CN105586346B - 一种烟草基因NtTCTP及其用途 - Google Patents

一种烟草基因NtTCTP及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种烟草基因NtTCTP，其特征在于：具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；其编码的蛋白质，具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，该基因用于调节烟草对PVY的抗性。

Description

一种烟草基因NtTCTP及其用途
技术领域
本发明涉及一种烟草基因NtTCTP及其用途，属于植物基因工程领域。
背景技术
翻 译 控 制 肿 瘤 蛋 白（Translationally controlled tumor protein，TCTP），也称 p21 或 p23，是真核生物中遍在表达和分布的一种蛋白。其最早发现于哺乳动物肿瘤细胞中，并在转录后水平受到调控。
多种生物中的大量研究发现 TCTP 参与多种细胞学过程，如促进组胺释放，细胞凋亡，微管组装、离子平衡等，并与一系列蛋白，如 polo 激酶、tubulin、actin 和钠钾 ATP酶等有相互作用。动物中 TCTP 参与细胞生长分化，恶性转化，抗逆以及细胞凋亡等。敲除TCTP基因后的老鼠，由于缺少细胞分化和过度细胞凋亡，导致老鼠出现胚胎致死现象。果蝇中，某一特异器官中TCTP表达被中断后，该器官细胞数目下降和细胞生长出现缺陷最终导致该器官变小。植物中TCTP mRNA 表达与有丝分裂密切相关，黑暗可以诱导牵牛中TCTPmRNA 积累。另外，TCTP 蛋白在调节韧皮部蛋白的长距离运输和花粉管生长的过程中发挥着重要作用。最近研究发现，拟南芥中，TCTP 作为有丝分裂生长的正调控因子，能够特异调控细胞周期的时间。TCTP 通过 TOR（Target of rapamycin）生长调控途径调节细胞分化。卷心菜中的研究发现，TCTP 不仅调控生长发育，同时受外界环境诱导。这些已有研究表明，TCTP 不仅能够调控有机体生长发育，而且具有植物专属功能，因此，研究该类基因对PVY的抗性研究，具有重要意义。
挖掘植物基因组中抗马铃薯Y病毒（potato virus Y,PVY），是植物抗病毒育种的关键。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种烟草基因NtTCTP以及该基因编码的蛋白质，该基因的活性与烟草抗PVY的抗性密切相关。
本发明的技术方案是：一种烟草基因NtTCTP，具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
一种烟草基因NtTCTP编码的蛋白质，具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
一种烟草基因NtTCTP用于调节烟草对PVY的抗性。
本发明的有益效果：本发明提供一个烟草翻译控制肿瘤蛋白基因，命名为NtTCTP，该基因全长507bp，编码一个含168个氨基酸的蛋白，并研究了该基因在烟草抗PVY过程中的作用。在栽培烟草中沉默该基因，烟草表现出对PVY更强的抗性，可达到免疫水平，在栽培烟草中超量表达该基因，烟草对PVY更敏感。说明该基因在烟草抗PVY过程中具有重要作用，可用于烟草等植物抗PVY育种。
首先克隆得到烟草中翻译控制肿瘤蛋白基因NtTCTP，并构建该基因的RNAi表达载体，通过农杆菌介导对烟草进行遗传转化，结果表明，该基因在烟草中沉默后，提高烟草对PVY的抗性，抗性可提高50%-80%。
附图说明
图1为不同株系中TCTP基因的western 杂交验证；
图2为TCTP超量表达株系O2、O7；TCTP沉默株系Ri16、Ri20和野生烟草WT的叶片性状图。
具体实施方式
一、材料与方法
1.实验材料
1.1栽培烟草品种“山西烟”，本研究室保存，Escherichia coli DH5α、根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens EHA105）、植物表达载体pBin438均为实验室保存。
1.2试剂 LA Taq酶、限制性内切酶购自TaKaRa公司。DNA凝胶纯化回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。T4 DNA连接酶购自NEB公司；pGEM-T vector载体购自Promega生物技术有限公司。ABI PRISMTM Optical 96-Well Reaction Plates, OpticalCaps购自ABI公司； DNA合成及测序由华大基因科技服务有限公司完成。
2.实验方法
2.1引物设计
根据登录到Genbank数据库中的糖基转移酶4的全长序列设计扩增全长基因的引物，并添加酶切位点Sal Ⅰ和BamH Ⅰ
NTGT4-QC-F1 5’-CGCGGATCCCGTTGCTCTACTTTCCACCTAT-3’
NTGT4-QC-R1 5’-ACGCGTCGACATCCAAGGCAAATGTGTAAGATA -3’
2.2 基因全长扩增
在0.2ml离心管中加入下列试剂：
名称 体积
烟草cDNA（本实验室保存） 1μl
F primer (10μM) 1μl
R primer (10μM) 1μl
10×PCR buffer (Mg2+) 2.5μl
dNTP Mixture (each 2.5mM) 2μl
HiFi Taq (5U/μl) 0.2μl
ddH2O 17.3μl
Total 25μl
PCR反应程序为：加热盖，95°C预变性5min；然后95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸2min，35个循环；最后72°C再延伸10min。
2.3全长表达载体构建
糖基转移酶4 pBin438植物表达载体，载体及全长扩增PCR产物分别用Sal Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切，酶切体系如下：
名称 体积
无菌水 7μL
10×Buffer 5μL
Sal Ⅰ 4μL
BamH Ⅰ 4μL
PCR回收产物/ pBin438 30μL
Total 50μl
酶切产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，回收PCR酶切产物和载体pBI121/ pBin438的大片段，连接。回收产物按下列比例进行定向连接。连接体系如下：
名称 体积
10×T4 DNA Ligase Buffer 1μL
PCR酶切产物 7μL
pBI121/ pBin438 DNA酶切大片段 1μL
T4 DNA Ligase 1μL
Total 10μL
16℃连接16小时或更长，以增加连接效率。
2.4 重组质粒转化根癌农杆菌
1）取0.5~1.0 μL的DNA，加入到根癌农杆菌感受态细胞中，轻轻混合，冰浴5min，迅速投入液氮中冷冻5min；
2）37℃水浴融化，加入800 μL YEB液体培养基，28℃，100 r/min，振荡培养4h；
3）4 000 r/min，离心5min，倒去大部分上清液，余100 μL左右，悬浮菌体；
4）涂布在含有40 mg/L Rif、50 mg/L Sm和100 mg/L Km的固体YEB培养基上，28℃培养48~96h。
2.5 根癌农杆菌介导的烟草的遗传转化 先将烟草叶盘预培养2-3天，然后用含有植物表达载体的根癌农杆菌EHA105分别进行侵染。共培养3-4天后，将叶盘取出，在含有除菌剂的液体培养基中除菌2-3h，然后再转到筛选培养基进行筛选及分化培养，约3周左右开始分化出抗性芽。待抗性芽长至3-4cm高时，将其从外植体基部切下，接种到生根培养基上进行生根培养。待小植株根系发达后，进行驯化移栽。得到大量移栽成活的抗性植株。将PCR检测呈阳性的植株移栽到大花盆中，直到收获种子。
2.6 根癌农杆菌介导的大豆的遗传转化 大豆品种黑农63种子经水漂洗后，用70%酒精消毒1min，0.1%的升汞消毒7min，无菌水冲洗3~5次，充分浸种至膨胀，接种在发芽培养基上，26±1℃，光照16h/d。取无菌苗剥去种皮，用手术刀将下胚轴截断，保留3mm下胚轴，然后沿两片子叶的纵轴从下胚轴的中间切开，分别切去顶芽及侧芽，在子叶节部位轻微刮伤并沿子叶纵轴划几刀，将子叶节近轴面朝上插入PM培养基中培养1d；将子叶放入菌液中，侵染30min，期间不断轻轻摇动；倒掉菌液，将外植体以近轴面朝下接种在共培养培养基中，暗处共培养4d；除菌：用含有500mg/L头孢噻肟钠的无菌水冲洗三遍，然后转移至筛选培养基上培养；侵染14 d后统计大豆子叶节丛生芽分化率。
2.6 PVY接种，抗病调查。
PVY 接种物制备：将新鲜的病叶加入在打碎机中，加少量磷酸缓冲液打碎，用纱布过滤去病叶残体，取新鲜的汁液制成P VY接种物。
PVY接种：接种时期为烟草4叶期， 在欲接种的烟株上选择 2 ～3片幼嫩叶片用砂纸轻轻摩擦，产生微伤，然后用毛刷蘸取PVY接种物 轻轻刷在摩擦后的叶片上。
2.7.数据调查：选择发病最重的时间，调查 P VY 的发病率和病级。
病级按如下标准调查 ：
0级：全株无病或出现极轻微花叶。
1级：1 /1 0到 1 /3的叶片表现轻微小叶脉坏死 或出现点刻状条斑症状以及轻微变形，整株其他叶片无症状，植株无明显矮化。
2级：1 /3到 1 /2的叶片表现点刻状条斑或脉坏死，病叶大部分小叶脉坏死，造成叶片较大面积的黄化、枯死，植株矮化为正常株高的2 /3以上。
3级：1 /2到 2/3的叶片表现较严重的脉坏死或 2 /3以上的叶片出现点刻状条斑坏死，单叶较大面积的枯死， 少部分叶片脱落。 或整株叶片开始变黄。
4级： 全株叶片表现严重的脉坏死或叶片变形、萎缩，2 /3左右的叶片萎蔫脱落，病株矮化为正常烟株的1 /2至 1 / 3 ，或整株凋萎。
病情指数 DI = [∑( 各级病株株数 ×该病级值) /( 调查总株数×最高级值) ]×100
二、实验结果
TCTP超量表达株系O2、O7；TCTP沉默株系Ri16、Ri20。
1.NtTCTP基因在不同株系中的表达验证
通过Western杂交验证表明，2个沉默载体株系，Ri16和Ri20中TCTP基因都没有表达，说明已经成功沉默，而2个超量表达的株系O2和O7表达量均超过对照（WT）,说明超量表达也是成功的（图1）。
2. NtTCTP基因超量表达和沉默株系抗病性鉴定结果
接种14天后调查病情，2个沉默株系Ri16和Ri20均表现免疫，未发病，抗病性有很大提高，而超量表达的株系O2和O7均表现出比对照更严重的坏死症状，病情更为严重（图2）。
以上结果表明，在烟草中沉默tctp基因能够提高植物对PVY的抗病性，该基因具有重要的应用价值。
3.结论
烟草翻译控制肿瘤蛋白基因(NtTCTP)能够明显提高烟草对PVY的抗性，具有较强的应用前景。
4.附录
烟草烟草翻译控制肿瘤蛋白基因的核酸序列及其编码的氨基酸序列。
序列表
SEQ ID NO:1 核酸序列
ATGTT GGTTT ATCAG GATCT TCTCT CCGGT GATGA GCTCC TTTCG GATTC ATTTT 55
CCTAC ACTGA ACTTG AGAAT GGAGT GCTTT GGGAA GTGCA AGGGA AGTGG GTTGT 110
TCAGG GAGCT GTTGA TGTGA ACATC GGGGC GAATC CATCT GCTGA AGGTG CAGAT 165
GAAGA CGAAG GTGTT GACGA TCAAG CCATC AAGGT TGTCG ATATT GTTGA CACTT 220
TCAGG CTTCA GGAGC AACCT TCTTT TGACA AGAAG CAGTT TGTTG CCTAC ATGAA 275
GAAAT ATATC AAGAA CCTAA CACCC AAGTT AGGCG CAGAG CAGGA AGAAG TTTTT 330
AAGAA CAACA TTCAA GGAGC AACCA AGTAC CTTTT GTCAA AGCTC AGTGA CCTTC 385
AATTC TTTGT TGGTG AGAGC ATGGC TGATG ATACT GGAAT GGTGT TTGCC TACTA 440
CAAGG ATGGC GCCAC TGATC CTACC TTTTT GTACC TCGCA CATGG ACTCA AGGAG 495
GTCAA GTGTT AA 507
SEQ ID NO:2 氨基酸序列
MLVYQDLLSGDELLSDSFSYTELENGVLWEVQGKWVVQGAVDVNIGANPSAEGADEDEGVDDQAIKVVDIVDTFRLQEQPSFDKKQFVAYMKKYIKNLTPKLGAEQEEVFKNNIQGATKYLLSKLSDLQFFVGESMADDTGMVFAYYKDGATDPTFLYLAHGLKEVKC
<110> 贵州省烟草科学研究院
<120>一种烟草基因NtTCTP及其用途
<160>2
<210> 1
<211>507
<212> DNA
<213>NtTCTP
<400> 1
ATGTT GGTTT ATCAG GATCT TCTCT CCGGT GATGA GCTCC TTTCG GATTC ATTTT 55
CCTAC ACTGA ACTTG AGAAT GGAGT GCTTT GGGAA GTGCA AGGGA AGTGG GTTGT 110
TCAGG GAGCT GTTGA TGTGA ACATC GGGGC GAATC CATCT GCTGA AGGTG CAGAT 165
GAAGA CGAAG GTGTT GACGA TCAAG CCATC AAGGT TGTCG ATATT GTTGA CACTT 220
TCAGG CTTCA GGAGC AACCT TCTTT TGACA AGAAG CAGTT TGTTG CCTAC ATGAA 275
GAAAT ATATC AAGAA CCTAA CACCC AAGTT AGGCG CAGAG CAGGA AGAAG TTTTT 330
AAGAA CAACA TTCAA GGAGC AACCA AGTAC CTTTT GTCAA AGCTC AGTGA CCTTC 385
AATTC TTTGT TGGTG AGAGC ATGGC TGATG ATACT GGAAT GGTGT TTGCC TACTA 440
CAAGG ATGGC GCCAC TGATC CTACC TTTTT GTACC TCGCA CATGG ACTCA AGGAG 495
GTCAA GTGTT AA 507
<210> 2
<211>168
<212> 氨基酸
<213> NtTCTP
<400> 2
MLVYQDLLSGDELLSDSFSYTELENGVLWEVQGKWVVQGAVDVNIGANPSAEGADEDEGVDDQAIKVVDIVDTFRLQEQP
SFDKKQFVAYMKKYIKNLTPKLGAEQEEVFKNNIQGATKYLLSKLSDLQFFVGESMADDTGMVFAYYKDGATDPTFLYLA
HGLKEVKC

Claims (2)

1.一种烟草基因NtTCTP在调节烟草对PVY的抗性中的应用。
2. 根据权利要求1所述烟草基因NtTCTP在调节烟草对PVY的抗性中的应用，其特征在于：由烟草基因NtTCTP编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
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"PREDICTED:Nicotiana tomentosiformis translationally-controlled tumor protein homolog(LOC104095072),mRNA"，Accession Number：XM_009601120.1;GenBank;《GenBank》;20141014;第1页
"Tobacco Translationally Controlled Tumor Protein Interacts with Ethylene Receptor Tobacco Histidine Kinase1 and Enhances Plant Growth through Promotion of Cell Proliferation";Jian-Jun Tao et al.;《Plant Physiology》;20150930;第169卷;第96页摘要和第111页右栏第2段
"烟草PVY隐性抗病基因的分子标记及其适用性";刘勇 等;《中国烟草学报》;20141231;第21卷(第1期);第76-81页
"翻译控制肿瘤蛋白功能的研究进展";颜培娥 等;《Chinese General Practice》;20130228;第16卷(第2B期);第583-586页

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