 120
caatcaaaat catgaggaag gcaaccaaaa tagtgaaggc caaattactc ctattcgaag 180
cattgtgtct gaagatgcag atactgaaag atcagaaagg gaaataggtc tgacccctcc 240
tgcaggaccg tcagcattgc cggatgagca gcttaacacg aaggtggagt gccacgaagc 300
tgaacgcaac tgttgctatg atgaggacac ttcgagctta tttgatactg aatcgctgta 360
cagcaaagca tccagtttgc acgaagacac tcgtaaggat acttctccaa gtgatctatc 420
tgctccgaga tctcccgagg aatctacagt ttttctgaac tcttctgttc cgggatcagt 480
aggtatcatt gctgattctg attttgttca cgttgctctg acataatgtc ttgttcaatc 540
ttttattgta gtatctgtga gagcctcctg actacatctt tcattttgct ttttcattag 600
gaatctgtcg aagcagcagg agaagaggta tagacgaact ccgcgccaag ctgcagagtt 660
tcaaagtctc cagcactgta aaaggaagct acattgctat gagtgcccct cgcccgaagc 720
aaggtgacaa tctgagccaa tctgcaatcg cgttgctccg gaacagcgag aacgcacctg 780
ctgttaaagt aggccatcct ggcaagccgg accctgatct tccggtcgac aagcgctgca 840
gcccatcagt ggaagatcaa gggatcactg ataggcagta gggcgtacgc cgtagtttat 900
tattgtggac agttagcgtt tgtgctcaac attagttggt ggtggtggtg ttcaaccttt 960
ggctgaaggt tattaggtgt gcatctgacc ggaaactatc cgtgtgtttg cgcagcgtgt 1020
agtgacgaag ctgctctgtg catttgttat tagcagttaa catattgtgg gtgtggtggc 1080
cgtggtggaa atgttaagca actggcagcc gtacagttgg ttaattggtt atgcaggcgt 1140
ttggttttgg cttttttgta atcctgttat cgtgaacaga tccgttgtgc cccgtgctgt 1200
tattcgtaca cgtgctcact tgtttaatct cttgcaatgg cttacccatg tactgggtcc 1260
agaagacagg cgaggagcat ggctattcgg aacagaagag ccgcaggtcg tttggcgttc 1320
catgagcaga cactgcagtg agtggatagc aatcaatagc gatgctcttt ggccttccat 1380
gaaacgcacg cactcatgta cgccgcccac aatccaagtc ggtgtacccc cgaatcgtcg 1440
atcatattaa ttccggccgc ctagcgctgc tatatataga gagacctcgc ggcactccac 1500
tcggatcctg caaggctgca acgcacacac ttccggccga ctcgatccgt ccaagtcgca 1560
gcaatgtcaa tggaagcggc gccacgccta cgcctcggcg ccgtcgtcgc gcttctcctc 1620
ttcctcgccg tgacgccccc tgagcccgcc gccagccgcg gagcccccgc ctccgccgtc 1680
ccgccgctgg tagcgcgcct ccgcgccttc tccggtgagc tcataaactt gttcgataat 1740
tctcctccat cgggccgggc tctgctagct agccaacttc tcgtcgtaaa taaatactgg 1800
aagctaacga gctctgtacg cgtgcgcaga ggccggcggc ggcgggttcg ccgagtgctg 1860
ggactcgctg acgcggctgg ggtcgtgcac gagcgagatc gtcatcttct tcgtgaacgg 1920
cgagtcctac atcgggcacg agtgctgcgt cgccgtccgc ggcgccacgc gccactgctg 1980
gcccgccatg ctcgcctccg tcggcttcac cgccgaggag gccgacgtcc tgcgcggctt 2040
ctgcgacgcc gaggaggccg ccgccaagga caagggccct cctccttccc cggcgggccc 2100
ggtccccgcg ccagagaagc cgtagcccgt gtcggggccc aataagctta taagcttcgc 2160
ttttgtttct acacgatgca cgttttgcta gagtagagct tgatgctgaa tggttcagcc 2220
aataaaatcg actcagtgta ctcgtggccc gtttctctga atcttccatt ttaatttaca 2280
gcaccagccc acgcaagacg atttgggcca agcccttcca atttatgcga ggagaactca 2340
gcccttggac accaagcagt aggaggggaa gcttggaaag tgtaacctga aggtgtctcc 2400
tctgaagaaa gatcaccaac accacatgtt tttttaaaaa aaaaaagaac aataaaaaac 2460
aagtgcaaat tatagacact aaattctctc cagtaatgaa atttgcgctt tgcccacggt 2520
ggaaacaaat aaatattaaa ttctgcagcc atatattgtg cacatcctta tcacatttct 2580
ctacggggga aaaaaaagaa tcaatcctgc taaccaaccg gtcgcacaga gcccagtacg 2640
ttcacaggtg gcaacgtgca ggcggagtcc ggcatcccag tacgcggacg cgggcaccac 2700
ggacaatctc ccatcctgct actagcttct gccttgtgcc atggatgatc atcctcgtcc 2760
atgtgcagct ttcctgttgg cagatcggtc tctgcatgag catggtgcct gtccatctgt 2820
actgcggcta gctgttaagt gctcccctgg cacgatccga tgcaacgcca ttagggtagg 2880
gctcacccat ccatatctat caactaggaa aattggcgcg ctatcgctgc gcctgtatgt 2940
gttgtacgtg tatgctaatg tggcctgttt gggctccttg gctgtagtgc aaaaggtgac 3000
ggaaggatga tgttggccca tttatagttg ctgatatggg agccattgca gaggga 3056
<210> 4
<211> 3426
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自pDAB129557的PhiYFP基因表达盒
<400> 4
cctttatgta ttgtgaattg cctcatgact ctgttttaca tcaggacctt gtcagactag 60
ttggcaacag tgtataaatg aaagcagcag tgtgcaggtg acttctaata ttgaagtgct 120
caatcaaaat catgaggaag gcaaccaaaa tagtgaaggc caaattactc ctattcgaag 180
cattgtgtct gaagatgcag atactgaaag atcagaaagg gaaataggtc tgacccctcc 240
tgcaggaccg tcagcattgc cggatgagca gcttaacacg aaggtggagt gccacgaagc 300
tgaacgcaac tgttgctatg atgaggacac ttcgagctta tttgatactg aatcgctgta 360
cagcaaagca tccagtttgc acgaagacac tcgtaaggat acttctccaa gtgatctatc 420
tgctccgaga tctcccgagg aatctacagt ttttctgaac tcttctgttc cgggatcagt 480
aggtatcatt gctgattctg attttgttca cgttgctctg acataatgtc ttgttcaatc 540
ttttattgta gtatctgtga gagcctcctg actacatctt tcattttgct ttttcattag 600
gaatctgtcg aagcagcagg agaagaggta tagacgaact ccgcgccaag ctgcagagtt 660
tcaaagtctc cagcactgta aaaggaagct acattgctat gagtgcccct cgcccgaagc 720
aaggtgacaa tctgagccaa tctgcaatcg cgttgctccg gaacagcgag aacgcacctg 780
ctgttaaagt aggccatcct ggcaagccgg accctgatct tccggtcgac aagcgctgca 840
gcccatcagt ggaagatcaa gggatcactg ataggcagta gggcgtacgc cgtagtttat 900
tattgtggac agttagcgtt tgtgctcaac attagttggt ggtggtggtg ttcaaccttt 960
ggctgaaggt tattaggtgt gcatctgacc ggaaactatc cgtgtgtttg cgcagcgtgt 1020
agtgacgaag ctgctctgtg catttgttat tagcagttaa catattgtgg gtgtggtggc 1080
cgtggtggaa atgttaagca actggcagcc gtacagttgg ttaattggtt atgcaggcgt 1140
ttggttttgg cttttttgta atcctgttat cgtgaacaga tccgttgtgc cccgtgctgt 1200
tattcgtaca cgtgctcact tgtttaatct cttgcaatgg cttacccatg tactgggtcc 1260
agaagacagg cgaggagcat ggctattcgg aacagaagag ccgcaggtcg tttggcgttc 1320
catgagcaga cactgcagtg agtggatagc aatcaatagc gatgctcttt ggccttccat 1380
gaaacgcacg cactcatgta cgccgcccac aatccaagtc ggtgtacccc cgaatcgtcg 1440
atcatattaa ttccggccgc ctagcgctgc tatatataga gagacctcgc ggcactccac 1500
tcggatcctg caaggctgca acgcacacac ttccggccga ctcgatccgt ccaagtcgca 1560
gcaccagaag acaccatgtc atctggagca cttctctttc atgggaagat tccttacgtt 1620
gtggagatgg aagggaatgt tgatggccac acctttagca tacgtgggaa aggctacgga 1680
gatgcctcag tgggaaaggt atgtttctgc ttctaccttt gatatatata taataattat 1740
cactaattag tagtaatata gtatttcaag tatttttttc aaaataaaag aatgtagtat 1800
atagctattg cttttctgta gtttataagt gtgtatattt taatttataa cttttctaat 1860
atatgaccaa aacatggtga tgtgcaggtt gatgcacaat tcatctgtac taccggagat 1920
gttcctgtgc cttggagcac acttgtcacc actctcacct atggagcaca gtgctttgcc 1980
aagtatggtc cagagttgaa ggacttctac aagtcctgta tgccagatgg ctatgtgcaa 2040
gagcgcacaa tcacctttga aggagatggc aacttcaaga ctagggctga agtcaccttt 2100
gagaatgggt ctgtctacaa tagggtcaaa ctcaatggtc aaggcttcaa gaaagatggt 2160
cacgtgttgg gaaagaactt ggagttcaac ttcactcccc actgcctcta catctgggga 2220
gaccaagcca accacggtct caagtcagcc ttcaagatat gtcatgagat tactggcagc 2280
aaaggcgact tcatagtggc tgaccacacc cagatgaaca ctcccattgg tggaggtcca 2340
gttcatgttc cagagtatca tcatatgtct taccatgtga aactttccaa agatgtgaca 2400
gaccacagag acaacatgag cttgaaagaa actgtcagag ctgttgactg tcgcaagacc 2460
tacctttgag tagttagctt aatcacctag agctccccgt gtcggggccc aataagctta 2520
taagcttcgc ttttgtttct acacgatgca cgttttgcta gagtagagct tgatgctgaa 2580
tggttcagcc aataaaatcg actcagtgta ctcgtggccc gtttctctga atcttccatt 2640
ttaatttaca gcaccagccc acgcaagacg atttgggcca agcccttcca atttatgcga 2700
ggagaactca gcccttggac accaagcagt aggaggggaa gcttggaaag tgtaacctga 2760
aggtgtctcc tctgaagaaa gatcaccaac accacatgtt tttttaaaaa aaaaaagaac 2820
aataaaaaac aagtgcaaat tatagacact aaattctctc cagtaatgaa atttgcgctt 2880
tgcccacggt ggaaacaaat aaatattaaa ttctgcagcc atatattgtg cacatcctta 2940
tcacatttct ctacggggga aaaaaaagaa tcaatcctgc taaccaaccg gtcgcacaga 3000
gcccagtacg ttcacaggtg gcaacgtgca ggcggagtcc ggcatcccag tacgcggacg 3060
cgggcaccac ggacaatctc ccatcctgct actagcttct gccttgtgcc atggatgatc 3120
atcctcgtcc atgtgcagct ttcctgttgg cagatcggtc tctgcatgag catggtgcct 3180
gtccatctgt actgcggcta gctgttaagt gctcccctgg cacgatccga tgcaacgcca 3240
ttagggtagg gctcacccat ccatatctat caactaggaa aattggcgcg ctatcgctgc 3300
gcctgtatgt gttgtacgtg tatgctaatg tggcctgttt gggctccttg gctgtagtgc 3360
aaaaggtgac ggaaggatga tgttggccca tttatagttg ctgatatggg agccattgca 3420
gaggga 3426
<210> 5
<211> 3307
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自pDAB129557的AAD-1基因表达盒
<400> 5
gtgcagcgtg acccggtcgt gcccctctct agagataatg agcattgcat gtctaagtta 60
taaaaaatta ccacatattt tttttgtcac acttgtttga agtgcagttt atctatcttt 120
atacatatat ttaaacttta ctctacgaat aatataatct atagtactac aataatatca 180
gtgttttaga gaatcatata aatgaacagt tagacatggt ctaaaggaca attgagtatt 240
ttgacaacag gactctacag ttttatcttt ttagtgtgca tgtgttctcc tttttttttg 300
caaatagctt cacctatata atacttcatc cattttatta gtacatccat ttagggttta 360
gggttaatgg tttttataga ctaatttttt tagtacatct attttattct attttagcct 420
ctaaattaag aaaactaaaa ctctatttta gtttttttat ttaatagttt agatataaaa 480
tagaataaaa taaagtgact aaaaattaaa caaataccct ttaagaaatt aaaaaaacta 540
aggaaacatt tttcttgttt cgagtagata atgccagcct gttaaacgcc gtcgacgagt 600
ctaacggaca ccaaccagcg aaccagcagc gtcgcgtcgg gccaagcgaa gcagacggca 660
cggcatctct gtcgctgcct ctggacccct ctcgagagtt ccgctccacc gttggacttg 720
ctccgctgtc ggcatccaga aattgcgtgg cggagcggca gacgtgagcc ggcacggcag 780
gcggcctcct cctcctctca cggcaccggc agctacgggg gattcctttc ccaccgctcc 840
ttcgctttcc cttcctcgcc cgccgtaata aatagacacc ccctccacac cctctttccc 900
caacctcgtg ttgttcggag cgcacacaca cacaaccaga tctcccccaa atccacccgt 960
cggcacctcc gcttcaaggt acgccgctcg tcctcccccc ccccccccct ctctaccttc 1020
tctagatcgg cgttccggtc catgcatggt tagggcccgg tagttctact tctgttcatg 1080
tttgtgttag atccgtgttt gtgttagatc cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga 1140
cctgtacgtc agacacgttc tgattgctaa cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg 1200
ggatggctct agccgttccg cagacgggat cgatttcatg attttttttg tttcgttgca 1260
tagggtttgg tttgcccttt tcctttattt caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt 1320
catcttttca tgcttttttt tgtcttggtt gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt 1380
ctagatcgga gtagaattct gtttcaaact acctggtgga tttattaatt ttggatctgt 1440
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taggataggt atacatgttg atgcgggttt tactgatgca tatacagaga tgctttttgt 1560
tcgcttggtt gtgatgatgt ggtgtggttg ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt 1620
agaatactgt ttcaaactac ctggtgtatt tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca 1680
tacatcttca tagttacgag tttaagatgg atggaaatat cgatctagga taggtataca 1740
tgttgatgtg ggttttactg atgcatatac atgatggcat atgcagcatc tattcatatg 1800
ctctaacctt gagtacctat ctattataat aaacaagtat gttttataat tatttcgatc 1860
ttgatatact tggatgatgg catatgcagc agctatatgt ggattttttt agccctgcct 1920
tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg 1980
tgttacttct gcaggtacag tagttagttg aggtaccgga tccacacgac accatggctc 2040
atgctgccct cagccctctc tcccaacgct ttgagagaat agctgtccag ccactcactg 2100
gtgtccttgg tgctgagatc actggagtgg acttgaggga accacttgat gacagcacct 2160
ggaatgagat attggatgcc ttccacactt accaagtcat ctactttcct ggccaagcaa 2220
tcaccaatga gcagcacatt gcattctcaa gaaggtttgg accagttgat ccagtgcctc 2280
ttctcaagag cattgaaggc tatccagagg ttcagatgat ccgcagagaa gccaatgagt 2340
ctggaagggt gattggtgat gactggcaca cagactccac tttccttgat gcacctccag 2400
ctgctgttgt gatgagggcc atagatgttc ctgagcatgg cggagacact gggttccttt 2460
caatgtacac agcttgggag accttgtctc caaccatgca agccaccatc gaagggctca 2520
acgttgtgca ctctgccaca cgtgtgttcg gttccctcta ccaagcacag aaccgtcgct 2580
tcagcaacac ctcagtcaag gtgatggatg ttgatgctgg tgacagagag acagtccatc 2640
ccttggttgt gactcatcct ggctctggaa ggaaaggcct ttatgtgaat caagtctact 2700
gtcagagaat tgagggcatg acagatgcag aatcaaagcc attgcttcag ttcctctatg 2760
agcatgccac cagatttgac ttcacttgcc gtgtgaggtg gaagaaagac caagtccttg 2820
tctgggacaa cttgtgcacc atgcaccgtg ctgttcctga ctatgctggc aagttcagat 2880
acttgactcg caccacagtt ggtggagtta ggcctgcccg ctgagtagtt agcttaatca 2940
cctagagctc ggtcgcagcg tgtgcgtgtc cgtcgtacgt tctggccggc cgggccttgg 3000
gcgcgcgatc agaagcgttg cgttggcgtg tgtgtgcttc tggtttgctt taattttacc 3060
aagtttgttt caaggtggat cgcgtggtca aggcccgtgt gctttaaaga cccaccggca 3120
ctggcagtga gtgttgctgc ttgtgtaggc tttggtacgt atgggcttta tttgcttctg 3180
gatgttgtgt actacttggg tttgttgaat tattatgagc agttgcgtat tgtaattcag 3240
ctgggctacc tggacattgt tatgtattaa taaatgcttt gctttcttct aaagatcttt 3300
aagtgct 3307
<210> 6
<211> 562
<212> DNA
<213> 柳枝稷
<400> 6
atgtcaatgg aagcggcgcc acgcctacgc ctcggcgccg tcgtcgcgct tctcctcttc 60
ctcgccgtga cgccccctga gcccgccgcc agccgcggag cccccgcctc cgccgtcccg 120
ccgctggtag cgcgcctccg cgccttctcc ggtgagctca taaacttgtt cgataattct 180
cctccatcgg gccgggctct gctagctagc caacttctcg tcgtaaataa atactggaag 240
ctaacgagct ctgtacgcgt gcgcagaggc cggcggcggc gggttcgccg agtgctggga 300
ctcgctgacg cggctggggt cgtgcacgag cgagatcgtc atcttcttcg tgaacggcga 360
gtcctacatc gggcacgagt gctgcgtcgc cgtccgcggc gccacgcgcc actgctggcc 420
cgccatgctc gcctccgtcg gcttcaccgc cgaggaggcc gacgtcctgc gcggcttctg 480
cgacgccgag gaggccgccg ccaaggacaa gggccctcct ccttccccgg cgggcccggt 540
ccccgcgcca gagaagccgt ag 562
<210> 7
<211> 163
<212> DNA
<213> 柳枝稷
<400> 7
cgccgcccac aatccaagtc ggtgtacccc cgaatcgtcg atcatattaa ttccggccgc 60
ctagcgctgc tatatataga gagacctcgc ggcactccac tcggatcctg caaggctgca 120
acgcacacac ttccggccga ctcgatccgt ccaagtcgca gca 163

Claims (18)

1.一种核酸载体，所述核酸载体包含可操作地连接到以下的启动子：
a)多接头序列；
b)非柳枝稷(Panicum virgatum)(Pavir.Cb02009)卵细胞异源编码序列；或
c)a)和b)的组合；
其中所述启动子包含与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的多核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的核酸载体，其中所述启动子的长度为1,400bp。
3.如权利要求1所述的核酸载体，其中所述启动子由与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的多核苷酸序列组成。
4.如权利要求1所述的核酸载体，所述核酸载体进一步包含编码可选择标记的序列。
5.如权利要求1所述的核酸载体，其中所述启动子可操作地连接到异源编码序列。
6.如权利要求5所述的核酸载体，其中所述异源编码序列编码可选择标记、杀昆虫抗性蛋白、小RNA分子、位点特异性核酸酶蛋白、除草剂耐受性蛋白、氮利用效率蛋白、水利用效率蛋白、营养品质蛋白或DNA结合蛋白。
7.如权利要求1所述的核酸载体，所述核酸载体进一步包含3'非翻译多核苷酸序列。
8.如权利要求1所述的核酸载体，所述核酸载体进一步包含5'非翻译多核苷酸序列。
9.如权利要求1所述的核酸载体，所述核酸载体进一步包含内含子序列。
10.如权利要求1所述的核酸载体，其中所述启动子具有胚胎细胞偏好性表达。
11.一种转基因植物，所述转基因植物包含与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的、可操作地连接到异源编码序列的多核苷酸序列。
12.如权利要求11所述的转基因植物，其中所述植物选自下组，该组由以下组成：玉蜀黍(Zea mays)、小麦、稻、高粱、燕麦、黑麦、香蕉、甘蔗、大豆、棉花、拟南芥、烟草、向日葵和低芥酸菜籽。
13.如权利要求12所述的转基因植物，其中所述植物是玉蜀黍。
14.如权利要求11所述的转基因植物，其中将所述异源编码序列插入所述植物的基因组中。
15.如权利要求11所述的转基因植物，其中启动子包含与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的多核苷酸序列，并且所述启动子与异源编码序列可操作地连接。
16.如权利要求15所述的转基因植物，所述转基因植物进一步包含3'非翻译序列。
17.如权利要求15所述的转基因植物，其中所述具有胚胎细胞组织偏好性表达的异源编码序列。
18.如权利要求15所述的转基因植物，其中所述启动子的长度为1,400bp。
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