CN110129363A - 提高番茄CRISPR/Cas9基因编辑效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及基因编辑领域，特别地涉及CRISPR/Cas9在番茄中的基因编辑。本申请提高了CRISPR/Cas9在番茄中基因编辑的效率。
Description
技术领域
本申请涉及基因编辑领域，特别地涉及提高CRISPR/Cas9在番茄中的基因编辑的效率。
背景技术
CRISPR/Cas9系统是近年来应用最为广泛的基因编辑系统，它由核酸酶Cas9和一个向导RNA(single guide RNA，sgRNA)组成，共同介导了目标位点的切割，进而通过细胞的内源修复系统带来突变。目前CRISPR/Cas9技术已经在越来越多的植物中得到应用。番茄(Solanum lycopersicum)是最主要的蔬菜作物之一，而且由于其遗传简单、容易转化、生命周期短等特点，也是一个非常重要的模式植物。
随着CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物中的广泛应用，提高CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率也变得非常迫切。目前报道的提高基因编辑效率的方法很多，其中包括对核酸酶蛋白进行密码子优化，选用不同的启动子驱动核酸酶的表达，选用不同的启动子驱动sgRNA的表达，优化sgRNA的结构，在核酸酶蛋白的两端加不同数量的NLS等等。
其中以对核酸酶做密码子优化的报道居多。最早报道的CRISPR/Cas9在植物上应用的文章大多是以人类基因偏好密码子优化的Cas9，这些蛋白在植物上也有酶活性(Feng等人,2013；Mao等人,2013；Nekrasov等人,2013；Xie等人,2013)，不过编辑的效率都不高。植物基因偏好密码子优化的Cas9能显著地提高其在植物中的基因编辑效率(Li等人,2013)，因而近期发表的大部分文章都使用了植物基因偏好密码子优化的Cas9(Shan等人,2013；Zhang等人,2014；Wang等人,2014)。
Sun等人比较了在大豆中使用大豆内源U6和拟南芥U6驱动相同sgRNA的编辑效率，结果显示大豆内源U6介导的sgRNA表达可以显著提高Cas9的编辑效率(Sun等人,2015)。Du等人的工作也得出了类似的结论，应用拟南芥U6启动子驱动sgRNA在大豆上取得了12.5％的编辑效率，而使用大豆内源的U6启动子取得了43.4％-48.1％的编辑效率，说明使用作物自身的启动子驱动sgRNA的表达可以显著地提高基因编辑的效率(Du等人,2016)。番茄中大多是使用拟南芥的U6驱动sgRNA的表达，Pan等人曾通过生物信息学的方法找到了7个番茄的U6启动子，但是并没有在实验中验证这些启动子驱动sgRNA进行基因编辑的数据(Pan等人,2017)。蒲艳等人也尝试了四个不同番茄内源的U6用于番茄基因编辑，其中一个在瞬时转化中取得了编辑，但是效率比较低(蒲艳等人,2018)。
CRISPR/Cas系统中sgRNA的结构也会对编辑效率产生很大影响。Dang等人对sgRNA的结构进行了优化并显著地提高了CRISPR/Cas9的基因编辑效率(Dang等人,2015)。CRISPR/Cas12a(Cpf1)对gRNA的结构有更高的要求，Tang等人证明在gRNA的两端加上HH和HDV的核酶结构，用II型启动子驱动，可以大大地提高其在植物中的基因编辑效率(Tang等人,2017)。之后的有关Cas12a的编辑文章也大都采用这样的结构(Lee等人,2018；Malzahn等人,2019)。
核定位信号(NLS)的优化也是另一个提高基因编辑效率的方法。Liu等人通过串联多个NLS提高了锌指核酸酶蛋白的编辑效率(Liu等人,2015)。另外，N-端串联四个核定位信号(NLS)可以显著地提高Cas9蛋白进入细胞核的能力(DOUDNA,Jennifer A,WO 2017/106569 A1)。Liu等人在Cas12a的C-端串联两个NLS表明能显著增加它在动物细胞中的编辑效率(Liu等人,2019)。
LeBlanc等人在拟南芥生长的过程中，对其进行了10天37℃30小时22℃42小时间断的高温处理，从而提高了CRISPR/Cas9在下一代的编辑效率(LeBlanc等人,2018)。CRISPR/Cas9在植物瞬时转化中，提高温度也可以提高其编辑效率(Malzahn等人,2019)，但是目前还没有在稳定转化过程中高温处理外植体可以提高CRISPR/Cas9基因编辑效率的报道。
发明内容
本发明涉及一种用CRISPR-Cas9在番茄中进行基因编辑的方法，其特征在于，所述的方法包括下列步骤：a)构建由CRISPR-Cas9介导的植物基因编辑载体；b)将在步骤a)中获得的植物基因编辑载体转入农杆菌；c)用所述农杆菌侵染番茄外植体，然后置于共培养基上进行共培养；d)将外植体置于恢复培养基上进行恢复培养；e)在恢复培养基上进行恢复培养后，将外植体置于筛选培养基上进行筛选培养；f)将筛选获得的抗性苗转入生根培养基进行生根培养，直至产生完整的植株，其中，步骤d)的恢复培养和步骤e)的筛选培养中的至少一个包括在高温培养温度例如30℃-34℃下进行培养。在一个优选的实施方案中，在所述筛选培养期间更换2-3次培养基。在一个进一步优选的实施方案中，在高温培养温度下进行的恢复培养的时间为恢复培养的第1、2、3、4、或5天。在另一个进一步优选的实施方案中，在高温培养温度下进行的筛选培养的时间为筛选培养的第1、2、3、4、5、6或7天。在一个进一步优选的实施方案中，在所述由CRISPR/Cas9介导的植物基因编辑载体中，用番茄内源的U6启动子驱动sgRNA表达。在另一个进一步优选的实施方案中，在所述由CRISPR/Cas9介导的植物基因编辑载体中，用番茄EF启动子驱动Cas9表达。在一个进一步优选的实施方案中，所述番茄U6启动子的序列如SEQ ID NO:9所示。在另一个进一步优选的实施方案中，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO:5所示。在一个进一步优选的实施方案中，所述番茄EF启动子的序列如SEQ ID NO:10所示。在另一个进一步优选的实施方案中，所述Cas9的序列如SEQ IDNO:2所示。在一个进一步优选的实施方案中，使用壮观霉素抗性基因作为筛选标记基因来进行筛选。在一个进一步优选的实施方案中，所述壮观霉素抗性基因的序列如SEQ ID NO:7所示。
发明描述
为了验证番茄内源启动子驱动Cas9和sgRNA可以提高基因编辑的效率，本文以番茄的一个内源基因(SlMYB12)为目标基因，分别比较了番茄的EF启动子和拟南芥EF启动子驱动Cas9的基因编辑效率，以及番茄内源U6启动子和拟南芥U6启动子驱动sgRNA的基因编辑效率。结果显示，番茄内源的启动子驱动Cas9或sgRNA都可以大大提高番茄基因编辑的效率。同时本实验对转化过程中恢复阶段和筛选阶段的外植体进行了24小时不同温度的处理，实验发现提高温度可以显著提高基因编辑的效率。这为今后在植物中改造基因编辑系统提供了很好的理论依据。
附图说明
图1.不同启动子驱动Cas9或者sgRNA的载体示意图。
图2.在高温下CRISPR/Cas9产生的突变类型的统计。
图3.突变体对应的基因型。
图4.突变表型示例。
序列表信息
SEQ ID NO:1为prAtEF(拟南芥EF启动子序列)。
SEQ ID NO:2为cCas9(Cas9基因序列)。
SEQ ID NO:3为tNos(Nos终止子序列)。
SEQ ID NO:4为prAtU6(拟南芥U6启动子序列)。
SEQ ID NO:5为sgRNA(番茄SlMYB12向导RNA序列，含靶标序列；其中位置1-19为靶标序列)。
SEQ ID NO:6为prGmEF(大豆EF启动子序列)。
SEQ ID NO:7为cSpec(筛选标记壮观霉素抗性基因aadA序列)。
SEQ ID NO:8为tPsE9(PsE9终止子序列)。
SEQ ID NO:9为prSlU6(番茄U6启动子序列)。
SEQ ID NO:10为prSlEF(番茄EF启动子序列)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
1.材料与方法
1.1.双元载体构建
实验中用到的双元载体所含的SpCas9表达盒的各个元件，sgRNA表达盒的各个元件均由金斯瑞(GenScript)进行合成，载体的构建方法采用标准的酶切连接的方法。所有载体都含有壮观霉素抗性基因aadA表达盒作为植物遗传转化过程中的筛选标记。
1.2.农杆菌介导的番茄转化
番茄遗传转化参考Khuong等人(Khuong等人,2013)的农杆菌介导的方法进行，转化所用的受体(番茄子叶)为Moneymaker，所用的农杆菌菌株为EHA101。
1.3.目标基因和潜在脱靶位点的突变检测方法
目标基因和潜在脱靶位点的突变是采用传统的Sanger测序方法进行检测，首先扩增目标片段，然后对目标片段进行回收测序，通过测序图谱的峰值来判断是否发生编辑，这与Lu等人和Hu等人的文章中所用的方法类似(Lu等人,2017；Hu等人,2018)。
2.实验结果
2.1.不同启动子元件对基因编辑效率的影响
本实验设计：用拟南芥EF启动子驱动Cas9和拟南芥U6启动子驱动sgRNA作为对照(参见图1A)，分别测试番茄U6启动子驱动sgRNA(参见图1B)和番茄EF启动子驱动Cas9(参见图1C)的基因编辑效率。所有载体的植物遗传转化都是使用aadA作为筛选标记(参见图1)。测试结果显示，这两种设计都可以不同程度地提高基因编辑的效率(参见表1)；番茄内源U6启动子驱动sgRNA可将基因编辑的效率从63％提高到73％，番茄EF启动子驱动Cas9可将基因编辑的效率从63％提高到81％。
表1.不同启动子驱动Cas9或sgRNA的突变频率统计
2.2.不同温度处理对基因编辑效率的影响
本实验在转化的不同阶段对外植体进行了不同温度的处理，分别在恢复阶段和筛选阶段进行了30℃和34℃24小时的处理，25℃作为标准流程的对照。结果表明，不论是在恢复阶段还是筛选阶段，不同的温度处理都可以提高Cas9在番茄中的基因编辑效率。表2和表3是恢复阶段进行了24小时的温度处理。如在表2中，载体24452在标准流程(25℃)下的平均编辑效率是55％；在恢复阶段30℃处理24小时后，编辑效率提高到了85％；在恢复阶段34℃处理24小时后，编辑效率提高到了80％。同时用另外一个载体24518(与24452是相同的sgRNA)对这个实验进行重复：如表3所示，载体24518在标准流程25℃下的编辑效率是81％；在恢复阶段30℃处理24小时后，编辑效率提高到了92％。由此可见，在恢复阶段对外植体进行24小时的高温处理可以提高CRISPR/Cas9在番茄中基因编辑的效率。另外，我们对载体24452进行了筛选阶段的温度处理，结果显示在表4中。如表4所示，载体24452在标准流程(25℃)下的编辑效率是73％；在筛选阶段30℃处理24小时后，编辑效率为77％；在筛选阶段34℃处理24小时后，编辑效率是89％。由此可见，在筛选阶段对外植体进行24小时的高温处理也可以提高CRISPR-Cas9在番茄中基因编辑的效率。
表2.载体24452在恢复阶段不同温度处理下的突变频率
表3.载体24518在恢复阶段不同温度处理下的突变频率
表4.载体24452在筛选阶段不同温度处理下的突变频率
2.3.突变类型分析
本实验对载体24452在恢复阶段30℃和34℃处理24小时的情况下的基因编辑突变类型进行了分析。突变类型主要是缺失，缺失的碱基数从1bp到272bp；有极少数几个(基因型1和基因型2)是1个碱基的插入；发现有一个含有倒转的突变类型(基因型37)。图2显示了在高温下CRISPR/Cas9产生的突变类型。由此可见，高温处理(30℃和34℃)产生的突变类型和在标准温度(25℃)下的并没有差异。
2.4.潜在脱靶突变分析
由于高温处理提高了基因编辑的效率，因而需要验证是否会增加潜在脱靶位点的突变。本实验针对不同的潜在脱靶位点，选取了10到30株目标基因编辑的E0植株进行潜在脱靶突变分析(载体24452)。通过Cas-OFFinder软件(Bae等人,2014)的分析，选取了8个有两到三个错配碱基的潜在脱靶位点，分别位于染色体的不同位置(参见表5)，设计引物对这些潜在脱靶位点进行扩增(参见表6)，然后进行PCR产物的回收测序。为了提高数据的可信度，本实验特意多选取了更多高温下编辑的植株用于检测潜在脱靶突变分析：正常温度下的为10株，34℃下为25到30株。测序结果表明，所有的这些位点都没有发生脱靶突变。由此可见，在本实验中温度处理并没有增加脱靶突变。
表6.在实验中所用到的引物序列
2.5.基因编辑产生的表型分析
表型分析选取了两个杂合突变为例子，当SlMYB12基因两个等位基因完全突变之后(参见图3；每株测了20个克隆，括号中的数为该基因型所占的克隆数)，会出现预想的表型，番茄的颜色从红色变为粉色(参见图4)(载体24452)。
3.讨论
本研究主要针对在番茄中基因编辑的效率进行优化，通过不同启动子驱动Cas9或者sgRNA来提高基因编辑的效率，并且在转化的过程中对处于恢复阶段和筛选阶段的外植体进行一段时间的高温处理也提高了基因编辑的效率。
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序列表
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<120> 提高番茄CRISPR/Cas9基因编辑效率的方法
<130> 81876-CN-REG-ORG-NAT-1
<141> 2019-06-11
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1160
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> prAtEF（拟南芥EF启动子序列）
<400> 1
aagcttgata tcggaagttt ctctcttgag ggaggttgct cgtggaatgg gacacatatg 60
gttgttataa taaaccattt ccattgtcat gagattttga ggttaatata tactttactt 120
gttcattatt ttatttggtg tttgaataaa tgatataaat ggctcttgat aatctgcatt 180
cattgagata tcaaatattt actctagaga agagtgtcat atagattgat ggtccacaat 240
caatgaaatt tttgggagac gaacatgtat aaccatttgc ttgaataacc ttaattaaaa 300
ggtgtgatta aatgatgttt gtaacatgta gtactaaaca ttcataaaac acaaccaacc 360
caagaggtat tgagtattca cggctaaaca ggggcataat ggtaatttaa agaatgatat 420
tattttatgt taaaccctaa cattggtttc ggattcaacg ctataaataa aaccactctc 480
gttgctgatt ccatttatcg ttcttattga ccctagccgc tacacacttt tctgcgatat 540
ctctgaggta agcgttaacg tacccttaga tcgttctttt tctttttcgt ctgctgatcg 600
ttgctcatat tatttcgatg attgttggat tcgatgctct ttgttgattg atcgttctga 660
aaattctgat ctgttgttta gattttatcg attgttaata tcaacgtttc actgcttcta 720
aacgataatt tattcatgaa actattttcc cattctgatc gatcttgttt tgagatttta 780
atttgttcga ttgattgttg gttggtggat ctatatacga gtgaacttgt tgatttgcgt 840
atttaagatg tatgtcgatt tgaattgtga ttgggtaatt ctggagtagc ataacaaatc 900
cagtgttccc tttttctaag ggtaattctc ggattgtttg ctttatatct cttgaaattg 960
ccgatttgat tgaatttagc tcgcttagct cagatgatag agcaccacaa tttttgtggt 1020
agaaatcggt ttgactccga tagcggcttt ttactatgat tgttttgtgt taaagatgat 1080
tttcataatg gttatatatg tctactgttt ttattgattc aatatttgat tgttcttttt 1140
tttgcagatt tgttgaccag 1160
<210> 2
<211> 4170
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cCas9（Cas9基因序列）
<400> 2
atggataaga agtattctat tggacttgat attggaacca actctgtggg atgggctgtt 60
attactgacg agtataaggt tccatctaag aagttcaagg ttcttggaaa cactgataga 120
cactctatta agaagaacct tattggtgct cttcttttcg attctggaga gactgctgag 180
gctactagac ttaagagaac tgctagaaga agatatacta gaagaaagaa cagaatttgc 240
tatcttcaag agattttctc taacgagatg gctaaggttg acgattcttt cttccacaga 300
cttgaggagt ctttccttgt tgaggaggat aagaagcacg agagacaccc aattttcgga 360
aacattgttg acgaggttgc ttatcacgag aagtatccaa ctatttatca ccttagaaag 420
aagctcgttg attctactga taaggctgat cttagactta tttatcttgc tcttgctcac 480
atgattaagt tcagaggaca cttccttatt gagggagatc ttaacccaga taactctgac 540
gttgataagc tcttcattca acttgttcaa acttataacc aacttttcga ggagaaccca 600
attaacgctt ctggagttga cgctaaggct attctttctg ctagactttc taagtctaga 660
aggcttgaga accttattgc tcaacttcca ggagagaaga agaacggact tttcggaaac 720
cttattgctc tttctcttgg acttactcca aacttcaagt ctaacttcga tcttgctgag 780
gacgctaagc tccaactttc taaggatact tacgacgatg atcttgataa ccttcttgct 840
caaattggag atcaatacgc tgatcttttc cttgctgcta agaacctttc tgacgctatt 900
cttctttctg atattcttag agttaacact gagattacta aggctccact ttctgcttct 960
atgattaaga gatacgacga gcaccaccaa gatcttactc ttcttaaggc tcttgttaga 1020
caacaacttc cagagaagta taaggagatt ttcttcgatc aatctaagaa cggatacgct 1080
ggatatattg acggaggagc ttctcaagag gagttctata agttcattaa gccaattctt 1140
gagaagatgg acggaactga ggagcttctt gttaagctca acagagagga tcttcttaga 1200
aagcaaagaa ctttcgataa cggatctatt ccacaccaaa ttcaccttgg agagcttcac 1260
gctattctta gaaggcaaga ggatttctat ccattcctta aggataacag agagaagatt 1320
gagaagattc ttactttccg tattccatat tacgttggac cacttgctag aggaaactct 1380
agattcgctt ggatgactag aaagtctgag gagactatta ctccttggaa cttcgaggag 1440
gttgttgata agggagcttc tgctcaatct ttcattgaga gaatgactaa cttcgataag 1500
aaccttccaa acgagaaggt tcttccaaag cactctcttc tttacgagta tttcactgtt 1560
tataacgagc ttactaaggt taagtacgtt actgagggaa tgagaaagcc agctttcctt 1620
tctggagagc aaaagaaggc tattgttgat cttcttttca agactaacag aaaggttact 1680
gttaagcaac ttaaggagga ttatttcaag aagattgagt gcttcgattc tgttgagatt 1740
tctggagttg aggatagatt caacgcttct cttggaactt atcacgatct tcttaagatt 1800
attaaggata aggatttcct tgataacgag gagaacgagg atattcttga ggatattgtt 1860
cttactctta ctcttttcga ggatagagag atgattgagg agagacttaa gacttacgct 1920
caccttttcg acgataaggt tatgaagcaa cttaagagaa gaagatatac tggatggggt 1980
agactttcta gaaagctcat taacggaatt agagataagc aatctggaaa gactattctt 2040
gatttcctta agtctgacgg attcgctaac agaaacttca tgcaacttat tcacgacgat 2100
tctcttactt tcaaggagga tattcaaaag gctcaagttt ctggacaagg agattctctt 2160
cacgagcaca ttgctaacct tgctggatct ccagctatta agaagggaat tcttcaaact 2220
gttaaggttg ttgacgagct tgttaaggtt atgggtagac acaagccaga gaacattgtt 2280
attgagatgg ctagagagaa ccaaactact caaaagggac aaaagaactc tagagagaga 2340
atgaagagaa ttgaggaggg aattaaggag cttggatctc aaattcttaa ggagcaccca 2400
gttgagaaca ctcaacttca aaacgagaag ctctatcttt attatcttca aaacggaaga 2460
gatatgtacg ttgatcaaga gcttgatatt aacagacttt ctgattacga cgttgatcac 2520
attgttccac aatctttcct taaggacgat tctattgata acaaggttct tactagatct 2580
gataagaaca gaggaaagtc tgataacgtt ccatctgagg aggttgttaa gaagatgaag 2640
aactattgga gacaacttct taacgctaag ctcattactc aaagaaagtt cgataacctt 2700
actaaggctg agagaggagg actttctgag cttgataagg ctggattcat taagagacaa 2760
cttgttgaga ctagacaaat tactaagcac gttgctcaaa ttcttgattc tagaatgaac 2820
actaagtacg acgagaacga taagctcatt agagaggtta aggttattac tcttaagtct 2880
aagctcgttt ctgatttcag aaaggatttc caattctata aggttagaga gattaacaac 2940
tatcaccacg ctcacgacgc ttatcttaac gctgttgttg gaactgctct tattaagaag 3000
tatccaaaac ttgagtctga gttcgtttac ggagattata aggtttacga cgttagaaag 3060
atgattgcta agtctgagca agagattgga aaggctactg ctaagtattt cttctattct 3120
aacattatga acttcttcaa gactgagatt actcttgcta acggagagat tagaaagagg 3180
ccacttattg agactaacgg agagactgga gagattgttt gggataaggg aagagatttc 3240
gctactgtta gaaaggttct ttctatgcca caagttaaca ttgttaagaa aactgaggtt 3300
caaactggag gattctctaa ggagtctatt cttccaaaga gaaactctga taagctcatt 3360
gctagaaaga aggattggga cccaaagaag tacggaggat tcgattctcc aactgttgct 3420
tattctgttc ttgttgttgc taaggttgag aagggaaagt ctaagaagct caagtctgtt 3480
aaggagcttg ttggaattac tattatggag agatcttctt tcgagaagaa cccagttgat 3540
ttccttgagg ctaagggata taaggaggtt aagaaggatc ttattattaa gctcccaaag 3600
tattctcttt tcgagcttga gaacggaaga aagagaatgc ttgcttctgc tggagagctt 3660
caaaagggaa acgagcttgc tcttccatct aagtacgtta acttccttta tcttgcttct 3720
cactacgaga agctcaaggg atctccagag gataacgagc aaaagcaact tttcgttgag 3780
caacacaagc actatcttga cgagattatt gagcaaattt ctgagttctc taagagagtt 3840
attcttgctg acgctaacct tgataaggtt ctttctgctt ataacaagca cagagataag 3900
ccaattagag agcaagctga gaacattatt caccttttca ctcttactaa ccttggtgct 3960
ccagctgctt tcaagtattt cgatactact attgatagaa agagatatac ttctactaag 4020
gaggttcttg acgctactct tattcaccaa tctattactg gactttacga gactagaatt 4080
gatctttctc aacttggagg agattcttct ccaccaaaga agaagagaaa ggtttcttgg 4140
aaggacgctt ctggatggtc tagaatgtga 4170
<210> 3
<211> 253
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tNos（Nos终止子序列）
<400> 3
gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60
atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120
atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180
gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240
atgttactag atc 253
<210> 4
<211> 448
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> prAtU6（拟南芥U6启动子序列）
<400> 4
aagcttcgtt gaacaacgga aactcgactt gccttccgca caatacatca tttcttctta 60
gctttttttc ttcttcttcg ttcatacagt ttttttttgt ttatcagctt acattttctt 120
gaaccgtagc tttcgttttc ttctttttaa ctttccattc ggagtttttg tatcttgttt 180
catagtttgt cccaggatta gaatgattag gcatcgaacc ttcaagaatt tgattgaata 240
aaacatcttc attcttaaga tatgaagata atcttcaaaa ggcccctggg aatctgaaag 300
aagagaagca ggcccattta tatgggaaag aacaatagta tttcttatat aggcccattt 360
aagttgaaaa caatcttcaa aagtcccaca tcgcttagat aagaaaacga agctgagttt 420
atatacagct agagtcgaag tagtgatt 448
<210> 5
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sgRNA（番茄SlMYB12向导RNA序列）
<400> 5
ggtcgttacc taaaaatgcg ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc 60
gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt tttt 104
<210> 6
<211> 2064
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> prGmEF（大豆EF启动子序列）
<400> 6
ccgagacact tgtgtgattg agagaaacac taatcttgtg aggactgaag tttggtgatt 60
atttcttgtg atctgtcgac aaaaatatca aatggggttt cttttacaaa ttatttacct 120
aaatgaatct gttttgaaaa tatttactcc atgggtctat ttttttatta caaagcgtct 180
ccctgaaggg cgcgttcccc gtgaaagtga cacgtggcag gacttgggac gtgccctgcg 240
tacaggcgcg atagttagtg ttgttacagc aggcgcatcg ggtcgtgttg gggaccaagg 300
tacgacaggt cgcgctgggg acccagacac gacccaattg ggtcgcactt tatttaatat 360
tttttatatt ttgtatattg tttttattta atatattttt atattatttt atttaatttt 420
tttatatttt atataatagt ttctatatta aataaattct tagcattatg tatgatttta 480
aagtcataaa taatttttta tattgttttt atttactata ttttttatat tttatttaat 540
atttatatat taaataaatc cttcatatta gaaaaaataa agaaaatatt aaataaaata 600
taaaatataa aaaagtaaaa aatattaaat aaaataatat aaaaaatatt ataaaaacaa 660
tataaaaaat ataaaaatat ttaataaaat aataaaaaaa atattatttt aaataaaatt 720
atttatgact ttaaactcta aagttgaatt ttaaaaaaat ataatttttt tacgatttta 780
gtaaaaaaaa aatacaagcc gcacaataca agtcgccttc tcaaaccctt cctcacgaca 840
ttctcggacc ttatgacacc gtcaccaaaa caatgatcca cgcgatatta ggcgcgtgca 900
aatcactcta atccgaaact agtagacatg ggaagcacga gctatacgcg agcgtttcaa 960
ttgccgccac gaaagcagag aaggccagaa acggaaccac ggtaaaatgg taagggtatt 1020
ttcgtaaaca gaagaaaaga gttgtagcta taaataaacc ctctaaccca cggcgcacta 1080
tttctcttca ctccttcgtt cactcttctt ctcttgcggc tagggtttta gcgcagcttc 1140
ttctaggttc gttctcttcc gccgctctat ggattttaaa ccttcgaatc atgtttattc 1200
cattgaatta tgttgcttgc agtttatatt ttctgaatct gtagttgttg tcttcaattt 1260
atcctatgct ttatagatca atcttttgtg tgtgtagtac gtaatttttg ttctttttgc 1320
ttttcgttca agttgttggg aataatcggg gtatcatgtt ttgatattgt ttgttttctt 1380
ttttgactgc ttaataattt ttaagttggt tttggttttg gggttttatg tgcttgttat 1440
attcaaatct ttggatccag atcttacaaa agttttgggt ttaaggatgt ttttggctga 1500
tgatgaatag atctataaac tgttcctttt aatcgattca agcttaggat tttactaggc 1560
ttttgcgaat aaatacgtga cagtaagcta attatgtcct ttttttgtct caatcatatc 1620
tgtctgggtg tgccataatt tgtgatatgt ctatctggta gaatcttgtg ttttatgctt 1680
tacgatttgg tatacctgtt tttgaacttg ttgtatgatg ggtatttaga tcaccctatc 1740
ttttttatgc ttctggaagt tttatgtaaa tgtcgaatat cttaatgttg ttgaacttat 1800
aatgttgtgt tgatgtatgt atgatggttt tgacaacttt tttcactggt tctgaaagtt 1860
ttatgtaaat tgcaaatatg ttaatgttgt tgaacttatt ttttttcctt cgatgttgtt 1920
ttgatgtatg tatgatggtt ttcaccgtag tttctatggc taatatctta atgttgttga 1980
gcttattttt ttccttatat gttgtgttga tgtatgtatg atggttttga caactttttt 2040
agtttctttg cagatttaag gaag 2064
<210> 7
<211> 1017
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cSpec（筛选标记壮观霉素抗性基因aadA序列）
<400> 7
atggcgcaag ttagcagaat ctgcaatggt gtgcagaacc catctcttat ctccaatctc 60
tcgaaatcca gtcaacgcaa atctccctta tcggtttctc tgaagacgca gcagcatcca 120
cgagcttatc cgatttcgtc gtcgtgggga ttgaagaaga gtgggatgac gttaattggc 180
tctgagcttc gtcctcttaa ggtcatgtct tctgtttcca cggcgtgcat gagggaagcg 240
ttgatcgccg aagtatcgac tcaactatca gaggtagttg gcgtcatcga gcgccatctc 300
gaaccgacgt tgctggccgt acatttgtac ggctccgcag tggatggcgg cctgaagcca 360
cacagtgata ttgatttgct ggttacggtg accgtaaggc ttgatgaaac aacgcggcga 420
gctttgatca acgacctttt ggaaacttcg gcttcccctg gagagagcga gattctccgc 480
gctgtagaag tcaccattgt tgtgcacgac gacatcattc cgtggcgtta tccagctaag 540
cgcgaactgc aatttggaga atggcagcgc aatgacattc ttgcaggtat cttcgagcca 600
gccacgatcg acattgatct ggctatcttg ctgacaaaag caagagaaca tagcgttgcc 660
ttggtaggtc cagcggcgga ggaactcttt gatccggttc ctgaacagga tctatttgag 720
gcgctaaatg aaaccttaac gctatggaac tcgccgcccg actgggctgg cgatgagcga 780
aatgtagtgc ttacgttgtc ccgcatttgg tacagcgcag taaccggcaa aatcgcgccg 840
aaggatgtcg ctgccgactg ggcaatggag cgcctgccgg cccagtatca gcccgtcata 900
cttgaagcta ggcaggctta tcttggacaa gaagatcgct tggcctcgcg cgcagatcag 960
ttggaagaat ttgttcacta cgtgaaaggc gagatcacca aagtagtcgg caaataa 1017
<210> 8
<211> 643
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tPsE9（PsE9终止子序列）
<400> 8
agctttcgtt cgtatcatcg gtttcgacaa cgttcgtcaa gttcaatgca tcagtttcat 60
tgcgcacaca ccagaatcct actgagtttg agtattatgg cattgggaaa actgtttttc 120
ttgtaccatt tgttgtgctt gtaatttact gtgtttttta ttcggttttc gctatcgaac 180
tgtgaaatgg aaatggatgg agaagagtta atgaatgata tggtcctttt gttcattctc 240
aaattaatat tatttgtttt ttctcttatt tgttgtgtgt tgaatttgaa attataagag 300
atatgcaaac attttgtttt gagtaaaaat gtgtcaaatc gtggcctcta atgaccgaag 360
ttaatatgag gagtaaaaca cttgtagttg taccattatg cttattcact aggcaacaaa 420
tatattttca gacctagaaa agctgcaaat gttactgaat acaagtatgt cctcttgtgt 480
tttagacatt tatgaacttt cctttatgta attttccaga atccttgtca gattctaatc 540
attgctttat aattatagtt atactcatgg atttgtagtt gagtatgaaa atatttttta 600
atgcatttta tgacttgcca attgattgac aacatgcatc aat 643
<210> 9
<211> 429
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> prSlU6（番茄U6启动子序列）
<400> 9
atgcattgta ttataagtac gttagaatgt gcaataaata tattatctat cattagaact 60
tgaattataa gtgaataata gattattttt tgtaatatga attaaaagtg tattaaacat 120
gtattaacgg tgatcaattg gttaaaaaaa agtttattat taaaatgata aatcttttta 180
atttatagta tatttatgta agttttcacg ttgagtaaat agcgaagaag ttgggcccaa 240
ccaagtaaaa taagaaggcc gggccattac aattaagtcg tcacacaact gggcttcatt 300
gaaaaaagcg caaaaccgat tccaggcccg tgttagcatg aagactcaac tcaaccagag 360
atttctccct catcgcttac agaaaaaagc tatatgctgt ttatattgcg aaatctaaca 420
gtgtagttt 429
<210> 10
<211> 1500
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> prSlEF（番茄EF启动子序列）
<400> 10
tactgaaaat taatattttt ttctttttga aatactaata catctaaatt taacaattgc 60
caaagtgatt tttaattagc ttgctggcta atcacaataa aaattactct cctttactat 120
ataagtaaat ttttattgct atatttgtta ttattattat tattattaat atttattttc 180
tacaaattta ataatatttt attttatatc attttaaaaa gataagtaat gaaatattaa 240
gaattcgttt ataattcttt tgcaggtggg tttctatttg taagctaatc tttttcagtt 300
atcctttttt taaaatcttt attattatta tagctatatc ttttatcttt taaaattaac 360
attatctatt aaagataatt tcaataaaag agtaaaaatt aatttagagt tctactgtct 420
tcaaatttct attttaaaaa atacttttaa aacttgatgt attttttacg tggtttttca 480
ctatgactta atttctgttt tattataata tgtataaata taaaaataga ttttccataa 540
catattataa aaaatgtaag gggcatttac gtaaatagat agacttaaaa gaggcaccga 600
gtgaacccta attctcatcg ttgagactat aaaatgccca ttatcccatt cgcacagtct 660
cttcattact tttgctgtta tttctcctca gctgtgccgc atatcgccta atttttcttc 720
tctaaggttt catcatcttc accaatttct ttaatctcga ttcaattttt tatgtttgat 780
ctgttattgt tctgtcacta catgtgtttt tcagttgttt tactagatga ttttcactgt 840
cttcttgtta gatcatacat atattgaaaa tgttttggat tgactttttt gtattgtgaa 900
tatctgttat tgtttgattg ttgttcagta tttacacacc cgatctgtgt tatgagcttg 960
gtcataacta tttctctgta tgtaaataca gatctgttaa tgtttgtaat caatttttca 1020
tatgcactgt tgatattgtt ctctctcctg tcctgttata tgttgatatg attcggtttt 1080
tgtataactt gaactaaaca ctagtcctaa atgttttttt tactatttaa gatttatata 1140
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accagttgag gtgcaatact aaaaatcaat tcaattactg atattttttg ctgtttaggt 1260
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aagtgtgaaa gctatagttc attgtttttg ttgcaattct tgaaaaatta attggtcaag 1380
ctataatgga ttttactttt tctgttttaa tattgaattt gctgaattta tgaatgggtt 1440
gcatggtttt tgaaatatgt tgttgtgtgt tgtgtaaatg cagtttctta gtgtctcaag 1500
Claims (12)
1.一种用CRISPR-Cas9在番茄中进行基因编辑的方法，其特征在于，所述的方法包括下列步骤：
a)构建由CRISPR-Cas9介导的植物基因编辑载体；
b)将在步骤a)中获得的植物基因编辑载体转入农杆菌；
c)用所述农杆菌侵染番茄外植体，然后置于共培养基上进行共培养；
d)将外植体置于恢复培养基上进行恢复培养；
e)在恢复培养基上进行恢复培养后，将外植体置于筛选培养基上进行筛选培养；
f)将筛选获得的抗性苗转入生根培养基进行生根培养，直至产生完整的植株，
其中，步骤d)的恢复培养和步骤e)的筛选培养中的至少一个包括在高温培养温度例如30℃-34℃下进行培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述筛选培养期间更换2-3次培养基。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在高温培养温度下进行的恢复培养的时间为恢复培养的第1、2、3、4、或5天。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在高温培养温度下进行的筛选培养的时间为筛选培养的第1、2、3、4、5、6或7天。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，在所述由CRISPR/Cas9介导的植物基因编辑载体中，用番茄内源的U6启动子驱动sgRNA表达。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，在所述由CRISPR/Cas9介导的植物基因编辑载体中，用番茄EF启动子驱动Cas9表达。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述番茄U6启动子的序列如SEQ ID NO:9所示。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO:5所示。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述番茄EF启动子的序列如SEQ ID NO:10所示。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述Cas9的序列如SEQ ID NO:2所示。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于，使用壮观霉素抗性基因作为筛选标记基因来进行筛选。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述壮观霉素抗性基因的序列如SEQ IDNO:7所示。
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