CN114214342B - NtFBA1基因在调控烟草PVY抗性方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种NtFBA1基因在调控烟草PVY抗性方面的应用，所述NtFBA1基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。通过对烟草中NtFBA1基因进行干扰会使得PVY积累减少，抗病性增强，NtFBA1可以负调控烟草PVY抗病性。本发明在筛选抗PVY病毒基因的育种中具有十分重要的应用价值。

Description

NtFBA1基因在调控烟草PVY抗性方面的应用
技术领域
本发明涉及一种NtFBA1基因在调控烟草PVY抗性方面的应用，属于烟草PVY抗性调控技术领域。
背景技术
马铃薯Y病毒(Potato virusY，即PVY)是世界范围内能够侵染茄科等34个属170多种植物并造成严重经济危害的植物病毒。近年来，随着田间PVY病毒重组变异和复合侵染的逐年加剧，现有基因资源难以满足抗病育种的挑战。因此筛选和鉴定新的抗PVY病毒基因并进行育种利用，是非常紧迫的工作。
果糖-1，6-二磷酸醛缩酶(Fructose 1,6bisphosphate aldolase，FBA)是糖酵解和糖异生途径中的一个关键酶，在高等植物中还参与卡尔文循环，在胞质中参与蔗糖的合成，而在叶绿体中则参与淀粉的合成，为生物体物质合成代谢提供能量ATP和底物。果糖-1，6-二磷酸醛缩酶糖酵解过程中的产物可用于脂类的合成和蛋白质代谢中，对于生物体的正常新陈代谢至关重要。
除参与碳代谢之外果糖-1，6-二磷酸醛缩酶在一些非生物胁迫响应方面也发挥相应功能，当植物感受到生物或非生物胁迫时，糖可以作为植物的重要信号物质响应激素和外界环境胁迫。果糖-1，6-二磷酸醛缩酶参与了重要的糖信号分子的合成。研究发现植物果糖-1，6-二磷酸醛缩酶能够影响光合作用的效率进而决定植物体的生物量产出，对提高作物的产量具有决定性的作用。果糖-1，6-二磷酸醛缩酶基因FBA能参与低温、高温、盐胁迫、干旱、强光等多种胁迫响应。近年来的研究结果还表明FBA基因还参与植物抗病过程，因此，研究FBA类基因对植物PVY的致病机理，具有重要意义。
发明内容
基于上述，本发明提供一种NtFBA1基因在调控烟草PVY抗性方面的应用，以提高烟草对PVY的抗性，降低PVY病毒给烟草生产带来的经济损失。
本发明的技术方案是：NtFBA1基因在调控烟草PVY抗性方面的应用，所述NtFBA1基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
可选的，降低所述NtFBA1基因在烟草中的表达量或活性。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种NtFBA1基因在调控烟草PVY抗性方面的应用，通过对烟草中NtFBA1基因进行干扰会使得PVY积累减少，抗病性增强，NtFBA1可以负调控烟草PVY抗病性。本发明在筛选抗PVY病毒基因的育种中具有十分重要的应用价值。
附图说明
图1为NtFBA1基因克隆测序结果；
图2为pET32a-NtFBA1构建示意图；
图3为pET32a-NtFBA1转化DH5α鉴定，图中，M:2000Marker，-:ddH2O对照，+:阳性质粒对照，1:pET32a-NtFBA1转化DH5αPCR鉴定；
图4为pET32a-NtFBA1转化BL21的鉴定，图中，M:2000Marker，-:ddH2O对照，+:阳性质粒对照，1-5:pET32a-NtFBA1转化BL21转化子；
图5为pBI121-NtTCTP-FLAG载体构建，图中，M:2000Marker，-:ddH2O对照，+:阳性质粒对照，1-5:pBI121-NtFBA1-FLAG转化DH5αPCR鉴定；
图6为图5pBI121-NtFBA1转化农杆菌LBA4404鉴定，图中，M:2000Marker，-:ddH2O对照，+:阳性质粒对照，1-2:pBI121-NtFBA1转化LBA4404PCR；
图7为pBI121-NtFBA1-FLAG转化农杆菌LBA4404的鉴定，图中，M:2000Marker，-:ddH2O对照，+:阳性质粒对照，1-5:pBI121-NtFBA1转化LBA4404 PCR检测；
图8为NtFBA1 RNAi载体构建，图中，
M1:2000Marker；M2:2000plus Marker；-:ddH2O对照+:阳性质粒对照
1:NtFBA1(RNAi-S)片段克隆2:NtFBA1(RNAi-AS)片段克隆
3-4:pFGC5941-NtFBA1(RNAi-S)转化transT1 PCR
5:pFAST-BluntSimple-NtFBA1(RNAi-AS)转化
transT16:PFGC5941-NtFBA1(RNAi)转化LBA4404菌液PCR
A:NtFBA1(RNAi-S)片段克隆B:NtFBA1(RNAi-AS)片段克隆
C:pFGC5941-NtFBA1(RNAi-S)转化transT1鉴定
D:pFAST-BluntSimple-NtFBA1(RNAi-AS)转化transT1鉴定
E:pFGC5941-NtFBA1(RNAi)转化LBA4404鉴定
图9为烟草遗传转化及植株再生，图中，A.预培养，B.农杆菌侵染，C.分化继代，D.抗性芽，E.分化继代，F.生根，G.驯化移栽，H.植株移栽，I.现蕾，J.开花；
图10为转NtFBA1基因过表达烟草PCR阳性鉴定；
图11为转NtFBA1基因RNAi烟草PCR阳性鉴定；
图12为转NtFBA1基因过表达烟草PVY发病率鉴定；
图13为转NtFBA1基因RNAi烟草PVY发病率鉴定；
图14为转NtFBA1基因RNAi烟草PVY病毒累积鉴定。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本发明实施例一种NtFBA1基因在调控烟草PVY抗性方面的应用，NtFBA1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。具有应用方式为：通过降低NtFBA1基因在烟草中的表达量或活性，来提高烟草PVY抗病性。
下面设计NtFBA1基因在植株中过量表达和沉默的对比试验来进行说明。
一、原核表达载体构建
1、NtFBA1基因克隆
以烟草cDNA为模板，利用高保真酶及基因特异性引物NtFBA1-A、NtFBA-AS进行扩增，得到目标长度扩增片段；将NtFBA1扩增产物经胶回收纯化与pEASY-Blunt Zero克隆载体连接，进行重组转化子检测，将正确的转化子进行测序，确定基因克隆正确。测序结果见图1。
其中，上述引物如下：
NtFBA1-A：TCCCCGCGGGATGTCTGCCTTTGTTGGAAAATGCT
NtFBA-AS：CGCGGATCCCTAATATTTGTAGCCAGAAACAAAG
上述引物分别如SEQ ID NO:2、3所示。
2、NtFBA1原核表达载体的构建
以目的基因NtFBA1的克隆载体质粒为模板，进行目的基因添加同源臂及酶切位点的PCR扩增，产物纯化；用限制性内切酶Sac I和Hind III酶切pET32a回收载体大片段，利用同源重组的方法进行载体构建(见图2)，连接后转化大肠杆菌感受态，挑取转化子PCR鉴定(见图3)，并将阳性转化子进行测序，序列正确，可用于原核表达实验。
将构建好的pET32a-NtFBA1载体转化BL21(DE3)，转化子用基因特异性引物进行PCR鉴定，分别得到目的大小的扩增条带(见图4)，表明原核表达载体已成功转化入大肠杆菌BL21。
二、植物表达载体的构建
1、基因超量表达载体构建
在NtFBA1-FLAG片段两端通过PCR的方法添加SfiI酶切pBI121载体同源臂，进行产物纯化，使用限制性内切酶SfiI对表达载体进行酶切，回收后与目的片段以同源重组方法相连接。连接后转化大肠杆菌，挑取转化子PCR鉴定，扩增得出目的片段在500bp左右(见图5)，并进行测序，确定载体构建成功。
通过冻融法将pBI121-NtFBA1-FLAG质粒转入农杆菌LBA4404中，挑取转化子活化后以培养的菌液为模板，基因特异性引物进行菌液PCR鉴定，凝胶电泳检测显示重组转化子已成功转入农杆菌中，可以继续进行叶盘侵染(见图6)。
以目的基因连接克隆载体质粒为模板，首先以pBI121-FBA1-S、FBA1-flag-AS、pBI121-HCF164-S、HCF164-flag-AS为引物进行PCR扩增，产物纯化后，再分别以pBI121-HCF164-S、pBI121-FBA1-S为上游引物，以FBA1-flag-AS为下游引物，用限制性内切酶SfiI对表达载体进行酶切，回收后与目的片段以同源重组方法相连接；连接后转化大肠杆菌感受态，挑取转化子进行PCR鉴定，经鉴定得出目的片段均在1000bp左右，与预期相符，并将阳性转化子进行测序，确定载体构建成功。
通过冻融法将构建好的质粒转入农杆菌LBA4404中，挑取转化子活化后以培养的菌液为模板，基因特异性引物进行菌液PCR鉴定，凝胶电泳检测显示重组转化子已成功转入农杆菌中(见图7)，可以继续进行叶盘侵染。
2、RNAi载体构建
由于RNAi载体所具有的较长发卡结构，无法测序，先使用一步克隆的方法将SenseArm连接到PFGC5941载体的Intron前端，经测序后，使用酶切连接的方式将AntisenseArm连入Intron的后端。
通过将NtFBA1进行序列比对分析，选择目的基因CDS区450bp左右具有高度序列特异性的基因片段作为靶序列，扩增得到500bp左右的PCR产物，符合预期。使用限制性内切酶Asci I对PFGC5941进行切割，得到线性化载体；将p5941-NtFBA1(RNAi-S)的PCR产物经过胶回收纯化，通过一步克隆的方式与线性化载体PFGC5941(AsciI)连接，进行重组转化子检测，并进行测序，均无突变，确定sense序列载体构建正确。
将NtFBA1(RNAi-AS)的PCR产物经过胶回收纯化，与pFAST-Blunt Simple克隆载体连接，进行重组转化子检测，并进行测序，均无突变，确定Antisense序列载体构建正确。
使用限制性内切酶BamH I和Xba I对得到的构建到pFGC5941载体上的sense片段进行酶切，与克隆载体上的antisense片段进行连接转化，酶切鉴定构建结果正确，并已成功转化农杆菌LBA4404，将转化子活化后进行PCR鉴定，凝胶电泳检测显示重组转化子已成功转入农杆菌中，可以继续进行烟草叶盘侵染(见图8)。
三、目的基因对烟草的遗传转化
1、转基因株系构建
利用农杆菌介导的遗传转化将构建好的植物表达载体侵染烟草叶盘，通过筛选获得大量抗性芽，抗性芽长到3cm至4cm左右，移入到生根培养基中培养获得抗性苗(见图9)；利用35s启动子序列设计检测引物对抗性苗进行PCR检测，目前获得转NtFBA1基因三次PCR重复阳性苗15株。
2、NtFBA1过表达和RNAi转基因植株的确认
转基因过表达植株共有11株，分别提取DNA后，以NPTII通用引物进行检测，预期PCR产物目标大小为500bp左右。PCR产物经电泳检测显示：11株烟株中有10株阳性，1株阴性(图10)。
转基因RNAi植株共有6株，分别提取DNA后，以单侧臂序列设计引物进行检测，预期PCR产物目标大小为300bp左右。CR产物经电泳检测显示：6株烟株中有5株阳性，1株阴性(图11)。
3、病毒接种后抗病鉴定
首先接种转基因过表达植株。接种后检测发现，过表达与野生型对PVY的抗性无论是发病时间还是发病率均没有实质性差别(图12)。
对RNAi转基因植株接种结果显示，当FBA1基因沉默后，植株对PVY产生一定比例的抗性，特别是接种后的15天之内，与对照相比，发病率减少2/3，但是随着时间推移，最终发病率又与野生型对照持平。在病毒积累方面，RNAi植株病毒积累减少1/3(图13和图14)。
根据上述NtFBA1基因在植株中过量表达和沉默的对比试验，可知NtFBA1基因干扰后烟草PVY积累减少，抗病性增强，NtFBA1可以负调控烟草PVY抗病性。
SEQUENCE LISTING
序列表
<110> 贵州省烟草科学研究院
<120> NtFBA1基因在调控烟草PVY抗性方面的应用
<160> 3
<210> 1
<211> 1074
<212> DNA
<213> NtFBA1基因
<400>1
ATGTCTGCCT TTGTTGGAAA ATATGCTGAG GAACTTATCA AGAACGCCAA GTACATAGCA 60
ACACCAGGGA AGGGTATTTT AGCAGCTGAT GAAAGTACCG GCACTATTGG AAAGCGTTTA 120
GCTAGCATTA AAGTTGAGAA CATTGAGTCC AATCGTCAAG CTCTTCGTGA ACTCCTTTTC 180
ACTTCTCCAA ATGCTCTCAC TCACCTCTCT GGTGTCATCC TCTTTGAGGA AACCCTTTAC 240
CAAAAAACTT GTGATGGGAA GCCTTTTGTC GAAGTTCTCC AAGAAAATAA TGTTGTTCCT 300
GGCATAAAGG TTGACAAGGG CACAGTGGAA TTAGCAGGAA CCAATGGTGA GACTACAACT 360
CAAGGTTTTG ACTCTTTGGG CGCACGTTGC GCGCAGTACT ACAAAGCAGG TGCTCGATTT 420
GCCAAGTGGA GAGCTGTGCT GAAAATTGGA CCCACCGAGC CTTCTGAGTT GTCCATCCAG 480
CAGAATGCTC AGGGACTAGC TCGTTATGCT ATCATTTGCC AAGAGAATGG ACTTGTGCCA 540
ATTGTTGAGC CAGAGATACT CACTGATGGA AACCATGACA TCAAGAAATG TGCTGCTGCT 600
ACTGAAACTG TTCTTGCAGC TGTTTACAAG GCTCTCAATG ACCACCATGT TCTTCTTGAA 660
GGAACTCTCT TAAAGCCCAA CATGGTCACC CCTGGCTCTG ATAGCCCAAA GGTTGCAGCA 720
GAGGTAATAG CAGAATACAC AGTTACAGCG CTGTGCCGGA CCGTGCCACC AGCAGTGCCA 780
GGGATAGTGT TCTTGTCAGG AGGACAGAGT GAGGAAGATG CAACAGTGAA TCTAAATGCA 840
ATGAACAAAT TGGAAGTGCT GAAGCCCTGG ACACTGTCAT TTTCCTTTGG TCGAGCTCTG 900
CAGCAAAGTA CACTTAAGAC TTGGGCTGGA AAACAGGAAA ATGTTGCCAA AGCGCAAGAG 960
GCATTTTTGG CAAGGTGCAA GGCCAATTCA GATGCCACTC TTGGAAAGTA CACTGGTGGA 1020
AGTGCCACTG GAGCTGCTTC TGAGAGTCTC TTTGTTTCTG GCTACAAATA TTAG 1074
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>2
TCCCCGCGGG ATGTCTGCCT TTGTTGGAAA ATGCT 35
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>3
CGCGGATCCC TAATATTTGT AGCCAGAAAC AAAG 34

Claims (2)

1.NtFBA1基因在负调控烟草对PVY抗性中的应用，所述NtFBA1基因的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的NtFBA1基因在负调控烟草对PVY抗性中的应用，其特征在于，降低所述NtFBA1基因在烟草中的表达量或活性。
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"PREDICTED: Nicotiana tabacum fructose-bisphosphate aldolase, cytoplasmic isozyme 1 -like (LOC107784214), mRNA"，Accession Number：XM_016605298.1;genbank;《GenBank》;第1-2页 *
"烟草NtWRKY40在植物应答病毒侵染过程中的作用";刘晶晶 等;《生物技术通报》;第32卷(第10期);第188-198页 *
"马铃薯Y病毒属病毒编码蛋白与寄主植物叶绿体蛋白互作研究进展";燕照玲 等;《河南农业科学》;第46卷(第11期);第1-5和18页 *

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