BR112019027401A2 - promotor de planta para expressão de transgene - Google Patents

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Abstract

A presente invenção refere-se a composições e métodos para promover a transcrição de uma sequência de nucleotídeos em uma planta ou célula vegetal, utilizando um promotor de um gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009). Algumas modalidades referem-se a um promotor de um gene de óvulo de Panicum virgatum (Pa-vir.Cb02009) que funciona em plantas para promover a transcrição de sequências de nucleotídeos ligadas de maneira funcional. Outras modalidades referem-se a uma UTR 3' de um gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) que funciona em plantas para promover a transcrição de sequências de nucleotídeos ligadas de maneira funcional.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VETOR DE ÁCIDO NUCLEICO, PLANTA TRANSGÊNICA E SEU USO".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO
[001] O presente pedido reivindica prioridade do benefício do Pedido de Patente Provisório dos EUA n.º de Série 65/525896, depositado em 28 de junho de 2017, cuja descrição é aqui incorporada a título de referência, em sua totalidade.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DE MATERIAL ENVIADO ELETRONICAMENTE
[002] É incorporada a título de referência, em sua totalidade, uma listagem de sequência de nucleotídeo/aminoácido legível por computador enviada concomitantemente com o presente documento e identificada conforme o seguinte: um arquivo ACII de 20,0 KB (Texto) nomeado "79402-US-PSP-20170628-Sequence-Listing-ST25.txt" criado em 16 de agosto de 2017.
ANTECEDENTES
[003] Muitas espécies de planta têm capacidade para serem transformadas com transgenes para introduzir traços ou características agronomicamente desejáveis. As espécies de planta resultantes são desenvolvidas e/ou modificadas para ter traços desejáveis particulares. Em geral, traços desejáveis incluem, por exemplo, melhorar a qualidade de valor nutricional, aumentar rendimento, conferir resistência a pragas ou doença, aumentar a seca e tolerância ao estresse, melhorar qualidades horticulturais (por exemplo, pigmentação e crescimento), conferir tolerância a herbicidas, possibilitar a produção de compostos industrialmente úteis e/ou materiais da planta, e/ou possibilitar a produção de produtos farmacêuticos.
[004] As espécies de planta transgênica que compreendem múltiplos transgenes empilhados em um locus genômico único são produzidas por meio de tecnologias de transformação vegetal. As tecnologias de transformação vegetal resultam na introdução de um transgene em uma célula vegetal, recuperação de uma planta transgênica fértil que contém a cópia integrada de modo estável do transgene no genoma de planta, e expressão de transgene subsequente por meio de resultados de transcrição e tradução em plantas transgênicas que possuem traços e fenótipos desejáveis. Entretanto, elementos reguladores de gene inovadores que permitem que a produção de espécies de planta transgênica expresse altamente múltiplos transgenes manipulados como um conjunto de traços são desejáveis.
[005] De modo semelhante, os elementos reguladores de gene inovadores que permitem a expressão de um transgene em tecidos ou órgãos particulares de uma planta são desejáveis. Por exemplo, a resistência aumentada de uma planta à infecção por patógenos originários do solo pode ser alcançada transformando-se o genoma de planta com um gene de resistência a patógeno, de modo que a proteína de resistência a patógeno seja expressa de modo robusto nas raízes da planta. Alternativamente, pode ser desejável expressar um transgene em tecidos vegetais que estão em uma fase de desenvolvimento ou crescimento particular, como, por exemplo, divisão ou alongamento celular. Adicionalmente, pode ser desejável expressar um transgene em tecidos de folha e caule de uma planta para fornecer tolerância contra herbicidas, ou resistência contra insetos e pragas acima do solo.
[006] Portanto, existe uma necessidade de elementos reguladores de gene inovadores que podem levar aos níveis desejáveis de expressão de transgenes em tecidos de planta específicos.
BREVE SUMÁRIO
[007] Em modalidades da presente descrição, a descrição se refere a um vetor de ácido nucleico que compreende um promotor operacionalmente ligado a: a) uma sequência poliligante; b) um gene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir. CD0O2009); ou c) uma combinação de a) e b), em que o dito promotor compreende uma sequência de polinucleotídeos que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1. Em um aspecto dessa modalidade, o promotor tem 1,400 pares de bases de comprimento. Em aspectos adicionais, o promotor consiste em uma sequência de polinucleotídeos que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1. Em outro aspecto, o promotor compreende uma sequência que codifica um marcador selecionável. Ainda em outro aspecto, o promotor é operacionalmente ligado a um transgene. Em alguns casos, o transgene codifica um marcador selecionável ou um produto de gene que confere resistência a inseticida, tolerância a herbicida, eficiência de uso de nitrogênio, eficiência de uso de água, expressão de um RNAi, ou qualidade nutricional. Em um aspecto adicional, o vetor de ácido nucleico compreende uma sequência de polinucleotídeos não traduzida 3'. Em um aspecto adicional, o vetor de ácido nucleico compreende uma sequência de polinucleotídeos não traduzida 5. Em um aspecto adicional, o vetor de ácido nucleico compreende uma sequência de Íntrons. Em aspectos adicionais, o promotor tem expressão de célula embrionária. Em aspectos adicionais, uma sequência de polinucleotídeos que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1 operacionalmente ligada a um transgene.
[008] Ainda em outra modalidade, a presente descrição se refere a uma planta transgênica que compreende o vetor de ácido nucleico. Em um aspecto, a planta é selecionada dentre o grupo que consiste em Zea mays, trigo, arroz, sorgo, aveia, centeio, bananas, cana de açúcar, soja, algodão, Arabidopsis, tabaco, girassol e canola. Em aspectos adicionais, o transgene é inserido no genoma da dita planta. Em outro aspecto, a planta transgênica inclui um promotor que compreende uma sequência de polinucleotídeos que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1 e o dito promotor é operacionalmente ligado a um transgene. Em aspectos adicionais, a planta transgênica compreende uma sequência não traduzida 3'. Em outros aspectos, o promotor transgênico conduz a expressão específica de tecido de célula embrionária de um transgene na planta transgênica. Ainda em outro aspecto, a planta transgênica compreende um promotor que tem 1.400 pares de bases de comprimento.
[009] Em modalidades da presente descrição, a descrição se refere a um método para produzir uma célula vegetal transgênica, em que o método compreende as etapas de: a) transformar uma célula vegetal com um cassete de expressão de gene que compreende um promotor de óvulo de Panicum virgatam (Pavir.Cb02009) operacionalmente ligado a pelo menos uma sequência de polinucleotídeos de interesse; b) isolar a célula vegetal transformada que compreende o cassete de expressão de gene; e, c) produzir uma célula vegetal transgênica que compreende o promotor de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) operacionalmente ligado a pelo menos uma sequência de polinucleotídeos de interesse. Em um aspecto, a transformação de uma célula vegetal é realizada com um método de transformação de planta. Esses métodos de transformação podem incluir um método de transformação de planta que é selecionado dentre o grupo que consiste em um método de transformação mediado por Agrobacterium, um método de transformação biolística, um método de transformação de carbeto de silício, um método de transformação de protoplasto, e um método de transformação de lipossomo. Em aspectos adicionais, a sequência de polinucleotídeos de interesse é expressa em uma célula vegetal. Em outros aspectos, a sequência de polinucleotídeos de interesse é integrada de modo estável ao genoma da célula vegetal transgênica. Em aspectos adicionais, o método compreende adicionalmente as etapas de: d) regenerar a célula vegetal transgênica em uma planta transgênica; e, e) obter a planta transgênica, em que a planta transgênica compreende o cassete de expressão de gene que compreende o promotor de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.
Cb0O2009) da reivindicação 1 operacionalmente ligado a pelo menos uma sequência de polinucleotídeo de interesse.
Em um aspecto adicional, a célula vegetal transgênica é uma célula vegetal transgênica monocotiledônea ou uma célula vegetal transgênica dicotiledônea.
Consequentemente, a célula vegetal transgênica dicotiledônea pode incluir célula vegetal de Arabidopsis, uma célula vegetal de tabaco, uma célula vegetal de soja, uma célula vegetal de canola, e uma célula vegetal de algodão.
De modo semelhante, a célula vegetal transgênica monocotiledônea pode incluir uma célula vegetal de Zea mays, uma célula vegetal de arroz, e uma célula vegetal de trigo.
Em outro aspecto, o promotor de óvulo Panicum virgatum (Pavir.
Cb02009) compreende o polinucleotídeo da SEQ ID NO:1. Em aspectos subsequentes, a primeira sequência de polinucleotídeos de interesse é operacionalmente ligada à extremidade 3' da SEQ ID NO:1. Em aspectos adicionais, o método compreende introduzir na célula vegetal uma sequência de polinucleotídeos de interesse operacionalmente ligada a um promotor de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009). Em aspectos adicionais, a sequência de polinucleotíidecos de interesse operacionalmente ligada ao promotor de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.
Cb02009) é introduzida na célula vegetal por um método de transformação de planta.
Os exemplos de tal método de transformação de planta incluem método de transformação mediada por Agrobacterium, um método de transformação biolística, um método de transformação de carbeto de silício, um método de transformação de protoplasto, e um método de transformação de lipossomo.
Em aspectos adicionais, a sequência de polinucleotídeos de interesse é expressa em tecido de célula embrionária.
Em aspectos adicionais, a sequência de polinucleotídeos de interesse é integrada de modo estável ao genoma da célula vegetal. Ainda em outro aspecto, a célula vegetal transgênica é uma célula vegetal monocotiledônea ou uma célula vegetal dicotiledônea. As células vegetais dicotiledôneas incluem uma célula vegetal de Arabidopsis, uma célula vegetal de tabaco, uma célula vegetal de soja, uma célula vegetal de canola, e uma célula vegetal de algodão. De modo semelhante, as células vegetais monocotiledôneas exemplificativas incluem uma célula vegetal de Zea mays, uma célula vegetal de arroz, e uma célula vegetal de trigo.
[0010] Em modalidades da presente descrição, a descrição se refere a uma célula vegetal transgênica que compreende um promotor de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009). Em um aspecto, a célula vegetal transgênica compreende um evento transgênico. Em aspectos adicionais, o evento transgênico compreende um traço agronômico. Tais traços agronômicos podem incluir um traço de resistência a inseticida, traço de tolerância a herbicida, traço de eficiência de uso de nitrogênio, traço de eficiência de uso de água, traço de qualidade nutricional, traço de ligação de DNA, traço de marcador selecionável, traço de RNA pequeno, ou qualquer combinação dos mesmos. Por exemplo, um traço tolerante a herbicida pode compreender a sequência de codificação aad-1. Em um aspecto subsequente, a célula vegetal transgênica produz um produto de mercadoria. Tais produtos de mercadoria podem incluir concentrado de proteína, isolado de proteína, grãos, farelo, farinha, óleo ou fibra. Em outros aspectos, a célula vegetal transgênica é selecionada dentre o grupo que consiste em uma célula vegetal dicotiledônea ou uma célula vegetal monocotiledônea. As células vegetais dicotiledôneas incluem uma célula vegetal de Arabidopsis, uma célula vegetal de tabaco, uma célula vegetal de soja, uma célula vegetal de canola, e uma célula vegetal de algodão. De modo semelhante, as células vegetais monocotiledôneas exemplificativas incluem uma célula vegetal de Zea mays, uma célula vegetal de arroz, e uma célula vegetal de trigo. Em um aspecto, o promotor de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) compreende um polinucleotídeo com pelo menos 90% de identidade de sequência com o polinucleotídeo da SEQ ID NO:1. Em aspectos subsequentes, o promotor de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. CbO02009) tem 1.400 pares de bases de comprimento. Em aspectos adicionais, o promotor de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) consiste na SEQ ID NO:1. Ainda em outro aspecto, a primeira — sequência de —polinucleotíidecos de interesse é operacionalmente ligada à extremidade 3' da SEQ ID NO:1. Em aspectos subsequentes, o traço agronômico é expresso em tecido de célula embrionária.
[0011] Em modalidades da presente descrição, a descrição se refere a um polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência de ácidos nucleicos com pelo menos 90% de identidade de sequência com o polinucleotídeo da SEQ ID NO:1. Em um aspecto, o polinucleotídeo isolado é especificamente expresso em tecido de célula embrionária. Em outro aspecto, o polinucleotídeo isolado é expresso em uma célula vegetal. Em outros aspectos, o polinucleotídeo isolado compreende um polinucleotídeo de quadro de leitura aberta que codifica um polipeptídeo e uma sequência de terminação. Em um aspecto, o polinucleotídeo da SEQ ID NO:1 tem 1.400 pares de bases de comprimento.
[0012] Em modalidades da presente descrição, a descrição se refere a um cassete de expressão de gene que compreende um promotor operacionalmente ligado a uma sequência de codificação heteróloga, em que o promotor compreende um polinucleotídeo que compreende uma identidade de sequência de pelo menos 95% com a SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1. Em modalidades adicionais, o cassete de expressão de gene compreende um íntron.
Em modalidades adicionais, o cassete de expressão de gene compreende uma UTR 5'. Em modalidades subsequentes, o promotor tem expressão preferencial de tecido.
Em outras modalidades, o promotor é operacionalmente ligado a uma sequência de codificação heteróloga que codifica um polipeptídeo ou um gene de RNA pequeno.
Exemplos do polipeptídeo codificado ou gene de RNA pequeno incluem uma sequência de codificação heteróloga que confere resistência a inseticida, tolerância a herbicida, um ácido nucleico que confere eficiência de uso de nitrogênio, um ácido nucleico que confere eficiência de uso de água, um ácido nucleico que confere qualidade nutricional, um ácido nucleico que confere proteína de ligação de DNA, e um ácido nucleico que codifica um marcador selecionável.
Em modalidades adicionais, o cassete de expressão de gene compreende uma região não traduzida 3'. Em modalidades adicionais, o cassete de expressão de gene compreende uma região não traduzida 5". Em modalidades adicionais, o cassete de expressão de gene compreende uma região terminadora.
Em outras modalidades, a presente descrição se refere a um vetor recombinante que compreende o cassete de expressão de gene, em que o vetor é selecionado dentre o grupo que consiste em um plasmídeo, um cosmídeo, um cromossomo artificial bacteriano, um vírus, e um bacteriófago.
Em outras modalidades, a presente descrição se refere a uma célula transgênica que compreende o cassete de expressão de gene.
Em um aspecto dessa modalidade, a célula transgênica é uma célula vegetal transgênica.
Em outros aspectos dessa modalidade, a planta transgênica compreende a célula vegetal transgênica.
Em aspectos adicionais, a planta transgênica é uma planta monocotiledônea ou planta dicotiledônea.
Exemplos de uma planta monocotiledônea incluem uma planta de maís, uma planta de arroz e uma planta de trigo.
Em aspectos adicionais da modalidade, a planta transgênica produz uma semente que compreende o cassete de expressão de gene. Em outras modalidades, o promotor é um promotor preferencial de tecido. Em algumas modalidades, o promotor preferencial de tecido é um promotor preferencial de célula embrionária.
[0013] O supracitado e outros recursos se tornarão mais evidentes a partir da seguinte descrição detalhada de diversas modalidades.
DESCRIÇÃO DETALHADA l Visão geralde diversas modalidades
[0014] O desenvolvimento de produtos de planta transgênica se torna complexo de modo crescente. As plantas transgênicas comercialmente viáveis necessitam agora do empilhamento de múltiplos transgenes/sequências de codificação heterólogas em um locus único. Os promotores vegetais e UTR 3' usados para pesquisa básica ou aplicações biotecnológicas são geralmente unidirecionais, direcionando apenas um gene que foi fundido em sua extremidade 3' (a jusante) para o promotor, ou em sua extremidade 5' (a montante) para a UTR 3. Consequentemente, cada transgene/sequência de codificação heteróloga necessita normalmente de um promotor e UTR 3' para expressão, em que múltiplos elementos reguladores são necessários para expressar múltiplos transgenes/sequências de codificação heterólogas em uma pilha de gene. Com um número crescente de transgenes em pilhas de gene, o mesmo promotor e/ou UTR 3' é rotineiramente usado para obter níveis otimizados de padrões de expressão de transgenes/sequências de codificação heterólogas diferentes. Obter — níveis otimizados de expressão — de transgene/sequência de codificação heteróloga é necessário para a produção de um traço poligênico único. Infelizmente, os construtos de múltiplos genes conduzidos pelo mesmo promotor e/ou UTR 3' são conhecidos por causar o silenciamento de gene que resulta em produtos transgênicos menos eficazes no campo. O promotor repetido e/ou elementos de UTR 3' podem levar a um silenciamento de gene com base em homologia. Além disso, as sequências repetitivas em um transgene podem levar à recombinação homóloga de locus intra gene que resulta em redisposições de polinucleotídeo. O silenciamento e a redisposição de transgenes terão provavelmente um efeito indesejável no desempenho de uma planta transgênica produzida para expressar transgenes/sequência de codificação heteróloga. Adicionalmente, o excesso de sítios de ligação de fator de transcrição (TF) devido à repetição de promotor pode causar a depleção de TF endógenos que levam à desativação de transcrição. Dada a necessidade de introduzir múltiplos genes/sequências de codificação heterólogas em plantas para manipulação metabólica e empilhamento de traço, uma variedade de promotores e/ou UTRs 3' é necessária para desenvolver safras transgênicas que acionam a expressão de múltiplos genes/sequências de codificação heterólogas.
[0015] Um problema particular na identificação de promotor e/ou UTR 3' é a necessidade de identificar promotores específicos de tecido, relacionados aos tipos de célula específicos, estágios de desenvolvimento e/ou funções na planta que não são expressas em outros tecidos de planta. Os promotores específicos de tecido (isto é, preferenciais de tecido) ou de órgão conduzem a expressão de gene em um certo tecido, como no grão, raiz, folha, ou tapetum da planta. Os promotores específicos de estágio de tecido e desenvolvimento e/ou UTRs 3' podem ser inicialmente identificados a partir da observação da expressão de genes/sequências de codificação heterólogas, que são expressos em tecidos particulares ou em períodos de tempo particulares durante o desenvolvimento vegetal. Esses promotores específicos de tecido e/ou UTRs 3' são necessários para certas aplicações na indústria de planta transgênica e são necessários visto que permitem expressão específica de genes heterológos de maneira seletiva de tecido e/ou estágio de desenvolvimento, o que indica a expressão do gene heterólogo de modo diferencial em vários órgãos, tecidos e/ou tempos, mas não em outros tecidos indesejáveis. Por exemplo, a resistência aumentada de uma planta à infecção por patógenos originários do solo pode ser alcançada transformando-se o genoma de planta com um gene de resistência a patógeno, de modo que a proteína de resistência a patógeno seja expressa de modo robusto nas raízes da planta. Alternativamente, pode ser desejável expressar um transgene em tecidos vegetais que estão em uma fase de desenvolvimento ou crescimento particular, como, por exemplo, divisão ou alongamento celular. Outra aplicação é a conveniência para usar promotores específicos de tecido e/ou UTRs 3' para restringir a expressão dos transgenes/sequências de codificação heterólogas que codifica um traço agronômico em tipos de tecidos específicos, como desenvolver células de parênquima. Como tal, um problema particular na identificação de promotores e/ou UTRs 3' é como identificar os promotores, e para relacionar o promotor identificado a propriedades de desenvolvimento da célula para expressão de tecido específica.
[0016] Outro problema que se refere à identificação de um promotor é a necessidade para clonar todos os elementos de controle de atuação cis e ativação trans relevantes de modo que o fragmento de DNA clonado conduza a transcrição no padrão de expressão específico desejável. Visto que tais elementos de controle estão localizados de modo distal da iniciação de tradução ou sítio inicial, o tamanho do polinucleotídeo que é selecionado para compreender o promotor é de importância para fornecer o nível de expressão e os padrões de expressão da sequência de polinucleotídeos promotora. Sabe-se que os comprimentos de promotor incluem informações funcionais, e genes/sequências de codificação heterólogas diferentes demonstraram ter promotores mais longos ou mais curtos do que promotores dos outros genes no genoma. Elucidar o sítio de início de transcrição de um promotor e prever os elementos de gene funcionais na região de promotor é desafiador. Em adição ao desafio há a complexidade, diversidade e natureza degenerada inerente de motivos reguladores e elementos reguladores cis e trans (Blanchette, Mathieu, et al. "Genome- wide computational prediction of transcriptional regulatory modules reveals new insights into human gene expression." Genome research
16.5 (2006): 656 a 668). Os elementos reguladores cis e trans são localizados nas partes distais do promotor que regulam a expressão espacial e temporal de um gene para ocorrer apenas em sítios necessários e em tempos específicos (Porto, Milena Silva, et al. "Plant promoters: an approach of structure and function" Molecular biotechnology 56.1 (2014): 38 a 49). Consequentemente, a identificação de elementos reguladores de promotor necessita que uma sequência apropriada de um tamanho específico que contém os elementos reguladores cis e trans necessários seja obtida de modo que resultará em conduzir a expressão de um transgene operacionalmente ligado/uma sequência de codificação heteróloga de maneira desejável.
[0017] São fornecidos métodos e composições para superar tais problemas através do uso de elementos reguladores de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) para expressar transgenes/se- quências de codificação heterólogas in planta. Il. "Termos e Abreviações
[0018] Ao longo da aplicação, vários termos são usados. A fim de fornecer um entendimento claro e consistente do relatório descritivo e reivindicações, incluindo o escopo a ser dado a esses termos, as seguintes definições são fornecidas.
[0019] Conforme usado no presente documento, o termo "íntron" se refere a qualquer sequência de ácidos nucleicos compreendida em um gene (ou sequência de polinucleotídeos expressa de interesse) que é transcrito, mas não traduzido. Íntrons incluem sequência de ácidos nucleicos não traduzidas em uma sequência expressa de DNA, assim como a sequência correspondente em moléculas de RNA transcritas a partir da mesma. Um construto descrito no presente documento também pode conter sequências que intensificam a tradução e/ou estabilidade de mMRNA, como íntrons. Um exemplo de tal íntron é o primeiro Íntron de gene |l da variante histona H3 de Arabidopsis thaliana ou qualquer outra sequência de íntrons comumente conhecida. Os íntrons podem ser usados em combinação com uma sequência promotora para intensificar a tradução e/ou estabilidade de MRNA.
[0020] O termo "isolado", conforme usado no presente documento, significa ter sido removido de seu ambiente natural, ou removido de outros compostos presentes quando o composto é primeiro formado. O termo "isolado" abrange materiais isolados de fontes naturais, assim como materiais (por exemplo, ácidos nucleicos e proteínas) recuperados após a preparação por expressão recombinante em uma célula hospedeira, ou compostos quimicamente sintetizados, como moléculas de ácido nucleico, proteínas e peptídeos.
[0021] O termo "purificado", conforme usado no presente documento, se refere ao isolamento de uma molécula ou composto em uma forma que é substancialmente livre de contaminantes normalmente associados à molécula ou composto em um ambiente nativo ou natural, ou substancialmente enriquecido em concentração em relação a outros compostos presentes quando o composto é primeiro formado, e meios que aumentaram em pureza como resultado de serem separados de outros componentes da composição original. O termo "ácido nucleico purificado" é usado no presente documento para descrever uma sequência de ácidos nucleicos que foi separada, produzida separada de ou purificada distante de outros compostos biológicos incluindo, mas sem limitação, polipeptídeos, lipídeos e carboidratos, enquanto efetua uma mudança química ou funcional no componente (por exemplo, um ácido nucleico pode ser purificado de um cromossomo removendo-se os contaminantes de proteína e rompendo ligações químicas que conectam o ácido nucleico ao DNA restante no cromossomo).
[0022] O termo "sintético", conforme usado no presente documento, se refere a uma molécula de polinucleotídeo (isto é, um DNA ou RNA) que foi criado por meio de síntese química como um processo in vitro. Por exemplo, um DNA sintético pode ser criado durante uma reação em um tubo Eppendorf"Y, de modo que o DNA sintético seja enzimaticamente produzido a partir de uma fita nativa de DNA ou RNA. Outros métodos de laboratório podem ser utilizados para sintetizar uma sequência de polinucleotídeos. Os oligonucleotídeos podem ser quimicamente sintetizados em um sintetizador oligo por meio de síntese de fase sólida com o uso de fosforamiditas. Os oligonucleotídeos sintetizados podem ser anelados entre si como um complexo, assim produzindo um polinucleotídeo "sintético". Outros métodos para sintetizar quimicamente um polinucleotídeo são conhecidos na técnica, e podem ser prontamente implementados para uso na presente descrição.
[0023] O termo "cerca de", conforme usado no presente documento, significa maior ou menor do que o valor ou faixa de valores declarada em 10 por cento, mas não é destinada a designar qualquer valor ou faixa de valores apenas a essa definição mais ampla. Cada valor ou faixa de valores precedida pelo termo "cerca de" também é destinada a abranger a modalidade do valor absoluto declarado ou faixa de valores.
[0024] Para os propósitos da presente descrição, um "gene" inclui uma região de DNA que codifica um produto de gene (consultar infra), assim como todas as regiões de DNA que regulam a produção do produto de gene, caso tais sequências reguladoras sejam ou não adjacentes às sequências de codificação e/ou transcritas.
Consequentemente, um gene inclui, mas não está necessariamente limitado a, sequências promotoras, terminadores, sequências reguladoras de tradução, como sítios de ligação de ribossomo e sítios de entrada de ribossomo internos, intensificadores, silenciadores, isoladores, elementos de limiar, origens de replicação, sítios de ligação de matriz, íntrons e regiões de controle de /ocus.
[0025] Conforme usado no presente documento, os termos "nativo" ou "natural" definem uma condição encontrada na natureza. Uma "sequência de DNA nativa" é uma sequência de DNA presente na natureza que foi produzida por meios naturais ou técnicas de reprodução tradicionais, mas não gerada por manipulação genética (por exemplo, com o uso de biologia molecular/técnicas de transformação).
[0026] Conforme usado no presente documento um "transgene" ou "sequência de codificação heteróloga" é definido para ser uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um produto de gene, incluindo, por exemplo, mas sem limitação, um mMRNA. Em uma modalidade, o transgene/sequência de codificação heteróloga é um ácido nucleico exógeno, em que o transgene/sequência de codificação heteróloga foi introduzida em uma célula hospedeira por manipulação genética (ou a progênie da mesma) em que o transgene/sequência de codificação heteróloga não é normalmente encontrado. Em um exemplo, um transgene/sequência de codificação heteróloga codifica um composto industrialmente ou farmaceuticamente útil, ou um gene/sequência de codificação heteróloga que codifica um traço agrícola desejável (por exemplo, um gene de resistência a herbicida). Em ainda outro exemplo, um transgene/sequência de codificação heteróloga é uma sequência de ácidos nucleicos antissenso, em que a expressão da sequência de ácidos nucleicos antissenso inibe a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos alvo. Em uma modalidade, o transgene/sequência de codificação heteróloga é um ácido nucleico endógeno, em que cópias genômicas adicionais do ácido nucleico endógeno são desejáveis, ou um ácido nucleico que está na orientação antissenso em relação à sequência de um ácido nucleico alvo em um organismo hospedeiro. Conforme usado no presente documento, "sequência de codificação heteróloga" significa qualquer sequência de codificação diferente daquela que codifica naturalmente a gene de óvulo de Zea mays, ou qualquer homólogo da proteína de óvulo de Zea mays expressa. O termo "heterólogo" é usado no contexto dessa invenção para qualquer combinação de sequências de ácido nucleico que não são normalmente constatadas como intimamente associadas em natureza.
[0027] Conforme usado no presente documento, o termo "transgene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir.Cb02009)" ou "gene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir. Cb02009)" é qualquer transgene que tem menos do que 80% de identidade de sequência com a sequência de codificação de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Chb02009) (SEQ ID NO:6 com o Nome de Locus de Phytozome de Pavir.3NGO027800 e Nome de Transcrição de Pavir.3NG027800.1 (primário) que está localizada em Chro3N:2179636..2180523 reverso e também conhecido pelas descrições Alias seguintes (Alias; Pavir.Cb02009, Pavir.Cb02009.v1.1, e/ou Pavir.Cb02009.1.v1.1).).
[0028] Um "produto de gene", conforme definido no presente documento, é qualquer produto produzido pelo gene. Por exemplo, o produto de gene pode ser o produto de transcrição direto de um gene (por exemplo, mMRNA, tRNA, rRNA, RNA antissenso, RNA de interferência, ribozima, RNA estrutural ou qualquer outro tipo de RNA) ou uma proteína produzida por tradução de um mMRNA. Os produtos de gene também incluem RNA que são modificados, por processos, como capeamento, poliadenilação, metilação, e edição, e proteínas modificadas por, por exemplo, metilação, acetilação, fosforilação,
ubiquitinação, ADP-ribosilação, miristilação e glicosilação. A expressão de gene pode ser influenciada por sinais externos, por exemplo, exposição de uma célula, tecido, ou organismo a um agente que aumenta ou diminui a expressão de gene. Expressão de um gene também pode ser regulada em qualquer parte da via de DNA a RNA a proteína. A regulação de expressão de gene ocorre, por exemplo, através de controles que atuam em transcrição, tradução, transporte de RNA e processamento, degradação de moléculas intermediárias, como MRNA, ou através da ativação, desativação, compartimentalização, ou degradação de moléculas de proteína específicas após terem sido feitas, ou por combinações das mesmas. A expressão de gene pode ser medida no nível de RNA ou o nível de proteína por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, Northern blot, RT-PCR, Western blot, ou ensaio de atividade de proteína in vitro, in situ, ou in vivo (ou ensaios de atividade de proteína in vitro, in situ ou in vivo).
[0029] Conforme usado no presente documento, o termo "expressão de gene" se refere ao processo pelo qual as informações codificadas de uma unidade de transcrição de ácido nucleico (incluindo, por exemplo, DNA genômico) são convertidas em uma parte operacional, não operacional ou estrutural de uma célula, incluindo frequentemente a síntese de uma proteína. A expressão de gene pode ser influenciada por sinais externos, por exemplo, exposição de uma célula, tecido, ou organismo a um agente que aumenta ou diminui a expressão de gene. Expressão de um gene também pode ser regulada em qualquer parte da via de DNA a RNA a proteína. A regulação de expressão de gene ocorre, por exemplo, através de controles que atuam em transcrição, tradução, transporte de RNA e processamento, degradação de moléculas intermediárias, como mMRNA, ou através da ativação, desativação, compartimentalização, ou degradação de moléculas de proteína específicas após terem sido feitas, ou por combinações das mesmas. A expressão de gene pode ser medida no nível de RNA ou o nível de proteína por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, Northern blot, RT-PCR, Western blot, ou ensaio de atividade de proteína in vitro, in situ, ou in vivo (ou ensaios de atividade de proteína in vitro, in situ ou in vivo).
[0030] Conforme usado no presente documento, "silenciamento de gene com base em homologia" (HBGS) é um termo genérico que inclui tanto o silenciamento de gene de transcrição quanto o silenciamento de gene pós-transcrição. Silenciamento de um locus-alvo por um locus de silenciamento não ligado pode resultar da inibição de transcrição (silenciamento de gene de transcrição; TGS) ou degradação de MRNA (silenciamento de gene de pós-transcrição; PTGS), devido à produção de RNA de fita dupla (dsRNA) correspondente às sequências promotoras ou transcritas, respectivamente. O envolvimento de componentes celulares distintos em cada processo sugere que TGS e PTGS induzidos por dsRNA resultarão provavelmente da diversificação de um mecanismo comum antigo. Entretanto, uma comparação estrita de TGS e PTGS foi difícil de alcançar devido ao fato de que depende geralmente da análise de loci de silenciamento distinto. Em alguns casos, um locus de transgene único pode acionar tanto TGS quanto PTGS, devido à produção de dsRNA correspondente ao promotor e sequências transcritas de genes-alvo diferentes. Mourrain et a/. (2007) Planta 225:365 a 379. É provável que siRNA sejam as moléculas reais que acionam TGS e PTGS em sequências homólogas: os siRNA acionariam, nesse modelo, o silenciamento e a metilação de sequências homólogas em cis e em trans através do espalhamento de metilação de sequências de transgene no promotor endógeno.
[0031] Conforme usado no presente documento, o termo "molécula de ácido nucleico" (ou "ácido nucleico" ou "polinucleotídeo") pode se referir a uma forma polimérica de nucleotídeos, a qual pode incluir tanto filamentos senso quanto antissenso de RNA, cDNA, DNA genômico, e formas sintéticas e polímeros misturados do supracitado. Um nucleotídeo pode se referir a um ribonucleotídeo, desoxirribonucleotídeo, ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. Uma "molécula de ácido nucleico", conforme usado no presente documento, é sinônimo de "ácido nucleico" e "polinucleotídeo". A molécula de ácido nucleico tem normalmente pelo menos 10 bases em comprimento, a menos que especificado de outro modo. O termo pode se referir a uma molécula de RNA ou DNA de comprimento indeterminado. O termo inclui formas de fita simples e dupla de DNA. Uma molécula de ácido nucleico pode incluir qualquer um dentre ou ambos os nucleotídeos de ocorrência natural e modificados ligados juntos por ligações de nucleotídeo de ocorrência natural e/ou de ocorrência não natural.
[0032] As moléculas de ácido nucleico podem ser modificadas quimicamente ou bioquimicamente, ou podem conter bases de nucleotídeo não natural ou derivadas, assim como serão prontamente observadas por técnicos no assunto. Tais modificações incluem, por exemplo, identificações, metilação, substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, modificações internucleotídeo (por exemplo, ligações não carregadas: por exemplo, fosfonatos de metil, fosfotriésteres, fosforamiditas, carbamatos, etc.; ligações carregadas: por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.; porções químicas pendentes: por exemplo, peptídeos; intercaladores: por exemplo, acridina, psoraleno, etc.; quelantes; alquilantes; e ligações modificadas: por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). O termo "molécula de ácido nucleico" também inclui qualquer conformação topológica, incluindo conformações de fita simples, de fita dupla, parcialmente duplexadas, triplexadas, em formato de grampo, circulares e travadas.
[0033] A transcrição avança de maneira 5' a 3' ao longo de uma fita de DNA. Isso significa que RNA é feito pela adição sequencial de ribonucleotídeo-5'-trifosfatos à terminação 3' da cadeia crescente (com uma eliminação necessária do pirofosfato). Em uma molécula de ácido nucleico linear ou circular, os elementos distintos (por exemplo, sequências de nucleotídeo particulares) podem ser denominados "a montante" ou "5' " em relação a um elemento adicional se forem ligados ou seriam ligados ao mesmo ácido nucleico na direção 5' daquele elemento. De modo similar, os elementos distintos podem estar "a jusante" ou "3"" em relação a um elemento adicional se forem ou seriam ligados ao mesmo ácido nucleico na direção 3' desse elemento.
[0034] Uma "posição" de base, conforme usado no presente documento, se refere à localização de um dado resíduo de nucleotídeo ou base em um ácido nucleico designado. O ácido nucleico designado pode ser definido por alinhamento (consultar abaixo) com um ácido nucleico de referência.
[0035] A hibridização se refere à ligação de duas fitas de polinucleotideo — por meio de ligações de hidrogênio. Os oligonucleotídeos e seus análogos hibridizam por ligação de hidrogênio, os quais incluem ligação de hidrogênio Watson-Crick, Hoogsteen ou Hoogsteen reversa, entre bases complementares. Em geral, as moléculas de ácido nucleico consistem em bases nitrogenosas que são pirimidinas (citosina (C), uracila (U), e timina (T)) ou purinas (adenina (A) e guanina (G)). Essas bases nitrogenosas formam ligações de hidrogênio entre uma pirimidina e uma purina, e a ligação da pirimidina à purina é denominada "pareamento de base." Mais especificamente, À fará ligação de hidrogênio com T ou U, e G se ligará a C. "Complementar" se refere ao pareamento de base que ocorre entre duas sequências de ácido nucleico distintas ou duas regiões distintas da mesma sequência de ácidos nucleicos.
[0036] "Especificamente hibridizável" e "especificamente complementar" são termos que indicam um grau suficiente de complementaridade de modo que a ligação estável e específica ocorra entre o oligonucleotídeo e o alvo de DNA ou RNA. O oligonucleotídeo não precisa ser 100% complementar à sua sequência-alvo para ser especificamente hibridizável. Um oligonucleotídeo é especificamente hibridizável quando a ligação do oligonucleotídeo à molécula de DNA ou RNA alvo interfere com a função normal do DNA ou RNA alvo, e há grau suficiente de complementaridade para evitar a ligação não específica do oligonucleotídeo a sequências não alvo sob condições em que a ligação específica é desejável, por exemplo, sob condições fisiológicas no caso de ensaios ou sistemas in vivo. Tal ligação é denominada como uma hibridização específica.
[0037] As condições de hibridização que resultam em graus particulares de estringência variarão dependendo da natureza do método de hibridização escolhido e a composição e comprimento das sequências de ácido nucleico de hibridização. Em geral, a temperatura de hibridização e a força iônica (especialmente a concentração de Na+ e/ou Mg2+) do tampão de hibridização contribuirá para a estringência de hibridização, embora tempos de lavagem também influenciem a estringência. Os cálculos em relação às condições de hibridização necessários para alcançar graus particulares de estringência são discutidos em Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.º edição, volumes 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova lorque, 1989, capítulos 9 e 11.
[0038] Conforme usado no presente documento, "condições estringentes" abrangem condições sob as quais a hibridização ocorrerá apenas se houver menos do que 50% de divergência entre a molécula de hibridização e o alvo de DNA. "Condições estringentes" incluem adicionalmente níveis particulares de estringência. Desse modo,
conforme usado no presente documento, condições de "estringência moderada" são aquelas sob as quais as moléculas com mais do que 50% de divergência de sequência não hibridizarão; as condições de "alta estringência" são aquelas sob as quais as sequências com mais do que 20% de divergência não hibridizarão; e condições de "estringência muito alta" são aquelas sob as quais as sequências com mais do que 10% de divergência não hibridizarão.
[0039] Em modalidades particulares, as condições estringentes podem incluir hibridização a 65ºC, seguida por lavagens a 65ºC com SSC 0,1xX/SDS 0,1% por 40 minutos.
[0040] As seguintes são condições de hibridização não limitantes representativas:
[0041] Estringência Muito Alta: A hibridização em tampão SSC 5x a 65ºC por 16 horas; lavagem duas vezes em tampão SSC 2x à temperatura ambiente por 15 minutos cada uma; e lavagem duas vezesem tampão SSC 0,5x a 65ºC por 20 minutos cada um.
[0042] Alta Estringência: A hibridização em tampão SSC 5x a 6X a 65 a 70ºC por 16 a 20 horas; lavagem duas vezes em tampão SSC 2x à temperatura ambiente por 5 a 20 minutos cada uma; e lavagem duas vezes em tampão SSC 1x a 55 a 70ºC por 30 minutos cada um.
[0043] Estringência Moderada: Hibridização em tampão SSC 6x à temperatura ambiente a 55ºC por 16 a 20 horas; lavagem pelo menos duas vezes em tampão SSC 2x a 3x à temperatura ambiente a 55ºC por a 30 minutos cada um.
[0044] Em modalidades particulares, moléculas de ácido nucleico especificamente —hibridizáveis podem permanecer ligadas sob condições de hibridização de estringência muito alta. Nessas e em modalidades adicionais, moléculas de ácido nucleico especificamente hibridizáveis podem permanecer ligadas sob condições de hibridização de estringência alta. Nessas e em modalidades adicionais, moléculas de ácido nucleico especificamente hibridizáveis podem permanecer ligadas sob condições de hibridização de estringência moderada.
[0045] Oligonucleotídeo: Um oligonucleotídeo é um polímero de ácido nucleico curto. Os oligonucleotídeos podem ser formados por clivagem de segmentos de ácido nucleico mais longos, ou por polimerização de precursores de nucleotídeo individual. Os sintetizadores automatizados permitem a síntese de oligonucleotídeos até diversas centenas de pares de bases em comprimento. Devido ao fato de que os oligonucleotídeos podem se ligar a uma sequência de nucleotídeos complementar, os mesmos podem ser usados como sondas para detectar DNA ou RNA. Os oligonucleotídeos compostos de DNA (oligodesoxirribonucleotídeos) podem ser usados em PCR, uma técnica para a amplificação de sequências de DNA pequenas. Em PCR, o oligonucleotídeo é tipicamente denominado como "iniciador", o qual permite que uma DNA polimerase estenda o oligonucleotídeo e replique a fita complementar.
[0046] Os termos "porcentagem de identidade de sequência" ou "porcentagem de identidade" ou "identidade" são usados de modo intercambiável para se referir a uma comparação de sequência com base em correspondências idênticas entre posições consequentemente idênticas nas sequências comparadas entre duas ou mais sequências de aminoácidos ou nucleotídeo. A porcentagem de identidade se refere à extensão em que duas sequências de polinucleotídeo ou peptídeo alinhadas de modo otimizado são invariáveis ao longo de uma janela de alinhamento de componentes, por exemplo, nucleotídeos ou aminoácidos. Os experimentos de hibridização e algoritmos matemáticos conhecidos na técnica podem ser usados para determinar a porcentagem de identidade. Muitos algoritmos matemáticos existem como programas de computador de alinhamento de sequência conhecidos na técnica que calculam a porcentagem de identidade.
Esses programas podem ser categorizados como programas de alinhamento de sequência globais ou programas de alinhamento de sequência locais.
[0047] Os programas de alinhamento de sequência global calculam a porcentagem de identidade de duas sequências por comparação de alinhamentos de extremidade a extremidade a fim de encontrar correspondências exatas, dividindo o número de correspondências exatas pelo comprimento das sequências mais curtas, e, então, multiplicando-se por 100. Basicamente, a porcentagem de nucleotídeos idênticos em uma sequência de polinucleotídeos linear de uma molécula de polinucleotídeo de referência ("consulta") em comparação com uma molécula de polinucleotídeo de teste ("assunto") quando as duas sequências são alinhadas de modo otimizado (com inserções, deleções ou lacunas de nucleotídeo apropriadas).
[0048] Os programas de alinhamento de sequência locais são similares em seu cálculo, mas apenas comparam fragmentos alinhados das sequências em vez de utilizar uma análise de extremidade a extremidade. Os programas de alinhamento de sequência local, como BLAST podem ser usados para comparar regiões específicas de duas sequências. Uma comparação de BLAST de duas sequências resulta em um valor E, ou valor de expectativa, que representa o número de alinhamentos diferentes com pontuações equivalentes a ou melhores do que a pontuação de alinhamento bruta, S, que se espera que ocorram em uma busca de banco de dados ao acaso. Quanto mais baixo o valor E, mais significativa a correspondência. Devido ao fato de que o tamanho de banco de dados é um elemento em cálculos de valor E, valores E obtidos por BLASTing em relação a bancos de dados públicos, como GENBANK, em geral, aumentaram ao longo do tempo para qualquer determinada consulta/correspondência de entrada. Em critérios de definição para segurança de previsão de função de polipeptídeo, uma "alta" correspondência de BLAST é considerada no presente documento como tendo um valor E para o acerto de BLAST superior de menos do que 16-30; um valor E de BLASTX médio é 1E- a 1KE-8; e um valor E de BLASTX baixo é maior que 1E-8. A atribuição de função de proteína na presente invenção é determinada com o uso de combinações de valores E, porcentagem de identidade, cobertura de consulta e cobertura de acerto.
A cobertura de consulta se refere à porcentagem da sequência de consulta que é representada no alinhamento de BLAST.
A cobertura de acerto se refere à porcentagem da entrada de banco de dados que é representada no alinhamento de BLAST.
Em uma modalidade da invenção, a função de um polipeptídeo de consulta é inferida a partir da função de um homólogo de proteína em que ou (1) hit p<1e-30 ou % de identidade >35% E query coverage >50% E hit coverage >50%, ou (2) hit p<1e-8 E query coverage >70% E hit coverage >70%. As abreviações a seguir são produzidas durante uma análise de BLAST de uma sequência.
SEQ NUM fornece a SEQ ID NO para as sequências de polinucleotídeos recombinantes listadas.
CONTIG ID fornece um nome de sequência arbitrária tomado a partir do nome do clone do qual a sequência de cDNA foi obtida.
PROTEIN NUM fornece a SEQ ID NO para a sequência de polipeptídeos recombinantes NCBI GI fornece o número de ID de GenBank para o acerto de BLAST superior para a sequência.
O acerto de BLAST superior é indicado pelo Número de Identificador do National! Center for Biotechnology Information GenBank.
NCBI GI DESCRIPTION se refere à descrição do acerto de BLAST superior de GenBank para a sequência.
E VALUE fornece o valor suposto para a correspondência de BLAST superior.
MATCH LENGTH fornece o comprimento da sequência que é alinhado na correspondência de BLAST superior TOP HIT PCT IDENT se refere à porcentagem de nucleotídeos correlacionados de modo idêntico (ou resíduos) que existim ao longo do comprimento dessa porção das sequências que são alinhadas na correspondência de BLAST superior.
CAT TYPE indica o esquema de classificação usado para classificar a sequência. GO BP = Consórcio de Ontologia de Gene —processo biológico; GO CC = Consórcio de Ontologia de Gene— componente celular; GO MF = Consórcio de Ontologia de Gene - função molecular; KEGG = KEGG hierarquia funcional (KEGG = Enciclopédia Kyoto de Genes e Genomas); EC = Classifcação de Enzima partir de liberação de banco de dados de ENZIMA 25.0; POI = Vias de Interesse.
CAT DESC fornece a subcategoria de esquema de classificação para a qual a sequência de consulta foi designada.
PRODUCT CAT DESC fornece a categoria de anotação de FunCAT para a qual a sequência de consulta foi designada.
PRODUCT HIT DESC fornece a descrição do acerto de BLAST que resultou em atribuição da sequência à categoria de função fornecida na coluna cat desc.
HIT E fornece o valor E para o acerto de BLAST na coluna hit desc.
PCT IDENT se refere à porcentagem de nucleotídeos correlacionados de modo idêntico (ou resíduos) que existem ao longo do comprimento dessa porção das sequências que é alinhada na correspondência de BLAST fornecido em hit desc.
QRY RANGE lista a faixa da sequência de consulta alinhada com o acerto.
HIT RANGE lista a faixa da sequência de acerto alinhada com a consulta.
QRY CVRG fornece a porcentagem de comprimento de sequência de consulta que corresponde à sequência de acerto (NCBI) na correspondência de BLAST (% de qry cvrg = (comprimento de correspondência/comprimento total de consulta) x 100).
HIT CVRG fornece a porcentagem de comprimento de sequência de acerto que corresponde à sequência de consulta na correspondência gerada com o uso de BLAST (% de cvrg de acerto = (comprimento de correspondência/comprimento total de acerto) x 100).
[0049] Os métodos para alinhar as sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Diversos programas e algoritmos de alinhamento são descritos. Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo de porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso de um programa de alinhamento AlignX do pacote de NTI de Vetor (Invitrogen, Carlsbad, CA). O programa de alinhamento AlignX é um programa de alinhamento de sequência global para polinucleotídeos ou proteínas.
Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa MegAlign do pacote de computação de bioinformática LASERGENE (MegAlign'y (01993- 2016). DNASTAR. Madison, WI). O programa MegAlign é um programa de alinhamento de sequência global para polinucleotídeos ou proteínas.
Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do pacote Clustal de programas de alinhamento, incluindo, porém, sem limitação, ClustalW e ClustalV (Higgins e Sharp (1988) Gene. Dec. 15;73(1):237-44; Higgins e Sharp
(1989) CABIOS 5:151-3; Higgins et a/. (1992) Comput.
Appl.
Biosci. 8:189-91). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do pacote GCG de programas (Wisconsin Package Versão 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do pacote BLAST de programas de alinhamento, por exemplo, porém, sem limitação, BLASTP, BLASTN, BLASTX, etc. (Altschul et a/. (1990) J.
Mol.
Biol. 215:403-10). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do pacote FASTA de programas de alinhamento, incluindo, porém, sem limitação, FASTA, TFASTX, TFASTY, SSEARCH, LALIGN etc. (Pearson (1994) Comput.
Methods Genome Res. [Proc.
Int.
Symp.], Data do Encontro, 1992 (Suhai e Sandor, Eds.), Plenum: Nova lorque, NY, pp. 111-20). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa de alinhamento T-Coffee (Notredame, et. al. (2000) J.
Mol.
Biol. 302, 205-17). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do pacote DIALIGN de programas de alinhamento, incluindo, porém, sem limitação DIALIGN, CHAOS, DIALIGN-TX, DIALIGN-T etc. (Al Ait, et. al. (2013) DIALIGN em GOBICS Nuc.
Acids Research 41, W3-W7). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do pacote MUSCLE de programas de alinhamento (Edgar (2004) Nucleic Acids Res. 32(5): 1792-1797). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa de alinhamento MAFFT (Katoh, et. al. (2002) Nucleic Acids Research 30(14): 3059-3066) Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa Genoogle (Albrecht, Felipe. arXiv150702987v1 [cs.DC] 10 de julho de 2015). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do pacote HMMER de programas (Eddy. (1998) Bioinformatics, 14:755-63) Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do pacote PLAST de programas de alinhamento, incluindo, porém, sem limitação, TPLASTN, PLASTP, KLAST e PLASTX (Nguyen & Lavenier. (2009) BMC Bioinformatics, 10:329). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa de alinhamento USEARCH (Edgar (2010) Bioinformatics 26(19), 2460-61). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do pacote SAM de programas de alinhamento (Hughey & Krogh (jan. de 1995) Technical Report UCSCOCRL-95-7, Universidade da Califórnia, Santa Cruz). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do Buscador IDF (O'Kane, K.C., The Effect of Inverse Document Frequency Weights on Indexed Sequence Retrieval, Online Journal of Bioinformatics, Volume 6 (2) 162-173, 2005). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa de alinhamento Parasail. (Daily, Jeff.
Parasail: SIMD C library for global, semi-global, and local pairwise sequence alignments.
BMC Bioinformatics. 17:18. 10 de fevereiro de 2016). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa de alinhamento ScalaBLAST (Oehmen C, Nieplocha J. "ScalaBLAST: A scalable implementation of BLAST for high-performance data-intensive bioinformatics analysis." IEEE Transactions on Parallel & Distributed Systems 17 (8): 740-749 ago. de 2006). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa de alinhamento SWIPE (Rognes, T.
Faster Smilth-Waterman database searches with inter-sequence SIMD parallelization.
BMC Bioiinformatics. 12, 221 (2011)). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa de alinhamento ACANA (Weichun Huang, David M.
Umbach, e Leping Li, Accurate anchoring alignment of divergent sequences.
Bioinformatics 22:29-34, 1 de janeiro de 2006). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa de alinhamento DOTLET (Junier, T. & Pagni, M.
DOTLET: diagonal plots in a web browser.
Bioinformatics 16(2): 178-9 fev. de 2000). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa de alinhamento G-PAS (Frohmberg, W., et al.
Conforme usado no presente documento, o termo "operacionalmente ligado" se refere a uma primeira sequência de ácidos nucleicos que é operacionalmente ligada a uma segunda sequência de ácidos nucleicos quando a primeira sequência de ácidos nucleicos está em uma relação funcional com a segunda sequência de ácidos nucleicos.
Por exemplo, um promotor é operacionalmente ligado a uma sequência de codificação quando o promotor afeta a transcrição ou expressão da sequência de codificação.
Quando produzidas de modo recombinante, sequências de ácidos nucleicos operacionalmente ligadas são geralmente contíguas e, quando necessário, para unir duas regiões de codificação de proteína, no mesmo quadro de leitura.
No entanto, os elementos não precisam ser contíguos para serem ligados de maneira funcional.
G-PAS 2.0 — uma versão aprimorada de ferramenta de alinhamento de proteína com uma rotina de retrocesso eficaz em múltiplos GPU.
Bulletin of the Polish Academy of Sciences Technical Sciences, Vol. 60, 491, nov. de 2012). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa de alinhamento GapMis (Flouri, T. et. al., Gap Mis: A tool for pairwise sequence alignment with a single gap.
Recent Pat DNA Gene Segq. 7(2): 84-95, ago. de 2013). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do pacote de EMBOSS de programas de alinhamento, incluindo, porém, sem limitação: Matcher, Needle, Stretcher, Water, Wordmatch, etc. (Rice, P., Longden, |. & Bleasby, A.
EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite.
Trends in Genetics 16(6) 276-77 (2000)). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa de alinhamento Ngila (Cartwright, R.
Ngila: global pairwise alignments with logarithmic and affine gap costs.
Bioinformatics. 23(11): 1427-28. 1 de junho de 2007). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do probA, também conhecido como propA, programa de alinhamento (Múuckstein, U., Hofacker, IL, & Stadler, PF.
Stochastic pairwise alignments.
Bioinformatics 18 Suppl. 2:8153-60. 2002). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do pacote SEQALN de programas de alinhamento (Hardy, P. & Waterman, M.
The Sequence Alignment Software Library at USC. 1997). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do pacote SIM de programas de alinhamento, incluindo, porém, sem limitação, GAP, NAP, LAP, etc. (Huang, X & Miller, W.
A Time-Efficient, Linear- Space Local Similarity Algorithm.
Advances in Applied Mathematics, vol. 12 (1991) 337-57). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa de alinhamento UGENE (Okonechnikov, K., Golosova, O. & Fursov, M.
Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit.
Bioinformatics. 2012 28:1166-67). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa de alinhamento BAli-Phy (Suchard, MA & Redelings, BD.
BAli-Phy: simultaneous Bayesian inference of alignment and phylogeny.
Bioinformatics. 22:2047-48. 2006). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa de alinhamento Base-By-Base (Brodie, R., et. al.
Base-By-Base: Single nucleotide-level analysis of whole viral genoma alignments, BMC Bioinformatics, 5, 96,
2004). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa de alinhamento DECIPHER (ES Wright (2015) "DECIPHER: harnessing local sequence context to improve protein multiple sequence alignment." BMC Bioinformatics, doi: 10.1186/s12859-015-0749-z.). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa de alinhamento FSA (Bradley, RK, et. al. (2009) Fast Statistical Alignment.
PLoS Computational Biology. 5:21000392). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa de alinhamento Geneious (Kearse, M., et. al. (2012). Geneious Basic: an integrad and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data.
Bioinformatics, 28(12), 1647-49). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa de alinhamento Kalign (Lassmann, T. & Sonnhammer, E.
Kalign — an accurate and fast multiple sequence alignment algorithm.
BMC Bioinformatics 2005 6:298). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa de alinhamento MAVID (Bray, N. & Pachter, L.
MAVID: Constrained Ancestral Alignment of Multiple Sequences.
Genome Res.
Abril de 2004; 14(4): 693-99). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa de alinhamento MSA (Lipman, DJ, et.al.
A tool for multiple sequence alignment.
Proc.
Nat' Acad.
Sci.
USA. 1989; 86:4412-15). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa de alinhamento MultAlin (Corpet, F., Multiple sequence alignment with hierarchial clustering.
Nucl.
Acids Res., 1988, 16(22), 10881-90). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso dos programas de alinhamento LAGAN ou MLAGAN (Brudno, et. al.
LAGAN and Multi- LAGAN: efficient tools for large-scale multiple alignment of genomic DNA.
Genome Research abril de 2003; 13(4): 721-31). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa de alinhamento Opal (Wheeler, T.J., & Kececiouglu, J.D.
Multiple alignment by aligning alignments.
Proceedings of the 15th ISCB conference on Intelligent Systems for Molecular Biology.
Bioinformatics. 23, i559-68, 2007) Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do pacote PicXAA de programas, incluindo, porém, sem limitação, PIcXAA, PicXAA-R, PicXAA-Web, etc. (Mohammad, S., Sahraeian, E. & Yoon, B.
PicXAA: greedy probabilistic construction of maximum expected accuracy alignment de multiple sequences.
Nucleic Acids Research. 38(15):4917-28. 2010). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa de alinhamento PSAlign (SZE, S.-H., Lu, Y., & Yang, Q. (2006) A polinomial time solvable formulation of multiple sequence alignment Journal of Computational Biology, 13, 309-19). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa de alinhamento StatAlign (Novák, Á., et.al. (2008) StatAlign: an extendable software package for joint Bayesian estimation of alignments and evolutionary trees. Bioinformatics, 24(20):2403-04). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa de alinhamento Gap de Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch, Journal of Molecular Biology 48:443-453, 1970). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa de alinhamento BestFit de Smith e Waterman (Smith e Waterman, Advances in Applied Mathematics, 2:482-489, 1981, Smith et a/., Nucleic Acids Research 11:2205-2220, 1983). Esses programas produzem alinhamentos de múltiplas sequências biologicamente significativas de sequências divergentes. Os alinhamentos de melhor correspondência calculados para as sequências selecionadas são alinhados de modo que identidades, similaridades e diferenças possam ser observadas.
[0050] O termo "similaridade" se refere a uma comparação entre sequências de aminoácidos, e leva em consideração não só aminoácidos idênticos em posições correspondentes, mas também aminoácidos de funcionalidade similar em posições correspondentes. Desse modo, similaridade entre sequências de polipeptídeos indica similaridade funcional, além de similaridade de sequência.
[0051] O termo "homologia" é, algumas vezes, usado para se referir ao nível de similaridade entre duas ou mais sequências de aminoácidos ou ácidos nucleicos em termos de porcentagem de identidade posicional (isto é, similaridade de sequência ou identidade). Homologia também se refere ao conceito de relação evolucionária, em geral, evidenciada por propriedades funcionais similares dentre diferentes ácidos nucleicos ou proteínas que compartilham sequências similares.
[0052] Conforme usado no presente documento, o termo "variantes" significa sequências substancialmente similares. Para sequências de nucleotídeos, variantes de ocorrência natural podem ser identificadas com o uso de técnicas de biologia molecular bastante conhecidas, tais como, por exemplo, com técnicas de reação em cadeia de polimerase (PCR) e de hibridização conforme delineado no presente documento.
[0053] Para as sequências de nucleotídeos, uma variante compreende uma deleção e/ou adição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítios internos dentro do polinucleotídeo nativo e/ou uma substituição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítios no polinucleotídeo nativo. Conforme usado no presente documento, uma sequência de nucleotídeos "nativa" compreende uma sequência de nucleotídeos de ocorrência natural. Para sequências de nucleotídeos, as variantes de ocorrência natural podem ser identificadas com o uso de técnicas de biologia molecular bem conhecidas, como, por exemplo, com técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR) e hibridização, conforme destacado abaixo. As sequências de nucleotídeos variantes também incluem sequências de nucleotídeos sinteticamente derivadas, como aquelas geradas, por exemplo, usando-se mutagênese de local direcionado. Geralmente, as variantes de uma sequência de nucleotídeos particular da invenção terão pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%>, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%o0, 99% ou mais de identidade de sequência com essa sequência de nucleotídeos particular conforme determinado por programas de alinhamento de sequências e parâmetros descritos em outra parte no presente documento. Uma variante biologicamente ativa de uma sequência de nucleotídeos da invenção pode diferir daquela sequência desde 1 a 15 resíduos de ácido nucleico, desde 1 a 10, como 6 a 10, desde 5, desde 4, 3, 2, ou até mesmo 1 resíduo de ácido nucleico.
[0054] Conforme usado no presente documento, o termo "operacionalmente ligado" se refere a uma primeira sequência de ácidos nucleicos é operacionalmente ligada a uma segunda sequência de ácidos nucleicos quando a primeira sequência de ácidos nucleicos está em uma relação funcional com a segunda sequência de ácidos nucleicos. Por exemplo, um promotor é operacionalmente ligado a uma sequência de codificação quando o promotor afeta a transcrição ou expressão da sequência de codificação. Quando produzidas de modo recombinante, sequências de ácidos nucleicos operacionalmente ligadas são geralmente contíguas e, quando necessário, para unir duas regiões de codificação de proteína, no mesmo quadro de leitura. No entanto, os elementos não precisam ser contíguos para serem ligados de maneira funcional.
[0055] Conforme usado no presente documento, o termo "promotor" se refere a uma região de DNA que geralmente está localizada a montante (em direção à região 5' de um gene) de um gene e é necessário para iniciar e acionar transcrição do gene. Um promotor pode permitir ativação ou repressão apropriadas de um gene que o mesmo controla. Um promotor pode conter sequências específicas que são reconhecidas por fatores de transcrição. Esses fatores podem se ligar a uma sequência de DNA de promotor, que resulta no recrutamento de polimerase de RNA, uma enzima que sintetiza RNA da região de codificação do gene. O promotor geralmente se refere a todos os elementos reguladores de gene localizados a montante do gene, incluindo, promotores a montante, UTR 5', íntrons e sequências líder.
[0056] Conforme usado no presente documento, o termo "promotor a montante" se refere a uma sequência de polinucleotídeos contígua que é suficiente para direcionar iniciação de transcrição. Conforme usado no presente documento, um promotor a montante abrange o sítio de iniciação de transcrição com diversos motivos de sequência, que incluem TATA Box, sequência de iniciadores, elementos de reconhecimento de TFIIB e outros motivos de promotor (Jennifer, E.F. et al., (2002) Genes & Dev., 16: 2583-2592). O promotor a montante fornece o sítio de ação para polimerase de RNA |l que é uma enzima de múltiplas subunidades com os fatores basais ou gerais de transcrição como, TFIIA, B, D, E, F e H. Esses fatores se agrupam em um complexo de pré-iniciação de transcrição que catalisa a síntese de RNA do modelo de DNA.
[0057] A ativação do promotor a montante é realizada pela sequência adicional de elementos reguladores de sequência de DNA aos quais diversas proteínas se ligam e interagem de modo subsequente com o complexo de iniciação de transcrição para ativar expressão de gene. Esses elementos reguladores de sequências de genes interagem com fatores de ligação de DNA específicos. Esses motivos de sequência podem, algumas vezes, ser denominados de cis- elementos. Tais cis-elementos, aos quais fatores de transcrição específicos de desenvolvimento ou específicos de tecido se ligam, individualmente ou em combinação, podem determinar o padrão de expressão espaço-temporal de um promotor no nível de transcrição. Esses cis-elementos variam amplamente no tipo de controle que os mesmos exercem em genes ligados de maneira funcional. Alguns elementos atuam para aumentar a transcrição de genes ligados de maneira funcional em resposta a respostas ambientais (por exemplo, temperatura, umidade e ferimento). Outros cis-elementos podem responder a sugestões desenvolvimentais (por exemplo, germinação, maturação de semente e florescimento) ou a informações espaciais (por exemplo, especificidade de tecido). Consultar, por exemplo, Langridge et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Scií USA 86:3219-23. Esses cis-elementos estão localizados em uma distância variável de ponto de partida de transcrição, alguns cis-elementos (chamados elementos proximais) são adjacentes a uma região de promotor de núcleo mínimo enquanto outros elementos podem ser posicionados diversos quilobases a montante ou a jusante do promotor (intensificadores).
[0058] Conforme usado no presente documento, os termos "região não traduzida 5"" ou "UTR 5" é definida como o segmento não traduzido no terminal 5' de pré-mnRNAs ou mMRNAs maduros. Por exemplo, em mMRNAs maduros, uma UTR 5' tipicamente abriga em sua extremidade 5' uma tampa cap de 7-metilguanosina e é envolvida em muitos processos, como splicing, poliadenilação, exportação de mMRNA em direção ao citoplasma, identificação da extremidade 5' do MRNA pelo maquinário de tradução, e proteção dos mMRNAs contra degradação.
[0059] Conforme usado no presente documento, os termos "terminador de transcrição" é definido como o segmento transcrito no terminal 3' de pré-mRNAs ou mRNAs maduros. Por exemplo, estiramentos mais longos de DNA além de sítio de "sinal de poliadenilação" são transcritos como um pré-mRNA. Essa sequência de DNA normalmente contém sinal de terminação de transcrição para o processamento apropriado do pré-mRNA em mRNA maduro.
[0060] Conforme usado no presente documento, o termo "região não traduzida 3"" ou "UTR 3"' é definido como o segmento não traduzido em um terminal 3' dos pré-mRNAs ou mRNAs maduros. Por exemplo, em mRNAs maduros, essa região abriga a poli-(A) cauda e é conhecida por ter muitos papéis em estabilidade de mMRNA, iniciação de tradução, e exportação de mRNA. Além disso, a UTR 3' é considerada como incluindo o sinal de poliadenilação e terminador de transcrição.
[0061] Conforme usado no presente documento, o termo "sinal de poliadenilação" designa uma sequência de ácidos nucleicos presentes em transcrições de mRNA que permitem transcrições, quando na presença de uma poli-(A) polimerase, a ser poliadenilado no sítio de poliadenilação, por exemplo, localizado 10 a 30 bases a jusante do poli-
(A) sinal. Muitos sinais de poliadenilação são conhecidos na técnica e são úteis para a presente invenção. Uma sequência exemplificativa inclui AAUAAA e variantes dos mesmos, como descrito em Loke J., et al., (2005) Plant Physiology 138(3); 1457-1468.
[0062] Um "transgene de ligação de DNA" é uma sequência de codificação de polinucleotídeo que codifica uma proteína de ligação de DNA. A proteína de ligação de DNA tem capacidade de se ligar de modo subsequente a outra molécula. Uma proteína de ligação pode se ligar a, por exemplo, uma molécula de DNA (uma proteína de ligação de DNA), uma molécula de RNA (uma proteína de ligação de RNA), e/ou uma molécula de proteína (uma proteína de ligação de proteína). No caso de uma proteína de ligação de proteína, a mesma pode se ligar a si mesma (para formar homodímeros, homotrímeros, etc.) e/ou pode se ligar a uma ou mais moléculas de uma proteína diferente ou proteínas diferentes. Uma proteína de ligação pode ter mais de um tipo de atividade de ligação. Por exemplo, proteínas de dedo de zinco têm ligação de DNA, ligação de RNA, e atividade de ligação de proteína.
[0063] Exemplos de proteínas de ligação de DNA incluem; meganucleases, dedos de zinco, CRISPRs, e domínios de ligação de TALEN que podem ser "geneticamente modificados" para se ligar a uma sequência de nucleotídeos predeterminada. Tipicamente, as proteínas de ligação de DNA geneticamente modificadas (por exemplo, dedos de zinco, CRISPRs ou TALEN) são proteínas que são de ocorrência não natural. Exemplos não limitantes de métodos para proteínas de ligação de DNA geneticamente modificadas são projeto e seleção. Uma proteína de ligação de DNA projetada é uma proteína de ocorrência não natural cujos projeto/composição resultam principalmente a partir de critérios racionais. Os critérios racionais para projeto incluem aplicação de regras de substituição e algoritmos computadorizados para processar informações em um banco de dados que armazena informações de projetos de ZFP, CRISPR e/ou TALEN existentes e dados de ligação. Consultar, por exemplo, Patentes dos EUA 6.140.081;
6.453.242; e 6.534.261; consultar também WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 e WO 03/016496 e Pedido dos EUA n.º 20110301073, 20110239315 e 20119145940.
[0064] Uma "proteína de ligação de DNA de dedo de zinco" (ou domínio de ligação) é uma proteína, ou um domínio dentro de uma proteína maior, que liga DNA de uma maneira específica de sequência através de um ou mais dedos de zinco, que são regiões de sequência de aminoácido dentro do domínio de ligação cuja estrutura é estabilizada através de coordenação de um fon de zinco. O termo proteína de ligação de DNA de dedo de zinco é, em geral, abreviado como proteína de dedo de zinco ou ZFP. Os domínios de ligação de dedo de zinco podem ser "geneticamente modificados" para se ligar a uma sequência de nucleotídeos predeterminada. Exemplos não limitantes de métodos para modificar geneticamente proteínas de dedo de zinco são projeto e seleção. Uma proteína de dedo de zinco projetada é uma proteína de ocorrência não natural cujos projeto/composição resultam principalmente a partir de critérios racionais. Os critérios racionais para projeto incluem aplicação de regras de substituição e algoritmos computadorizados para processar informações em um banco de dados que armazena informações de projetos de ZFP existente e dados de ligação. Consultar, por exemplo, as Patentes dos EUA nº U.S. 6.140.081; 6.453.242; 6.534.261 e
6.794.136; consultar também WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 e WO 03/016496.
[0065] Em outros exemplos, o domínio de ligação de DNA de um ou mais das nucleases compreende um domínio de ligação de DNA de efetor de TAL de ocorrência natural ou geneticamente modificado (ocorrência não natural). Consultar, por exemplo, Pedido de Patente dos n.º 20110301073, incorporado a título de referência em sua totalidade no presente documento.
As bactérias patogênicas de planta do gênero Xanthomonas são conhecidas por causar muitas doenças em plantas de cultura importantes.
A patogenicidade de Xanthomonas depende de um sistema de secreção de tipo Ill conservada (T3S) que injeta mais do que proteínas atuadoras diferentes na célula vegetal.
Dentre essas proteínas injetadas estão atuadores similares a ativador de transcrição (TALEN) que imitam ativadores transcricionais de planta e manipulam o transcritoma de planta (consultar Kay et al., (2007) Science 318:648- 651). Essas proteínas contêm um domínio de ligação de DNA e um domínio de ativação transcricional.
Um dos atuadores de TAL mais bem caracterizados é AvrBs3 de Xanthomonas campestgris pv.
Vesicatoria (consultar Bonas et al. (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136 e WO?2010079430). Os atuadores de TAL contêm um domínio centralizado de repetições em paralelo, em que cada repetição contém aproximadamente 34 aminoácidos, que são chave para a especificidade de ligação de DNA dessas proteínas.
Além disso, os mesmos contêm uma sequência de localização nuclear e um domínio ácido de ativação transcricional (para uma avaliação, consultar Schornack S, et a/., (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272). Além disso, nas bactérias patogênicas Ralstonia solanacearum dois genes, designados brg11 e hpx17 foram constatados como sendo homólogos à família AvrBs3 de Xanthomonas na cepa biovar R.
Solanacearum GMI1000 e na cepa biovar 4 R81000 (Consultar Heuer et a/., (2007) Appl and Enviro Micro 73(13): 4379- 4384). Esses genes são 98,9% idênticos em sequência de nucleotídeos entre si, mas diferem por uma deleção de 1.575 pb no domínio de repetição de hpx17. No entanto, ambos os produtos de gene têm menos do que 40% de identidade de sequência com proteínas de família AvrBs3 de Xanthomonas.
Consultar, por exemplo, Pedido de Patente dos EUA n.º 20110301073, incorporado a título de referência em sua totalidade.
[0066] A especificidade desses atuadores de TAL depende das sequências constatadas nas repetições em paralelo. A sequência repetida compreende aproximadamente 102 pb e as repetições são tipicamente 91 a 100% homólogas entre si (Bonas et al. ibid). O polimorfismo das repetições está normalmente localizado nas posições 12 e 13 e parece ser uma correspondência de um para um entre a identidade dos dirresíduos hipervariáveis nas posições 12 e 13 com a identidade dos nucleotídeos contíguos na sequência-alvo do atuador de TAL (consultar Moscou e Bogdanove, (2009) Science 326:1501 e Boch et al., (2009) Science 326:1509-1512). Experimentalmente, o código natural para reconhecimento de DNA desses atuadores de TAL foi determinado de modo que uma sequência de HD nas posições 12 e 13 leve a uma ligação à citosina (C), NG se liga a T, NI a A, C, G ou T, NN se liga a A ou G, e ING se liga a T. Essas repetições de ligação de DNA foram agrupadas em proteínas com novas combinações e números de repetições, para produzir fatores artificiais de transcrição que têm capacidade de interagir com novas sequências e ativar a expressão de um gene repórter não endógeno em células vegetais (Boch et a/., ibid). As proteínas de TAL geneticamente modificadas foram ligadas a um meio domínio de clivagem de Fokl para produzir uma fusão de nuclease de domínio de atuador de TAL (TALEN) que exibe atividade em um ensaio de repórter de levedura (alvo à base de plasmídeo).
[0067] O sistema de nuclease de CRISPR (Repetições Palindrômicas Curtas Interespaçadas Regularmente Agrupadas)/Cas (CRISPR Associado) é um sistema de nuclease recentemente geneticamente modificado com base em um sistema bacteriano que pode ser usado para modificação genética de genoma. A mesma tem como base, em parte, na resposta imune adaptativa de muitas bactérias e Archaea. Quando um vírus ou plasmídeo invade uma bactéria,
segmentos do DNA do invasor são convertidos em RNAs de CRISPR (crRNA) pela resposta "imune". Esse crRNA, então, se associa, através de uma região de complementaridade parcial, com outro tipo de RNA chamado tracrRNA para guiar a nuclease de Cas9 para uma região homóloga ao crRNA no DNA alvo chamado um "protoespaçador." Cas9 realiza a clivagem do DNA para gerar extremidades sem corte na ruptura de fita dupla (DSB) em sítios especificados por uma sequência guia de 20 nucleotídeos contida dentro da transcrição de cr»RNA. Cas9 necessita tanto do cr»RNA quanto do tracrRNA para reconhecimento de DNA específico de sítio e clivagem. Esse sistema foi, agora, geneticamente modificado de modo que o crRNA e o tracrRNA possam ser combinados em uma molécula (o "único RNA guia"), e a porção equivalente de crRNA do único RNA guia pode ser geneticamente modificada para guiar a nuclease de Cas9 para alvejar qualquer sequência desejada (consultar Jinek et a/., (2012) Science 337, pp. 816- 821, Jinek et al., (2013), eLife 2:200471, e David Segal, (2013) eLife 2:000563). Em outros exemplos, o cr>RNA se associa ao tracr»RNA para guiar a nuclease de Cpf1 para uma região homóloga ao crRNA para clivar DNA com extremidades escalonadas (consultar Zetsche, Bernd, et al. Cell 163.3 (2015): 759-771.). Desse modo, o sistema de CRISPR/Cas pode ser geneticamente modificado para criar um DSB em um alvo desejado em um genoma, e a reparação do DSB pode ser influenciada pelo uso de inibidores de reparação para ocasionar um aumento em reparo propenso a erro.
[0068] Em outros exemplos, o transgene de ligação de DNA é uma nuclease específica de sítio que compreende uma Meganuclease geneticamente modificada (ocorrência não natural) (também descrita como uma endonuclease de migração) As sequências de reconhecimento de endonucleases ou meganucleases de migração como |-Scel, I|-Ceul, PI-Pspl, Pl-Sce, I-ScelV, I-Csml, I|-Panl, I-Scell, I|-
Ppol, I-Scelll, |-Crel, I-Tevl, I-Tevll e I-Tevlll são conhecidas. Consultar também Patente dos EUA n.º 5,420,032; Patente dos EUA n.º
6.833.252; Belfort et a/., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-30 3388; Dujon et a/., (1989) Gene 82:115—118; Perler et a/., (1994) Nucleic Acids Res. 22, 11127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224—-228; Gimble et al., (1996) J. Mol. Biol. 263:163—180; Argast et a/., (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 e o catálogo New England Biolabs. Além disso, a especificidade de ligação de DNA de endonucleases e meganucleases de migração pode ser geneticamente modificada para se ligar a sítios de alvo não naturais. Consultar, por exemplo, Chevalier et al., (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et a/., (2003) Nucleic Acids Res. 5 31:2952-2962; Ashworth et al., (2006) Nature 441:656-659; Paques et al., (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; Pedido de Patente dos EUA n.º 20070117128. Os domínios de ligação de DNA das endonucleases e meganucleases de migração podem ser alterados no contexto da nuclease como um todo (isto é, de modo que a nuclease inclua o domínio de clivagem de cognato) ou possa ser fundida a um domínio de clivagem heterólogo.
[0069] Conforme usado no presente documento, o termo "transformação" abrange todas as técnicas que uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida em tal célula. Exemplos incluem, porém, sem limitação: transfecção com vetores virais; transformação com vetores de plasmídeo; eletroporação; lipofecção; microinjeção (Mueller et al., (1978) Cell 15:579-85); transferência mediada por Agrobacterium; absorção de DNA direta; transformação mediada por whiskers'""; e bombardeamento de microprojétil. Essas técnicas podem ser usadas tanto para transformação estável quanto transformação transitória de uma célula vegetal. "Transformação estável" se refere à introdução de um fragmento de ácido nucleico em um genoma de um organismo hospedeiro resultando em herança geneticamente estável. Após transformação estável, o fragmento de ácido nucleico é integrado de forma estável no genoma do organismo hospedeiro e qualquer geração subsequente. Os organismos hospedeiros que contêm os fragmentos de ácido nucleico transformados são chamados de organismos "transgênicos". "Transformação transiente" se refere à introdução de um fragmento de ácido nucleico no núcleo, ou organela que contém DNA, de um organismo hospedeiro, resultando em expressão gênica sem herança geneticamente estável.
[0070] Uma sequência exógena de ácidos nucleicos. Em um exemplo, um transgene é uma sequência de genes (por exemplo, um gene resistente a herbicida), um gene que codifica um composto industrial ou farmaceuticamente útil, ou um gene que codifica um traço agrícola desejado. Em ainda outro exemplo, o transgene é uma sequência de ácidos nucleicos antissenso, em que a expressão da sequência de ácidos nucleicos antissenso inibe a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos alvo. Um transgene pode conter sequências reguladoras operacionalmente ligadas ao transgene (por exemplo, um promotor). Em algumas modalidades, uma sequência de polinucleotídeos de interesse é um transgene. No entanto, em outras modalidades, uma sequência de polinucleotídeos de interesse é uma sequência endógena de ácidos nucleicos, em que cópias genômicas adicionais da sequência endógena de ácidos nucleicos são desejadas, ou uma sequência de ácidos nucleicos que está na orientação antissenso em relação à sequência de uma molécula alvo de ácido nucleico no organismo hospedeiro.
[0071] Conforme usado no presente documento, o termo um "evento" transgênico é produzido por transformação de células vegetais com DNA heterólogo, isto é, um construto de ácido nucleico que inclui um transgene de interesse, regeneração de uma população de plantas que resulta da inserção do transgene no genoma da planta, e seleção de uma planta particular caracterizada por inserção em uma localização de genoma particular. O termo "evento" se refere ao transformador original e progênie da transformação que incluem o DNA heterólogo. O termo "evento" também se refere a progênie produzida por um cruzamento sexual entre a transformação e outra variedade que inclui o DNA genômico/transgene. Mesmo após retrocruzamento repetido para um parente recorrente, o DNA de transgene inserido e DNA genômico de flanqueamento (DNA genômico/transgene) do parente transformado está presente na progênie do cruzamento na mesma localização cromossômica. O termo "evento" também se refere a DNA do transformador original e progênie do mesmo que compreende o DNA inserido e sequência genômica de flanqueamento imediatamente adjacente ao DNA inserido que esperava-se que fosse transferido para uma progênie que recebe DNA inserido, incluindo o transgene de interesse como resultado de um cruzamento sexual de uma linhagem parental que inclui o DNA inserido (por exemplo, o transformador original e progênie que resultam de autopolinização) e uma linhagem parental que não contém o DNA inserido.
[0072] Conforme usado no presente documento, os termos "Reação de Cadeia de Polimerase" ou "PCR" definem um procedimento ou técnica na qual quantidades por minuto de ácido nucleico, RNA e/ou DNA, são amplificadas, como descrito na Pat. dos EUA n.º 4.683.195 expedida em 28 de julho de 1987. Em geral, informações de sequência das extremidades da região de interesse ou além precisam estar disponíveis, de modo que iniciadores de oligonucleotídeo possam ser projetados; esses iniciadores serão idênticos ou similares em sequência aos filamentos opostos do modelo a ser amplificado. Os nucleotídeos de terminal 5' dos dois iniciadores podem coincidir com as extremidades do material amplificado. PCR pode ser usado para amplificar sequências de RNA específicas, sequências de DNA específicas de
DNA genômico total, e CDNA transcrito do RNA celular total, sequências de bacteriófago ou plasmídeo, etc. Consultar geralmente Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989).
[0073] Conforme usado no presente documento, o termo "iniciador" se refere a um oligonucleotídeo com capacidade de atuar como um ponto de iniciação de síntese ao longo de uma fita complementar quando condições são adequadas para síntese de um produto de extensão de iniciador. As condições de sintetização incluem a presença de quatro trifosfatos de desoxirribonucleotídeo diferentes e pelo menos um agente de indução de polimerização como transcriptase reversa ou DNA polimerase. Os mesmos estão presentes em um tampão adequado, que pode incluir constituintes que são cofatores ou que afetam condições, como pH e similares em diversas temperaturas adequadas. Um iniciador é, de preferência, uma sequência de fita única, de modo que eficácia de amplificação seja otimizada, mas sequências de fita dupla possam ser utilizadas.
[0074] Conforme usado no presente documento, o termo "sonda" se refere a um oligonucleotídeo que hibridiza para uma sequência-alvo. No procedimento de ensaio TaqManG ou de estilo TaqManO, a sonda hibridiza para uma porção do alvo situado entre o sítio de recozimento dos dois iniciadores. Uma sonda inclui cerca de oito nucleotídeos, cerca de dez nucleotídeos, cerca de quinze nucleotídeos, cerca de vinte nucleotídeos, cerca de trinta nucleotídeos, cerca de quarenta nucleotídeos, ou cerca de cinquenta nucleotídeos. Em algumas modalidades, uma sonda inclui de cerca de oito nucleotídeos a cerca de quinze nucleotídeos. Uma sonda pode incluir ainda uma identificação detectável, por exemplo, um fluoróforo (Texas-RedG, isotiocianato de fluoresceína, etc.,). A identificação detectável pode ser fixada de modo covalente diretamente ao oligonucleotídeo de sonda, por exemplo,
localizado na extremidade 5' da sonda ou na extremidade 3' da sonda. Uma sonda que inclui um fluoróforo pode também incluir ainda um arrefecedor brusco, por exemplo, Black Hole QuencherTY, lowa BlackTY, etc.
[0075] Conforme usado no presente documento, os termos "endonucleases de restrição" e "enzimas de restrição" se referem a enzimas bacterianas, cada uma das quais corta DNA de fita dupla em ou próximo a uma sequência específica de nucleotídeos. As enzimas de restrição do tipo 2 reconhecem e clivam DNA no mesmo sítio, e incluem porém, sem limitação, Xbal, BamHI, Hindlll, EcoRI, Xhol, Sall, Kpnl, Aval, Pst! e Smal.
[0076] Conforme usado no presente documento, o termo "vetor" é usado de modo intercambiável com os termos "construto", "vetor de clonagem" e "vetor de expressão" e significam o veículo pelo qual uma sequência de DNA ou RNA (por exemplo, um gene exógeno) pode ser introduzida em uma célula hospedeira, de modo a transformar o hospedeiro e promover expressão (por exemplo, transcrição e tradução) da sequência introduzida. Um "vetor não viral" se destina a significar qualquer vetor que não compreende um vírus ou retrovírus. Em algumas modalidades, um "vetor " é uma sequência de DNA que compreende pelo menos uma origem de replicação de DNA e pelo menos um gene de marcador selecionável. Exemplos incluem, porém, sem limitação, um plasmídeo, cosmídeo, bacteriófago, cromossomo artificial bacteriano (BAC), ou vírus que transporta DNA exógeno em uma célula. Um vetor também pode incluir um ou mais genes, moléculas antissenso, e/ou genes de marcador selecionável e outros elementos genéticos conhecidos na técnica. Um vetor pode transduzir, transformar ou infectar uma célula, fazendo, dessa maneira, com que a célula expresse as moléculas de ácido nucleico e/ou proteínas codificadas pelo vetor. O termo "plasmídeo" define uma fita circular de ácido nucleico com capacidade de replicação autossomal ou em uma célula hospedeira procariótica ou em uma célula hospedeira eucariótica. O termo inclui ácido nucleico que pode ser ou DNA ou RNA e pode ser de fita única ou dupla. O plasmídeo da definição também pode incluir as sequências que correspondem a uma origem bacteriana de replicação.
[0077] Conforme usado no presente documento, o termo "gene de marcador selecionável" conforme usado no presente documento define um gene ou outro cassete de expressão que codifica uma proteína que facilita identificação de células nas quais o gene de marcador selecionável é inserido. Por exemplo, um "gene de marcador selecionável" abrange genes repórter, assim como genes usados em transformação de planta para, por exemplo, proteger células vegetais de um agente seletivo ou fornecer resistência/tolerância a um agente seletivo. Em uma modalidade, apenas essas células ou plantas que recebem um marcador selecionável funcional têm capacidade de dividir ou cultivar mediante condições que têm um agente seletivo. Exemplos de agentes seletivos podem incluir, por exemplo, antibióticos, incluindo espectinomicina, neomicina, canamicina, paromomicina, gentamicina e higromicina. Esses marcadores selecionáveis incluem neomicina fosfotransferase (npt Il), que expressa uma enzima que confere resistência ao antibiótico canamicina, e genes para os antibióticos relacionados neomicina, paromomicina, gentamicina, e G418, ou o gene para higromicina fosfotransferase (hpt), que expressa uma enzima que confere resistência à higromicina. Outros genes de marcador selecionável podem incluir genes que codificam resistência a herbicida, incluindo barrar ou se opor (resistência contra glufosinato de amônio ou fosfinotricina), sintase de acetolactato (ALS, resistência contra inibidores “como sulfonilureias (SUs), imidazolinonas (IMIs), triazolpirimidinas (TPs), oxibenzoatos de pirimidinila (POBs), e triazolinonas de sulfonilamino carbonil que impedem a primeira etapa na síntese dos aminoácidos de cadeia ramificada), glifosato, 2,4-D, e resistência ou sensibilidade a metal. Exemplos de "genes repórter" que podem ser usados como um gene de marcador selecionável incluem a observação visual de proteínas expressas de gene repórter, como proteínas que codificam B-glucuronidase (GUS), luciferase, proteína verde fluorescente (GFP), proteína amarelo fluorescente (YFP), DsRed, B-galactosidase, cloranfenicol acetiltransferase (CAT), fosfatase alcalina e similares. A expressão "marcador positivo" se refere a plantas que foram transformadas para incluir um gene de marcador selecionável.
[0078] Conforme usado no presente documento, o termo "marcador detectável" se refere a uma identificação com capacidade de detecção, como, por exemplo, um radioisótopo, composto fluorescente, composto bioluminescente, um composto quimiluminescente, quelante de metal, ou enzima. Exemplos de marcadores detectáveis incluem, porém, sem limitação, o seguinte: identificações fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fósforos lantanídeos), identificações enzimáticas (por exemplo, rábano peroxidase, B-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), quimiluminescência, grupos biotinila, epítopos de polipeptídeo predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de par de zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, etiquetas de epítopo). Em uma modalidade, um marcador detectável pode ser fixado por braços espaçadores de diversos comprimentos para reduzir impedimento estérico potencial.
[0079] Conforme usado no presente documento, os termos "cassete", "cassete de expressão" e "cassete de expressão de gene" se referem a um segmento de DNA que pode ser inserido em um ácido nucleico ou polinucleotídeo em sítios de restrição específicos ou por recombinação homóloga. Conforme usado no presente documento, o segmento de DNA compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse, e o cassete e sítios de restrição são projetados para garantir a inserção do cassete no quadro de leitura apropriado para transcrição e tradução. Em uma modalidade, um cassete de expressão pode incluir um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse e que tem elementos além do polinucleotídeo que facilitam a transformação de uma célula hospedeira específica. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene também pode incluir elementos que permitem expressão aperfeiçoada de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse em uma célula hospedeira. Esses elementos podem incluir, porém, sem limitação: um promotor, um promotor mínimo, um intensificador, um elemento de resposta, uma sequência de terminador, uma sequência de poliadenilação, e similares.
[0080] Conforme usado no presente documento, um "ligante" ou "espaçador" é uma ligação, molécula ou grupo de moléculas que ligam duas entidades separadas entre si. Ligantes e espaçadores podem fornecer espaçamento ideal das duas entidades ou podem fornecer ainda uma ligação lábil que permite que as duas entidades sejam separadas umas das outras. As ligações lábeis incluem grupos fotocliváveis, porções químicas ácidas-lábeis, porções químicas de base-lábeis e grupos cliváveis por enzima. Os termos "poliligante" ou "múltiplos sítios de clonagem", conforme usado no presente documento, definem um agrupamento de três ou mais sítios de enzima de restrição de Tipo 2 localizados dentro de 10 nucleotídeos uns em relação aos outros em uma sequência de ácidos nucleicos. Em outros exemplos, o termo "poliligante", conforme usado no presente documento, se refere a um estiramento de nucleotídeos que são alvejados para unir duas sequências por meio de qualquer método de clonagem contínuo conhecido (isto é, Gibson Assembly&, NEBuilder HIFIDNA Assembly&O,
Golden Gate Assembly, BioBrick& Assembly, etc.). Os construtos que compreendem um poliligante são utilizados para a inserção e/ou excisão de sequências de ácidos nucleicos como a região de codificação de um gene.
[0081] Conforme usado no presente documento, o termo "controle" se refere a uma amostra usada em um procedimento analítico para propósitos de comparação. Um controle pode ser "positivo" ou "negativo". Por exemplo, quando o propósito de um procedimento analítico é detectar uma transcrição expressa de modo diferente ou polipeptídeo em células ou tecido, é geralmente preferencial incluir um controle positivo, como uma amostra de uma planta conhecida que exibe a expressão desejada, e um controle negativo, como uma amostra de uma planta conhecida que não tem a expressão desejada.
[0082] Conforme usado no presente documento, o termo "planta" inclui uma planta completa e qualquer descendente, célula, tecido, ou parte de uma planta. Uma classe de planta que pode ser usada na presente invenção é geralmente tão abrangente quanto a classe de plantas inferiores e superiores passíveis de mutagênese, incluindo angiospermas — (plantas —monocotiledôneas e dicotiledôneas), gimnospermas, samambaias e algas multicelulares. Desse modo, "planta" inclui plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas. O termo "partes de planta" inclui qualquer parte (ou partes) de uma planta, incluindo, por exemplo e sem limitação: semente (incluindo semente madura e semente não madura); um corte de planta; uma célula vegetal; uma cultura de célula vegetal; um órgão de planta (por exemplo, pólen, embriões, flores, frutos, brotos, folhas, raízes, caules e explantes). Um tecido de planta ou órgão de planta pode ser uma semente, protoplasto, calo ou qualquer outro grupo de células vegetais que é organizado em uma unidade estrutural ou funcional. Uma célula vegetal ou cultura de tecido pode ter capacidade de regenerar uma planta que tem as características fisiológicas e morfológicas da planta a partir da qual a célula ou tecido foi obtido, e de regenerar uma planta que tem substancialmente o mesmo genótipo que a planta. Em contrapartida, algumas células vegetais não têm capacidade de ser regeneradas para produzir plantas. As células regeneráveis em uma célula vegetal ou cultura de tecido podem ser embriões, protoplastos, células meristemáticas, calo, pólen, folhas, anteras, raízes, pontas de raiz, seda, flores, grãos, espigas, sabugos, cascas ou caules.
[0083] As partes de planta incluem partes passíveis de colheita e partes úteis para a propagação de plantas de progênie. As partes de planta úteis para propagação incluem, por exemplo, e sem limitação: semente; fruta; um corte; uma muda; um tubérculo; e um porta-enxerto. Uma parte passível de colheita de uma planta pode ser qualquer parte útil de uma planta, incluindo, por exemplo, e sem limitação: flor; pólen; muda; tubérculo; folha; caule; fruta; semente; e raiz.
[0084] Uma célula vegetal é a unidade estrutural e fisiológica da planta, que compreende um protoplasto e uma parede celular. Uma célula vegetal pode estar na forma de uma única célula isolada, ou um agregado de células (por exemplo, um calo friável e uma célula cultivada), e pode ser parte de uma unidade organizada superior (por exemplo, um tecido de planta, órgão de planta, e planta). Desse modo, uma célula vegetal pode ser um protoplasto, um gameta que produz célula, ou uma célula ou coleção de células que podem se regenerar em uma planta completa. Dessa maneira, uma semente, que compreende múltiplas células vegetais e tem capacidade de se regenerar em uma planta completa, é considerada uma "célula vegetal" em modalidades no presente documento.
[0085] Conforme usado no presente documento, o termo "RNA pequeno" se refere a diversas classes de ácido ribonucleico de não codificação (ncRNA). O termo RNA pequeno descreve as cadeias curtas de ncRNA produzido em células bacterianas, animais, plantas e fungos. Essas cadeias curtas de nocºRNA podem ser produzidas naturalmente dentro da célula ou podem ser produzidas pela introdução de uma sequência exógena que expressa a cadeia curta ou ncRNA. As sequências de RNA pequeno não codificam diretamente para uma proteína, e diferem em função de outro RNA uma vez que as sequências de RNA pequeno são apenas transcritas e não traduzidas. As sequências de RNA pequeno são envolvidas em outras funções celulares, incluindo expressão de gene e modificação. As moléculas pequenas de RNA são normalmente produzidas de cerca de 20 a 30 nucleotídeos. As sequências de RNA pequeno podem ser derivadas de precursores mais longos. Os precursores formam estruturas que se dobram novamente umas nas outras em regiões autocomplementares; os mesmos são, então, processados pela nuclease Dicer em animais ou DCL1 em plantas.
[0086] Muitos tipos de RNA pequeno existem ou naturalmente ou produzidos artificialmente, incluindo micro-RNAs (mIiRNA), RNAs curtos de interferência (siRNA), RNAs antissenso, RNA curto em formato de grampo (shRNA) e RNAs nucleolares pequenos (SNOoRNA). Determinados tipos de RNA pequeno, como micro-RNA e siRNA, são importantes em silenciamento de gene e interferência de RNA (RNAi). O silenciamento de gene é um processo de regulação genética no qual um gene que seria normalmente expresso é "desligado" por um elemento intracelular, nesse caso, o RNA pequeno. A proteína que seria normalmente formada por essas informações genéticas não é formada devido à interferência, e as informações codificadas no gene são bloqueadas da expressão.
[0087] Conforme usado no presente documento, o termo "RNA pequeno" abrange moléculas de RNA descritas na literatura como "RNA minúsculo" (Storz, (2002) Science 296:1260-3; Illangasekare et al,
(1999) RNA 5:1482-1489); "RNA pequeno" procariótico (SRNA) (Wassarman et al., (1999) Trends Microbiol. 7:37-45); "RNA de não codificação (ncRNA)" eucariótico; "micro-RNA (mMIRNA)"; "não mMRNA pequeno (sSnMRNA)"; "RNA funcional (fRNA)"; "RNA de transferência (tRNA)"; "RNA catalítico" [por exemplo, ribozimas, incluindo ribozimas de auto-acilação (Illangaskare et a/., (1999) RNA 5:1482-1489); "RNAs nucleolares pequenos (snoRNAs)," "tlmRNA" (também conhecido como "10S RNA," Muto et a/., (1998) Trends Biochem Sci. 23:25-29; e Gillet et al., (2001) Mol Microbiol. 42:879-885); moléculas de RNAi, incluindo sem limitação "RNA pequeno de interferência (siRNA);" "siRNA preparado por endoribonuclease (e-siRNA)," "RNA curto em formato de grampo (SshRNA)" e "RNA regulado temporariamente pequeno (StRNA)," "siRNA cortado (d-siRNA)," e aptâmeros, oligonucleotídeos e outros ácidos nucleicos sintéticos que compreendem pelo menos uma base de uracila.
[0088] A menos que especificamente explicado de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que o comumente entendido por aqueles de habilidade comum na técnica a qual essa descrição pertence. As definições de termos comuns em biologia molecular podem ser constatadas em, por exemplo: Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
[0089] Conforme usado no presente documento, os artigos, "um", "uma" e "o/a" incluem referências ao plural a menos que o contexto cite claramente e de modo não ambíguo de outro modo. Il. Elementos Reguladores de Gene de Óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) e Ácidos Nucleicos que compreendem os mesmos
[0090] São fornecidos métodos e composições para uso de um promotor de um gene de óvulo Zea para expressar transgenes de óvulo não-Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) em planta Em uma modalidade, um promotor pode ser o gene de óvulo Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) promotor da SEQ ID NO:1.
[0091] Em uma modalidade, é fornecido um polinucleotídeo que compreende um promotor, em que o promotor é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% idêntico à SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, um promotor é um promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) que compreende um polinucleotídeo de pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% de identidade ao polinucleotídeo da SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, é fornecido um polinucleotídeo isolado que compreende pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% de identidade ao polinucleotídeo da SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, é fornecido um vetor de ácido nucleico que compreende um promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) da SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, é fornecido um polinucleotídeo que compreende um promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) que é operacionalmente ligado a um poliligante. Em uma modalidade, é fornecido um cassete de expressão de gene que compreende um promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) que é operacionalmente ligado a um transgene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir.Cb02009). Em uma modalidade, é fornecido um vetor de ácido nucleico que compreende um promotor de gene óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) que é operacionalmente ligado a um transgene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir.Cb02009). Em uma modalidade, o promotor consiste na SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade ilustrativa, um vetor de ácido nucleico compreende um promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) que é operacionalmente ligado a um transgene, em que o transgene pode ser uma resistência a transgene de inseticida, uma tolerância a transgene de herbicida, uma eficiência de uso de transgene de nitrogênio, uma eficiência de uso de transgene de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene de RNA pequeno, transgene de marcador selecionável ou combinações dos mesmos.
[0092] Em uma modalidade, um vetor de ácido nucleico compreende um cassete de expressão de gene, como revelado no presente documento. Em uma modalidade, um vetor pode ser um plasmídeo, um cosmídeo, um cromossomo artificial bacteriano (BAC), um bacteriófago, um vírus, ou um fragmento de polinucleotídeo excisado para uso em transformação direta ou alvejamento de gene como um DNA doador.
[0093] A expressão de transgene também pode ser regulada por uma região 5' de UTR localizada a jusante da sequência de promotor. Tanto um promotor quanto uma UTR 5' podem regular expressão de transgene. Embora um promotor seja necessário para acionar a transcrição, a presença de uma UTR 5' pode aumentar níveis de expressão que resultam em transcrição de mRNA para tradução e síntese de proteína. Uma região de gene de UTR 5' auxilia em expressão estável de um transgene. Em uma modalidade adicional, uma UTR 5' é operacionalmente ligada a um promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009). Em uma modalidade, uma UTR 5' pode ser a UTR 5º de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) da SEQ ID NO:7.
[0094] Em uma modalidade, é fornecido um polinucleotídeo que compreende uma UTR 5', em que a UTR 5' é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%,
ou 100% idêntica à SEQ ID NO:7. Em uma modalidade, uma UTR 5' é uma UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) que compreende um polinucleotídeo de pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% de identidade ao polinucleotídeo da SEQ ID NO:7. Em uma modalidade, é fornecido um polinucleotídeo isolado que compreende pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% de identidade ao polinucleotídeo da SEQ ID NO:7. Em uma modalidade, é fornecido um vetor de ácido nucleico que compreende uma UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) da SEQ ID NO:7. Em uma modalidade, é fornecido um polinucleotídeo que compreende um URT 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) que é operacionalmente ligada a um poliligante.
Em uma modalidade, é fornecido um cassete de expressão de gene que compreende uma UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) que é operacionalmente ligada a um transgene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir.Cb02009). Em uma modalidade, é fornecido um vetor de ácido nucleico que compreende uma UTR 5' de gene óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) que é operacionalmente ligada a um transgene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir.Cb02009). Em uma modalidade, a UTR 5' consiste na SEQ ID NO: 7. Em uma modalidade ilustrativa, um vetor de ácido nucleico compreende uma UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) que é operacionalmente ligada a um transgene, em que o transgene pode ser uma resistência a transgene de inseticida, uma tolerância a transgene de herbicida, uma eficiência de uso de transgene de nitrogênio, uma eficiência de uso de transgene de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene de RNA pequeno, transgene de marcador selecionável ou combinações dos mesmos.
[0095] A expressão de transgene também pode ser regulada por uma região de íntron localizada a jusante da sequência de promotor. Tanto um promotor quanto um íntron podem regular expressão de transgene. Embora um promotor seja necessário para acionar a transcrição, a presença de um íntron pode aumentar níveis de expressão que resultam em transcrição de mMRNA para tradução e síntese de proteína. Uma região de gene de íntron auxilia em expressão estável de um transgene. Em uma modalidade adicional, um íntron é operacionalmente ligado a um promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009).
[0096] De acordo com uma modalidade, é fornecido um vetor de ácido nucleico que compreende um cassete de expressão de gene recombinante, em que o cassete de expressão de gene recombinante compreende um promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) operacionalmente ligado a uma sequência poliligante, um gene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) ou transgene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cbo02009) ou combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o cassete de gene recombinante compreende um promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) operacionalmente ligado a um gene de óvulo ou transgene de não Panicum virgatum (Pavir.Cb02009). Em uma modalidade, o cassete de gene recombinante compreende um promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) como revelado no presente documento é operacionalmente ligado a uma sequência poliligante. O poliligante é operacionalmente ligado ao promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) de uma maneira que inserção de uma sequência de codificação em um dos sítios de restrição do poliligante irá ligar de modo funcional à sequência de codificação permitindo expressão da sequência de codificação quando o vetor é transformado ou transfectado em uma célula hospedeira.
[0097] De acordo com uma modalidade, é fornecido um vetor de ácido nucleico que compreende um cassete de gene que consiste em um promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) e um gene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir.Cb02009). Em uma modalidade, o promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cbo02009) da SEQ ID NO: 1 é operacionalmente ligado à extremidade 5' do gene de óvulo ou transgene de não Panicum virgatum (Pavir.Cbo02009). Em uma modalidade adicional, a sequência de promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) compreende SEQ ID NO: 1 ou uma sequência que tem 80, 85, 90, 95, 99 ou 100% de identidade de sequência com uma SEQ ID NO: 1. De acordo com uma modalidade, é fornecido um vetor de ácido nucleico que compreende um cassete de gene que consiste em um promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009), um gene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir.Cb02009), em que o promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) é operacionalmente ligado à extremidade 5' do gene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir.Cb02009), e a sequência de promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) compreende SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem 80, 85, 90, 95, 99 ou 100% de identidade de sequência com uma SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade adicional, a sequência de promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) consiste na SEQ ID NO: 1, ou a sequência de 1.400 pb que tem 80, 85, 90, 95, ou 99% de identidade de sequência com uma SEQ ID NO: 1.
[0098] De acordo com uma modalidade, é fornecido um vetor de ácido nucleico que compreende um cassete de expressão de gene recombinante, em que o cassete de expressão de gene recombinante compreende uma UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) operacionalmente ligada a uma sequência poliligante,
um gene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir.Cbo02009) ou transgene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) ou combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o cassete de gene recombinante compreende uma UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) operacionalmente ligada a um gene de óvulo ou transgene de não Panicum virgatum (Pavir.Cb02009). Em uma modalidade, o cassete de gene recombinante compreende uma UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009), como revelado no presente documento, que é operacionalmente ligada a uma sequência poliligante. O poliligante é operacionalmente ligado à UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) de uma maneira que inserção de uma sequência de codificação em um dos sítios de restrição do poliligante irá ligar de modo funcional à sequência de codificação permitindo expressão da sequência de codificação quando o vetor é transformado ou transfectado em uma célula hospedeira.
[0099] De acordo com uma modalidade, é fornecido um vetor de ácido nucleico que compreende um cassete de gene que consiste em uma UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) e um gene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir.Cb02009). Em uma modalidade, a UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cbo02009) da SEQ ID NO:7 é operacionalmente ligada à extremidade 5' do gene de óvulo ou transgene de não Panicum virgatum (Pavir.Cb02009). Em uma modalidade adicional, a sequência de UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) compreende SEQ ID NO:7 ou uma sequência que tem 80, 85, 90, 95, 99 ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO:7. De acordo com uma modalidade, é fornecido um vetor de ácido nucleico que compreende um cassete de gene que consiste em uma UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009), um gene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir.Cb02009), em que a UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) é operacionalmente ligada à extremidade 5' do gene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir.Cb02009), e a sequência de UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) compreende SEQ ID NO:7 ou uma sequência que tem 80, 85, 90, 95, 99 ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO 7. Em uma modalidade adicional, a sequência de UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) consiste em SEQ ID NO:7 ou uma sequência de 163 pb que tem 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com uma SEQ ID NO:7.
[00100] Um promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) pode também compreender um ou mais elementos de sequência adicional. Em algumas modalidades, um promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) pode compreender um éxon (por exemplo, um peptídeo líder ou sinal como um peptídeo de transição de cloroplasto ou sinal de retenção de ER). Por exemplo e sem limitação, um promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) pode codificar um éxon incorporado ao promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) como uma modalidade adicional.
[00101] Ainda são fornecidos métodos e composições para uso de uma UTR 3' de um gene de óvulo de Zea para terminar transgenes de óvulo de não-Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) na planta. Em uma modalidade, um terminador de UTR 3' pode ser a UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) da SEQ ID NO:2.
[00102] Em uma modalidade, é fornecido um polinucleotídeo que compreende uma UTR 3', em que a UTR 3' é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% idêntica à SEQ ID NO:2. Em uma modalidade, uma UTR 3' é uma UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009)
que compreende um polinucleotídeo de pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% de identidade ao polinucleotídeo da SEQ ID NO:2. Em uma modalidade, é fornecido um polinucleotídeo isolado que compreende pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% de identidade para o polinucleotídeo da SEQ ID NO:2. Em uma modalidade, é fornecido um vetor de ácido nucleico que compreende uma UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) da SEQ ID NO:2. Em uma modalidade, é fornecido um polinucleotídeo que compreende uma UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) que é operacionalmente ligado a um poliligante. Em uma modalidade, é fornecido um cassete de expressão de gene que compreende uma UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) que é operacionalmente ligada a um transgene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir.Cb02009). Em uma modalidade, é fornecido um vetor de ácido nucleico que compreende uma UTR 3' de gene óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) que é operacionalmente ligado a um transgene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir.Cb02009). Em uma modalidade, a UTR 3' consiste na SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade ilustrativa, um vetor de ácido nucleico compreende uma UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) que é operacionalmente ligado a um transgene, em que o transgene pode ser uma resistência a transgene de inseticida, uma tolerância a transgene de herbicida, uma eficiência de uso de transgene de nitrogênio, uma eficiência de uso de transgene de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene de RNA pequeno, transgene de marcador selecionável ou combinações dos mesmos.
[00103] De acordo com uma modalidade, é fornecido um vetor de ácido nucleico que compreende um cassete de expressão de gene recombinante, em que o cassete de expressão de gene recombinante compreende uma UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) operacionalmente ligada a uma sequência poliligante, um gene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir.Cbo02009) ou transgene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) ou combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o cassete de gene recombinante compreende uma UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) operacionalmente ligada a um gene de óvulo ou transgene de não Panicum virgatum (Pavir.Cb02009). Em uma modalidade, o cassete de gene recombinante compreende uma UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009), como revelado no presente documento, que é operacionalmente ligada a uma sequência poliligante. O poliligante é operacionalmente ligado à UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) de uma maneira que inserção de uma sequência de codificação em um dos sítios de restrição do poliligante irá ligar de modo funcional à sequência de codificação permitindo expressão da sequência de codificação quando o vetor é transformado ou transfectado em uma célula hospedeira.
[00104] De acordo com uma modalidade, é fornecido um vetor de ácido nucleico que compreende um cassete de gene que consiste em uma UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) e um gene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir.Cb02009). Em uma modalidade, a UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cbo02009) da SEQ ID NO: 2 é operacionalmente ligada à extremidade 3' do gene de óvulo ou transgene de não Panicum virgatum (Pavir.Cb02009). Em uma modalidade adicional, a sequência de UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) compreende SEQ ID NO: 2 ou uma sequência que tem 80, 85, 90, 95, 99 ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2. De acordo com uma modalidade, é fornecido um vetor de ácido nucleico que compreende um cassete de gene que consiste em uma UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009), um gene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir.Cb02009), em que a UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) é operacionalmente ligada à extremidade 3' do gene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir.Cb02009), e a sequência de UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) compreende SEQ ID NO:2 ou uma sequência que tem 80, 85, 90, 95, 99 ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade adicional, a sequência de UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) consiste em SEQ ID NO:2 ou uma sequência de 931 pb que tem 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2.
[00105] Em uma modalidade, é fornecido um construto de ácido nucleico que compreende um promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) e um gene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) e, opcionalmente, um ou mais dos seguintes elementos:
[00106] a) uma região não traduzida 5';
[00107] Db) um Ííntron; e
[00108] cc) uma região não traduzida 3',
[00109] emque,
[00110] o promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) consiste na SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1;
[00111] a UTR 5 de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) consiste na SEQ ID NO:7 ou uma sequência que tem 95% de identidade de sequência com uma SEQ ID NO:7; e
[00112] a região não traduzida 3' consiste em uma região não traduzida 3' conhecida, SEQ ID NO:2 ou uma sequência que tem 95%
de identidade de sequência com uma SEQ ID NO:2; adicionalmente em que o dito promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. CbO02009) é operacionalmente ligado ao dito transgene e cada elemento opcional, quando presente, é também operacionalmente ligado tanto ao promotor quanto ao transgene. Em uma modalidade adicional, é fornecida uma célula transgênica que compreende o construto de ácido nucleico revelado imediatamente acima. Em uma modalidade, a célula transgênica é uma célula vegetal, e em uma modalidade adicional, uma planta é fornecida, em que a planta compreende as ditas células transgênicas.
[00113] De acordo com uma modalidade, o vetor de ácido nucleico compreende ainda uma sequência que codifica um marcador selecionável. De acordo com uma modalidade, o cassete de gene recombinante é operacionalmente ligado a uma borda de T-DNA de Agrobacterium. De acordo com uma modalidade, o cassete de gene recombinante compreende ainda uma primeira e uma segunda bordas de T-DNA, em que a primeira borda de T-DNA é operacionalmente ligada a uma extremidade de um construto de gene, e a segunda borda de T-DNA é operacionalmente ligada à outra extremidade de um construto de gene. A primeira e a segunda bordas de T-DNA de Agrobacterium podem ser independentemente selecionadas a partir de sequências de borda de T-DNA que se originam de cepas bacterianas selecionadas dentre o grupo que consiste em uma borda de T-DNA de sintetização de nopalina de Agrobacterium, uma borda de T-DNA de sintetização de ocotopina de Agrobacterium, uma borda de T-DNA de sintetização de manopina de Agrobacterium, uma borda de T-DNA de sintetização de succinamopina de Agrobacterium, ou qualquer combinação das mesmas. Em uma modalidade, uma cepa de Agrobacterium selecionada dentre o grupo que consiste em uma cepa de sintetização de nopalina, uma cepa de sintetização de manopina,
uma cepa de sintetização de succinamopina, ou uma cepa de sintetização de octopina é fornecida, em que a dita cepa compreende um plasmídeo, em que o plasmídeo compreende um transgene operacionalmente ligado a uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem 80, 85, 90, 95, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1. Em outra modalidade, a primeira e a segunda bordas de T-DNA de Agrobacterium podem ser independentemente selecionadas a partir de sequências de borda de T- DNA que se originam de cepas bacterianas selecionadas dentre o grupo que consiste em uma borda de T-DNA de sintetização de nopalina de Agrobacterium, uma borda de T-DNA de sintetização de ocotopina de Agrobacterium, uma borda de T-DNA de sintetização de manopina de Agrobacterium, uma borda de T-DNA de sintetização de succinamopina de Agrobacterium, ou qualquer combinação das mesmas.
Em uma modalidade, uma cepa de Agrobacterium selecionada dentre o grupo que consiste em uma cepa de sintetização de nopalina, uma cepa de sintetização de manopina, uma cepa de sintetização de succinamopina, ou uma cepa de sintetização de octopina é fornecida, em que a dita cepa compreende um plasmídeo, em que o plasmídeo compreende um transgene operacionalmente ligado a uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO:7 ou uma sequência que tem 80, 85, 90, 95, ou 99% de identidade de sequência com uma SEQ ID NO:7. Em uma modalidade, uma cepa de Agrobacterium selecionada dentre o grupo que consiste em uma cepa de sintetização de nopalina, uma cepa de sintetização de manopina, uma cepa de sintetização de succinamopina, ou uma cepa de sintetização de octopina é fornecida, em que a dita cepa compreende um plasmídeo, em que o plasmídeo compreende um transgene operacionalmente ligado a uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO:2 ou uma sequência que tem 80, 85, 90, 95, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO:2.
[00114] Transgenes de interesse que são adequados para uso nos construtos presentemente revelados incluem, porém, sem limitação, sequências de codificação que conferem (1) resistência a pragas ou doença, (2) tolerância a herbicidas, (3) traços agronômicos adicionados de valor, como; aprimoramento de rendimento, eficiência de uso de nitrogênio, eficiência de uso de água, e qualidade nutricional, (4) ligação de uma proteína a DNA de uma maneira específica de sítio, (5) expressão de RNA pequeno, e (6) marcadores selecionáveis. De acordo com uma modalidade, o transgene codifica um marcador selecionável ou um produto de gene que confere resistência a inseticida, tolerância a herbicida, expressão de RNA pequeno, eficiência de uso de nitrogênio, eficiência de uso de água, ou qualidade nutricional.
1. Resistência de Inseto
[00115] Diversos genes de resistência de inseto podem ser ligados de maneira funcional ao promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) que compreende SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que tem 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com uma SEQ ID NO: 1. Além disso, os genes de resistência de inseto podem ser ligados de maneira funcional à UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) que compreende SEQ ID NO:7, ou uma sequência que tem 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com uma SEQ ID NO:7. Do mesmo modo, os genes de resistência de inseto podem ser ligados de maneira funcional à UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cbo02009) que compreende SEQ ID NO: 2, ou uma sequência que tem 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com uma SEQ ID NO: 2. As sequências operacionalmente ligadas podem, então, ser incorporadas em um vetor escolhido para permitir identificação e seleção de plantas transformadas ("transformantes"). As sequências de codificação de resistência de inseto exemplificativas são conhecidas na técnica. Como modalidades de sequências de codificação de resistência de inseto que podem ser operacionalmente ligadas aos elementos reguladores da presente descrição, os traços a seguir são fornecidos. As sequências de codificação que fornecem resistência de inseto de Lepidópteros exemplificativa incluem: cry1A; cry1A.105; cry1Ab; cry1Ab(truncado); Ccry1Ab-Ac (proteina de fusão); cry1Ac (comercializado como Widestrike&O); cry1C; cryIF (comercializado como Widestrike&); cry 1Fa2; cry2Ab2; cry2Ãe; cry9C; mocry1F; pinll (proteína inibidora de protease); vip3A(a); e vip3Aa20. As sequências de codificação que fornecem resistência de inseto de Coleóptero exemplificativa incluem: cry34Ab1 (comercializado como HerculexO); cry35Ab1 (comercializado como HerculexO); cry3A; cry3Bb1; dvsnf7; e mcry3A. As sequências de codificação que fornecem resistência de múltiplos insetos exemplificativa incluem ecry31.Ab. A lista acima de genes de resistência de inseto não se destina a ser limitante. Quaisquer genes de resistência de inseto são abrangidos pela presente descrição.
2. Tolerância a Herbicida
[00116] Diversos genes de tolerância a herbicida podem ser ligados de maneira funcional ao promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) que compreende SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que tem 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com uma SEQ ID NO: 1. Do mesmo modo, os genes de tolerância a herbicida podem ser ligados de maneira funcional ao UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) que compreende SEQ ID NO:7, ou uma sequência que tem 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com uma SEQ ID NO:7. Do mesmo modo, os genes de tolerância a herbicida podem ser ligados de maneira funcional à UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) que compreende SEQ ID NO: 2, ou uma sequência que tem 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com uma SEQ ID NO: 2. As sequências operacionalmente ligadas podem, então, ser incorporadas em um vetor escolhido para permitir identificação e seleção de plantas transformadas ("transformantes"). As sequências de codificação de tolerância a herbicida exemplificativas são conhecidas na técnica.
Como modalidades de sequências de codificação de tolerância a herbicida que podem ser operacionalmente ligadas aos elementos reguladores da presente descrição, são fornecidos os traços a seguir.
O herbicida glifosato contém um modo de ação inibindo-se a enzima EPSPS (sintase de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato). Essa enzima é envolvida na biossíntese de aminoácidos aromáticos que são essenciais para o crescimento e desenvolvimento de plantas.
Diversos mecanismos enzimáticos são conhecidos na técnica que podem ser utilizados para inibir essa enzima.
Os genes que codificam tais enzimas podem ser ligados de maneira funcional aos elementos reguladores de gene da presente descrição.
Em uma modalidade, genes de marcador selecionável incluem, porém, sem limitação genes que codificam genes de resistência a glifosato incluem: genes mutantes de EPSPS, como genes 2mEPSPS, genes cp4 EPSPS, genes mEPSPS, genes dgt-28; genes aroA; e genes de degradação de glifosato, como genes de acetil transferase de glifosato (gaf) e genes de oxidase de glifosato (gox). Esses traços são atualmente comercializados como Gly-Tol'"Y, OptimumO GATO, AgrisureG GT e Roundup ReadyO.
Os genes de resistência para compostos de glufosinato e/ou bialafos incluem genes dsm-2, bare pat.
Os traços de bar e pat são atualmente comercializados como LibertyLinkA.
Também são incluídos genes de tolerância que fornecem resistência a genes 2,4-D, como genes aad-1 (deve ser observado que genes aad-1 têm ainda atividade em herbicidas de arloxifenoxipropionato) e genes aad-12 (deve ser observado que genes aad-12 têm ainda atividade em auxinas sintéticas de piidiloxiacetato). Esses traços são comercializados como tecnologia de proteção de cultura Enlistê. Os genes de resistência para inibidores de ALS (sulfonilureas, imidazolinonas, triazolpirimidinas, pirimidiniltiobenzoatos, e sulfonilamino-carbonil-triazolinonas) são conhecidos na técnica. Esses genes de resistência mais comumente resultam de mutações de ponto para o ALS que codifica sequência de genes. Outros genes de resistência de inibidor de ALS incluem genes hra, os genes csrí-2, genes Sr-HrA e genes surB. Alguns dos traços são comercializados sob o nome comercial ClearfieldO. Os herbicidas que inibem HPPD incluem as pirazolonas, como pirazoxifeno, benzofenona, e topramezona; tricetonas, como mesotriona, sulcotriona, tembotriona, benzobiciclona; e dicetonitrlas como isoxaflutol. Esses herbicidas de HPPD exemplificativos podem ser tolerados por traços conhecidos. Exemplos de inibidores de HPPD incluem genes hppadPF W336 (para resistência a isoxaflutol) e genes avhppd-03 (para resistência a meostriona). Um exemplo de traços tolerantes a herbicida oxinila incluem o gene bxn, que tem se mostrado como expressando resistência ao herbicida/antibiótico bromoxinil. Os genes de resistência para dicamba incluem o gene de mono-oxigenase de dicamba (dmo), como revelado no Pedido Internacional PCT n.º WO 2008/105890. Os genes de resistência para herbicidas do tipo inibidor de PPO ou PROTOX (por exemplo, acifluorfeno, butafenacil, flupropazil, pentoxazona, carfentrazona, fluazolato, — piraflufeno, —aclonifenoy azafenidinay flumioxazina, flumiclorac, bifenox, oxifluorfeno, lactofen, fomesafen, fluoroglicofen, e sulfentrazona) são conhecidos na técnica. Genes exemplificativos que confere resistência a PPO incluem sobre-expressão de uma enzima de PPO de Arabidopsis thaliana de tipo selvagem (Lermontova | e Grimm B, (2000) Overexpression of plastidic protoporphyrinogen IX oxidase leads to resistance to the diphenyl-ether herbicide acifluorfen. Plant Physiol 122:75-83.), o gene de PPO de B. subtilis (Li, X. e Nicholl D.
2005. Development of PPO inhibitor-resistant cultures and crops. Pest
Manag. Sci. 61:277-285 and Choi KW, Han O, Lee HJ, Yun YC, Moon YH, Kim MK, Kuk Yl, Han SU and Guh JO, (1998) Generation of resistance to the dipheny!l ether herbicide, oxyfluorfen, via expression of the Bacillus subtilis protoporphyrinogen oxidase gene in transgenic tobacco plants. Biosci Biotechnol Biochem 62:558-560.) Os genes de resistência para ácidos propiônicos piridinoxi ou fenoxi e ciclo-hexonas incluem os genes de codificação de inibidor de ACCase (por exemplo, Acc1-S1, Acc1-S2 e Acc1-S3). Genes exemplificativos que conferem resistência a ciclo-hexanodionas e/ou ácido ariloxifenoxipropanoico incluem haloxifop, diclofop, fenoxiprop, fluazifop, e quizalofop. Finalmente, herbicidas podem inibir fotossíntese, incluindo triazina ou benzonitrila são fornecidos com tolerância por genes psbA (tolerância a triazina), genes 1s+ (tolerância a triazina), e genes nitrilase (tolerância a benzonitrila). A lista acima de genes de tolerância a herbicida não se destina a ser limitante. Quaisquer genes de tolerância a herbicida são abrangidos pela presente descrição.
3. Traços Agronômicos
[00117] Diversos genes de traço agronômico podem ser ligados de maneira funcional ao promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb0O2009) que compreende SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que tem 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com uma SEQ ID NO: 1. Além disso, os genes de traço agronômico podem ser ligados de maneira funcional à UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) que compreende SEQ ID NO:7, ou uma sequência que tem 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com uma SEQ ID NO:7. Do mesmo modo, os genes de traço agronômico podem ser ligados de maneira funcional à UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) que compreende SEQ ID NO: 2, ou uma sequência que tem 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com uma SEQ ID NO: 2. As sequências operacionalmente ligadas podem, então, ser incorporadas em um vetor escolhido para permitir identificação e seleção de plantas transformadas ("transformantes"). As sequências de codificação de traço agronômico exemplificativas são conhecidas na técnica.
Como modalidades de sequências de codificação de traço agronômico que podem ser operacionalmente ligadas aos elementos reguladores da presente descrição, são fornecidos os traços a seguir.
O amolecimento atrasado de fruta, como fornecido pelos genes pg inibem a produção de enzima poligalacturonase responsável pela ruptura de moléculas de pectina na parede celular e, desse modo, ocasiona amolecimento atrasado da fruta.
Ademais, amadurecimento/senescência de fruta atrasados de gene acc atuam para suprimir a expressão normal do gene nativo acc Synthase, resultando em produção de etileno reduzida e amadurecimento de fruta atrasado.
Enquanto que os genes accd metabolizam o precursor do etileno de hormônio de amadurecimento de fruta, resultando em amadurecimento de fruta atrasado.
De modo alternativo, os genes sam-k ocasionam amadurecimento atrasado reduzindo-se S-adenosilmetionina (SAM), um substrato para produção de etileno.
Fenótipos de tolerância ao estresse por falta de água, como fornecido por genes cspB, mantêm funções celulares normais mediante condições de estresse por água preservando-se estabilidade e tradução de RNA.
Outro exemplo inclui os genes EcBetA que catalisam a produção da glicina betaína de composto osmoprotetor que confere tolerância ao estresse por água.
Além disso, os genes RmBetA catalisam a produção da glicina betaína de composto osmoprotetor que confere tolerância a estresse por água.
A fotossíntese e o aperfeiçoamento de rendimento são fornecidos com o gene bbx32 que expressa uma proteína que interage com um ou mais fatores endógenos de transcrição para regular os processos fisiológicos diurnos/noturnos da planta.
A produção etanol pode ser aumentada por expressão dos genes amy797E que codifitam uma enzima de alfa-amilase termoestável que aperfeiçoa produção de bioetanol aumentando-se a termoestabilidade de amilase usada em amido de degradação. Finalmente, composições de aminoácido modificadas podem resultar pela expressão dos genes cordapA que codificam uma enzima de sintase de di-hidrodipicolinato que aumenta a produção de lisina de aminoácido. A lista acima de sequências de codificação de traço agronômico não se destina a ser limitante. Qualquer sequência de codificação de traço agronômico é abrangida pela presente descrição.
4. Proteínas de Ligação de DNA
[00118] Diversos genes de transgene de ligação de DNA podem ser ligados de maneira funcional ao promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) que compreende SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que tem 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com uma SEQ ID NO: 1. Além disso, os genes de transgene de ligação de DNA podem ser ligados de maneira funcional à UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) que compreende SEQ ID NO:7, ou uma sequência que tem 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com uma SEQ ID NO:7. Do mesmo modo, os genes de transgene de ligação de DNA podem ser ligados de maneira funcional à UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) que compreende SEQ ID NO: 2, ou uma sequência que tem 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com uma SEQ ID NO: 2. As sequências operacionalmente ligadas podem, então, ser incorporadas a um vetor escolhido para permitir identificação e seleção de plantas transformadas ("transformantes"). As sequências de codificação de proteína de ligação de DNA exemplificativas são conhecidas na técnica. Como modalidades de sequências de codificação de proteína de ligação de DNA que podem ser operacionalmente ligadas aos elementos reguladores da presente descrição, os tipos a seguir de proteínas de ligação de DNA podem incluir; Dedos de Zinco, TALENS, CRISPRS, e meganucleases. A lista acima de sequências de codificação de proteína de ligação de DNA não se destina a ser limitante. Quaisquer sequências de codificação de proteína de ligação de DNA são abrangidas pela presente descrição.
5. RNA Pequeno
[00119] Diversas sequências de RNA pequeno podem ser operacionalmente ligadas ao promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) que compreende SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que tem 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com uma SEQ ID NO: 1. Do mesmo modo, as sequências de RNA pequeno podem ser operacionalmente ligadas à UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. CbD0O2009) que compreende SEQ ID NO: 2, ou uma sequência que tem 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com uma SEQ ID NO: 2. As sequências operacionalmente ligadas podem, então, ser incorporadas em um vetor escolhido para permitir identificação e seleção de plantas transformadas ("transformantes"). Os traços de RNA pequeno exemplificativos são conhecidos na técnica. Como modalidades de sequências de codificação de RNA pequeno que podem ser operacionalmente ligadas aos elementos reguladores da presente descrição, os traços a seguir são fornecidos. Por exemplo, amadurecimento/senescência de fruta atrasados do RNA pequeno anti-efe atrasa o amadurecimento suprimindo-se a produção de etileno por meio de silenciamento do gene ACO que codifica uma enzima de formação de etileno. A produção de lignina alterada de RNA pequeno ccomt reduz teor de guanacil (G) lignina por inibição da S-adenosil-L-metionina endógena: trans-cafeoil CoA 3-O-metiltransferase (gene CCOMT). Ademais, a Tolerância a Ferimento de Mancha Preta em Solanum verrucosum pode ser reduzida pelo RNA pequeno Ppo5 que aciona a degradação de transcrições de
Ppo5 para bloquear desenvolvimento de ferimento de mancha preta. Também é incluído o RNA pequeno dvsnf7 que inibe Crisomelídeo do Sistema Radicular do Milho Ocidental com dsRNA que contém um fragmento de 240 pb do gene Crisomelídeo do Sistema Radicular do Milho Ocidental Snf7. O amido/carboidratos modificados podem resultar de RNA pequeno, como o RNA pequeno pPhL (degrada transcrições de PhL para limitar a formação de açúcares de redução através de degradação de amido) e RNA pequeno pR1 (degrada transcrições de R1 para limitar a formação de açúcares de redução através de degradação de amido). Adicionalmente, benefícios como acrilamida reduzida que resulta do RNA pequeno asn1 que aciona degradação de Asn1 para prejudicar formação de asparagina e reduzir poliacrilamida. Finalmente, o fenótipo de não escurecimento de RNA pequeno pgas de supressão de ppo resulta em PPO de supressão para produzir maçãs com um fenótipo de não escurecimento. A lista acima de RNAs pequenos não se destina a ser limitante. Quaisquer sequências de codificação de RNA pequeno são abrangidas pela presente descrição.
6. Marcadores Selecionáveis
[00120] Diversos marcadores selecionáveis também descritos como genes repórter podem ser ligados de maneira funcional ao promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) que compreende SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que tem 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com uma SEQ ID NO: 1. Além disso, os marcadores selecionáveis também descritos como genes repórter podem ser ligados de maneira funcional à UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb0O2009) que compreende SEQ ID NO:7, ou a sequência que tem 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:7. Do mesmo modo, os marcadores selecionáveis também descritos como genes repórter podem ser ligados de maneira funcional à UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum
(Pavir. Chb02009) que compreende SEQ ID NO: 2, ou uma sequência que tem 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com uma SEQ ID NO: 2. As sequências operacionalmente ligadas podem, então, ser incorporada a um vetor escolhido para permitir identificação e seleção de plantas transformadas ("transformantes"). Muitos métodos estão disponíveis para confirmar expressão de marcadores selecionáveis em plantas transformadas, incluindo, por exemplo, sequenciamento de DNA e PCR (reação de cadeia de polimerase), Southern blotting, blotting de RNA, métodos imunológicos para detecção de uma proteína expressa do vetor. Mas, normalmente os genes repórter são observados através de observação visual de proteínas que, quando expressas, produzem um produto colorido. Genes repórter exemplificativos são conhecidos na técnica e codificam B-glucuronidase (GUS), luciferase, proteína verde fluorescente (GFP), proteína amarelo fluorescente (YFP, Phi-YFP), proteína vermelho fluorescente (DsSRFP, RFP, etc), £- galactosidase, e similares (Consultar Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Edição, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001, cujo conteúdo do mesmo é incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade).
[00121] Genes marcadores selecionáveis são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados. Genes de marcados selecionáveis incluem genes que codificam resistência a antibiótico, como aqueles que codificam neomicina fosfotransferase |l (NEO), resistência a espectinomicina/estreptionomicina (AAD), e higromicina fosfotransferase (HPT ou HGR), assim como genes que conferem resistência a compostos de herbicida. Os genes de resistência a herbicida geralmente codificam para uma proteína alvo modificada insensível ao herbicida ou para uma enzima que degrada ou desintoxica o herbicida na planta antes de o mesmo poder atuar. Por exemplo, resistência a glifosato foi obtida usando-se codificação de genes para enzimas alvo mutantes, sintase de 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato (EPSPS). Genes e mutantes para EPSPS são bem conhecidos, e adicionalmente descritos abaixo. Resistência a glufosinato de amônio, bromoxinil, e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D) foram obtidos usando-se genes bacterianos que codificam PAT ou DSM-2, uma nitrilase, um AAD-1, ou um AAD-12, em que cada um dos quais são exemplos de proteínas que desintoxicam seus respectivos herbicidas.
[00122] Em uma modalidade, herbicidas podem inibir o ponto de crescimento ou meristema, incluindo imidazolinona ou sulfonilurea, e genes para resistência/tolerância de sintase de aceto-hidroxiácido (AHAS) e sintase de acetolactato (ALS) para esses herbicidas são bem conhecidos. Os genes de resistência de glifosato incluem sintase de 5- enolpiruvilshiquimato-3-fosfato mutante (EPSP) e genes dgt-28 (por meio da introdução de ácidos nucleicos recombinantes e/ou diversas formas de mutagênese in vivo de genes EPSP nativos), genes aroA e genes de glifosato acetil transferase (GAT), respectivamente). Os genes de resistência para outros compostos de fosfono incluem genes bar e pat de espécie Streptomyces, incluindo Streptomyces hygroscopicus e Streptomyces viridichromogenes, e piridinóxi ou ácidos fenóxi propiônicos e ciclo-hexonas (genes de codificação de inibidor de ACCase). Genes exemplificativos que conferem resistência a ciclo- hexanodionas e/ou ácido ariloxifenoxipropanoico (incluindo haloxifop, diclofop, fenoxiprop, fluazifop, quizalofop) incluem genes de carboxilase de coenzima de acetila A (ACCase); Acc1-S1, Acc1-S2 e Acc1-S3. Em uma modalidade, herbicidas podem inibir fotossíntese, incluindo triazina (genes psbA e 1s+) ou benzonitrila (gene nitrilase). Além disso, tais marcadores selecionáveis podem incluir marcadores de seleção positiva como enzima fosfomanose isomerase (PMI).
[00123] Em uma modalidade, genes de marcador selecionável incluem, porém, sem limitação genes que codificam: 2,4-D; neomicina fosfotransferase ||; cianamida hidratase; aspartato quinase; sintase de di-hidrodipicolinato; triptofano descarboxilase; sintase de di-hidrodipi- colinato e aspartato quinase dessensibilizado; gene bar; triptofano descarboxilase; neomicina fosfotransferase (NEO); higromicina fosfotransferase (HPT ou HYG); di-hidrofolato redutase (DHFR); fosfinotricina — acetiltransferase; ácido 2,2-dicloropropiônico de- halogenase; sintase de aceto-hidroxiácido; sintase de 5-enolpiruvil- shiquimate-fosfato (aroA); haloarilnitrlase; carboxilase de acetil- coenzima A; sintase de di-hidropteroato (sul |); e polipeptídeo de fotosistema 1! 32 kD (psbA). Uma modalidade também inclui genes de marcador selecionável que codificam resistência a: cloranfenicol; metotrexato; higromicina; espectinomicina; bromoxinil; glifosato; e fosfinotricina. A lista acima de genes marcadores selecionáveis não é destinada a ser limitante. Qualquer gene de marcador selecionável ou repórter é abrangido pela presente descrição.
[00124] Emalgumas modalidades, as sequências de codificação são sintetizadas para expressão ideal em uma planta. Por exemplo, em uma modalidade, uma sequência de codificação de um gene foi modificada por otimização de códon para aperfeiçoar expressão em plantas. Uma resistência a transgene de inseticida, uma tolerância a transgene de herbicida, uma eficiência de uso de transgene de nitrogênio, uma eficiência de uso de transgene de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, ou um transgene de marcador selecionável pode ser otimizado para expressão em uma espécie de planta particular ou, de modo alternativo, pode ser modificada para expressão ideal em plantas dicotiledôneas ou monocotiledôneas. Códons preferenciais de planta podem ser determinados a partir dos códons de frequência mais alta nas proteínas expressas na maior quantidade na espécie de planta particular de interesse. Em uma modalidade, uma sequência de codificação, gene,
ou transgene é projetado para ser expresso em plantas em um nível mais alto, resultando em maior eficácia de transformação. Os métodos para otimização de planta de genes são bem conhecidos. Orientação relacionada à otimização e produção de sequências de DNA sintético pode ser constatada, por exemplo, nos documentos WO2013016546, WO?2011146524, WO1997013402, Patente dos EUA n.º 6166302, e Patente dos EUA n.º 5380831, incorporados ao presente documento a título de referência. Transformação
[00125] Os métodos adequados para transformação de plantas incluem qualquer método pelo qual DNA pode ser introduzido em uma célula, por exemplo e sem limitação: eletroporação (consulte, por exemplo, Patente dos EUA 5.384.253) bombardeamento de microprojétil (consulte, por exemplo, Patentes dos EUA 5.015.580,
5.550.318, 5.538.880, 6.160.208, 6.399.861 e 6.403.865); transformação mediada por Agrobacterium (consulte, por exemplo, Patentes dos EUA 5.635.055, 5.824.877, 5.591.616; 5.981.840, e
6.384.301); e transformação de protoplasto (consulte, por exemplo, Patente dos EUA 5.508.184).
[00126] Um construto de DNA pode ser introduzido diretamente no DNA genômico da célula vegetal com o uso de técnicas, como agitação com fibras de carboneto de silício (consulte, por exemplo, Patentes dos EUA 5.302.523 e 5.464.765), ou os construtos de DNA podem ser introduzidos diretamente no tecido de planta com o uso de métodos biolísticos, como bombardeamento de partícula de DNA (consultar, por exemplo, Klein et a/. (1987) Nature 327:70-73). De modo alternativo, o construto de DNA pode ser introduzido na célula vegetal por meio de transformação de nanopartícula (consultar, por exemplo, Pedido de Patente dos EUA n.º 20090104700, que é incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade).
[00127] Além disso, transferência de gene pode ser alcançada com o uso de bactérias ou vírus não Agrobacterium, como Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizoboium meliloti, Mesorhizobium loti, vírus X de batata, vírus mosaico de couve-flor e vírus mosaico de veia de aipim e/ou vírus mosaico de tabaco, consultar, por exemplo, Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1):1-4.
[00128] Através da aplicação de técnicas de transformação, células, de praticamente qualquer espécie de planta, podem ser transformadas de modo estável, e estas células podem ser desenvolvidas em plantas transgênicas por técnicas bem conhecidas. Por exemplo, técnicas que podem ser particularmente úteis no contexto de transformação de algodão são descritas na Patente dos EUA n.º 5.846.797, 5.159.135,
5.004.863 e 6.624.344; técnicas para transformar plantas Brassica, em particular, são descritas, por exemplo, na Patente dos EUA 5.750.871; técnicas para transformar grãos de soja são descritas, por exemplo, na Patente dos EUA 6,384,301; e técnicas para transformar Zea mays são descritas, por exemplo, nas Patentes dos EUA 7.060.876 e 5.591.616, e Pedido Internacional PCT WO 95/06722.
[00129] Após entrega eficaz de um ácido nucleico exógeno para uma célula receptora, uma célula transformada é geralmente identificada para cultura adicional e regeneração de planta. A fim de aprimorar a capacidade de identificar transformantes, pode ser desejado empregar um gene de marcador selecionável com o vetor de transformação usado para gerar a transformação. Em uma modalidade ilustrativa, uma população de célula transformada pode ser examinada expondo-se as células a um agente ou agentes seletivos, ou as células podem ser analisadas para o traço de gene de marcador desejado.
[00130] —Ascélulas que sobrevivem à exposição a um agente seletivo, ou células que foram classificadas como positivas em um ensaio de análise, podem ser cultivadas em meios que suportam regeneração de plantas. Em uma modalidade, qualquer meio de cultura de tecido de planta adequado pode ser modificado incluindo-se substâncias adicionais, como reguladores de crescimento. O tecido pode ser mantido em um meio básico com reguladores de crescimento até tecido suficiente estar disponível para iniciar esforços de regeneração de planta, ou após ciclos repetidos de seleção manual, até a morfologia do tecido ser adequada para regeneração (por exemplo, pelo menos 2 semanas), então, transferidas para meios condutores para formação de disparo. As culturas são transferidas periodicamente até formação de disparo suficiente ter ocorrido. Uma vez que os brotos são formados, os mesmos são transferidos para meio condutor para formação de raiz. Uma vez que raízes suficientes são formadas, plantas podem ser transferidas para o solo para crescimento e maturação adicional. Confirmação Molecular
[00131] Uma célulatransformada vegetal, calo, tecido ou planta pode ser identificada e isolada selecionando-se ou analisando-se o material de planta geneticamente modificado para traços codificados pelos genes de marcador presentes na transformação de DNA. Por exemplo, a seleção pode ser realizada cultivando-se o material de planta geneticamente modificado em meios que contêm uma quantidade inibidora do antibiótico ou herbicida ao qual o construto de gene de transformação confere resistência. Ademais, plantas transformadas e células vegetais também podem ser identificadas analisando-se as atividades de quaisquer genes de marcador visíveis (por exemplo, a B- glucuronidase, luciferase, ou proteína genes verde fluorescente) que podem estar presentes nos construtos de ácido nucleico recombinante. Tal seleção e metodologias de análise são bem conhecidas por técnicos no assunto. Os métodos de confirmação molecular que podem ser usados para identificar plantas transgênicas são conhecidos por aqueles com habilidade na técnica. Diversos métodos exemplificativos são adicionalmente descritos abaixo.
[00132] Sinalizadores moleculares foram descritos para uso em detecção de sequência. Brevemente, uma sonda de oligonucleotídeo de FRET é projetada, que sobrepõe a junção de DNA de inserto e genômica de flanqueamento. A estrutura exclusiva da sonda de FRET resulta em a mesma conter uma estrutura secundária que mantém as porções químicas de arrefecimento brusco e fluorescentes em grande proximidade. A sonda de FRET e iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de DNA de inserto e um na sequência genômica de flanqueamento) passam por ciclos na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Após amplificação de PCR bem-sucedida, hibridização da(s) sonda(s) de FRET para a sequência-alvo resulta na remoção da estrutura secundária de sonda e separação espacial das porções químicas de arrefecimento brusco e fluorescentes. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de insertos genômico/transgene de flanqueamento devido à amplificação bem- sucedida e hibridização. Tal ensaio de sinalizador molecular para detecção de uma reação de amplificação é uma modalidade da presente descrição.
[00133] O ensaio de sonda de hidrólise, conhecido de outro modo como TAQMANSº (Life Technologies, Foster City, Calif.), é um método de detecção e quantificação da presença de uma sequência de DNA. Brevemente, uma sonda de oligonucleotídeo de FRET é projetada com um oligo dentro do transgene e um na sequência genômica de flanqueamento para detecção específica de evento. A sonda de FRET e iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de DNA de inserto e um na sequência genômica de flanqueamento) passam por ciclos na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. A hibridização da sonda de FRET resulta em clivagem e liberação da porção química fluorescente na direção contrária da porção química de arrefecimento brusco na sonda de FRET. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de insertos de transgene/flanqueamento devido à amplificação bem-sucedida e hibridização. Tal ensaio de sonda de hidrólise para detecção de como uma reação de amplificação é uma modalidade da presente descrição.
[00134] Ensaios de KASParê são um método de detectar e quantificar a presença de uma sequência de DNA. Brevemente, a amostra de DNA genômico que compreende o polinucleotídeo de cassete de expressão de gene integrado é analisado com o uso de um ensaio com base em reação de cadeia de polimerase (PCR) conhecido como um sistema de ensaio KASParº. O ensaio de KASParº usado na prática da presente descrição pode utilizar uma mistura de ensaio de PCR de KASParº que contém múltiplos iniciadores. Os iniciadores usados na mistura de ensaio de PCR podem compreender pelo menos um iniciador avançado e pelo menos um iniciador reverso. O iniciador avançado contém uma sequência que corresponde a uma região específica do polinucleotídeo de DNA, e o iniciador reverso contém uma sequência que corresponde a uma região específica da sequência genômica. Além disso, os iniciadores usados na mistura de ensaio de PCR podem compreender pelo menos um iniciador avançado e pelo menos um iniciador reverso. Por exemplo, a mistura de ensaio de PCR de KASParº pode usar dois iniciadores avançados que correspondem a dois alelos diferentes e um iniciador reverso. Um dos iniciadores avançados contém uma sequência que corresponde à região específica da sequência genômica endógena. O segundo iniciador avançado contém uma sequência que corresponde a uma região específica do polinucleotídeo de DNA. O iniciador reverso contém uma sequência que corresponde a uma região específica da sequência genômica. Tal ensaio de KASParO para detecção de uma reação de amplificação é uma modalidade da presente descrição.
[00135] Em algumas modalidades, o sinal fluorescente ou corante fluorescente é selecionado dentre o grupo que consiste em um corante fluorescente HEX, um corante fluorescente FAM, um corante fluorescente JOE, um corante fluorescente TET, um corante fluorescente Cy 3, um corante fluorescente Cy 3.5, um corante fluorescente Cy 5, um corante fluorescente Cy 5.5, um corante fluorescente Cy 7 e um corante fluorescente ROX.
[00136] Em outras modalidades, a reação de amplificação é executada com o uso de segundos corantes de DNA fluorescente adequados que têm capacidade de tingir DNA celular em uma faixa de concentração detectável por citometria de fluxo, e têm um espectro de emissão fluorescente que é detectável por uma ciclagem térmica em tempo real. Deve ser observado por aqueles de habilidade comum na técnica que outros corantes de ácido nucleico são conhecidos e estão sendo continuamente identificados. Qualquer corante de ácido nucleico adequado com excitação apropriada e espectros de emissão pode ser empregue, como YO-PRO-16, SYTOX Green6, SYBR Green |O, SYTO110, SYTO120, SYTO130, BOBOGO, YOYOG, e TOTOS. Em uma modalidade, um segundo corante de DNA fluorescente é SYTO138 usado em menos do que 10 UM, menos do que 4 UM, ou menos do que 2,7 uM.
[00137] Em modalidades adicionais, Sequenciamento de Próxima Geração (NGS) pode ser usado para detecção. Como descrito por Brautigma et a/., 2010, análise de sequência de DNA pode ser usada para determinar a sequência de nucleotídeos do fragmento isolado e amplificado. Os fragmentos amplificados podem ser isolados e subclonados em um vetor e sequenciados com o uso de método de terminador de cadeia (também denominado de sequenciamento de Sanger) ou sequenciamento de terminador de corante. Além disso, o amplicon pode ser sequenciado com Sequenciamento de Próxima
Geração. As tecnologias de NGS não exigem a etapa de subclonagem, e múltiplas leituras de sequenciamento podem ser completadas em uma única reação. Três plataformas de NGS são comercialmente disponíveis, o Genome Sequencer FLX'Y disponível junto à 454 Life Sciences / Roche, o Illumina Genome Analyser'"" disponível junto à Solexa e SOLID'" da Applied Biosystems (acrônimo para: "Sequenciamento por Ligação Oligo e Detecção"). Além disso, há dois métodos de sequenciamento de molécula única que estão sendo atualmente desenvolvidos. Os mesmos incluem o verdadeiro Sequenciamento de Molécula Única (tSMS) disponível junto à Helicos Bioscience'"" e o sequenciamento de Single Molecule Real TimeTY (SMRT) disponível junto à Pacific Biosciences.
[00138] O Genome Sequencer FLX'TY que é comercializado por 454 Life Sciences/Roche é um NGS de leitura longa, que usa PCR de emulsão e pirosequenciamento para gerar leituras de sequenciamento. Os fragmentos de DNA de 300 a 800 pb ou bibliotecas que contêm fragmentos de 3 a 20 kb podem ser usados. As reações podem produzir mais de um milhão de leituras de cerca de 250 a 400 bases por execução para um rendimento total de 250 a 400 megabases. Essa tecnologia produz as leituras mais longas, mas a emissão de sequência total por execução é baixa em comparação com outras tecnologias de NGS.
[00139] O lllumina Genome Analyser"" que é comercializado por Solexa'"y é um NGS de leitura curta que usa sequenciamento por abordagem de síntese com nucleotídeos de terminador reversível identificados por corante fluorescente e tem como base PCR de ponte de fase sólida. A construção de bibliotecas de sequenciamento de extremidade pareada que contém fragmentos de DNA de até 10 kb pode ser usada. As reações produzem mais de 100 milhões de leituras curtas que têm 35 a 76 bases em comprimento. Esses dados podem produzir de 3 a 6 gigabases por execução.
[00140] O sistema de Sequenciamento por Ligação de Oligo e Detecção (SOLID) comercializado por Applied Biosystems'" é uma tecnologia de leitura curta. Essa tecnologia de NGS usa DNA de fita dupla fragmentado que tem até 10 kb em comprimento. O sistema usa sequenciamento por ligação de iniciadores de oligonucleotídeo identificados por corante e PCR de emulsão para gerar um bilhão de leituras curtas que podem resultar em uma emissão de sequência total de até 30 gigabases por execução.
[00141] tSMS de Helicos Bioscience!" e SMRT de Pacific Biosciences'Y aplicam uma abordagem diferente que usa moléculas de DNA único para as reações de sequência. O sistema tSMS HelicosTY produz até 800 milhões de leituras curtas que podem resultar em 21 gigabases por execução. Essas reações são completadas com o uso de nucleotídeos de terminador virtual identificados com corante fluorescente que é descrito como uma abordagem de "sequenciamento por síntese",
[00142] O sistema de Sequenciamento de Próxima Geração SMRT comercializado por Pacific Biosciences'" usa um sequenciamento por síntese em tempo real. Essa tecnologia pode produzir leituras de até
1.000 pares de bases de comprimento como resultado de não ser limitada por terminadores reversíveis. O rendimento bruto de leitura que é equivalente à cobertura de uma dobra de um genoma humano diploide pode ser produzido por dia com o uso dessa tecnologia.
[00143] Em outramodalidade, a detecção pode ser completada com o uso de ensaios de blotting, incluindo Western blots, Northern blots, e Southern blots. Tais ensaios de blotting são técnicas comumente usadas em pesquisa biológica para a identificação e quantificação de amostras biológicas. Esses ensaios incluem, primeiro, separar os componentes de amostra em géis por eletroforese, seguido por transferência dos componentes separados de modo eletroforético dos géis para membranas de transferência que são produzidas a partir de materiais como nitrocelulose, fluoreto de polivinilideno (PVDF), ou Náilon. Os analitos também podem ser diretamente manchados nesses suportes ou direcionados para regiões específicas nos suportes aplicando-se vácuo, ação de capilaridade ou pressão, sem separação anterior. As membranas de transferência são, então, comumente submetidas a um tratamento de pós-transferência para aperfeiçoar a habilidade dos analitos de serem distinguidos uns dos outros e detectados, ou visualmente ou por leitores automatizados.
[00144] Em uma modalidade adicional, a detecção pode ser completada com o uso de um ensaio ELISA, que usa um imunoensaio de enzima de fase sólida para detectar a presença de uma substância, normalmente um antígeno, em uma amostra líquida ou amostra úmida. Os antígenos da amostra são fixados a uma superfície de uma placa. Então, um anticorpo específico adicional é aplicado sobre a superfície de modo que o mesmo possa se ligar ao antígeno. Esse anticorpo é ligado a uma enzima e, na etapa final, uma substância que contém o substrato da enzima é adicionada. A reação subsequente produz um sinal detectável, mais comumente uma alteração de cor no substrato. Plantas Transgênicas
[00145] Emuma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula vegetal compreende um promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009). Em uma modalidade uma planta, tecido de planta, ou célula vegetal compreende o promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) de uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula vegetal compreende um cassete de expressão de gene que compreende uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO:1, ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO:1 que é operacionalmente ligada a um gene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir. Cb02009). Em uma modalidade ilustrativa, uma planta, tecido de planta, ou célula vegetal compreende um cassete de expressão de gene que compreende um promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb0O2009) que é operacionalmente ligado a um transgene, em que o transgene pode ser uma resistência a transgene de inseticida, uma tolerância a transgene de herbicida, uma eficiência de uso de transgene de nitrogênio, uma eficiência de uso de transgene de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene de marcador selecionável ou combinações dos mesmos.
[00146] De acordo com uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula vegetal é fornecida, em que a planta, tecido de planta, ou célula vegetal compreende uma sequência derivada de promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) operacionalmente ligada a um transgene, em que a sequência derivada de promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) compreende uma sequência SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula vegetal é fornecida, em que a planta, tecido de planta, ou célula vegetal compreende SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 operacionalmente ligada a um gene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir. Cb02009). Em uma modalidade, a planta, tecido de planta, ou célula vegetal é uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea ou uma célula ou tecido derivado de uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea. Em uma modalidade, a planta é selecionada dentre o grupo que consiste em Zea mays, trigo, arroz, sorgo, aveia, centeio, bananas, cana de açúcar, soja, algodão, girassol e canola. Em uma modalidade, a planta é Zea mays. De acordo com uma modalidade, a planta, tecido de planta, ou célula vegetal compreende SEQ ID NO: 1 ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1 operacionalmente ligada a um gene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir. CbO02009). Em uma modalidade, a planta, tecido de planta, ou célula vegetal compreende um promotor operacionalmente ligado a um transgene, em que o promotor consiste na SEQ ID NO: 1 ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1. De acordo com uma modalidade, o construto de gene que compreende sequência de promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) operacionalmente ligada a um transgene é incorporado ao genoma da planta, tecido de planta, ou célula vegetal.
[00147] Emuma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula vegetal compreende uma UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009). Em uma modalidade uma planta, tecido de planta, ou célula vegetal compreende a UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) de uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO:7 ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO:7. Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula vegetal compreende um cassete de expressão de gene que compreende uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO:7, ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO:7 que é operacionalmente ligada a um gene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir. Cb02009). Em uma modalidade ilustrativa,
uma planta, tecido de planta, ou célula vegetal compreende um cassete de expressão de gene que compreende uma UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb0O2009) que é operacionalmente ligado a um transgene, em que o transgene pode ser uma resistência a transgene de inseticida, uma tolerância a transgene de herbicida, uma eficiência de uso de transgene de nitrogênio, uma eficiência de uso de transgene de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene de marcador selecionável ou combinações dos mesmos.
[00148] De acordo com uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula vegetal é fornecida, em que a planta, tecido de planta, ou célula vegetal compreende uma sequência derivada de UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) operacionalmente ligada a um transgene, em que a sequência derivada de UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) compreende uma sequência SEQ ID NO:7 ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com SEQ ID NO:7. Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula vegetal é fornecida, em que a planta, tecido de planta, ou célula vegetal compreende SEQ ID NO:7, ou a sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com SEQ ID NO:7 operacionalmente ligada a um gene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir.Cb02009). Em uma modalidade, a planta, tecido de planta, ou célula vegetal é uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea ou uma célula ou tecido derivado de uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea. Em uma modalidade, a planta é selecionada dentre o grupo que consiste em Zea mays, trigo, arroz, sorgo, aveia, centeio, bananas, cana de açúcar, soja, algodão, girassol e canola. Em uma modalidade, a planta é Zea mays. De acordo com uma modalidade, a planta, tecido de planta, ou célula vegetal compreende SEQ ID NO:7 ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%,
95% ou 99,5% de identidade de sequência com SEQ ID NO:7 operacionalmente ligada a um gene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir. CbO02009). Em uma modalidade, a planta, tecido de planta, ou célula vegetal compreende uma UTR 5' operacionalmente ligada a um transgene, em que a UTR 5' consiste na SEQ ID NO:7 ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com SEQ ID NO:7. De acordo com uma modalidade, o construto de gene que compreende sequência de UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) operacionalmente ligada a um transgene é incorporado ao genoma da planta, tecido de planta, ou célula vegetal.
[00149] Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula vegetal compreende uma UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb0O2009). Em uma modalidade uma planta, tecido de planta, ou célula vegetal compreende a UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) de uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO:2 ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO:2. Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula vegetal compreende um cassete de expressão de gene que compreende uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO:2, ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO:2 que é operacionalmente ligada a um gene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir. CbO2009). Em uma modalidade ilustrativa, uma planta, tecido de planta, ou célula vegetal compreende um cassete de expressão de gene que compreende uma UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) que é operacionalmente ligado a um transgene, em que o transgene pode ser uma resistência a transgene de inseticida, uma tolerância a transgene de herbicida, uma eficiência de uso de transgene de nitrogênio, uma eficiência de uso de transgene de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene de marcador selecionável ou combinações dos mesmos.
[00150] De acordo com uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula vegetal é fornecida, em que a planta, tecido de planta, ou célula vegetal compreende uma sequência derivada de UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) operacionalmente ligada a um transgene, em que a sequência derivada de UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) compreende uma sequência SEQ ID NO:2 ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com SEQ ID NO:2. Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula vegetal é fornecida, em que a planta, tecido de planta, ou célula vegetal compreende SEQ ID NO:2, ou a sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com SEQ ID NO:2 operacionalmente ligada a um gene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir.Cb02009). Em uma modalidade, a planta, tecido de planta, ou célula vegetal é uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea ou uma célula ou tecido derivado de uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea. Em uma modalidade, a planta é selecionada dentre o grupo que consiste em Zea mays, trigo, arroz, sorgo, aveia, centeio, bananas, cana de açúcar, soja, algodão, girassol e canola. Em uma modalidade, a planta é Zea mays. De acordo com uma modalidade, a planta, tecido de planta, ou célula vegetal compreende SEQ ID NO:2 ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com SEQ ID NO:2 operacionalmente ligada a um gene de óvulo de não Panicum virgatum (Pavir. CbO2009). Em uma modalidade, a planta, tecido de planta, ou célula vegetal compreende uma UTR 3' operacionalmente ligada a um transgene, em que a UTR 3' consiste na SEQ ID NO:2 ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com SEQ ID NO:2. De acordo com uma modalidade, o construto de gene que compreende sequência de UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) operacionalmente ligada a um transgene é incorporado ao genoma da planta, tecido de planta, ou célula vegetal.
[00151] Emuma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula vegetal de acordo com os métodos revelados no presente documento pode ser uma planta dicotiledônea. A planta dicotiledônea, tecido de planta, ou célula vegetal pode ser, porém, sem limitação, alfafa, colza, canola, mostarda indiana, mostarda da Etiópica, soja, girassol, algodão, feijões, brócolis, repolho, couve-flor, aipo, pepino, berinjela, alface; melão, ervilha, pimenta, amendoim, batata, abóbora, rabanete, espinafre, beterraba, girassol, tabaco, tomate e melancia.
[00152] Um técnico no assunto reconhecerá que, após a sequência exógena ser incorporada de modo estável em plantas transgênicas e confirmada como sendo operável, a mesma pode ser introduzida em outras plantas por cruzamento sexual. Qualquer uma dentre um número de técnicas de melhoramento genético padrão pode ser usada, dependendo das espécies a serem cruzadas.
[00153] A presente descrição também abrange sementes das plantas transgênicas descritas acima, em que a semente tem o transgene ou construto de gene que contém os elementos reguladores de gene da presente descrição. A presente descrição abrange ainda a progênie, clones, linhagens celulares ou células das plantas transgênicas descritas acima, em que a dita progênie, clone, linhagem celular ou célula tem o transgene ou construto de gene que contém os elementos reguladores de gene da presente descrição.
[00154] A presente descrição também abrange o cultivo de plantas transgênicas descritas acima, em que a planta transgênica tem o transgene ou construto de gene que contém os elementos reguladores de gene da presente descrição. Consequentemente, tais plantas transgênicas podem ser geneticamente modificadas para, entre outros, ter um ou mais traços ou eventos transgênicos desejados que contêm os elementos reguladores de gene da presente descrição, ao serem transformadas com moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção, e podem ser colhidos ou cultivados por qualquer método conhecido por técnicos no assunto.
Método de Expressar um Transgene
[00155] Em uma modalidade, um método de expressar pelo menos um transgene em uma planta compreende cultivar uma planta que compreende um promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) operacionalmente ligado a pelo menos um transgene ou uma sequência poliligante. Em uma modalidade, o promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) consiste em uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, um método de expressar pelo menos um transgene em uma planta que compreende cultivar uma planta que compreende um promotor de gene de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb0O2009) operacionalmente ligado a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressar pelo menos um transgene em um tecido de planta ou célula vegetal que compreende realizar a cultura de um tecido de planta ou célula vegetal que compreende um promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) operacionalmente ligado a pelo menos um transgene.
[00156] Em uma modalidade, um método de expressar pelo menos um transgene em uma planta compreende cultivar uma planta que compreende um cassete de expressão de gene que compreende um promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) operacionalmente ligado a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, o promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. CbO02009) consiste em uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, um método de expressar pelo menos um transgene em uma planta compreende cultivar uma planta que compreende um cassete de expressão de gene que compreende um promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) operacionalmente ligado a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressar pelo menos um transgene em uma planta compreende cultivar uma planta que compreende um cassete de expressão de gene que compreende um promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) operacionalmente ligado a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressar pelo menos um transgene em um tecido de planta ou célula vegetal compreende realizar a cultura de um tecido de planta ou célula vegetal que compreende um cassete de expressão de gene que contém um promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) operacionalmente ligado a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressar pelo menos um transgene em um tecido de planta ou célula vegetal compreende realizar a cultura de um tecido de planta ou célula vegetal que compreende um cassete de expressão de gene, um promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) operacionalmente ligado a pelo menos um transgene.
[00157] Em uma modalidade, um método de expressar pelo menos um transgene em uma planta compreende cultivar uma planta que compreende uma UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) operacionalmente ligada a pelo menos um transgene ou uma sequência poliligante. Em uma modalidade, a UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) consiste em uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO:7 ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO:7. Em uma modalidade, um método de expressar pelo menos um transgene em uma planta que compreende cultivar uma planta que compreende uma UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) operacionalmente ligada a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressar pelo menos um transgene em um tecido de planta ou célula vegetal que compreende realizar a cultura de um tecido de planta ou célula vegetal que compreende uma UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) operacionalmente ligada a pelo menos um transgene.
[00158] Em uma modalidade, um método de expressar pelo menos um transgene em uma planta compreende cultivar uma planta que compreende um cassete de expressão de gene que compreende uma UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) operacionalmente ligada a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, a UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Ch0O2009) consiste em uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO:7 ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO:7. Em uma modalidade, um método de expressar pelo menos um transgene em uma planta compreende cultivar uma planta que compreende um cassete de expressão de gene que compreende uma UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb0O2009) operacionalmente ligada a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressar pelo menos um transgene em uma planta compreende cultivar uma planta que compreende um cassete de expressão de gene que compreende uma UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) operacionalmente ligada a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressar pelo menos um transgene em um tecido de planta ou célula vegetal compreende realizar a cultura de um tecido de planta ou célula vegetal que compreende um cassete de expressão de gene que contém uma UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) operacionalmente ligada a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressar pelo menos um transgene em um tecido de planta ou célula vegetal compreende realizar a cultura de um tecido de planta ou célula vegetal que compreende um cassete de expressão de gene, uma UTR 5' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) operacionalmente ligada a pelo menos um transgene.
[00159] Em uma modalidade, um método de expressar pelo menos um transgene em uma planta compreende cultivar uma planta que compreende uma UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Ch0O2009) operacionalmente ligada a pelo menos um transgene ou uma sequência poliligante. Em uma modalidade, a UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) consiste em uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO:2 ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO:2. Em uma modalidade, um método de expressar pelo menos um transgene em uma planta que compreende cultivar uma planta que compreende uma UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) operacionalmente ligada a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressar pelo menos um transgene em um tecido de planta ou célula vegetal que compreende realizar a cultura de um tecido de planta ou célula vegetal que compreende uma UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) operacionalmente ligada a pelo menos um transgene.
[00160] Em uma modalidade, um método de expressar pelo menos um transgene em uma planta compreende cultivar uma planta que compreende um cassete de expressão de gene que compreende uma UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) operacionalmente ligada a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, a UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) consiste em uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO:2 ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO:2. Em uma modalidade, um método de expressar pelo menos um transgene em uma planta compreende cultivar uma planta que compreende um cassete de expressão de gene que compreende uma UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) operacionalmente ligada a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressar pelo menos um transgene em uma planta que compreende cultivar uma planta que compreende um cassete de expressão de gene que compreende uma UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) operacionalmente ligada a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressar pelo menos um transgene em um tecido de planta ou célula vegetal que compreende realizar a cultura de um tecido de planta ou célula vegetal que compreende um cassete de expressão de gene que contém uma UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) operacionalmente ligada a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressar pelo menos um transgene em um tecido de planta ou célula vegetal que compreende realizar a cultura de um tecido de planta ou célula vegetal que compreende um cassete de expressão de gene, uma UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) operacionalmente ligada a pelo menos um transgene.
[00161] Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar determinados recursos e/ou modalidades específicos. Os exemplos não devem ser interpretados como limitando a descrição aos recursos ou modalidades específicas exemplificadas.
EXEMPLOS Exemplo 1: Novo Projeto de uma Combinação de Elementos Reqgulatórios Otimizados de Gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Chbo2009)
[00162] O promotor de um gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) (SEQ ID NO:1) e uma UTR 3' de um gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) (SEQ ID NO:2) foi identificado a partir da sequência de DNA genômico (gDNA) de Panicum virgatum. Essas sequências de elemento regulador foram identificadas realizando-se BLAST do banco de dados Phytozome (Goodstein DM, Shu S, Howson R, Neupane R, Hayes RD, Fazo J, Mitros T, Dirks W, Hellsten U, Putnam N, Rokhsar DS (2012) Nucleic Acids Res. 40: D1178-1186) com um gene de óvulo de Arabidopsis thaliana DD45/EC1.2 (número de acesso ao Genbank At2g921740). Os acertos resultantes foram analisados e uma única sequência de codificação foi selecionada para análise adicional. Para a identificação de uma região promotora inovadora, 1 a 3 kb de nucleotídeos foram recuperados a montante do sítio inicial de tradução (códon ATG) e análises in silico adicionais foram realizadas. Para a identificação de uma região UTR 3' inovadora, 0,5 a 2 kb de nucleotídeos foram recuperados a jusante do sítio de parada e análises in silico adicionais foram realizadas. As análises in silico incluíam a identificação de sequências de polinucleotídeos a partir de quaisquer outros genes circundantes, conforme necessário, verificando-se a presença sequências repetitivas que poderiam resultar em silenciamento de expressão de gene, ou a presença de UTR 5' que podem conter exões e íntrons de não codificação. Com base nessas análises, as sequências de promotor de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) foram sintetizadas e movidas adiante para uso adicional para acionar a expressão de uma transgene. A partir da avaliação da sequência cromossômica contígua que abrangia milhões de pares de bases, uma sequência de polinucleotídeos de 1.400 pares de bases (SEQ ID NO:1) foi identificada e isolada para uso na expressão de sequências de codificação heterólogas. Essa sequência de polinucleotídeos inovadora foi analisada para uso como uma sequência reguladora para acionar a expressão de um gene e é fornecida nos pares de bases 1 a 1.400 da SEQ ID NO:3. Similarmente, a partir da avaliação da sequência cromossômica contígua que abrangia milhões de pares de bases, uma sequência de polinucleotídeos de 163 pares de bases (SEQ ID NO:7) foi identificada e isolada para uso na terminação de sequências de codificação heterólogas. Essa sequência de polinucleotídeos inovadora foi analisada para uso como uma sequência reguladora como uma UTR 5' para acionar a expressão de um gene e é fornecida nos pares de bases 1.401 a 1.563 da SEQ ID NO:3. Finalmente, a partir da avaliação da sequência cromossômica contígua que abrangia milhões de pares de bases, uma sequência de polinucleotídeos de 931 pares de bases (SEQ ID NO:2) foi identificada e isolada para uso na terminação de sequências de codificação heterólogas. Essa sequência de polinucleotídeos inovadora foi analisada para uso como uma sequência reguladora para terminar a expressão de um gene e é fornecida nos pares de bases 2.126 a 3.056 da SEQ ID NO:3.
Exemplo 2: Construção de Vetor (pDAB129557)
[00163] O vetor pDAB129557 foi construído para incorporar a combinação inovadora de sequências de polinucleotídeos reguladoras que flanqueiam um transgene.
O construto de vetor pDAB129557 continha um cassete de expressão de gene, em que o transgene PhiYFP foi acionado pelo promotor de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.
ChbO02009) da SEQ ID NO:1 e contendo a UTR 5' de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) da SEQ ID NO:7 foi flanqueado por UTR 3' de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.
Cb02009) da SEQ ID NO:2. Uma listagem de sequências desse cassete de expressão de gene é fornecida como a SEQ ID NO:4. O vetor também continha um cassete de expressão de gene marcador selecionável que continha o transgene aad-1 (Patente dos EUA n.º 7.838.733) acionado pelo promotor Actin1 de Oryza sativa (Patente dos EUA n.º 5.641.876) e foi terminado pela UTR 3' de Lipase de Zea mays (Patente dos EUA n.º 7.179.902). Uma listagem de sequências desse cassete de expressão de gene é fornecida como a SEQ ID NO:5. Esse construto foi construído sintetizando o promotor recém-projetado e UTR 3' de um gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) e clonando o promotor em um vetor de entrada GeneArt Seamless Cloning'" (Life Technologies) com o uso de um fornecedor terceirizado.
O vetor de entrada resultante foi identificado como pDAB 129546 e continha o promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) que aciona o transgene PhiYFP que foi usado para bombardeio de partícula de tecidos de Zea mays.
Clones do vetor de entrada, pDAB129546, foram obtidos e DNA plasmídeo foi isolado e confirmado por meio de digestões com enzima de restrição e sequenciamento.
Além disso, o vetor de entrada PpDAB129546 foi integrado em um vetor de destino com o uso do sistema de clonagem Gateway"" (Life Technologies). Clones do plasmídeo binário resultante, pDAB129557, foram obtidos e DNA plasmídeo foi isolado e confirmado por meio de digestões com enzima de restrição e sequenciamento.
Os construtos resultantes continham uma combinação de elementos reguladores que acionam a expressão de um transgene e terminam expressão de um transgene. Exemplo 3: Transformação de Zea mays
[00164] Transformação de Zea mays por meio de Bombardeio de Partículas
[00165] O construto experimental pDAB129546 foi transformado em Zea mays c.v. B104 por meio de transformação por bombardeio de partículas de embriões imaturos isolados. Por exemplo, embriões imaturos de Zea mays c.v. B104 foram aleatoriamente isolados de oito espigas com tamanho médio de embrião de 1,8 a 2,4 mm. Os embriões imaturos foram coletados em meios de infecção e colocados em meio de osmose para incubação sob luzes brilhantes com um fluxo de fótons de 50 uM e uma temperatura a 27ºC de um dia para o outro. No dia após o isolamento, 36 embriões imaturos por placa foram dispostos dentro de um círculo alvo e foram usados para bombardeio de partículas (PB). Três placas por construtos foram usadas, dais quais uma tinha embriões imaturos com tamanho entre 2,2 a 2,4 e duas tinham embriões imaturos com tamanho entre 1,8 a 2,2 mm. As partículas de ouro foram revestidas com 5 ul de DNA (de um estoque de 1,0 ug/uL) com o uso de uma precipitação de CaCl2/espermidina. Os parâmetros usados para o bombardeio foram: partículas de ouro de 1,0 mícron, discos de 7,58 MPa 1.100 psi) de ruptura, vácuo de 68,58 centímetros 27 polegadas de Hg e distância de bombardeio de 6 cm.
[00166] Uma vez que os bombardeios tenham sido concluídos, as placas foram colocadas em uma caixa transparente e retornadas às mesmas condições de cultivo conforme indicado acima. Os embriões imaturos foram coletados após 72 horas para análise de imagens microscópicas da proteína YFP de expressão. A análise de imagens foi realizada com o uso de um microscópio estéreo fluorescente Leica M165 FC equipado com lente objetiva Leica Planapo 2,0Xx e câmera de 1,4 megapixel Leica DFC310 FX.
[00167] A análise de imagens de expressão de YFP em embriões imaturos bombardeados indica que o promotor de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) inovador e a UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. CD0O2009) acionaram com sucesso a expressão de YFP em milho quando comparados a embriões imaturos não transformados que não resultaram em expressão da proteína YFP em milho. Exemplo 4: Perfis de Expressão de Genes Ligados de Maneira Funcional ao Elemento Regulador de Óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Chb02009) em Plantas de Cultura
[00168] O elemento regulador de promotor de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. ChD0O2009) da SEQ ID NO:1 contendo a UTR 5' de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Chb0O2009) da SEQ ID NO:7 e o elemento regulador de UTR 3' de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) da SEQ ID NO:2, conforme fornecido em pDAB129546 resultaram na expressão do transgene YFP em embriões imaturos de Zea mays. Dessa maneira, os elementos reguladores de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb0O2009) inovadores (o promotor de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) da SEQ ID NO:1, a UTR 5' de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb0O2009) da SEQ ID NO:7 e a UTR 3' de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) da SEQ ID NO:2) foram identificados e caracterizados. São revelados pela primeira vez elementos reguladores de promotor inovadores para uso na expressão de construtos de gene. Exemplo 5: Análise de Número de Cópias de Transgene de Sonda de Hidrólise (qPCR)
[00169] Váriostiposde análises moleculares foram empregados para triar eventos simples de baixo número de cópias. DNA foi extraído com um kit QIAGEN MagaAttract"" com o uso de processadores de partículas magnéticas THERMO FISHER KingFisher"" e os protocolos recomendados pelo fornecedor. A análise de número de cópias de transgene integrada foi realizada com o uso de ensaios de Sonda de Hidrólise específicos para os genes phiyfo e aad1f. Além disso, a contaminação por integração inadvertida da cadeia principal de plasmídeo de vetor binário foi detectada por um ensaio de Sonda de Hidrólise específico para o gene de resistência a Espectinomicina (Spec) originado na cadeia principal de vetor binário. Os ensaios de Sonda de Hidrólise para genes endógenos de mais Invertase (número de acesso ao GenBank'Y U16123) e Culina (número de acesso ao GenBank'Y XM 008664750) foram desenvolvidos como padrões de referência internos. A Tabela 1 lista as sequências de oligonucleotídeos dos componentes de ensaio de Sonda de Hidrólise (iniciadores e sondas de BHQ foram sintetizados pela INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES, Coralville, IA, sondas MGB foram sintetizadas pela APPLIED BIOSYSTEMS, Grand Island, NY). As reações PCR de Sonda de Hidrólise Biplex foram configuradas de acordo com a Tabela 2 com cerca de 10 ng de DNA, e as condições de ensaio são apresentadas na Tabela 3.
[00170] Para amplificação, a mistura mestre Fast Advanced“ (Life Technologies, Carlsbad, CA) foi preparada à concentração final 1X em uma reação multiplex de 10 ul de volume contendo 0,1% de PVP, 0,4 UM de cada iniciador e 0,2 UM de cada sonda. A porção química fluorescente FAM (6-Carbóxi Fluoresceína Amidita) foi excitada a 465 nm e a fluorescência foi medida a 510 nm; os valores correspondentes para a porção química fluorescente HEX (hexaclorofluoresceína) foram 533 nm e 580 nm, e para VICº os valores foram 538 nm e 554 nm. O nível de fluorescência gerado para cada reação foi analisado com o uso do sistema de PCR em tempo real Roche LightCyclerº480 de acordo com as recomendações do fabricante. O número de cópias de transgene foi determinado por comparação de saídas de Light Cyclerº480 de valores de gene Alvo/Referência com amostras desconhecidas com valores de gene Alvo/Referência de padrões de número de cópias conhecidos (Cópia 1 representando plantas hemizigotas, Cópia 2 representando plantas homozigotas).
[00171] As pontuações Cp, isto é, o ponto em que o sinal de fluorescência cruza o limite de fundo com o uso do algoritmo de pontos de ajuste (software LightCyclerº versão 1.5) e o módulo Relative Quant (com base no método AACt) foram usados para realizar a análise de dados de PCR em tempo real. Tabela 1: Lista de iniciadores de nucleotídeo diretos e reversos e sondas fluorescentes (sintetizadas pela Applied Biosystems) usados para número de cópias de gene de interesse e detecção de expressão relativa. Fra [RIR essi di d1 Para detecção de phivfp Invertase de Refe- ante rência de Maís Culina de Refe- tras sema rência de Maís Tabela 2: Mistura de PCR para análise de número de cópias de DNA. Concentração final
RO BE PVP (10% Mistura Mestre ROCHE 2X Iniciador Direto GOI (10 uM Iniciador Reverso GOI (10 uM Sonda GO! (5 uM Iniciador Direto de Referência (10 uM Iniciador Reverso de Referência (10 uM Sonda de Referência (5uM
Tabela 3: Condições de termociclador para amplificação de PCR de sonda de hidrólise. mm EE so Exemplo 6: Análise de Transcrito Relativo (RNA)
[00172] APCR de sonda de hidrólise é usada para detectar o nível relativo de transcrito de phiyfp. As amostras de tecido de espiga imatura contendo óvulo não fertilizado foram coletadas. RNA é extraído com o Kit de RNA total KingFisher (Thermo Scientific, número de catálogo 97020196). cDNA é produzido a partir de -500 ng de RNA com kit de síntese de cDNA de alta capacidade (Invitrogen, Carlsbad, CA, número de catálogo: 4368814) com o uso de iniciador aleatório (TVN oligo-SEQ ID NO:20: TTITTTTITTITTITTTITTTTITVN) em uma reação de 20 ul contendo 2,5 unidades/uL de transcriptase reversa MultiScribe, 200 nM de TVN oligo e 4 MM de dNTP. A reação é iniciada com 10 minutos a 25ºC para pré-incubação, então, 120 minutos para síntese a 37ºCe5 minutos a 85ºC para inativação.
[00173] O cDNA recém-sintetizado é, então, usado para amplificação. A configuração de qPCR, as condições de execução e a captura de sinal são as mesmas que aquelas para análise de número de cópias de DNA exceto pelo fato de que Culina é usada como o gene de referência para milho. Os dados de expressão de gene de interesse são calculados com o uso de 2-ººº* em relação ao nível de Culina. Exemplo 7: Análise Microscópica de Padrões de Expressão de Promotor Específico para Óvulo em Óvulos de Maís Não Fertilizados
[00174] Plantas transgênicas de maís TO contendo construto de promotor específico para óvulo pDAB129557 foram cultivadas em estufa. Plantas do tipo selvagem foram cultivadas na mesma estufa. As plantas sofreram despendoamento e as espigas imaturas foram coletadas durante diferentes estágios de desenvolvimento da emergência de seda até o estágio em que o comprimento de seda foi Tem. As folhas de casca circundantes foram removidas das espigas e cortadas em seções de 6 a 8 grãos. Essas seções foram fixadas do lado do grão a um estágio de amostra com cola de cianoacrilato e cortadas a 250 mícrons de espessura em um Leica VT1200 vibratome. Essas seções foram montadas em lâminas de vidro em uma gota de água e examinadas em um microscópio composto ereto Leica DM5000 e as imagens foram capturadas com uma câmera digital Leica DFC T7000 com o uso de um conjunto de filtro YFP.
[00175] As seções de grão da linhagem transgênica pDAB129559 mostraram células/tecido que expressa YFP no saco embrionário. No entanto, nenhuma fluorescência de YFP foi observada a partir do saco embrionário dos grãos obtidos de planta de controle não transgênica.
[00176] O elemento regulador de promotor de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) da SEQ ID NO:1 contendo a UTR 5' de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Chb0O2009) da SEQ ID NO:7 e o elemento regulador de UTR 3' de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) da SEQ ID NO:2, conforme fornecido em pDAB129559 resultaram na expressão do transgene YFP em embriões imaturos de Zea mays. Dessa maneira, os elementos reguladores de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb0O2009) inovadores (o promotor de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) da SEQ ID NO:1, a UTR 5' de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb0O2009) da SEQ ID NO:7 e a UTR 3' de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) da SEQ ID NO:2) foram identificados e caracterizados. São revelados pela primeira vez elementos reguladores de promotor inovadores para uso na expressão de construtos de gene.
Exemplo 8: Análise Microscópica e de Abundância de Transcrito de Padrões de Expressão de Promotor Específico para Óvulo em Óvulos de Mais Fertilizados
[00177] Plantas transgênicas de maís TO contendo construto de promotor específico para óvulo pDAB129557 foram cultivadas na estufa. Plantas do tipo selvagem foram cultivadas na mesma estufa. As plantas sofreram despendoamento e as espigas sofreram polinização cruzada com o uso de pólen de plantas de maís não transgênicas. As espigas fertilizadas foram coletadas 4 dias após a polinização. As folhas de casca circundantes foram removidas das espigas e cortadas em seções de 6 a 8 grãos. Essas seções foram fixadas do lado do grão a um estágio de amostra com cola de cianoacrilato e cortadas a 250 mícrons de espessura em um Leica VT 1200 vibratome'"Y. Essas seções foram montadas em lâminas de vidro em uma gota de água e examinadas em um microscópio composto ereto Leica DM50007Y e as imagens foram capturadas com uma câmera digital Leica DFC T7000TY com o uso de um conjunto de filtro YFP.
[00178] Os óvulos fertiizados imageados da linhagem transgênica pDAB129557 mostraram células/tecido que expressam YFP no embrião/saco embrionário.
[00179] A análise de transcrito dos grãos contendo embriões não fertiizados obtidos a partir de plantas transgênicas pDAB129557 mostrou transcrito de YFP enquanto nenhum transcrito foi detectado nas plantas de controle não transgênicas.
[00180] O elemento regulador de promotor de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. ChD0O2009) da SEQ ID NO:1 contendo a UTR 5' de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Chb0O2009) da SEQ ID NO:7 e o elemento regulador de UTR 3' de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) da SEQ ID NO:2, conforme fornecido em pDAB129557 resultaram na expressão do transgene YFP em embriões imaturos de Zea mays.
Dessa maneira, os elementos reguladores de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb0O2009) inovadores (o promotor de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) da SEQ ID NO:1, a UTR 5' de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) da SEQ ID NO:7 e a UTR 3' de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) da SEQ ID NO:2) foram identificados e caracterizados. São revelados pela primeira vez elementos reguladores de promotor inovadores para uso na expressão de construtos de gene. Exemplo 9: Transformação mediada por Agrobacterium de Genes Ligados de Maneira Funcional ao Promotor de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009), à UTR 5' de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) e/ou à UTR 3' de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cbo02009)
[00181] A soja pode ser transformada com genes ligados de maneira funcional ao promotor de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009), à UTR 5' de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) e/ou à UTR 3' de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) utilizando as mesmas técnicas anteriormente descritas no Exemplo nº 11 ou no Exemplo nº 13 do pedido de patente WO 2007/053482.
[00182] O algodão pode ser transformado com genes ligados de maneira funcional ao promotor de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cbo2009), à UTR 5 de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) e/ou à UTR 3' de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) utilizando as mesmas técnicas anteriormente descritas nos Exemplos nº 14 da Patente dos EUA n.º 7.838.733 ou no Exemplo nº 12 do pedido de patente WO 2007/053482 (Wright et al.).
[00183] A canola pode ser transformada com genes ligados de maneira funcional ao promotor de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb0O2009), a UTR 5 de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Chb02009) e/ou a UTR 3' de óvulo de Panicum virgatum
(Pavir. Cb02009) utilizando as mesmas técnicas anteriormente descritas no Exemplo nº 26 da Patente dos EUA n.º 7.838.733 ou no Exemplo nº 22 do pedido de patente WO 2007/053482 (Wright et a/.).
[00184] Otrigopode ser transformado com genes ligados de maneira funcional ao promotor de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009), a UTR 5' de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) e/ou à UTR 3' de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009) utilizando as mesmas técnicas anteriormente descritas no Exemplo nº 23 do pedido de patente WO 2013/116700A1 (Lira et al.).
[00185] O arroz pode ser transformado com genes ligados de maneira funcional ao promotor de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009), a UTR 5 de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Chb02009) e/ou a UTR 3' de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) utilizando as mesmas técnicas anteriormente descritas no Exemplo nº 19 do pedido de patente WO 2013/116700A1 (Lira et al.). Exemplo 10: Transformação mediada por Agrobacterium de Genes Ligados de Maneira Funcional aos Elementos Reguladores de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009)
[00186] À luzda presente descrição, culturas adicionais podem ser transformadas de acordo com as modalidades da presente descrição com o uso de técnicas que são conhecidas na técnica. Para transformação mediada por Agrobacterium de centeio, consultar, por exemplo, Popelka JC, Xu J, Altpeter F., "Generation of rye with low transgene copy number after biolistic gene transfer and production of (Secale cereale L.) plants instantly marker-free transgenic rye," Transgenic Res. Out. de 2003; 12(5):587 a 596.). Para transformação mediada por Agrobacterium de sorgo, consultar, por exemplo, Zhao et al., "Agrobacterium-mediated sorghum transformation," Plant Mol Biol. Dez. de 2000; 44(6):789 a 798. Para transformação mediada por Agrobacterium de cevada, consultar, por exemplo, Tingay et al.
"Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformation," The Plant Journal, (1997) 11: 1.369 a 1.376. Para transformação mediada por Agrobacterium de trigo, consultar, por exemplo, Cheng et al/., "Genetic Transformation de Wheat Mediated by Agrobacterium tumefaciens," Plant Physiol. Nov. de 1997;115(3):971 a 980. Para transformação mediada por Agrobacterium de arroz, consultar, por exemplo, Hiei et al., "Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens," Plant Mol. Biol. Set. de 1997;35(1-2):205 a 218.
[00187] Os nomes em latim para essas e outras plantas são determinados abaixo. Deve ficar claro que outras técnicas de transformação (não Agrobacterium) podem ser usadas para transformar genes ligados de maneira funcional ao promotor de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb0O2009) ou a UTR 5' de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb0O2009), por exemplo, nessas e em outras plantas. Os exemplos incluem, porém sem limitação; Maís (Zea mays), Trigo (Triticum spp.), Arroz (Oryza spp. e Zizania spp.), Cevada (Hordeum spp.), Algodão (Abroma augusta e Gossypium spp.), Soja (Glycine max), Beterraba sacarina e de mesa (Beta spp.), Cana de açúcar (Arenga pinnata), Tomate (Lycopersicon esculentum e outras spp., Physalis ixocarpa, Solanum incanum e outras spp., e Cyphomandra betacea), Batata (Solanum tuberosum), Batata-doce (Ipomoea batatas), Centeio (Secale spp.), Pimentas (Capsicum annuum, chinense e frutescens), Alface (Lactuca sativa, perennis e pulchella), Repolho (Brassica spp.), Aipo (Apium graveolens), Berinjela (Solanum melongena), Amendoim (Arachis hypogea), Sorgo (Sorghum spp.), Alfafa (Medicago sativa), Cenoura (Daucus carota), Feijão (Phaseolus spp. e outros gêneros), Aveias (Avena sativa e strigosa), Ervilhas (Pisum, Vigna e Tetragonolobus spp.), Girassol (Helianthus annuus), Abóbora (Cucurbita spp.), Pepino (Cucumis sativa), Tabaco (Nicotiana Spp.), Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), Gramado (Lolium, Agrostis,
Poa, Cynodon, e outros gêneros), Trevo (Trifolium), Ervilhaca (Vicia). À transformação de tais plantas com genes ligados de maneira funcional a UTR 3' de gene de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb02009), por exemplo, é contemplada nas modalidades da presente descrição.
[00188] O uso do promotor de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009), da UTR 5 de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb0O2009) e/ou da UTR 3' de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Ch0O2009) para acionar genes ligados de maneira funcional pode ser implantado em muitas espécies de madeira decíduas e perenes. Tais aplicações estão também dentro do escopo das modalidades desta descrição. Essas espécies incluem, porém sem limitação; amieiro (Alnus spp.), freixo (Fraxinus spp.), espécies de choupo tremedor e álamo (Populus spp.), faia (Fagus spp.), bétula (Betula spp.), cereja (Prunus Spp.), eucalipto (Eucalyptus spp.), nogueira (Carya spp.), bordo (Acer spp.), carvalho (Quercus spp.) e pinheiro (Pinus spp.).
[00189] O uso de promotor de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009), da UTR 5 de óvulo de Panicum virgatum (Pavir.Cb0O2009) e/ou da UTR 3' de óvulo de Panicum virgatum (Pavir. Cb02009) para acionar genes ligados de maneira funcional pode ser implantado em espécies ornamentais e frutíferas. Tais aplicações estão também dentro do escopo das modalidades desta descrição. Os exemplos incluem, porém sem limitação; rosa (Rosa spp.), sarça ardente (Euonymus spp.), petúnia (Petunia spp.), begônia (Begonia Spp.), rododendro (Rhododendron spp.), maçã silvestre ou maçã (Malus Spp.), pera (Pyrus spp.), pêssego (Prunus spp.) e calêndulas (Tagetes SPp.).
[00190] Embora diversos aspectos e modalidades exemplificativos tenham sido discutidos acima, técnicos no assunto reconhecerão certas modificações, trocas, adições e subcombinações dos mesmos. É pretendido, portanto, que as reivindicações anexas e reivindicações introduzidas doravante sejam interpretadas como incluindo todas tais modificações, permutações, adições e subcombinações conforme estejam dentro de seu espírito e escopo verdadeiros.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES
1. Vetor de ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende um promotor operacionalmente ligado a: a) uma sequência poliligante; b) uma sequência de codificação heteróloga de óvulo que não Panicum virgatum (Pavir.Cb02009); ou c) uma combinação de a)eb); em que o referido promotor compreende uma sequência de polinucleotídeos que apresenta pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1.
2. Vetor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido promotor apresenta 1.400 pares de bases de comprimento.
3. Vetor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido promotor consiste em uma sequência de polinucleotídeos que apresenta pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1.
4, Vetor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência que codifica um marcador selecionável.
5. Vetor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é ligado operacionalmente a uma sequência de codificação heteróloga.
6. Vetor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação heteróloga codifica um marcador selecionável, uma proteína de resistência a inseticida, uma molécula de RNA pequena, uma proteína nuclease sítio- específica, uma proteína de tolerância a herbicida, uma proteína de eficiência de uso de nitrogênio, uma proteína de eficiência de uso de água, uma proteína de qualidade nutricional ou uma proteína de ligação ao DNA.
7. Vetor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência 3' de polinucleotídeos não traduzidos.
8. Vetor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência 5' de polinucleotídeos não traduzidos.
9. Vetor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência de íntrons.
10. Vetor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido promotor tem expressão preferencial em célula embrionária.
11. Planta transgênica, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de polinucleotídeos que apresenta pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1 operacionalmente ligada a uma sequência de codificação heteróloga.
12. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a referida planta é selecionada dentre o grupo que consiste em Zea mays, trigo, arroz, sorgo, aveia, centeio, bananas, cana de açúcar, soja, algodão, Arabidopsis, tabaco, girassol e canola.
13. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a referida planta é Zea mays.
14. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a sequência de codificação heteróloga é inserida no genoma da referida planta.
15. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que um promotor compreende uma sequência de polinucleotídeos que apresenta pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1, e o referido promotor é operacionalmente ligado a uma sequência de codificação heteróloga.
16. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma sequência 3' não traduzida.
17. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a referida sequência de codificação heteróloga apresenta expressão preferencial em tecido de célula embrionária.
18. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o referido promotor apresenta 1.400 pares de bases de comprimento.
19. Uso de uma planta, parte de planta, célula vegetal ou semente compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que apresenta pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1 operacionalmente ligada a uma sequência de codificação heteróloga, caracterizado pelo fato de que o referido uso é para cruzamento com uma segunda planta, regeneração de um planta, plantar ou cultivar um campo de plantas, ou produzir produtos vegetais.
20. Invenção, caracterizada por qualquer uma de suas modalidades ou quaisquer categorias aplicáveis de reivindicação, por exemplo, produto, processo ou uso englobado pela matéria inicialmente descrita, revelada ou ilustrada no pedido de patente.
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