CN113293174A

CN113293174A - 一种用于碱基编辑的核酸构建物

Info

Publication number: CN113293174A
Application number: CN202010648376.9A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Shandong Shunfeng Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shandong Shunfeng Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-07-07
Filing date: 2020-07-07
Publication date: 2021-08-24
Anticipated expiration: 2040-07-07
Also published as: CN113293174B

Abstract

本发明提供了一种核酸构建物，所述核酸构建物具有5’至3’端可操作连接的第一启动子、碱基编辑元件和基因编辑酶，其特征在于，所述第一启动子为EF1α启动子，所述碱基编辑元件选自腺嘌呤脱氨酶或胞嘧啶脱氨酶，所述基因编辑酶选自nCas9‑XNG，所述核酸构建物可以提高基因编辑的效率。

Description

一种用于碱基编辑的核酸构建物

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于碱基编辑的核酸构建物以及其在碱基编辑中的应用。

背景技术

随着CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物中的广泛应用，提高CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率也变得非常迫切。CRISPR/Cas9系统的编辑效率对其在作物基础研究以及应用研究中是必须考虑的一个因素。

单碱基编辑器是在Cas9的基础上融合脱氨酶，在向导RNA的引导下特异性地实现单个碱基突变以改变基因功能。相比传统CRISPR-Cas9系统，单碱基编辑器可以实现单个碱基突变以控制基因功能，不会导致DNA双链断裂。但是，单碱基编辑器在植物中利用时涉及到碱基编辑效率不高的问题，本领域迫切需要开发一种提高在植物中的碱基编辑效率的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种核酸构建物，将其用于植物中的碱基编辑，提高在植物中的碱基编辑效率。

一方面，本发明提供了一种核酸构建物，所述核酸构建物具有5’至3’端可操作连接的第一启动子、碱基编辑元件和基因编辑酶；

其中，所述第一启动子为EF1α启动子，所述碱基编辑元件选自腺嘌呤脱氨酶或胞嘧啶脱氨酶，所述基因编辑酶选自nCas9-XNG。

在一个实施方式中，所述第一启动子、碱基编辑元件和基因编辑酶彼此之间还可以包括任意的连接肽或连接序列，其并不影响上述核酸构建物的正常转录和翻译。

在一个实施方式中，所述基因编辑酶的3’端连接有UGI的编码序列。

所述EF1α启动子来源于选自下组的一种或多种植物：玉米、水稻、大豆、拟南芥、烟草、番茄；优选，番茄EF1α启动子；更优选的，所述EF1α启动子的序列如SEQ ID NO.:1所示。

在优选的实施方式中，所述碱基编辑元件选自腺嘌呤脱氨酶，所述腺嘌呤脱氨酶包括野生型和突变型的腺嘌呤脱氨酶。

在另一优选例中，所述腺嘌呤脱氨酶包括野生型和/或突变型的腺嘌呤脱氨酶；例如，ABE7.10。

在优选的实施方式中，所述腺嘌呤脱氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示；或者与SEQ ID NO.:3所示序列的同源性≥75％(较佳地≥85％，更佳地≥90％或≥95％或≥98％或≥99％)。

在另一优选例中，所述胞嘧啶脱氨酶包括野生型和突变型的胞嘧啶脱氨酶。

在另一优选例中，所述胞嘧啶脱氨酶包括APOBEC。

在另一优选例中，所述APOBEC选自下组：APOBEC1(A1)、APOBEC2(A2)、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3E、APOBEC3F、APOBEC3H、APOBEC4(A4)、活化诱导脱氨酶(activation induced cytidine deaminase,AID)、或其组合。

在另一优选例中，所述胞嘧啶脱氨酶的突变型包括CBE2.0、CBE2.1、CBE2.2、CBE2.3、CBE2.4。

在一个实施方式中，所述nCas9-XNG的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示。

在另一优选例中，所述核酸构建物还包括一个或多个序列可操作连接的定位信号序列。

在另一优选例中，所述的定位信号选自下组：核定位信号、叶绿体定位信号、线粒体定位信号、或其组合。

在另一优选例中，所述的定位信号包括核定位信号，优选地，包括至少1个核定位信号。

在其他的实施方式中，所述核酸构建物还包括gRNA的编码序列；进一步的，还包括与所述gRNA可操作连接的第二启动子。

在一优选例中，所述第二启动子来源于选自下组的一种或多种植物：水稻、玉米、大豆、拟南芥、烟草或番茄。

在另一优选例中，所述第二启动子包括RNA聚合酶III依赖的启动子。

在另一优选例中，所述第二启动子为RNA聚合酶III依赖的启动子。

在另一优选例中，所述第二启动子选自下组：U6、U3、U6a、U6b、U6c、U6-1、U3b、U3d、U6-26、U6-29、H1、或其组合。

在另一优选例中，所述第二启动子包括U6启动子。

在其他的实施方式中，所述核酸构建物还包括终止子；所述终止子选自下组：NOS、Poly A、T-UBQ、rbcS、或其组合。

另一方面，本发明还提供了一种载体，所述载体包括上述核酸构建物。

在另一优选例中，所述载体为植物表达载体。

在另一优选例中，所述的载体为可转染或转化植物细胞的表达载体。

在另一优选例中，所述的载体为农杆菌Ti载体。

在另一优选例中，所述的构建物整合到所述载体的T-DNA区。

在另一优选例中，所述载体是环状的或线性的。

另一方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述细胞含有本发明所述的核酸构建物，或其基因组整合有一个或多个所述的核酸构建物。

在另一优选例中，所述的细胞为植物细胞。

在另一优选例中，所述的植物选自下组：单子叶植物、双子叶植物、裸子植物、或其组合。

在另一优选例中，所述的植物选自下组：禾本科植物、豆科植物、十字花科植物、茄科、伞形科、或其组合。

在另一优选例中，所述的植物选自下组：拟南芥、小麦、大麦、燕麦、玉米、水稻、高粱、粟、大豆、花生、烟草、番茄、白菜、油菜、菠菜、生菜、黄瓜、茼蒿、空心菜、芹菜、油麦菜、或其组合。

在另一优选例中，所述的宿主细胞是用选自下组的方法将上述核酸构建物导入细胞的：农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法、电击法、超声波法和聚乙二醇(PEG)介导法。

另一方面，本发明提供了一种对植物进行基因编辑的方法，包括步骤：

(i)提供待编辑植物；和

(ii)将本发明所述的核酸构建物或载体导入所述待编辑植物的植物细胞，从而在所述植物细胞内进行基因编辑。

在一个实施方式中，所述基因编辑为单碱基编辑。

在另一优选例中，所述导入为通过农杆菌导入。

在另一优选例中，所述导入为通过基因枪导入。

在另一优选例中，所述的基因编辑为定点碱基替换(或突变)。

在另一优选例中，所述定点替换(或突变)包括将A突变为G。

在另一优选例中，所述定点替换(或突变)包括将C突变为T。

在另一优选例中，所述的植物包括任何可进行转化技术的植物类型，包括单子叶植物、双子叶植物和裸子植物。

在另一优选例中，所述的植物为双子叶植物。

另一方面，本发明提供了一种制备经基因编辑的植物细胞的方法，包括步骤：

将本发明所述的核酸构建物或载体导入植物细胞，使得所述植物细胞中的基因发生定点替换(或突变)，从而制得所述经基因编辑的植物细胞。

在另一优选例中，所述的导入采用农杆菌转化法或基因枪轰击法。

另一方面，本发明还提供了上述核酸构建物、载体的用途，所述用途为对植物进行基因编辑。

另一方面，本发明还提供了上述核酸构建物在提高碱基编辑效率中的应用；优选的，为提高植物中的碱基编辑效率。

另一方面，本发明提供了一种制备植物的方法，包括步骤：将本发明制备的所述经基因编辑的植物细胞再生为植物体，从而获得所述经基因编辑的植物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。

一般定义：

除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与所属领域的普通技术人员之一通常理解的相同的含义。

如本文所用，术语“基因编辑”或“碱基突变”或“碱基编辑”指核苷酸序列的某一位置处发生碱基的替换(substitution)、插入(insertion)和/或缺失(deletion)。本发明中所述“编辑”或“突变”优选为单碱基突变。

如本文所用，术语“碱基替换”指核苷酸序列的某一位置处的碱基突变为另一不同的碱基，比如A突变为G。

如本文所用，术语“A.T到G.C”指在双链核酸序列(尤其是基因组序列)中，某一位置上的A-T碱基对突变为或替换为G-C碱基对。

如本文所用，术语“C.G到T.A”指在双链核酸序列(尤其是基因组序列)中，某一位置上的C-G碱基对突变为或替换为T-A碱基对。

如本文所用，术语“基因编辑酶”指适用于CRISPR(规律成簇间隔短回文重复序列Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶技术Tanscription Activator-like(TAL)effector nucleases)、ZFN(锌指核酸技术，Zinc finger nuclease)等编辑工具的核酸酶。优选地，所述基因编辑酶为CRISPR酶，又名Cas蛋白，其种类包括但并不限于：Cas9蛋白、Cas12蛋白、Cas13蛋白、Cas14蛋白、Csm1蛋白、FDK1蛋白。所述的Cas蛋白是指蛋白家族，可以根据其来源不同而具有不同的结构，如来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的SpCas9、来源于葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的SaCas9；还可以根据结构特征(如结构域)进行下位分类，如Cas12家族包括Cas12a(又名Cpf1)、Cas12b、Cas12c、Cas12i等。所述的Cas蛋白可以具有双链或单链或无切割活性。本发明所述的Cas蛋白可以是野生型或其突变体，所述的突变体的突变类型包括氨基酸的替换、取代或缺失，所述的突变体可以改变也可以不改变Cas蛋白的酶切活性。优选地，本发明所述的Cas蛋白只具有单链切割活性或无切割活性，其为野生型Cas蛋白的一种突变体。优选地，本发明Cas蛋白为具有单链切割活性的Cas9、Cas12、Cas13或Cas14。在一优选实施方式中，本发明的Cas9蛋白包括SpCas9n(D10A)、nSpCas9NG、SaCas9n、ScCas9n、XCas9n，其中“n”表示nick，即只具有单链切割活性的Cas蛋白。突变已知Cas蛋白获得具有单链或无切割活性的Cas蛋白为本领域的常规技术手段。本领域技术人员所知，现有技术中已报到的多种具有核酸切割活性的Cas蛋白，该公知蛋白或其改造后的变体均可以实现本发明的功能，本文通过引用方式将其纳入保护范围。

如本文所用，所述的“gRNA”又称为guide RNA或导向RNA，并且具有本领域技术人员通常理解的含义。一般而言，导向RNA可以包含同向(direct)重复序列和导向序列(guidesequence)，或者基本上由或由同向重复序列和导向序列(在内源性CRISPR系统背景下也称为间隔序列(spacer))组成。gRNA在不同的CRISPR系统中，依据其所依赖的Cas蛋白的不同，可以包括crRNA和tracrRNA，也可以只含有crRNA。crRNA和tracrRNA可以经过人工改造融合形成single guide RNA(sgRNA)。本发明所述的gRNA可以是天然的，也可以是经过人工改造或设计合成的。在某些情况下，导向序列是与靶序列具有足够互补性从而与所述靶序列杂交并引导CRISPR/Cas复合物与所述靶序列的特异性结合的任何多核苷酸序列，通常具有17-23nt的序列长度。在某些实施方案中，当最佳比对时，导向序列与其相应靶序列之间的互补程度为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％。确定最佳比对在本领域的普通技术人员的能力范围内。例如，存在公开和可商购的比对算法和程序，诸如但不限于ClustalW、matlab中的史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman)、Bowtie、Geneious、Biopython以及SeqMan。

如本文所用，术语“植物”包括全植株、植物器官(如叶、茎、根等)、种子和植物细胞以及它们的子代。可用于本发明方法的植物的种类没有特别限制，一般包括任何可进行基因编辑技术的植物类型，包括单子叶、双子叶植物和裸子植物、被子植物，主要包括木本植物。

在本发明中，核苷酸序列的描述是从5’至3’方向，除非特别注明。

如本文所用，“尿嘧啶糖苷酶抑制剂(uracil DNA glycosylase inhibitor，UGI)”能够抑制胞内的尿嘧啶DNA糖苷酶将U再催化回C。

EF启动子是指延伸因子的启动子，延伸因子(elongation factors，EF)是指在mRNA翻译时促进多肽链延伸的蛋白质因子。真核生物中延伸因子包括：EF1α、EF1β和EF2。原核生物中延伸因子包括EF-Tu、EF-Ts以及EF-G。EF1a是真核延伸因子1α，它是蛋白质生物合成的重要组成部分。EF1A通过GTP依赖性机制催化氨酰基tRNA与核糖体A位点的结合。EF1A占可溶性蛋白总量的3-10％，被认为是细胞质中最丰富的可溶性蛋白之一。

在一优选实施方式中，EF启动子包括，但并不限于：EF1a启动子、EF1β启动子、EF2启动子、EF-Tu、EF-Ts、EF-G。

在一优选实施方式中，本发明的启动子指来源于茄科植物(较佳地，来自番茄或类似植物)的EF1a启动子元件。

一种典型的本发明的启动子的序列如SEQ ID NO.:1所示。

应理解，该术语还包括来自其他不同茄科植物的与SEQ ID NO.:1所示启动子同源的启动子。此外，该术语还包括SEQ ID NO.:1所示启动子或其同源启动子的衍生启动子或活性片段，主要这些衍生启动子或活性片段保留了高效的基因编辑效率的功能，例如保留至少50％SEQ ID NO.:1所示启动子的特异启动功能(以可以被启动的外源基因的表达量进行表示)。

如本文所用，术语“茄科植物”包括番茄、马铃薯、茄子、辣椒、枸杞、烟草。

如本文所用，术语“启动子”或“启动子区(域)”是指一种准确有效起始基因转录功能的核酸序列，引导基因核酸序列转录为mRNA，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，一般地，启动子或启动子区域提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。

在本文中，所述启动子或启动子区(域)包括启动子的变体，启动子变体可以通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。

本发明还包括与本发明的优选启动子序列(SEQ ID NO.:1)具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的核酸，所述核酸也具有特异性提高植物基因编辑效率的功能。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列相似性或同一性)。

应理解，尽管本发明的实例中提供了来源于茄科，比如番茄的启动子EF1a，但是来源于其它类似的植物(尤其是与番茄属于同一科)的、与本发明启动子具有一定同源性(保守性)的启动子，也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它植物中分离得到该启动子。

本发明的启动子可以被可操作地与外源基因连接，该外源基因相对于启动子而言可以是外源(异源)的。本发明所述的外源基因(也称为目的基因)没有特别的限制，可以为编码具有特定功能蛋白的基因，比如(a)基因编辑酶和(b)腺嘌呤脱氨酶和/或胞嘧啶脱氨酶。

所述外源基因的代表性例子包括(但不限于)：抗性基因、筛选标记基因、表位标签、报告基因序列、核定位信号序列、转录激活结构域(例如，转录激活结构域(例如，VP64)、转录抑制结构域(例如，KRAB结构域或SID结构域)、核酸酶结构域(例如，Fok1)，病毒衣壳蛋白基因，抗体基因；以及具有选自下列的活性的结构域：核苷酸脱氨酶，甲基化酶活性,去甲基化酶,转录激活活性,转录抑制活性,转录释放因子活性,组蛋白修饰活性,核酸酶活性,单链RNA切割活性,双链RNA切割活性,单链DNA切割活性,双链DNA切割活性和核酸结合活性。

所述的抗性基因选自下组：抗除草剂基因、抗病毒基因、耐寒基因、耐高温基因、抗旱基因、抗涝基因、或抗虫基因。所述的筛选标记基因选自下组：gus(β-葡萄糖苷酸酶)基因、hyg(潮霉素)基因、neo(新霉素)基因、或gfp(绿色荧光蛋白)基因。

本发明还提供了一种包括本发明的启动子和/或基因表达盒的重组载体。作为一种优选的方式，重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。作为另一种优选方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向)：启动子、目的基因、和终止子。如果需要，所述的重组载体还可以包括选自下组的元件：3’多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等)；增强子；或操作子。

本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。

本发明的启动子、表达盒或载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl₂法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。

作为本发明的一种优选方式，制备转基因植物的方法是：将携带启动子和目的基因(两者可操作地连接)的载体转入农杆菌，农杆菌再将含启动子和目的基因的载体片段整合到植物的染色体上。涉及的转基因受体植物例如是拟南芥、小麦、大麦、燕麦、玉米、水稻、高粱、粟、大豆、花生、烟草、番茄、白菜、油菜、菠菜、生菜、黄瓜、茼蒿、空心菜、芹菜、油麦菜等。在本发明的实例中，所述的重组载体是pCAMBIA1300载体，将本发明的启动子构建到该载体中，转化植株。

在一优选实施方式中，本发明克隆了EF启动子(如番茄SlEF1a启动子)，并使用该启动子驱动Cas酶与脱氨酶的融合蛋白编码序列的表达，最终获得了一种对双子叶植物高效率单碱基替换和基因敲除的系统。

如本文所用，术语“腺嘌呤脱氨酶”为催化腺嘌呤水解脱氨基生成次黄嘌呤和氨的酶。将腺嘌呤A转变为次黄嘌呤I，次黄嘌呤I可与胞嘧啶配对，在DNA水平被当成鸟嘌呤(G)进行读码与复制，导致A·T配对转换为G·C配对。TadA腺嘌呤脱氨酶，来源于大肠杆菌，经过人工改造目前已获的ecTadA突变体。TadA与ecTadA的二聚体为目前常用的腺嘌呤脱氨酶。

在本发明中，适用的TadA既包含野生型的形式也包含其特定的突变形式TadA7-10，也可包含野生型的形式和突变形式的组合。TadA7-10能够以DNA作为底物进行脱氨反应。

在本发明中，核酸构建物中腺嘌呤脱氨酶编码序列可以根据适用宿主的不同，而采用宿主偏好的方式进行密码子优化。

如本文所用，术语“胞嘧啶脱氨酶(APOBEC)”为能够催化细胞内胞嘧啶脱氨形成尿嘧啶的酶,将胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，损伤DNA在重新复制过程中被聚合酶作用，尿嘧啶在DNA复制过程中会被识别成T，导致C·G配对转换为T·A配对。已发现的APOBECs家族成员有11个，包括APOBEC1(A1)、APOBEC2(A2)、APOBEC3A～H(3A、3B、3C、3D、3E、3F、3H)、APOBEC4(A4)以及活化诱导脱氨酶(activation induced cytidine deaminase,AID)。

在本发明中，适用的胞嘧啶脱氨酶既包含野生型的形式也包含其特定的突变形式(如CBE2.0、CBE2.1、CBE2.2、CBE2.3、CBE2.4)，也可包含野生型的形式和突变形式的组合。突变形式的胞嘧啶脱氨酶能够以DNA作为底物进行脱氨反应。

在本发明中，核酸构建物中胞嘧啶脱氨酶编码序列可以根据适用宿主的不同，而采用宿主偏好的方式进行密码子优化。

在本发明的一个优选的实施方式中，优选的胞嘧啶脱氨酶为CBE2.0、CBE2.1、CBE2.2、CBE2.3、CBE2.4。

本发明的构建物中所用的各种元件或者是本领域中已知的，或者可用本领域技术人员已知的方法制备。例如，可通过常规方法，如PCR方法、全人工化学合成法、酶切方法获得相应的元件，然后通过熟知的DNA连接技术连接在一起，就形成了本发明的构建物。

将本发明的构建物插入外源载体(尤其是适合转基因植物操作的载体)，就构成了本发明的载体。

将本发明的载体转化植物细胞从而介导本发明的载体对植物细胞染色体进行整合，并在植物体内表达，制得经基因编辑的植物细胞。

将本发明的经基因编辑的植物细胞再生为植物体，从而获得经基因编辑的植物。

将本发明构建好的上述核酸构建物，通过常规的植物重组技术(例如农杆菌转让技术)，可以导入植物细胞，从而获得携带所述核酸构建物(或带有所述核酸构建物的载体)的植物细胞，或获得基因组中整合有所述核酸构建物的植物细胞。

本发明中整合有所述核酸构建物的植物个体，在其子代可通过常规筛选或采用本领域已知的其他手段进行分离或去除，从而制得经基因编辑且不含有核酸构建物的植物体。

具体地，本发明是将一种特定的EF启动子，如番茄EF1a驱动基因编辑酶(如Cas9)与脱氨酶融合蛋白编码序列的表达，从而提高基因编辑效率。

该载体的主要特征是将特定的EF启动子(如番茄EF1α)、脱氨酶和Cas融合蛋白的编码序列，任选地还包括核定位信号、UGI编码序列连接在一起，从而形成本发明的特定的核酸构建物。当该核酸构建物在细胞质中表达后，该核酸构建物所编码的融合蛋白可以非常高效地被转移至细胞核内，并由式II构建物所编码的guide RNA引导至基因组中的靶点位置，从而在靶点位置进行A.T到G.C或C.G到T.A的碱基替换，并基本上避免或消除了发生插入/缺失的风险，并且可显著提高基因编辑的效率。

选择适用于植物细胞的guide RNA的表达框，并将其与上述融合蛋白的开放表达框(ORF)构建在同一载体。

本发明中，载体可以是例如质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的，在本领域中众多描述。优选地，本发明中的表达载体是质粒。表达载体可包含启动子、翻译起始的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、转录终止子、增强子等。表达载体中也可以含有一个或多个可选择标记基因以便用于选择包含载体的宿主细胞。这种可选择的标记包括编码二氢叶酸还原酶的基因，或赋予新霉素耐受性的基因，赋予对四环素或氨苄青霉素耐受性的基因等。

本发明的核酸构建物可通过多种方法插入载体中，例如通过用适当的限制性核酸内切酶消化插入物和载体后进行连接。多种克隆技术在本领域中是已知的，这些均在本领域技术人员的知识范围内。

本发明中适用的载体包括可从商业渠道获得的质粒，例如但不限于：pBR322(ATCC37017)，pCAMBIA1300，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)，GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pD10，psiX174pBluescript II KS，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)，ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)，pKK232-8，pCM7，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，和pSVL(Pharmacia)等。

附图说明

图1.本发明实施例的碱基编辑器示意图；其中，AtU6、Pro AtRPS5A、Pro SlEF1α为启动子；sgRNA为向导RNA；ABE7.10为腺嘌呤脱氨酶，NLS为核定位信号；NOS为终止子，nCas9-NG或nCas9-XNG为基因编辑酶。

实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

1、靶标选择

选择拟南芥中的AtSUVHs基因，利用拟南芥AtRPS5A启动子(所述AtRPS5A启动子的序列如SEQ ID NO.:2所示)驱动不同的Cas9变体的碱基编辑器考察拟南芥中的单碱基编辑效率，所使用的gRNA如下表所示：

gRNA	Target sequence(5'-3')PAM	Target gene
			gRNA1	TACGCAGGAGAGCTTCTAGAGG	AtSUVH5
gRNA2	AATTGTTCACAGCGCATAT GGG	AtSUVH5
			gRNA3	GCATACCAACGAGTACTTC AGA	AtSUVH4
gRNA4	TTACAAATGGCAAGCTTGG CGT	AtSUVH9
			gRNA5	TGTGGTGAGTTTGCATATGAT GAT	AtSUVH2
gRNA6	TGCCGAGCGGAAGAGCTCT GAG	AtSUVH2

选择拟南芥中的AtFT基因，选择SlEF1a启动子(序列如SEQ ID NO.:1所示)驱动不同的Cas9变体的碱基编辑器考察拟南芥中的单碱基编辑效率，所使用的gRNA如下表所示：

gRNA	Target sequence(5'-3')PAM	Target gene
			gRNA1	GGAGATATTCTCGGAGGTGAGGG	AtFT
gRNA2	CGAGAATATCTCCATTGGTTTGT	AtFT

2、载体构建

通过同源重组技术获得ABE单碱基编辑器的表达盒(参见图1)，所述腺嘌呤脱氨酶ABE7.10的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示，所述nCas9-NG的氨基酸序列如SEQ ID NO.:4所示，所述nCas9-XNG的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示。

具体操作如下：

A)以番茄基因组DNA为模版，用正/反向引物pSlEF1a-F/pSlEF1a-R对目标片段进行扩增，获得PCR产物。

B)用限制内切酶Sbf1和SalI酶切回收载体骨架

proAtU6-gRNA-pro35S-ABE7.10-nCas9-NG

proAtU6-gRNA-pro35S-ABE7.10-nCas9-XNG

C)通过同源重组将A获得PCR产物连入B获得的骨架载体中，获得单碱基编辑载体:

proAtU6-gRNA-proSlEF1a-ABE7.10-nCas9-NG；

proAtU6-gRNA-proSlEF1a-ABE7.10-nCas9-XNG

D)转化大肠杆菌，挑单克隆测序验证片段成功连入载体。

以同样方法构建含有Pro AtRPS5A启动子的单碱基编辑载体:

proAtU6-gRNA-proAtRPS5A-ABE7.10-nCas9-NG；

proAtU6-gRNA-proAtRPS5A-ABE7.10-nCas9-XNG

3、遗传转化

(A)上述构建质粒直接转化农杆菌GV3101：

农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA，之后冰浴30min,放入液氮中5min，然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min，冰上放置5min。

取出离心管，加入700ul YEP培养基，振荡培养2～4hr。

取出菌液与含相应抗生素的YEP培养基平板上涂板，在培养箱中倒置培养,2天左右菌落可见。

(B)拟南芥转基因

(1).在转化前三天，接种含有双元载体的农杆菌到5ml含有抗生素(庆大霉素20mg/L，卡那霉素50mg/L)的LB液体培养基中，28℃下震荡培养2天。

(2).两天后，将1ml培养的农杆菌转移到100ml含有抗生素的LB液体培养基中，28℃继续震荡培养24小时。

(3).将农杆菌转入离心管中，6000rpm/min，室温条件下，离心10分钟，然后将上清倒出。

(4).将沉淀用200ml浸染液重悬，形成均匀的农杆菌悬浮液(OD600＝0.8左右)，并将农杆菌悬浮液转移到一个敞口的器皿中(500ml烧杯)。

(5).选取初果期的健壮植株，带盆钵一起倒扣于盛有农杆菌悬浮液的容器上方，将整个花序浸入上述农杆菌悬浮液中约20-30秒，注意叶片尽量不与浸染液接触。同一个烧杯中的农杆菌悬浮液可以转化10株或者更多株拟南芥。在此过程中，尽量避免将蛭石倒入农杆菌悬浮液中。

(6).将盆钵取下，横放于暗箱中约24小时。注意保持一定的湿度。

(7).24小时后将处理过的拟南芥植株放于22～25℃的光照条件下使其正常生长。

(8).大约三周后收取成熟种子。

(9).阳性苗筛选和基因编辑检测。

将收到的种子铺在潮霉素终浓度为50mg/L的1/2MS培养基上进行筛选。两周后，将阳性苗移种到土里。

取每株植物的叶片，提取基因组DNA，在gRNA的靶向位点两侧设计引物。扩增得到的片段进行Sanger测序，确定每株植物的基因型。

4、实验结果

AtRPS5A启动子驱动的ABE-nCas9-NG和ABE-nCas9-XNG在拟南芥中的基因编辑效率为0，没有表现出碱基编辑效率，如下表所示：

相反，利用SlEF1a驱动的ABE-nCas9-NG和ABE-nCas9-XNG在拟南芥中都可以进行基因编辑，意想不到的是，采用SlEF1a驱动的ABE-nCas9-XNG的编辑效率要远高于ABE-nCas9-NG的基因编辑效率。

具体而言，如下表所示，SlEF1a-ABE-nCas9-NG和SlEF1a-ABE-nCas9-XNG在NGG和NGPAM位点都有编辑效率；而且，在同一PAM位点下，SlEF1a-ABE-nCas9-XNG的碱基编辑效率比SlEF1a-ABE-nCas9-NG高三倍左右。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东舜丰生物科技有限公司

<120> 一种用于碱基编辑的核酸构建物

<130> 111

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1583

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Solanum lycopersicum SlEF1α promoter

<400> 1

gattagtttg tcaaatagta gagttcattt aaaattcttc agccatatag ttctattttt 60

aagctagtcg actttttttt tcttactgaa aattaatatt tttttctttt tgaaatacta 120

atacatctaa atttaacaat tgccaaagtg atttttaatt agcttgctgg ctaatcacaa 180

taaaaattac tctcctttac tatataagta aatttttatt gctatatttg ttattattat 240

tattattatt aatatttatt ttctacaaat ttaataatat tttattttat atcattttaa 300

aaagataagt aatgaaatat taagaattcg tttataattc ttttgcaggt gggtttctat 360

ttgtaagcta atctttttca gttatccttt ttttaaaatc tttattatta ttatagctat 420

atcttttatc ttttaaaatt aacattatct attaaagata atttcaataa aagagtaaaa 480

attaatttag agttctactg tcttcaaatt tctattttaa aaaatacttt taaaacttga 540

tgtatttttt acgtggtttt tcactatgac ttaatttctg ttttattata atatgtataa 600

atataaaaat agattttcca taacatatta taaaaaatgt aaggggcatt tacgtaaata 660

gatagactta aaagaggcac cgagtgaacc ctaattctca tcgttgagac tataaaatgc 720

ccattatccc attcgcacag tctcttcatt acttttgctg ttatttctcc tcagctgtgc 780

cgcatatcgc ctaatttttc ttctctaagg tttcatcatc ttcaccaatt tctttaatct 840

cgattcaatt ttttatgttt gatctgttat tgttctgtca ctacatgtgt ttttcagttg 900

ttttactaga tgattttcac tgtcttcttg ttagatcata catatattga aaatgttttg 960

gattgacttt tttgtattgt gaatatctgt tattgtttga ttgttgttca gtatttacac 1020

acccgatctg tgttatgagc ttggtcataa ctatttctct gtatgtaaat acagatctgt 1080

taatgtttgt aatcaatttt tcatatgcac tgttgatatt gttctctctc ctgtcctgtt 1140

atatgttgat atgattcggt ttttgtataa cttgaactaa acactagtcc taaatgtttt 1200

ttttactatt taagatttat ataatatgga tagatttttt gagttcctag tctctgaaga 1260

ggttaagctt gctgtagttg tttaccagtt gaggtgcaat actaaaaatc aattcaatta 1320

ctgatatttt ttgctgttta ggtttttgac aaagtacttt aatttgcttt attgaactaa 1380

aaacgtagtc ctgaattcat tgcaagtgtg aaagctatag ttcattgttt ttgttgcaat 1440

tcttgaaaaa ttaattggtc aagctataat ggattttact ttttctgttt taatattgaa 1500

tttgctgaat ttatgaatgg gttgcatggt ttttgaaata tgttgttgtg tgttgtgtaa 1560

atgcagtttc ttagtgtctc aag 1583

<210> 2

<211> 1660

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 2

ctcaactttt gattcgctat ttgcagtgca cctgtggcgt tcatcacatc ttttgtgaca 60

ctgtttgcac tggtcattgc tattacaaag gaccttcctg atgttgaagg agatcgaaag 120

taagtaactg cacgcataac cattttcttt ccgctctttg gctcaatcca tttgacagtc 180

aaagacaatg tttaaccagc tccgtttgat atattgtctt tatgtgtttg ttcaagcatg 240

tttagttaat catgcctttg attgatcttg aataggttcc aaatatcaac cctggcaaca 300

aaacttggag tgagaaacat tgcattcctc ggttctggac ttctgctagt aaattatgtt 360

tcagccatat cactagcttt ctacatgcct caggtgaatt catctatttc cgtcttaact 420

atttcggtta attaaagcac gaacaccatt actgcatgta gaagcttgat aaactatcgc 480

caccaattta tttttgttgc gatattgtta ctttcctcag tatgcagctt tgaaaagacc 540

aaccctctta tcctttaaca atgaacaggt ttttagaggt agcttgatga ttcctgcaca 600

tgtgatcttg gcttcaggct taattttcca ggtaaagcat tatgagatac tcttatatct 660

cttacatact tttgagataa tgcacaagaa cttcataact atatgcttta gtttctgcat 720

ttgacactgc caaattcatt aatctctaat atctttgttg ttgatctttg gtagacatgg 780

gtactagaaa aagcaaacta caccaaggta aaatactttt gtacaaacat aaactcgtta 840

tcacggaaca tcaatggagt gtatatctaa cggagtgtag aaacatttga ttattgcagg 900

aagctatctc aggatattat cggtttatat ggaatctctt ctacgcagag tatctgttat 960

tccccttcct ctagctttca atttcatggt gaggatatgc agttttcttt gtatatcatt 1020

cttcttcttc tttgtagctt ggagtcaaaa tcggttcctt catgtacata catcaaggat 1080

atgtccttct gaatttttat atcttgcaat aaaaatgctt gtaccaattg aaacaccagc 1140

tttttgagtt ctatgatcac tgacttggtt ctaaccaaaa aaaaaaaaat gtttaattta 1200

catatctaaa agtaggttta gggaaaccta aacagtaaaa tatttgtata ttattcgaat 1260

ttcactcatc ataaaaactt aaattgcacc ataaaatttt gttttactat taatgatgta 1320

atttgtgtaa cttaagataa aaataatatt ccgtaagtta accggctaaa accacgtata 1380

aaccagggaa cctgttaaac cggttcttta ctggataaag aaatgaaagc ccatgtagac 1440

agctccatta gagcccaaac cctaaatttc tcatctatat aaaaggagtg acattagggt 1500

ttttgttcgt cctcttaaag cttctcgttt tctctgccgt ctctctcatt cgcgcgacgc 1560

aaacgatctt caggtgatct tctttctcca aatcctctct cataactctg atttcgtact 1620

tgtgtatttg agctcacgct ctgtttctct caccacagcc 1660

<210> 3

<211> 364

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ABE

<400> 3

Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr

1 5 10 15

Leu Ala Lys Arg Ala Trp Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val

20 25 30

Leu Val His Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Pro Ile

35 40 45

Gly Arg His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln

50 55 60

Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Val Thr Leu Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His Ser

85 90 95

Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Ala Arg Asp Ala Lys Thr Gly Ala

100 105 110

Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His His Pro Gly Met Asn His Arg

115 120 125

Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu Leu

130 135 140

Ser Asp Phe Phe Arg Met Arg Arg Gln Glu Ile Lys Ala Gln Lys Lys

145 150 155 160

Ala Gln Ser Ser Thr Asp Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly

165 170 175

Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser Gly

180 185 190

Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp

195 200 205

Met Arg His Ala Leu Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu

210 215 220

Val Pro Val Gly Ala Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu

225 230 235 240

Gly Trp Asn Arg Ala Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu

245 250 255

Ile Met Ala Leu Arg Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu

260 265 270

Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala

275 280 285

Gly Ala Met Ile His Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Gly Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His Tyr

305 310 315 320

Pro Gly Met Asn His Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp

325 330 335

Glu Cys Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Phe Phe Arg Met Pro Arg Gln Val

340 345 350

Phe Asn Ala Gln Lys Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp

355 360

<210> 4

<211> 1368

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cas9-NG

<400> 4

Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val

1 5 10 15

Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe

20 25 30

Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu

50 55 60

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

85 90 95

Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys

100 105 110

His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr

115 120 125

His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp

130 135 140

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His

145 150 155 160

Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro

165 170 175

Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr

180 185 190

Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala

195 200 205

Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn

210 215 220

Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn

225 230 235 240

Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe

245 250 255

Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp

260 265 270

Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

275 280 285

Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp

290 295 300

Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser

305 310 315 320

Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys

325 330 335

Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe

340 345 350

Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser

355 360 365

Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg

385 390 395 400

Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu

405 410 415

Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe

420 425 430

Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile

435 440 445

Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp

450 455 460

Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu

465 470 475 480

Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr

485 490 495

Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser

500 505 510

Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys

515 520 525

Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln

530 535 540

Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr

545 550 555 560

Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp

565 570 575

Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly

580 585 590

Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp

595 600 605

Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr

610 615 620

Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala

625 630 635 640

His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr

645 650 655

Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp

660 665 670

Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe

675 680 685

Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe

690 695 700

Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu

705 710 715 720

His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly

725 730 735

Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly

740 745 750

Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln

755 760 765

Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile

770 775 780

Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro

785 790 795 800

Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu

805 810 815

Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg

820 825 830

Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys

835 840 845

Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg

850 855 860

Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys

865 870 875 880

Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys

885 890 895

Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp

900 905 910

Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr

915 920 925

Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp

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Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser

945 950 955 960

Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg

965 970 975

Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val

980 985 990

Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe

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Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala

1010 1015 1020

Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe

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Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala

1040 1045 1050

Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu

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Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val

1070 1075 1080

Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr

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Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Arg Pro Lys

1100 1105 1110

Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro

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Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Val Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val

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Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys

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Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu

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Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Arg

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Phe Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val

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Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser

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His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys

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Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Arg Ala

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Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Val Tyr Arg Ser

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Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr

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1355 1360 1365

<210> 5

<211> 1368

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cas9-XNG

<400> 5

Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val

1 5 10 15

Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe

20 25 30

Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu

50 55 60

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

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Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys

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His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr

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130 135 140

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His

145 150 155 160

Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro

165 170 175

Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr

180 185 190

Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala

195 200 205

Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn

210 215 220

Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn

225 230 235 240

Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe

245 250 255

Asp Leu Ala Glu Asp Thr Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp

260 265 270

Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

Met Ile Lys Leu Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys

325 330 335

Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe

340 345 350

Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser

355 360 365

Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg

385 390 395 400

Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ile Ile Pro His Gln Ile His Leu

405 410 415

Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe

420 425 430

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485 490 495

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Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys

515 520 525

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530 535 540

Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr

545 550 555 560

Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp

565 570 575

Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly

580 585 590

Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp

595 600 605

Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr

610 615 620

Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala

625 630 635 640

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645 650 655

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660 665 670

Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe

675 680 685

Ala Asn Arg Asn Phe Ile Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe

690 695 700

Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu

705 710 715 720

His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly

725 730 735

Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly

740 745 750

Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln

755 760 765

Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile

770 775 780

Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro

785 790 795 800

Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu

805 810 815

Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg

820 825 830

Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys

835 840 845

Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg

850 855 860

Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys

865 870 875 880

Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys

885 890 895

Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp

900 905 910

Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr

915 920 925

Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp

930 935 940

Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser

945 950 955 960

Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg

965 970 975

Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val

980 985 990

Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe

995 1000 1005

Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala

1010 1015 1020

Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe

1025 1030 1035

Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala

1040 1045 1050

Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu

1055 1060 1065

Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val

1070 1075 1080

Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr

1085 1090 1095

Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Arg Pro Lys

1100 1105 1110

Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro

1115 1120 1125

Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Val Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val

1130 1135 1140

Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys

1145 1150 1155

Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser

1160 1165 1170

Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys

1175 1180 1185

Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu

1190 1195 1200

Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Arg

1205 1210 1215

Phe Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val

1220 1225 1230

Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser

1235 1240 1245

Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys

1250 1255 1260

His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys

1265 1270 1275

Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala

1280 1285 1290

Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn

1295 1300 1305

Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Arg Ala

1310 1315 1320

Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Val Tyr Arg Ser

1325 1330 1335

Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr

1340 1345 1350

Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

1355 1360 1365

Claims

1.一种核酸构建物，所述核酸构建物具有5’至3’端可操作连接的第一启动子、碱基编辑元件和基因编辑酶，其特征在于，所述第一启动子为EF1α启动子，所述碱基编辑元件选自腺嘌呤脱氨酶或胞嘧啶脱氨酶，所述基因编辑酶选自nCas9-XNG。

2.根据权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述EF1α启动子来源于选自下组的一种或多种植物：玉米、水稻、大豆、拟南芥、烟草、番茄；优选，所述EF1α启动子为番茄EF1α启动子；更优选的，所述EF1α启动子的序列如SEQ ID NO.:1所示。

3.根据权利要求1或2所述的核酸构建物，其特征在于，所述nCas9-XNG的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示。

4.根据权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物还包括gRNA的编码序列。

5.根据权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述碱基编辑元件的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。

6.一种载体，所述载体包括权利要求1-5任一所述的核酸构建物。

7.权利要求1-5任一所述的核酸构建物或权利要求6所述的载体在进行基因编辑中的应用；优选的，所述应用为在植物中进行基因编辑。

8.一种对植物进行基因编辑的方法，其特征在于，所述方法包括向植物细胞中导入权利要求1-5任一所述的核酸构建物或权利要求6所述的载体的步骤。

9.一种制备经基因编辑的植物细胞的方法，其特征在于，所述方法包括向植物细胞中导入权利要求1-5任一所述的核酸构建物或权利要求6所述的载体，使得所述植物细胞中的基因发生基因编辑，从而制得所述经基因编辑的植物细胞。

10.一种制备植物的方法，所述方法包括将权利要求9制备得到的植物细胞繁殖为植物的步骤。