CN112048493B - 一种增强Cas9及其衍生蛋白介导的基因操纵系统的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种增强Cas9及其衍生蛋白介导的基因操纵系统的方法及应用。本发明提供了一种用于增强Cas9衍生的人工转录因子的方法，即将具有二聚化功能的多肽与Cas9或其衍生蛋白融合。根据上述方法，本发明将具有二聚化活性的CC结构域与人工激活子dCas9‑TV融合后获得新型人工激活子dCas9‑CCTV。该dCas9‑CCTV发生了蛋白质的二聚化，同时具有比原始dCas9‑TV更强劲的基因激活能力，并且在转基因植株中有着良好的多基因激活能力，可以应用于增强Cas9及其衍生蛋白介导的基因操纵系统，使该系统在基因激活生物体的产生方面具有更好的应用价值。

Description

一种增强Cas9及其衍生蛋白介导的基因操纵系统的方法及 应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及增强Cas9及其衍生蛋白介导的基因编辑或表达调控的方法，具体涉及一种增强Cas9及其衍生蛋白介导的基因操纵系统的方法及应用。

背景技术

近年来，基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑技术因其简捷、高效等特点被广泛应用于生物基因功能研究、人类临床疾病治疗和作物遗传改良等领域。该系统主要由核酸酶Cas9以及向导RNA（sgRNA）组成。在sgRNA的引导下，Cas9结合于靶标基因位点处，行使核酸酶功能，产生DNA双链断裂，然后由细胞内源修复机制带来突变。科研人员发现，当通过D10A或H840A的氨基酸突变使Cas9的核酸酶活性部分或全部丧失时，其仍具有在sgRNA引导下结合靶标基因位点的功能。根据这一特性，科研人员将具有转录激活活性、转录抑制活性、胞嘧啶脱氨活性或腺嘌呤脱氨活性的多肽分别与前述核酸酶活性部分或全部丧失的Cas9蛋白融合，开发了一系列基于CRISPR/Cas9的转录调控工具和单碱基编辑工具[统称“基因操纵（gene manipulation）工具”]。

随着该技术的广泛应用，科研人员发现在细胞、动物，尤其是植物中，现有的基于Cas9及其衍生蛋白的基因操纵工具的效率尚不能完全满足大家的需求。而在众多基因操纵工具中，Cas9及其衍生的人工转录激活子颇具代表性。

常用的第一代dCas9（nuclease-dead Cas9）人工转录激活子dCas9-VP64是将dCas9与来自人类单纯性疱疹病毒的激活结构域VP64融合，已有的证据表明其不管是在植物还是动物细胞中仅能微弱激活靶基因的表达。近年来，新一代dCas9高效人工转录激活子SAM, SunTag, dCas9-VPR等相继开发应用于动植物细胞中，有效提高了其对靶基因的激活效果，推动了相关研究领域的发展。本团队于2017年，经拟南芥原生质体筛选系统，通过对比融合了不同转录激活结构域的dCas9人工激活子，最终获得了一个高效的人工转录激活子dCas9-TV（Li，Z. et al. A potent Cas9-derived gene activator for plant andmammalian cells. Nature plants，3，930–936，2017）。其不仅能促进植物细胞中目的基因的高效表达，同时也能在哺乳动物细胞中有效激活内源基因的表达。但是，在面对本底表达量较高的基因（如拟南芥FLS2基因）时，dCas9-TV人工转录激活子亦仅微弱激活目的基因AtFLS2表达1.6倍。这说明开发激活效果更强的dCas9人工转录激活子对于本领域的发展仍十分必要。

因此，寻找一个通用地，便捷地增强Cas9及其衍生蛋白介导的基因操纵系统的方法变得十分迫切。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种增强Cas9及其衍生蛋白介导的基因操纵系统的方法及应用，将具有二聚化活性的多肽与Cas9或其衍生蛋白融合后获得的新型人工激活子发生了蛋白质的二聚化，其基因激活能力得到了增强，在转基因植株中有着良好的多基因激活能力。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明提供一种用于增强Cas9衍生的人工转录因子的方法，具体为：将具有二聚化功能的多肽与Cas9或其衍生蛋白融合。

优选地，所述具有二聚化功能的多肽包括但不限于来自于酵母转录激活子GCN4的螺旋卷曲结构域（CC结构域）。

优选地，所述Cas9包括但不限于SpCas9、SaCas9、ScCas9，及其变体（包括但并不限于SpCas9的VQR、EQR、VRER、xCas9、Cas9-NG、SpG、SpRY和SaCas9的KKH）。

优选地，所述Cas9衍生的人工转录因子包括但不限于人工转录激活子dCas9-TV。本发明的试验证明，将具有二聚化活性的CC结构域与dCas9-TV蛋白融合后获得的新型人工激活子dCas9-CCTV发生了蛋白质的二聚化，其基因激活能力得到了增强。

优选地，所述具有二聚化功能的多肽与Cas9或其衍生蛋白通过接头融合连接。进一步的，所述具有二聚化功能的多肽可以连接在Cas9或其衍生蛋白的N末端或C末端。

在一些实施方案中，所述接头包括但并不限于GS、GGSGG、GGSGGSGG和XTEN；所述接头可以是长1-50个（例如1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或20-25 个、25-50个）或更多个氨基酸、无二级以上结构的非功能性氨基酸序列。例如，所述接头可以是柔性接头，如PR、GGGGS、PRGGSGG、ARGGSGG、GS、GAP、(GGGGS)×3、GGS和(GGS)×7。

本发明还提供了采用上述方法制备得到的Cas9衍生的人工转录激活子。

本发明还提供了采用上述方法制备得到的Cas9衍生的人工转录激活子在增强Cas9及其衍生蛋白介导的基因操纵系统中的应用。

优选地，所述Cas9及其衍生蛋白介导的基因操纵系统包括基因编辑系统，单碱基编辑系统，转录抑制系统，转录激活系统。

本发明还提供了一种用于对生物体基因组中的靶基因进行基因激活的系统，包括下列组合中的至少一项：

i）采用上述方法制备得到的Cas9衍生的人工转录激活子，和向导RNA；

ii）包含编码采用上述方法制备得到的Cas9衍生的人工转录激活子的核苷酸序列的表达载体，和向导RNA；

iii）采用上述方法制备得到的Cas9衍生的人工转录激活子，和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达载体；

iv）包含编码采用上述方法制备得到的Cas9衍生的人工转录激活子的核苷酸序列的表达载体，和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达载体；

v）包含编码采用上述方法制备得到的Cas9衍生的人工转录激活子的核苷酸序列和编码向导RNA的核苷酸序列的表达载体。

优选地，所述采用上述方法制备得到的Cas9衍生的人工转录激活子为新型人工激活子dCas9-CCTV。

进一步地，所述dCas9-CCTV可由向导RNA引导至目的基因组中靶基因的特定区域，例如启动子区域，而导致靶基因转录水平上调表达。一般地，本发明所述人工转录激活子dCas9-CCTV由于编码有核定位序列（NLS），因而靶向位于细胞核基因组的基因。当然，根据所需要激活基因的位置，本发明的dCas9-CCTV融合蛋白还可以包括其他的定位序列，例如细胞质定位序列、叶绿体定位序列和线粒体定位序列。

进一步地，人工转录激活子dCas9-CCTV的核苷酸序列和/或编码向导RNA的核苷酸序列与表达调控元件以可操作的方式连接。

更进一步地，本发明可使用的启动子包括但不限于聚合酶(Pol) I、Pol II或PolIII启动子。具体地，Pol I启动子如非洲爪蟾RNA Pol I启动子；Pol II启动子包括但不限于巨细胞病毒立即早期（CMV）启动子和猿猴病40（SV40）立即早期启动子；Pol III启动子的实例包括U6和H1启动子；可以使用诱导型启动子如雌激素诱导启动子；启动子的其他实例包括T7噬菌体启动子和β-半乳糖苷酶启动子。特别地，当用于植物时，启动子可以是花椰菜马赛克病毒35S启动子、玉米Ubi-1启动子、拟南芥UBQ10启动子、水稻U6启动子、水稻U3启动子拟南芥U6-26启动子、拟南芥U6-1启动子、拟南芥U3启动子。

本发明还提供了上述的用于对生物体基因组中的靶基因进行基因激活的系统在产生基因激活生物体中的应用。

本发明还提供了一种产生基因激活生物体的方法，即将上述的用于对生物体基因组中的靶基因进行基因激活的系统导入生物体的细胞中。

具体地，一种产生基因激活生物体的方法，即将基于dCas9-CCTV人工转录激活子的基因激活系统（即dCas9-CCTV基因激活系统）导入生物体的细胞中。由此向导RNA将本发明的dCas9-CCTV人工转录激活子靶向植物基因组中的靶基因特定区域，如启动子区域，导致内源靶基因在转录水平上发生上调。

进一步地，可被Cas9衍生的人工转录激活子和向导RNA复合物识别并靶向的靶序列的设计可以参照例“Cong，L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science，339，819-23，2013；和Li，JF. et al. Multiplex and homologousrecombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotianabenthamiana using guide RNA and Cas9. Nature biotechnology，31，688–69，2013”；本发明的基因激活系统靶向的靶序列的3’末端需包含前间隔序列邻近基序（protospaceradjacent motif, PAM）5’-NGG-3’，其中N独立的选择自A、G、C和T。

特别地，可被dCas9-CCTV基因激活系统靶向激活的靶基因所需的向导RNA的设计原则可以参考“Li，Z. et al. A potent Cas9-derived gene activator for plant andmammalian cells. Nature plants，3，930–936，2017”。

在本发明中，dCas9-CCTV基因激活系统所使用的向导RNA的靶位点可以位于基因组中靶基因的任意位置，例如启动子区域、增强子区域、外显子区域和内含子区域；主要地，本发明所述dCas9-CCTV基因激活系统所使用的向导RNA的靶位点位于靶基因的启动子区域的转录起始位点（TSS）前300个碱基之内。

在本发明中，可以通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的方法检测所述细胞靶基因的转录水平的上调表达，或是直接使用靶基因的内源抗体通过蛋白质印迹（Western Blot）技术检测靶基因蛋白水平的上调表达。

在本发明中，所述dCas9-CCTV基因激活系统可以通过本领域人员通常所知晓的各种方法导入细胞内，可用于导入细胞的方法包括但不限于：磷酸钙转染、原生质融合、电穿孔、脂质体转染、微注射、病毒感染（如杆状病毒、痘苗病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和其他病毒）、基因枪法、PEG介导的原生质体转化、农杆菌介导的转化。

优选地，所述生物体包括哺乳动物、家禽和植物。具体的，所述哺乳动物包括猴、犬、猪、羊、人、小鼠、大鼠；家禽包括鸡、鸭、鹅；植物包含单子叶植物和双子叶植物，例如水稻、玉米、小麦、高粱、大麦、大豆、花生、拟南芥、番茄、烟草、土豆、草莓。

特别地，本发明适合于产生基因激活的植物，包括但并不限于大田作物，如水稻；在本发明的产生有基因激活的植物的方法中，本领域技术人员可通过熟知的各种方法将dCas9-CCTV基因激活系统导入植物；可用于将本发明的dCas9-CCTV基因激活系统导入植物的方法包括但不限于：土壤农杆菌介导的转化、基因枪法、花粉管通道法和子房注射法、PEG介导的原生质体转化、植物病毒介导的转化。

在本发明的一些实施方式中，直接将体外表达的 dCas9-CCTV融合蛋白和/或体外转录的向导RNA分子转化至所述植物，所述融合蛋白和/或向导RNA分子能够在植物细胞中实现对靶基因的瞬时激活。

本发明的另一些实施方式中，所述靶基因与植物性状如农艺性状相关，由此所述基因激活可导致所述植物相对于野生型植物具有改变的性状；包括并不限于OsGW7基因，已有研究表明过表达OsGW7可使水稻籽粒变得细长；以及OsER1基因，已有研究表明其与气孔发育有着重要联系，还和水稻耐热有关。

在本发明的另一些实施方式中，本发明的产生基因激活植物的方法还包括获得所述基因激活的植物的后代。另一方面，本发明还提供了基因激活的植物或其后代或其部分，其中所述植物通过本发明前述的方法（即产生基因激活植物的方法）获得。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了一种用于增强Cas9衍生的人工转录激活子的方法，即将具有二聚化功能的多肽与Cas9或其衍生蛋白融合。根据上述方法本发明将具有二聚化活性的CC结构域与人工激活子dCas9-TV融合后获得的新型人工激活子dCas9-CCTV，免疫共沉淀（Co-IP）实验证实，不论在拟南芥细胞还是在水稻细胞中，dCas9-CCTV都发生了蛋白质的二聚化；同时，进一步的试验验证发现，dCas9-CCTV具有比原始dCas9-TV更强劲的基因激活能力，并且在转基因植株中有着良好的多基因激活能力，可以应用于增强Cas9及其衍生蛋白介导的基因操纵系统，从而开发出激活效果更强的Cas9及其衍生蛋白介导的基因操纵系统，使该系统在基因激活生物体的产生方面具有更好的应用价值。

附图说明

图1为具有二聚化活性的CC结构域与dCas9-TV人工转录激活子融合获得的dCas9-CCTV在植物细胞中发生了蛋白二聚化；

图中，A为dCas9-CCTV的结构示意图，NLS代表入核信号，dCas9是核酸酶缺失版本的Cas9蛋白，colied coils代表来自酵母GCN4转录激活子的螺旋卷曲结构域（具有同源二聚化功能），TV是转录激活结构域。B和C分别为dCas9-CCTV在拟南芥和水稻细胞中发生蛋白二聚化的CO-IP实验。

图2为人工转录激活子dCas9-CCTV在水稻细胞中展现出比dCas9-TV更强的基因激活能力；

图中，A为dCas9-CCTV和dCas9-TV的结构示意图，2*FLAG是FLAG标签蛋白，方便对人工转录激活子进行Western Blot检测；B和C分别为在水稻原生质体中通过对荧光素酶报告基因OsGW7p-LUC和OsER1p-LUC证明dCas9-CCTV的基因激活能力强于dCas9-TV的基因激活实验，Ctrl代表仅表达OsGW7p-LUC或OsER1p-LUC报告基因的对照组；dCas9-CCTV代表仅表达人工转录激活子dCas9-CCTV而不表达相应的sgRNA；dCas9-CCTV或dCas9-TV下有+sgRNA则代表分别各自共表达了OsGW7-sgRNA或OsER1-sgRNA；数据为平均值±标准差（n=3）；*，p<0.05，显著差异；**，p<0.01，极显著差异；双尾学生t检验。

图3为使用基于dCas9-CCTV的基因激活系统在转基因水稻中实现了对内源OsGW7和OsER1基因的高效共同激活。

图中，纵坐标代表通过RT-qPCR检测的内源靶基因（OsGW7和OsER1）相对于内参基因OsACTIN1的绝对表达量；柱图上的数值代表内源靶基因（OsGW7或OsER1）相对于野生型水稻（#WT）的对应内源基因的激活倍数；左柱子代表OsGW7，而右柱子代表OsER1；#1，#7，#14代表导入dCas9-CCTV基因激活系统的3个独立的T₀代转基因株系，数据为平均值±标准差（n=2）。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。

除非特别说明，本发明实施例所提及的科技名词具有本领域技术人员所普遍理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学等相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。例如，本发明中使用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域技术人员熟知，并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989。同时为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

“基因操纵系统”在本发明中指的是CRISPR/Cas9基因编辑系统，及其衍生而来的单碱基编辑系统，转录抑制系统和转录激活系统。

“CRISPR/Cas9基因编辑系统”指的是由细菌免疫系统CRISPR（Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats，成簇规律间隔短回文重复序列）/Cas9发展而来的基因组编辑系统。它包含核酸酶Cas9以及向导RNA。核酸酶Cas9在向导RNA的引导下，靶向结合并且切割目标DNA序列，形成DNA双链断裂（DSB）。适用于本发明的CRISPR/Cas9基因编辑系统包括但不限于发表于“Li，JF. et al. Multiplex andhomologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nature biotechnology，31，688–69，2013”中的系统。

在本发明中，“sgRNA”和“向导RNA”可互换使用，指的是能与CRISPR/Cas9形成蛋白核酸复合物并将复合物靶向靶序列的具有发卡结构的RNA分子。一般地，决定向导RNA特异性的是其5’端的20个碱基。

“单碱基编辑系统”指的是近年来基于CRISPR/Cas9系统开发而成的，可对生物体基因组上的单个碱基序列进行编辑的系统。单碱基系统使用的是核酸酶部分失活的nCas9（D10A）蛋白与胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶的融合蛋白，称为胞嘧啶或腺嘌呤单碱基编辑器。在向导RNA的引导下，nCas9(D10A)负责结合到靶标DNA上，由于其核酸酶活性部分缺失，其仅能切割靶标DNA的一条链，而不能形成双链断裂。随后，胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶催化靶标DNA上特定位置的C胞嘧啶碱基或A腺嘌呤碱基脱氨基化形成U尿嘧啶碱基或I次黄嘌呤碱基。在细胞内源DNA修复机制的作用下，U尿嘧啶碱基或I次黄嘌呤碱基被修复为T胸腺嘧啶碱基或G鸟嘌呤碱基。最终实现了C或A到T或G的碱基替换。

常用的胞嘧啶脱氨酶包括并不限于来自大鼠的rAPOBEC1、来自七鳃鳗的PmCDA1、来自人的hAID、来自人的hAPOBEC3A、来自人的hAPOBEC3B、来自人的hAPOBEC3G。胞嘧啶单碱基编辑器除了含有nCas9(D10A)和胞嘧啶脱氨酶，经常还包含有拷贝数不等的尿嘧啶糖苷酶抑制子（UGI）蛋白。常用的腺嘌呤脱氨酶包括并不限于大肠杆菌tRNA腺嘌呤脱氨酶TadA(ecTadA)的变体，特别是以单链DNA作为底物的变体，包括TadA-7.10和TadA-8e。适用于本发明的CRISPR/Cas9衍生的单碱基编辑系统包括但不限于发表于“Zong，Y. et al.Precise base editing in rice, wheat and maize with a Cas9-cytidine deaminasefusion. Nature biotechnology，35，438-440，2017”中的系统。

“转录抑制系统”指的是由CRISPR/Cas9系统衍生而来的可以抑制特定基因表达的系统。转录抑制系统使用的是核酸酶全部丧失的dCas9(D10A,H840A)与可选地具有转录抑制活性的蛋白结构域的融合蛋白。在向导RNA的引导下，dCas9负责结合于靶基因启动子或基因编码区的特定区域。具有转录抑制活性的结构域则负责阻遏转录机器的运行，从而最终达到降低靶基因表达的目标。可选地，单独的dCas9也可起到转录抑制的作用，如dCas9直接结合到基因的TATA box区域，阻止转录复合蛋白的结合。常用的具有转录抑制活性的蛋白结构域包括但不限于如KRAB结构域、SRDX结构域。适用于本发明的CRISPR/Cas9衍生的转录抑制系统包括但不限于发表于“Lowder，LG. A CRISPR/Cas9 toolbox for multiplexedplant genome editing and transcriptional regulation. Plant Physiology，169，971–985，2015”中的系统。

“转录激活系统”指的是由CRISPR/Cas9系统衍生而来的可以激活特定基因表达的系统。转录激活系统核酸酶全部丧失的dCas9(D10A,H840A)与具有转录激活活性的蛋白结构域的融合蛋白。在向导RNA的引导下，dCas9负责结合于靶基因启动子的特定区域。具有转录激活活性的蛋白结构域则负责招募转录起始复合蛋白，从而最终达到促进靶基因表达的目标。常用的具有转录激活活性的蛋白结构域包括并不限于VP64结构域、p300结构域、TV结构域。适用于本发明的CRISPR/Cas9衍生的转录激活系统包括但不限于发表于“Li，Z. etal. A potent Cas9-derived gene activator for plant and mammalian cells.Nature plants，3，930–936，2017”中的系统。

“dCas9-CCTV”、“dCas9-CCTV融合蛋白”和“人工转录激活子dCas9-CCTV”在本发明中可互换使用，指的是融合有CCTV结构域的dCas9人工转录激活子。dCas9-CCTV衍生于CRISPR/Cas9基因编辑系统，不同的是所使用的dCas9的核酸酶活性部分或全部丧失。在向导RNA的引导下，dCas9负责结合至靶基因的特定位置上，而CCTV结构域则负责招募转录起始蛋白复合体以及发挥二聚化功能，促进靶基因的表达。

“二聚化”指的是两个蛋白质自发的形成二聚体。特别地，在本发明中指的是由dCas9-CCTV融合蛋白自发形成二聚体。

“转录激活”、 “基因激活”和“基因转录激活”在本发明中可互换使用，指通过某种特定方式促进靶基因的转录和翻译。特别地，在本发明中指的是由dCas9-CCTV基因激活系统所造成的靶基因的，超越野生型细胞和/或生物体中相应基因表达水平的转录与翻译。

“基因组”在用于植物细胞时不仅包括存在于细胞核中的核基因组，而且还包括存在于细胞中细胞器如叶绿体DNA和线粒体DNA。

“生物体”包括适于基因组编辑的任何生物体，优选真核生物。生物体的实例包括但不限于哺乳动物如人、小鼠、大鼠、猴、犬、猪、羊、牛、猫；家禽如鸡、鸭、鹅；植物包括单子叶植物和双子叶植物，例如水稻、玉米、小麦、高粱、大麦、大豆、花生、拟南芥。

“基因激活的生物体”或“基因激活的细胞”意指在其基因组内包含可表达dCas9-CCTV基因激活系统的表达构建体，并且靶标基因被上调表达的生物体或细胞。

针对序列而言的“外源”意指来自外来物种的序列；而“内源”指的是来自物种本身的序列。

“核酸序列”和“核苷酸序列”可互换使用并且是单链或双链RNA或DNA聚合物，任选地可含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸可由如下单个字母名称代指：“A”为腺苷或脱氧腺苷（分别对应RNA或DNA），“T”表示脱氧胸苷，“G”表示鸟苷或脱氧鸟苷，“C”表示胞苷或脱氧胞苷，“U”表示尿苷，“R”表示嘌呤（A或G），“Y”表示嘧啶（C或T），“K”表示G或T，“H”表示A或C或 T，“I”表示肌苷，除此之外，“N”表示任何核苷酸。

“多肽”、“蛋白质”、“蛋白”、“蛋白结构域”和“结构域”在本发明中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“蛋白质”、“蛋白”、“蛋白结构域”和“结构域”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化。

“表达构建体”是指适于感兴趣的核苷酸序列在生物体中表达的载体如重组载体。“表达”指可产生有功能的产物。例如，核苷酸序列的表达可指核苷酸序列的转录（如转录生成mRNA或功能RNA）和/或RNA 翻译成前体或成熟蛋白质。

本发明所述“表达构建体”可以是线性的核酸片段、环状质粒、病毒载体，或者可以是能够翻译的RNA（如mRNA）。

本发明的“表达构建体”可包含相同来源但以不同于天然排列方式的调控序列和感兴趣的核苷酸序列，亦包含不同来源的调控序列和感兴趣的核苷酸序列。

“调控序列”指位于编码序列的上游（包括5′非编码序列）、中间或下游（包括3′非编码序列），并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。

调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。

本发明所述“启动子”指能够控制其下游一段新核酸片段转录的核苷酸片段。在本发明的一些实施方案中，启动子是能够控制生物体的细胞中基因转录的启动子，无论其是否来源于所述生物体。启动子可以是组成型启动子或组织特异性启动子或诱导型启动子。

“组成型启动子”指一般可引起下游基因在大多数细胞类型中的多数情况下表达的启动子。“组织特异性启动子”指主要但非必须在一种特定的组织或器官中表达，而且也可在一种特定细胞或细胞系中表达的启动子。

“诱导型启动子”响应内源或外源刺激（环境、激素、化学信号等）而选择性表达可操纵连接的启动子。

“可操作的方式连接”指调控元件（例如但不限于启动子序列、转录终止序列）与核酸序列（例如编码序列或开放读码框）连接，使得核酸序列的转录被所述调控元件控制和调节。用于将调控元件区域可操作地连接于核酸分子的技术为本领域所熟知。

将核酸分子（例如并不限于质粒、线性核酸片段、RNA）或蛋白质“导入”生物体是指用所述核酸或蛋白质转化入生物体细胞中，使得所述核酸或蛋白质在细胞中能够发挥功能。本发明所述“转化”包括稳定转化和瞬时转化。

“稳定转化”指将外源核苷酸序列通过一定方法导入基因组中，从而使外源基因稳定遗传。一旦稳定转化，外源核酸序列可稳定地整合进所述生物体和其连续世代的基因组中。

“瞬时转化”指将核酸分子或蛋白质导入细胞中，执行功能而没有外源基因发生稳定遗传。瞬时转化中，外源核酸序列一般不整合进所述基因组中。

本发明所使用的术语“植物”包括整个植物和任何后代、植物的细胞、组织或部分。术语“植物部分”包括植物的任何部分，包括，例如但不限于种子（包括成熟种子、没有种皮的未成熟胚、和不成熟的种子）；植物插条；植物细胞；植物细胞培养物；植物器官（例如花粉、胚、花、果实、芽、叶、根、茎，和相关外植体）。植物组织或植物器官可以是种子、愈伤组织、或者任何其他被组织成结构或功能单元的植物细胞群体。植物细胞或组织培养物能够再生出具有该细胞或组织所来源的植物的生理学和形态学特征的植物，并能够再生出与该植物具有基本上相同基因型的植物。与此相反，一些植物细胞不能够再生产生植物。植物细胞或组织培养物中的可再生细胞可以但不限于胚、原生质体、愈伤 组织、花粉、叶、花药、穗、茎。

植物部分包括可收获的部分和可用于繁殖后代植物的部分。可用于繁殖的植物部分包括，例如但不限于果实、插条、种子、块茎、砧木。植物的可收获部分可以是植物的任何有用部分，包括，例如但不限于花粉、苗、块茎、叶。

术语“原生质体”是指细胞壁被部分或完全去除，且细胞膜裸露的植物细胞。一般地，原生质体是没有细胞壁的分离的植物细胞，其具有再生成细胞培养物或整株植物的潜力。

“植物后代”包括植物的任何后续世代。

“性状”指植物或细胞的生理的、形态的、生化的或物理的特征。在一些实施方法中，这些特征肉眼可见，例如并不限于果实大小、植株高矮、种子长宽；另一些实施方法中，可用生物化学技术测定的指标，例如并不限于种子或叶片中蛋白、淀粉或油类的含量；在一些实施方法中，可通过观察的代谢或生理过程，例如并不限于测定对水分胁迫、特定盐或糖的抗性；另一些实施方法中，是可检测的基因表达水平。

“农艺性状”是可测量的指标参数，包括但不限于：叶片绿色、籽粒产量、籽粒品质、生长速率、总生物量或积累速率、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、植物氮含量、植物游离氨基酸含量、植物蛋白含量、抗旱性、耐热性、氮的吸收、根的倒伏、收获指数、茎的倒伏、株高、穗高、穗长、抗病性、抗寒性、抗盐性和分蘖数。

实施例1 在植物细胞中评估将具有二聚化活性的CC结构域与dCas9-TV融合获得的人工转录激活子dCas9-CCTV是否发生蛋白二聚化

为数众多的天然转录因子以二聚化形式发挥功能。在本实施例中，首先将来自酵母转录激活子GCN4的螺旋卷曲CC结构域，引入本团队已公开发表的强激活子dCas9-TV（Li，Z. et al. A potent Cas9-derived gene activator for plant and mammalian cells.Nature plants，3，930–936，2017）中，具体试验方法如下：

1、构建dCas9-CCTV瞬时表达载体

HBT-dCas9-TV-FLAG载体（Li，Z. et al. A potent Cas9-derived geneactivator for plant and mammalian cells. Nature plants，3，930–936，2017.）由本实验室构建和保存。通过商业化合成（泓迅生物）两端具有AvrII内切酶酶切位点的来自酵母转录激活子GCN4的螺旋卷曲结构域CC序列，使用前述酶消化并回收片段，进而于已经由前述AvrII内切酶（NEB公司）消化过的HBT-dCas9-CCTV-FLAG载体进行T4连接，产生HBT-dCas9-CCTV-FLAG载体。使用NcoI内切酶（NEB公司）对HBT-dCas9-CCTV-FLAG载体进行单酶切，同时将商业化合成（泓迅生物）的带有相应同源臂序列的2*HA序列与前述经NcoI（NEB公司）单酶切后的载体进行标准重组克隆（诺唯赞生物），从而获得dCas9-CCTV的瞬时表达载体HBT-dCas9-CCTV-HA载体。构建如图1A所示人工转录激活子dCas9-CCTV。

2、原生质体的制备

本发明实施例所使用的拟南芥为野生型Col-0，水稻为野生型中花11。

（1）拟南芥原生质体制备

1）12小时光照/12小时黑暗、24℃、60%湿度，培养4周拟南芥；

2）配制酶解溶液（1.5％纤维素酶R10，0.4％果胶酶R10，0.4M甘露醇，20mM MES(pH5.7)，20mM KCl，10mM CaCl₂和0.1％BSA）并取10mL平铺于植物培养板中；

3）选取20-30片生长健康的拟南芥叶片，用刀片切成0.5-1mm的条带；

4）将条带放入酶解液中，注意用塑料环将其拨散开来，使其四面都充分与酶液接触，黑暗酶解3小时；

5）在酶解进行2小时左右，配置PEG反应液（40％PEG4000(v/v)，0.2M甘露醇和0.1MCaCl₂），并将其放置于摇晃的仪器上慢慢溶解；

6）酶解完后，加入10ML W5溶液（154mM NaCl，125mM CaCl₂，5mM KCl和2mM MES(pH5.7) ），用适当的力度摇晃培养板，使原生质体释放于溶液中。此时可以看到溶液变绿，用75μm的尼龙膜过滤，收集细胞溶液于30mL离心管中；

7）细胞溶液用水平转子以800rpm的转速离心2分钟，之后用真空泵吸去尽可能多的上清液；

8）加入10mL W5溶液重悬细胞，轻轻摇晃使其重悬起来，并将其至于冰上休息0.5小时-1小时；

9）800rpm离心1分钟，将其上清液吸走，加入适量MMg溶液（0.4M甘露醇，15mMMgCl₂和4mM MES(pH5.7)）重悬，在光学显微镜下使用细胞计数板将原生质体浓度调节至2×10⁵个/mL。

（2）水稻原生质体制备

1）12小时光照（32℃）/12小时黑暗（28℃），200μmol·m^-2 ·s^-1光照，70 %湿度，土培或者无菌组培8-10天水稻幼苗 (1-2片叶，植物呈鲜绿状)；

2）配制酶解液（配制方法同拟南芥原生质体）15mL，并用针筒和0.45μm孔径的滤膜过滤，加入至直径10cm的细胞培养皿中；

3）选取约200棵生长健康、颜色嫩绿的水稻苗，用刀片把叶鞘（即芽鞘至第一片叶之间的部分）切成0.5-1mm的茎段；

4）将茎段放入酶解液中，注意用接种环将各个茎段分散，避免粘连，并使其完全浸没于酶解液中，置于50-60rpm转速的水平摇床上，避光酶解3小时；

5）酶解完后，加入10mL W5溶液，用适当的力度摇晃培养皿，使原生质体释放于溶液中，此时可以看到溶液变淡绿，用孔径45μm的尼龙膜过滤酶解产物，收集滤液至圆底离心管中；再向酶解的培养板中加入10mL W5，重复上述操作，以提高产量；

6）在水平离心机中以150g离心5 分钟，然后用真空泵吸去尽可能多的上清液，淡绿色原生质体沉于圆底管底部；

7）缓慢加入10mL W5溶液，轻轻摇晃圆底管以重悬细胞，随后于冰上静置0.5-1小时；

8）冰上静置后，以150g水平离心3分钟，吸去上清，缓慢加入2mL MMg溶液并轻摇圆底管以重悬原生质体，用血球计数板在显微镜下确定细胞浓度，再次加入适量MMg溶液调整细胞浓度至2×10⁶个/mL；

3、原生质体转染及免疫共沉淀(Co-IP)

1) 向15mL圆底管中依次加入1mL前述调整好细胞浓度的拟南芥（水稻）原生质体、100μL质粒[其中,处理组为50μL(100μg) HBT-dCas9-CCTV-FLAG + 50μL(100μg) HBT-dCas9-CCTV-HA；对照组为100μL(100μg) HBT-dCas9-CCTV-FLAG]和1.1mL PEG，反应液轻柔地充分混匀，室温静置反应5分钟（水稻避光反应15分钟），随后加入4.4mL W5溶液，混匀以终止转染。水平离心机1000rpm离心2分钟（水稻200g离心5分钟），吸去上清，加入500μL W5溶液重悬，并转移至10mL WI溶液[0 .5M甘露醇，20mM KCl和4mM MES(pH 5 .7)]中，室温黑暗培养12小时。

2）黑暗条件下培养12小时后，使用水平离心机1050rpm离心2分钟（水稻250g离心5分钟），吸上清，冻于液氮，放于-80℃冰箱备用。

1）配制IP buffer（50 mL） ：

1 M HEPES（pH 7.5）	0.5 mL
		50% 甘油	10 mL
10% Triton X-100	5 mL
		5 M NaCl	1 mL
0.5 M EDTA	100 μL
		ddH<sub>2</sub>O	33.4 mL

2）从-80℃冰箱取出前述样品（处理组和对照组）冰上解冻，-30℃取出IP buffer+蛋白酶抑制剂于冰上解冻， HA珠子（Sigma公司）取出放在4 ℃摇床上摇匀，备用。

3）向前述样品中分别加入200 μL IP buffer（含蛋白酶抑制剂），加一个涡旋一个，30秒/次，所有的样品全部涡旋一次后，不加IP buffer再涡旋一次。

4）取20 μL样品于1.5 mL离心管中，加入6×浓度蛋白质缓冲液（全式金生物）10 μL，涡旋混匀，95℃金属浴5分钟。

5）向剩下的样品中继续加入320 μL IP buffer+蛋白酶抑制剂，加一个涡旋一个，30秒/次，所有的样品全部涡旋一次后，再涡旋3次，使裂解效果更好一些。

6）将上述样品全部转移到1.5 mL的离心管中，4 ℃离心机最大转速离心10-15分钟。

7）洗珠子，每个样品10 μL珠子，用IP buffer洗两次（加入1 mL IP buffer，上下颠倒混匀，8,000 rpm离心15秒，除上清），剩余30-50 μL备用。

8）将6）中离心后的上清全部转移到带有珠子的离心管中，于4℃摇床上孵育20分钟（dCas9-CCTV蛋白不稳定，易降解）。

9）孵育结束后，将样品于13,000 rpm下离心30秒，后将其转移到Co-IP柱子中，且在6,600 rpm下离心30秒，去掉液体。

10）向柱子中加入500 μL IP buffer，6,600 rpm离心30秒，去掉液体，该步骤重复5-7次。

11）向柱子中加入500 μL50 mM Tris-HCl（pH 7.5），4,500 rpm离心30秒，去掉液体。

12）将上述柱子转移到新的离心管中，6,600 rpm空离30-60秒，将柱子下端开口拿黄色盖子盖住。

13）往柱子中加入2×浓度蛋白质缓冲液（全式金生物）50 μL，拿枪头轻轻吹打一下，盖上盖子，95 ℃金属浴10分钟。

14) 打开柱子下塞并转移至新的1.5 mL离心管中，13,000 rpm离心3分钟，收样。

4、免疫印迹（Western blot）

1）将前述变性后的蛋白样品（处理组和对照组）上样至10% SDS-PAGE胶电泳槽中，没有样品的孔用等量的2×浓度蛋白质缓冲液（全式金生物）补齐，100 V恒压电泳2小时30分钟[1x SDS Running Buffer（Glycine 14.4 g/L, Tris base 3.02 g/L, SDS 1 g/L)浸没）]。

2）取一张大小合适的PVDF膜，用甲醇浸泡30秒，然后用纯水洗涤3-5遍，用1×Transfer Buffer（Glycine 14.4 g/L, Tris base 3.02 g/ L）浸泡，将跑胶结束的凝胶取出，去掉浓缩胶，用纯水漂洗2-3次后用1×Transfer Buffer 浸泡。

3）取出分离胶，按照阴极板-海绵-滤纸-分离胶-PVDF膜-滤纸-海绵-阳极板的顺序叠好材料，赶走气泡，350 mA恒流下转膜2.5小时。

4）取出PVDF膜，靠近分离胶的一面朝上，用1×TBST[15 mM NaCl, 25 mM Trisbase, 0.5% Tween-20(v/v), pH 7.4]洗涤一次，然后用 5%脱脂奶粉溶液（1 g脱脂奶粉溶于20 mL 1×TBST缓冲液）于60 rpm的水平摇床室温封闭1小时，弃去溶液。

5）加入含有1μL抗体（α-FLAG/α-HA，Sigma公司）的10 mL 5%脱脂奶粉溶液，4℃水平摇床过夜孵育。

6）用1×TBST缓冲液洗涤4次，每次10分钟，弃去溶液，将ECL显色液按1:1的体积比混匀后加到洗好的膜上，在成像仪中拍照。

如图1中的(B)和(C)所示，在拟南芥和水稻原生质体细胞中通过免疫共沉淀（Co-IP）实验证实，将具有二聚化活性的CC结构域与人工激活子dCas9-TV融合后获得的新型人工激活子dCas9-CCTV不管是在拟南芥细胞还是在水稻细胞中都发生了蛋白质的二聚化（图1B和1C）。

实施例2 在水稻原生质体中评估dCas9-CCTV的激活效果

在水稻原生质体中使用相同的sgRNA，以背靠背的形式对比具有二聚化能力的dCas9-CCTV与原始dCas9-TV的基因激活效果（图2A）。具体试验方法如下：

1、构建sgRNA瞬时表达载体

参照已公开发表的论文中阐述的方法（Li，JF. et al. Multiplex andhomologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nature biotechnology，31，688–69，2013；Li，Z. et al. A potent Cas9-derived gene activator for plant and mammalian cells.Nature plants，3，930–936，2017; Li, Z. et al. Targeted TranscriptionalActivation in Plants Using a Potent Dead Cas9-Derived Synthetic GeneActivator. Current protocols in molecular biology, 127, e89，2019），并基于pUC119-OsU6apro-sgRNA （Li, Z. et al. 2019. Current protocols in molecularbiology, https://doi.org/10.1002/cpmb.89）构建表达载体pUC119-OsGW7-sgRNA和pUC119-OsER1-sgRNA。向导RNA所包含的靶序列信息如表1所示。

表1 向导RNA靶点信息

注：“方向”指的是相对于基因编码序列的方向，“+”表示与基因编码序列同向；“-”表示与基因编码序列反向。

2、构建荧光素酶报告基因OsGW7p-LUC和OsER1p-LUC瞬时表达载体

根据已发表论文描述的方法（Li, Z. et al. Targeted TranscriptionalActivation in Plants Using a Potent Dead Cas9-Derived Synthetic GeneActivator. Current protocols in molecular biology, 127, e89，2019）。首先通过PCR的方式将OsGW7基因启动子（一般认为ATG前-2kb左右可作为启动子序列）从野生型中花11水稻叶片基因组中克隆出来，同时在启动子序列开始和末尾（ATG前，不包含ATG）分别引入BamHI和NcoI内切酶序列；之后，将上述片段经BamHI和NcoI内切酶（NEB公司）双酶切之后，由T4连接酶连接进已使用上述双内切酶消化过的LUC载体，从而克隆出具有OsGW7启动子序列的OsGW7p-LUC报告基因。OsER1p-LUC报告基因的构建方法与OsGW7p-LUC报告基因相同。

3、水稻原生质体的制备与转染

水稻原生质体制备的方法如前所述。转染方法简单描述如下：在2mL圆底离心管中，加入200μL水稻生质体与8μL(16μg) dCas9-CCTV(TV)表达载体或空白载体、8μL (16μg)OsGW7/OsER1-sgRNA表达载体、4μL (8μg) OsGW7p/OsER1p-LUC质粒和1μL (2μg) UBQ10-GUS质粒，再加入220μL PEG反应液，轻柔地充分混匀，室温静置（避光15分钟），随后加入800μL W5溶液，混匀以终止转染。水平离心机离心（200g离心5分钟），吸去上清，加入100μL W5溶液重悬，并转移至1mL WI溶液中，室温黑暗培养12小时。

4、萤光素酶报告基因活性的检测

1）细胞裂解：

转染后的水稻原生质体黑暗培养12小时后，200g水平离心5分钟，吸去上清，加入100μL裂解液[25mM Tris-HCl(pH 7.8)，2mM DTT，2mM trans-1,2-diaminocyclohexane-N’N’N’N’-tetraacetic acid，10％(v/v)glycerol和1％(v/v)Triton X-100]，剧烈震荡使原生质体充分裂解。12000 rpm离心30秒，水稻原生质体可明显看到有白色或淡黄色残渣沉淀在管底。此后裂解液须置于冰上，并尽快进行后续测量步骤。

2）GUS检测：

把黑底酶标板置于冰上，向各孔中分别加入10μL裂解上清；用排枪向同一个重复的样品中同时加入50μL MUG工作液[10mM Tris-HCl(pH 8 .0)，1mM 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide(MUG)，2mM MgCl₂]，轻微吹打数下混匀，注意避免气泡产生；37 ℃避光反应30 分钟；反应结束后把酶标板置于冰水浴中5分钟以终止反应；用Varioskan LUX microplate reader酶标仪“GUS程序”读数（程序设置：选择读取荧光——激发波长365 nm、发射波长455 nm——设置读取区域）。

3）LUC检测：

GUS反应开始后即可进行LUC检测；于白底酶标板各孔中分别加入10 μL裂解液；用普通枪（或冲锋枪）按机器读数顺序先后或用排枪同时，向各孔中分别加入100μL LUC工作液；迅速进入酶标仪读数，选取“LUC程序”（化学发光——设置读取间隔为1000 ms——设置读数顺序与加样顺序一致——设置每孔读书次数为10次——设置读取区域）；注意LUC反应开始时速率能保持数分钟的稳定，随后逐渐衰减，故加入底物后应尽快测量。

4）计算：

数据导出至Excel表后，应首先扣除空白组的背景值，再计算各样品的LUC/GUS比值，接着将对照组（即仅含promoter-LUC和UBQ10pro-GUS的组）的LUC/GUS 值换算成1，再以此为标准计算各样品的Relative LUC activity，该值即为Promoter activity；根据Promoter activity作柱状图，并添加Error bar。

由图2中的(B)和(C)可看出，不管是对于荧光素酶报告基因OsGW7p-LUC (B)或是OsER1p-LUC (C)的基因激活实验，都显示出，当使用相同sgRNA时，人工转录激活子dCas9-CCTV具有比原始dCas9-TV更强劲的基因激活能力（统计分析显示具有显著性差异），平均激活能力前者是后者的1.7倍左右。具体地，相对于仅转染报告基因OsGW7p-LUC的对照组而言，dCas9-CCTV结合OsGW7-sgRNA激活报告基因7376.9倍，而dCas9-TV结合OsGW7-sgRNA仅激活3546.9倍，前者约为后者的2倍（图2B）。对于报告基因OsER1p-LUC，dCas9-CCTV结合OsER1-sgRNA激活报告基因919.3倍，而dCas9-TV仅973.2倍，前者约为后者的1.4倍（图2C）。可见，具有蛋白二聚化功能的dCas9-CCTV具有比原始的dCas9-TV更加强力的基因激活效果。

因此，引入二聚化结构域并已证实具有二聚化活性的dCas9-CCTV增强了dCas9-TV基因激活系统。而dCas9-TV基因激活系统属于Cas9及其衍生蛋白介导的基因操纵系统，从而证实了，将具有二聚化功能的多肽与Cas9或其衍生蛋白融合，使该融合蛋白发生二聚化，最终加强了Cas9及其衍生蛋白介导的基因操纵系统。

实施例3 在转基因水稻中评估dCas9-CCTV基因激活系统激活多个基因的效果

将dCas9-CCTV与两个sgRNA，OsGW7-sgRNA和OsER1-sgRNA构建双元载体（dCas9-CCTV-PTGs-OsGW7-OsER1），其中dCas9-CCTV使用AtUBQ10启动子，两个sgRNA通过ZmUBi-1启动子驱动的tRNA加工系统表达，并进行水稻转基因，然后对1月大的转基因水稻叶片进行RNA提取和RT-qPCR实验，具体试验方法如下：

1、构建dCas9-CCTV基因激活系统共同靶向OsGW7和OsER1的稳定转化载体并获得基因激活稳定转化水稻植株

将商业化合成（泓迅生物）的dCas9-CCTV的表达框AtUBQ10pro-dCas9-CCTV-NOSterm与商业化合成（泓迅生物）的sgRNA表达框ZmUbi-1pro-PTGs-OsGW7-OsER1-HSP term通过酶切连接的方式克隆进双元载体pCAMBIA1300（原核卡那霉素抗性，真核潮霉素抗性），最终构建得到转化载体pCAMBIA1300-dCas9-CCTV-PTGs-OsGW7-OsER1。

将上述载体利用冻融转化法转入农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）株系EHA105感受态细胞，后续委托武汉伯远生物科技有限公司进行水稻的遗传转化工作，供体水稻采用粳稻中花11，得到转基因水稻。

2、转基因水稻叶片总RNA提取

使用TAKARA公司的RNAiso Plus产品，方法如下：

1）剪取15-30 mg约1个月大的水稻叶片放入装有研磨珠的2 mL研磨管中，迅速放入液氮；将上述样品放入研磨机中研磨，时刻注意补充液氮以避免样品降解；

2）研磨充分后迅速加入1 mL RNAiso Plus液体，充分涡旋混匀，室温静置5分钟；

3）4 ℃，12000g离心5分钟；

4）上清迅速转移至RNase-free的1.5 mL离心管中，加入200 μL氯仿，盖紧管盖并上下剧烈震荡15秒，可明显看到溶液乳化，室温静置5分钟；

5）4 ℃，12000g离心15分钟，液体分为三层，最上层无色上清为RNA。

6）将上清（450 μL）转移至新的1.5 mL RNase-free的离心管中，注意枪头不要触碰白色中间层；

7）迅速加入500 μL异丙醇，上下颠倒，充分混匀，室温静置10分钟；

8）4 ℃，12000g离心10分钟，一般可在底部看到白色RNA沉淀；

9）倒掉上清，加入使用DEPC水配制的75 %乙醇1 mL，轻柔颠倒混匀；

10）4 ℃，7500g离心5分钟；

11）重复第9），10）步洗涤操作一次，倒掉上清，注意尽量倒干净以免酒精残留过多；必要时可用枪吸干，不能触碰白色RNA沉淀；

12）将上述管子室温晾干或于超净台中吹干，经验表明在沉淀刚刚由白色变为透明状态时加水溶解效果最好，一般依沉淀量加入15-30 μL DEPC水，注意不要离心或加热干燥，可能造成RNA难以完全溶解；

13）将上述RNA水溶液在60 ℃金属浴中加热5分钟，以促进RNA充分溶解；

14）最后将RNA样品于-80 ℃保存。

3、RNA反转录

使用TAKARA公司的PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser进行反转录：

1）去除基因组DNA：

Total RNA	1 μg
		gDNA Eraser	1 μL
5×gDNA Eraser Buffer	2 μL
		RNase-Free dH<sub>2</sub>O	补至10 μL

瞬时离心，于42 ℃反应2分钟后迅速放于冰上；

2）RT-PCR：

第一步反应产物	10 μL
		PrimeScript RT Enzyme Mix I	1 μL
RT Primer Mix	1 μL
		5×Prime Script Buffer 2 (for Real Time)	4 μL
RNase-free dH<sub>2</sub>O	4 μL
		Total	20 μL

注意：此步最好以配置成Mix的形式分装，若单独反应则需先加水和5× Buffer，混匀使gDNA Eraser活性充分受到抑制后再加入其他组分。

37 ℃，15 min；

85 ℃，5 sec；

4℃，保存。

以上步骤如无特殊说明应全程4 ℃进行；

合成的cDNA若需长期保存，应保存于至少-20 ℃。

4、实时定量PCR

使用TAKARA公司的TB GreenTM RT Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)在LightCyceler 96 System (Roche Diagnostics)机器上进行实时定量PCR：

1）所使用引物序列：

靶标基因：

OsGW7-qPCR-F CATCGACACCAAGTCACAAGGG；

OsGW7-qPCR-R TGACGTGTCGAGGACAGAGATG；

OsER1-qPCR-F CTGTAGCCCACGGATAATACAC；

OsER1-qPCR-R GCCATAGCTGTAGACATCAGAC。

内参基因：

OsACT1-qPCR-F CCACTATGTTCCCTGGCATT；

OsACT1-qPCR-R GTACTCAGCCTTGGCAATCC。

2）稀释引物及模板：

配置Primer Mix（4 μM，50 μL）：

qPrimer-F (100 μM)	2 μL
		qPrimer-R (100 μM)	2 μL
ddH<sub>2</sub>O	46 μL

模板通常将前述反转录产物稀释8倍来使用（20μL cDNA + 80μL ddH₂O）。

3）qPCR：

cDNA（已稀释）	3 μL
		Primer Mix (4 μM)	1 μL
2× TB Green Premix Ex Taq	7 μL
		ddH<sub>2</sub>O	4 μL
Total	15 μL

通常将除cDNA以外的其它组分混成SYBR Mix，然后分装12 μL/孔，最后加cDNA模板，低速离心2分钟，上机测试（注意：2×TB Green Premix Ex Taq应避光吸样，同时避免反复冻融，配置SYBR Mix应分引物配置，至少包含内参与目的基因两种Mix，全程操作保持低温）。

LightCyceler 96 System (Roche Diagnostics)机器的qPCR程序：

本实验室通常采用3步法；

变性：95 ℃，30 sec[Ramp rate（升温速率）：4.4 ℃/ sec]，1 cycle。

PCR：

分析模式：定量分析；

95 ℃，30 sec（Ramp rate: 4.4 ℃/ sec）；

55 ℃，30 sec（Ramp rate: 2.2 ℃/ sec，Acqusition Mode: Single）；

72 ℃，30 sec（Ramp rate: 2.2 ℃/ sec）。

融解：

分析模式：融解曲线；

95 ℃，5 sec（Ramp rate: 4.4 ℃/ sec）；

60 ℃，1 min（Ramp rate: 2.2 ℃/ sec）；

95℃ 1 sec（Ramp rate:0.11 ℃/ sec, Acqusition Mode: Continuous,Acqusitions: 5 per℃）,1cycle。

降温：

50 ℃，30 sec（Ramp rate: 2.2 ℃/ sec）,1 cycle。

4）分析数据

使用LightCycler® 96 SW 1.1获取数据，通过融解曲线来判断引物是否特异以及数据是否可信，并在EXCEL表上根据2^(-ΔCt) 和2^(-ΔΔCt) 计算目的基因的绝对表达量和相对表达量。

本实验一共获得了3个高效基因共激活的转基因水稻株系，由图3的转基因水稻数据也可得知，基于dCas9-CCTV的基因激活系统在转基因植株中有着良好的多基因激活能力。其中对内源OsGW7相比于野生型水稻的激活倍数从174倍到339倍不等，对内源OsER1的激活从4760倍到12056倍不等。其中#7号株系对内源OsGW7的激活达到339倍，相对于自身内参基因OsACTIN1的0.91倍表达量；对内源OsER1的激活达到12056倍，相对于自身内参基因OsACTIN1的5.71倍表达量。OsGW7和OsER1基因与水稻的重要农艺性状，籽粒发育和叶片气孔发育以及耐热性有关，因此，本实施例展示了dCas9-CCTV基因激活系统在水稻转基因植株中的高效多基因激活能力，在未来的农作物遗传改造方面有着广阔的应用。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.一种用于增强Cas9衍生的人工转录因子激活效率的方法，其特征在于，通过接头将具有二聚化功能的多肽与Cas9衍生的人工转录激活子dCas9-TV融合，得到dCas9-CCTV，其中CC为具有二聚化功能的多肽，所述多肽来自于酵母转录激活子GCN4的螺旋卷曲结构域；所述Cas9选自SpCas9、SaCas9、ScCas9，所述多肽CC插入到dCas9和转录激活结构域TV之间。

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