CN105567727B - 烟草糖基转移酶基因NtGT4在调控植物细胞分化中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种烟草糖基转移酶基因NtGT4在调控植物细胞分化中的应用。本发明发现了烟草糖基转移酶基因NtGT4的新功能，将烟草糖基转移酶基因NtGT4应用于调控植物细胞的分化，能够显著提高植物细胞的分化水平，转化了该基因的大豆与对照相比能够显著提高大豆不定芽的分化，平均分化程度可以提高40％。

Description

烟草糖基转移酶基因NtGT4在调控植物细胞分化中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及烟草糖基转移酶基因NtGT4在调控植物细胞分化中的应用。

背景技术

细胞分化是植物生长过程中重要的生理过程，对植物细胞分化的机理进行研究有助于了解生命科学的本质，在植物的遗传转化中，可以通过对分化相关基因的调控，控制细胞分化的速度和分化的方向。目前已知的参与植物细胞分化的主要因素有植物细胞的极性、核质关系、激素等。目前已知有多种基因参与了植物细胞分化过程。

糖基转移酶是在生物体内将催化活化的糖连接到不同的受体分子的一类酶，如蛋白、核酸、寡糖、脂和小分子上，糖基化的产物具有很多生物学功能。在已知的与分化相关的基因中，没有糖基转移酶基因参与植物细胞分化相关过程的报道。

烟草糖基转移酶NtGT4，为一种分离自烟草基因组酶，目前还没有对该酶的生物学功能的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供烟草糖基转移酶基因NtGT4的新功能，从而为研究植物细胞分化提供新的途径。

为达到以上目的，本发明提供了烟草糖基转移酶基因NtGT4在调控植物细胞分化中的应用。

其中，所述应用为促进植物不定芽的分化。

其中，所述烟草糖基转移酶基因NtGT4的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

可选的，所述植物是为茄科或豆科植物。

优选的，所述植物是烟草或大豆。

可选的，所述应用包括以下1)-3)中的至少一项：

1)通过PCR扩增获得烟草糖基转移酶基因NtGT4的全长序列；

2)构建烟草糖基转移酶基因NtGT4的表达载体；

3)在植物细胞中表达烟草糖基转移酶基因NtGT4所编码的氨基酸序列。

其中，所述表达载体优选为将NtGT4克隆到pBin438获得的植物表达载体。

其中，可以通过根癌农杆菌转化的方法将NtGT4转化入植物细胞。

可选的，所述PCR扩增所使用的特异性引物为：

正向引物：5’-CGCGGATCCCGTTGCTCTACTTTCCACCTAT-3’；

反向引物：5’-ACGCGTCGACATCCAAGGCAAATGTGTAAGATA-3’。

可选的，所述PCR扩增所使用的反应体系如表1所示：

表1

可选的，所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；然后95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；最后72℃再延伸10min。

本发明发现了烟草糖基转移酶基因NtGT4的新功能，将烟草糖基转移酶基因NtGT4应用于调控植物细胞的分化，能够显著提高植物细胞的分化水平，转化了该基因的大豆与对照相比能够显著提高大豆不定芽的分化，平均分化程度可以提高40％。

附图说明

图1 NtGT4基因PCR产物电泳检测结果，其中M为分子量标准；1和2为NTGT4全长。

图2为烟草“贵烟1号”的植株再生情况。

其中，A为抗性芽分化情况；B为抗性植株生长；C为抗性植株生根情况；D为移栽后的抗性植株；E为植株现蕾情况；F为植株开花情况；G为植株结实情况。

图3为不同株系叶盘平均分化芽数随时间变化表。

图4为转糖基转移酶基因4烟草与对照叶盘分化图。

图5为转基因大豆与对照不定芽分化图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1

一、材料与方法

1.实验材料

1.1栽培烟草品种“贵烟1号”，，Escherichia coli DH5α、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens EHA105)、植物表达载体pBin438均为贵州省烟草科学研究院保存，大豆品种“黑农63”由黑龙江省农科院提供。

1.2试剂LA Taq酶、限制性内切酶购自TaKaRa公司。DNA凝胶纯化回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。T₄DNA连接酶购自NEB公司；pGEM-T vector载体购自Promega生物技术有限公司。ABI PRISMTM Optical 96-Well Reaction Plates,OpticalCaps购自ABI公司；DNA合成及测序由华大基因科技服务有限公司完成。

2.实验方法

2.1引物设计

根据登录到Genbank数据库中的糖基转移酶4的全长序列设计扩增全长基因的正向引物(NTGT4-QC-F1)和反向引物(NTGT4-QC-R1)，并添加酶切位点SalⅠ和BamHⅠ。

NTGT4-QC-F1：5’-CGCGGATCCCGTTGCTCTACTTTCCACCTAT-3’；

NTGT4-QC-R1：5’-ACGCGTCGACATCCAAGGCAAATGTGTAAGATA-3’。

2.2基因全长扩增：在0.2ml离心管中加入下表1中试剂：

表1

PCR反应程序为：加热盖，95℃预变性5min；然后95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；最后72℃再延伸10min。

2.3全长表达载体构建

糖基转移酶4pBin438植物表达载体，载体及全长扩增PCR产物分别用SalⅠ和BamHⅠ双酶切，酶切体系如下表2所示：

表2

酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，回收PCR酶切产物和载体pBI121/pBin438的大片段，连接。回收产物按下列比例进行定向连接。16℃连接16小时或更长，以增加连接效率。连接体系如下表3所示：

表3

2.4重组质粒转化根癌农杆菌

1)取0.5～1.0μL的DNA，加入到根癌农杆菌感受态细胞中，轻轻混合，冰浴5min，迅速投入液氮中冷冻5min；

2)37℃水浴融化，加入800μL YEB液体培养基，28℃，100r/min，振荡培养4h；

3)4000r/min，离心5min，倒去大部分上清液，余100μL左右，悬浮菌体；

4)涂布在含有40mg/L Rif、50mg/L Sm和100mg/L Km的固体YEB培养基上，28℃培养48～96h。

2.5根癌农杆菌介导的烟草的遗传转化：先将烟草叶盘预培养2-3天，然后用含有植物表达载体的根癌农杆菌EHA105分别进行侵染。共培养3-4天后，将叶盘取出，在含有除菌剂的液体培养基中除菌2-3h，然后再转到筛选培养基进行筛选及分化培养，约3周左右开始分化出抗性芽。待抗性芽长至3-4cm高时，将其从外植体基部切下，接种到生根培养基上进行生根培养。待小植株根系发达后，进行驯化移栽。得到大量移栽成活的抗性植株。将PCR检测呈阳性的植株移栽到大花盆中，直到收获种子。

2.6根癌农杆菌介导的大豆的遗传转化：大豆品种黑农63种子经水漂洗后，用70％酒精消毒1min，0.1％的升汞消毒7min，无菌水冲洗3-5次，充分浸种至膨胀，接种在发芽培养基上，26±1℃，光照16h/d。取无菌苗剥去种皮，用手术刀将下胚轴截断，保留3mm下胚轴，然后沿两片子叶的纵轴从下胚轴的中间切开，分别切去顶芽及侧芽，在子叶节部位轻微刮伤并沿子叶纵轴划几刀，将子叶节近轴面朝上插入PM培养基中培养1d；将子叶放入菌液中，侵染30min，期间不断轻轻摇动；倒掉菌液，将外植体以近轴面朝下接种在共培养培养基中，暗处共培养4d；除菌：用含有500mg/L头孢噻肟钠的无菌水冲洗三遍，然后转移至筛选培养基上培养；侵染14d后统计大豆子叶节丛生芽分化率。

二、主要实验结果

2.1全长基因的克隆

以烟草栽培品种“贵烟1号”叶片的cDNA为模版，糖基转移酶4特异性引物为引物，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析后可以看出，其扩增片段的大小约为1.5kb左右，与预期大小一致，凝胶成像系统观察电泳图谱，如图1所示。

2.2植物表达载体的构建

将克隆到的烟草糖基转移酶基因构建到植物表达载体pbin438上，其主要元件如下表4所示：

表4

名称	代号	细菌抗性	植物抗性
				糖基转移酶4全长	4	卡那(Kan)	卡那(Kan)

三、植物表达载体对烟草“贵烟1号”的遗传转化

3.1建立了“贵烟1号”的再生体系和遗传转化体系

将Km浓度设置为0、5、10、15、20、25mg/L 6个梯度，结果见表5卡那霉素浓度梯度试验。

表5

Km浓度(mg/L)	接种外植体数	分化外植体数	平均分化率(％
				0	225	191	84.9
5	225	114	50.9
				10	225	21	9.3
15	225	8	3.6
				20	225	0	0
25	225	0	0

注：本试验为三次重复的结果

从表5中可以看出，Km浓度为20mg/L时烟草叶盘分化率为0，完全抑制了不定芽的分化，但为了提高筛选效果，减少因个体差异而出现的未转化目的基因的抗性植株，故将Km浓度确定为25mg/L。3.2基因对烟草的遗传转化及植株再生

分别将糖基转移酶基因4的植物表达载体遗传转化烟草，重组农杆菌对烟草叶盘侵染、除菌后、筛选后，获得转化植株，其再生过程见图2。

3.4转基因材料分化实验

选取转化糖基转移酶基因4的纯合株系7个(5、6、9、11、12、13、15)，对照株系(转化空载体)1个(31)进行分化实验，用无菌的打孔器打取叶盘后接到芽分化培养基上，各株系叶盘平均分化芽数随时间变化见图3，转基因材料分化能力均优于对照，与对照相比，转基因烟草不定芽的分化时间提高1-2天，分化效率提高2-10倍。在分化第11天时，不同株系叶盘的分化状态见图4.

3.5烟草糖基转移酶基因4对大豆分化的影响

将烟草糖基转移酶基因4和空载体同时转化大豆，经除菌后转移到分化培养基上培养了，14天后调查分分化率，只转化空载体的大豆分化率只有50％，而转化烟草糖基转移酶基因4大豆不定芽分化率达到70％，明显提高了大豆的分化(图5)。

4.结论

烟草糖基转移酶基因4能够明显促进烟草和大豆细胞的分化，具有较强的应用前景。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (3)

1.烟草糖基转移酶基因NtGT4在促进烟草或大豆不定芽的分化中的应用，其特征在于，所述烟草糖基转移酶基因NtGT4的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括以下1)-3)中的至少一项：

1)通过PCR扩增获得烟草糖基转移酶基因NtGT4的全长序列；

2)构建烟草糖基转移酶基因NtGT4的表达载体；

3)在植物细胞中表达烟草糖基转移酶基因NtGT4所编码的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增所使用的特异性引物为：

正向引物：5’-CGCGGATCCCGTTGCTCTACTTTCCACCTAT-3’；

反向引物：5’-ACGCGTCGACATCCAAGGCAAATGTGTAAGATA-3’。