CN115637269A

CN115637269A - 一种多顺反子间隔区元件及其在植物育种中的应用

Info

Publication number: CN115637269A
Application number: CN202211502702.0A
Authority: CN
Inventors: 徐玉泉; 岳群; 柳小庆; 马旭辉; 陈茹梅; 李素贞
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2022-11-29
Filing date: 2022-11-29
Publication date: 2023-01-24

Abstract

本发明公开了一种多顺反子间隔区元件及其在植物育种中的应用。包括IGG2和IGG4。该表达元件可在植物中对多个基因进行串联表达，实现通过一个启动子和一个转录终止子来控制多个基因的协同表达或抑制，从而缩短外源多基因目标DNA片段的长度，减少实验操作步骤，提高工作效率。对于利用植物合成生物学进行活性天然产物的生产与产量的提高、病虫害抗性的提升等方面具有较高的实际应用价值。

Description

一种多顺反子间隔区元件及其在植物育种中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多顺反子间隔区元件及其在植物育种中的应用。

背景技术

随着世界人口快速增长与资源日益消耗，人类需要开发新型高效生物系统，以满足对食品、能源等的需求。合成生物学技术以其“跨物种”转移功能元件以及模块的能力，逐渐成为解决这些问题的主要手段。随着合成生物学技术的不断进步，其底盘细胞也从大肠杆菌、酿酒酵母等简单的单细胞体系向复杂的多细胞体系过度。在已有的植物基因工程和转基因技术的基础，以植物为底盘的植物合成生物学已逐渐成为研究热点。先正达公司将3个外源的类胡萝卜素生物合成基因转入水稻中，获得了含有β-胡萝卜素的“黄金大米”（Beyer, P. (2010). Golden Rice and 'Golden' crops for human nutrition. NewBiotechnol 27, 478-481）。柳小庆等将4个虾青素合成相关基因转入玉米中，获得了含有虾青素的红色转基因玉米（Liu, XQ et al. (2021). Metabolic engineering ofastaxanthin-rich maize and its use in the production of biofortified eggs,Plant Biotechnology Journal, 19(9):1812-1823）。

这些研究通常需要在植物中进行多个基因的协调表达。目前，在植物中，这些基因的表达需要为每一个基因提供单独的启动子和终止子，在可供选择的启动子数量有限的情况下，这些基因的表达常常需要重复使用同样的启动子和终止子，从而致使实验操作繁复、目标DNA片段过长，并极大的增加了转化子内部基因同源重组的概率。为了解决这一问题，科学家试图寻找能够用于构建类似原核生物多顺反子的表达元件来实现一个启动子控制多个基因的表达。目前报道较多的为2A自裂解肽序列和RBS。

2021年，徐玉泉等鉴定了2个可用于构建真菌多顺反子的基因间隔区表达元件（intergenic gap, IGG）（徐玉泉、岳群、张礼文，一种内源搭载的外源基因高效可控表达系统，ZL201911072118.4，授权公告日：2021年11月23日），极大的降低目标DNA片段的长度，减少实验操作步骤，提高工作效率。然而，这些元件在植物中是否也有此功能尚不清楚。若能够在植物中利用该元件构建多顺反子，成功实现多基因的表达，将极大减少实验操作步骤，提高工作效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多顺反子间隔区元件及其在植物育种中的应用。

本发明通过将序列5’-CAATCAAAC-3’（IGG2）或5’-GAGTCAATCAA

ACACTC-3’（IGG4）置于2个基因之间，连接上游基因的终止密码子和下游基因的起始密码子，构建双顺反子，在植物中检测其连接的上下游基因的表达，获得了2个适用于植物的多顺反子间隔区表达元件。

一种多顺反子间隔区元件，包括IGG2，其核苷酸序列为5’-CAATCAAAC-3’； IGG4，其核苷酸序列为5’-GAGTCAATCAAACACTC-3’。

所述多顺反子中开放阅读框的数量为2-6个。

所述多顺反子间隔区元件在植物育种中的应用。

优选的，构建包含植物基因多顺反子的植物表达载体，所述多顺反子开放阅读框序列之间插入多顺反子间隔区元件。

所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选玉米或烟草。

一种多顺反子间隔区元件在异源表达中的应用，所述基因间隔区序列为5’-CAATCAAAC-3’或5’-GAGTCAATCAAACACTC-3’。

所述异源表达在植物中进行。

所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选玉米或烟草。

本发明的有益效果：本发明的多顺反子间隔区元件可用于植物等真核生物基因的异源表达，对于利用植物合成生物学进行活性天然产物的生产与产量的提高、病虫害抗性的提升等方面具有较高的实际应用价值。本发明的多顺反子间隔区元件可对多个基因进行串联表达，实现通过一个启动子和一个转录终止子来控制多个基因的协同表达或抑制，从而缩短外源多基因目标DNA片段的长度，减少实验操作步骤，提高工作效率。

附图说明

图1为不同多顺反子间隔区元件连接的上游基因（Dsred）和下游基因（GFP）在本氏烟草叶片表皮细胞中的表达，Dsred 的C端融合一个内质网滞留信号即KDEL信号序列，在GFP的N端融合一个核定位信号NLS。

图2 为多顺反子间隔区元件在玉米中的应用。A，用于玉米遗传转化的载体pCP-IGG-BZ示意图；2BDEN：一个玉米种子特异表达双向启动子；BKT/CrtZ 和 CrtI/PSY1由IGG2连接形成两个多顺反子，其中，每个基因都有自己独立的起始密码子和终止密码子；通过PCR检测和测序结果证明转基因玉米基因组中整合了上述表达框。B，由pCP-IGG-BZ转化获得的转基因玉米，红色籽粒表示虾青素代谢途径已在玉米籽粒中重构成功。C，在基因组水平检测pCP-IGG-BZ的T-DNA区是否整合到玉米基因组中；在转录水平检测BKT/CrtZ 和CrtI/PSY1是否依然与IGG2连接在一起；在蛋白水平检测PSY1蛋白是否与CrtI成功分离。D，通过HPLC检测转基因玉米中是否合成了虾青素，由峰图可以看出由pCP-IGG-BZ转化获得转基因玉米中虾青素的峰谱和标品以及实验室前期创制的高虾青素玉米的峰谱一致。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

下述实施例中，本式烟草、玉米、根癌农杆菌GV3101和表达载体pCAMBIA1300-nLuc、p2BDEN-mtp，均来源于中国农业科学院生物技术研究所。

酶与试剂盒：高保真DNA扩增MIX、无缝克隆试剂盒购自诺唯赞公司；DNA loadingbuffer和DNA marker购自康为世纪公司；DNA纯化胶回收试剂盒购自Thermo公司；质粒提取试剂盒购自天根公司；内切酶购自NEB公司；无内毒素质粒大量提取试剂盒购自promega公司；RNA 提取试剂盒 TransZol Up Plus RNA Kit购自全式金公司；反转录试剂盒MonScript™ RTIII All-in-One Mix with dsDNase购自莫纳生物公司；大肠杆菌NEB 10-beta感受态购自NEB公司；其它试剂均为国产分析纯产品。

培养基：大肠杆菌培养基为LB培养基（1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl，pH7.0）。根癌农杆菌培养基为YEB培养基（0.5%蔗糖、0.1%酵母提取物、1%蛋白胨、0.05%MgSO₄·7H₂O，pH 7.0）。若制固体培养基，加入2%琼脂粉。

烟草转化液：10 mM MES-KOH（pH 5.6）、200 µM乙酰丁香酮、10 mM MgCl₂。

实施例1多顺反子间隔区元件连接基因在烟草中的瞬时表达

1.实验目的

以Dsred基因为IGG上游基因，以GFP为IGG下游基因，并在Dsred的C端融合一个内质网滞留信号即KDEL信号序列，在GFP的N端融合一个核定位信号NLS，IGG选用序列5’-CAATCAAAC-3’（IGG2）和5’-GAGTCAATCAAACACTC-3’（IGG4），注射烟草后，通过共聚焦显微镜LSM700观察侵染的叶片，确定蛋白的亚细胞定位。

2.实验方法

（1）表达质粒的构建

根据Dsred、GFP、IGG序列5’-CAATCAAAC-3’（IGG2）和5’-GAGTCAATCAAACACTC-3’（IGG4）、KDEL或NLS的序列信息设计引物，并在相应的引物中添加IGG2或IGG4、KDEL或NLS的序列、以及pCAMBIA1300-nLuc的同源序列，通过PCR对Dsred、GFP进行扩增，获得相应片段后，利用多片段无缝克隆将片段连接到经SacI和PstI酶切的pCAMBIA1300-nLuc上，构建pCAMBIA1300-Dsred-KDEL-IGG-NLS-GFP系列质粒，通过PCR筛选阳性克隆。

（2）农杆菌转化

取出保存于-80℃的农杆菌感受态细胞（100 μL每管），置于冰上解冻。加入1 µg质粒，轻轻混匀，置冰上30 min后，液氮中速冻5 min，37℃热激5 min，冰上孵育5 min。加入600 uL YEB液体培养基（不含抗生素），混匀，28℃，220 rpm 振荡4 h。4,000 rpm离心5 min去掉上清后重悬，将菌液涂布于含有100 µg/mL卡那霉素和25 µg/mL利福平的YEB平板上。待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，28℃培养2-3天，挑取转化子，提取质粒，通过PCR筛选阳性转化子。

（3）烟草的瞬时转化

取农杆菌接种至4 mL 100 µg/ml卡那霉素和25 µg/mL利福平的YEB中， 28℃ 220rpm培养过夜，将过夜培养物接种于10 mL 100 µg/mL卡那霉素和25 µg/mL利福平的YEB中，OD₆₀₀为0.15，28℃ 220 rpm培养至OD₆₀₀为0.8-1，3700 rpm 15 min，去掉上清，用烟草转化液重悬至OD₆₀₀为1.5，室温黑暗静置2 h。用注射器针头轻刺烟草叶片，用注射器将农杆菌缓慢注射到叶片中，室温黑暗过夜，温室继续培养2-3天，取叶片镜检。

3.实验结果及分析

使用IGG2或IGG4时，绿色荧光均仅存于细胞核，内质网上则均可观察到红色荧光，说明携带内质网滞留信号的Dsred和携带核定位信号的GFP均进行了表达，并且表达成为了两个独立蛋白（图1）。因此，IGG2或IGG4均可用于植物中多顺反子的构建。

实施例2 多顺反子间隔区元件连接基因在玉米中的应用

1.实验目的

采用双向启动子P_2BDEN，两端分别启动与虾青素合成相关的两个基因，且两个基因用IGG序列进行连接。一端以PaCrtI基因为IGG上游基因，ZmPSY1基因为下游基因。另一端以HpCrtZ为IGG上游基因，CrBKT基因为下游基因，IGG选用序列5’-CAATCAAAC-3’（IGG2），通过农杆菌介导玉米遗传转化。证明该序列可以在单子叶植物玉米中进行应用。

2.实验方法

（1）载体构建

2018年柳小庆等发表文章中的载体p2BDEN-mtp。根据PaCrtI和ZmPSY1序列信息设计引物，并在相应的引物中添加IGG2序列以及p2BDEN-mtp的同源序列，通过PCR对PaCrtI、ZmPSY1进行扩增，获得相应片段后，利用多片段无缝克隆将片段连接到经HindIII和NcoI酶切的p2BDEN-mtp上，构建p2BDEN-CP质粒，通过PCR筛选阳性克隆。根据HpCrtZ和CrBKT序列信息设计引物，并在相应的引物中添加IGG2序列以及p2BDEN-mtp的同源序列，通过PCR对HpCrtZ，CrBKT进行扩增，获得相应片段后，利用多片段无缝克隆将片段连接到经BamHI和PstI酶切的p2BDEN-CP载体上，构建p2BDEN-CP-BZ(CrBKT:IGG2:HpCrtZ:2BDEN:PaCrtI:IGG2:ZmPSY1)质粒，通过PCR筛选阳性克隆。

（2）农杆菌转化：方法同实例1。

（3）农杆菌介导的玉米遗传转化

1）取授粉后10-13 天的玉米幼穗，去掉苞叶及花丝，用5％次氯酸钠（加0.1％吐温-20)，浸泡幼穗30 min，再用灭菌水冲洗3次。

2）在超净工作台上，剥离幼胚，确保胚的直径在1.5-2 mm，放入分装好含有侵染培养基的2 mL离心管内，每管20-100个胚。

3）用接种环刮取 YEB固体培养基上的农杆菌约3 mm ，放入液体侵染培养基中，28℃摇床上培养2-3 h，直至 OD₅₅₀=03-0.4。

4）用液体侵染培养基清洗幼胚2次，然后吸干液体再加1.5-2 mL 农杆菌侵染液，轻轻混匀20次左右，室温黑暗下孵育5 min。

5）将含有胚的农杆菌侵染液分别倒入无菌的滤纸上稍稍晾干，然后用无菌的镊子将胚转移到共培养基上，置于20℃培养箱，黑暗培养3天。

6）用无菌的镊子将胚转移到恢复培养基上，然后置于28℃培养箱黑暗培养7天。

7）用无菌的镊子将胚转移到筛选培养基上，然后置于28℃培养箱黑暗培养，每2周转接一次。

8）经2-3代筛选后，待抗性愈伤出现后将其单独挑出，在筛选培养基上继续黑暗培养。

9）将抗性愈伤转移至再生培养上，然后置于28℃培养箱黑暗培养14天左右，待形成胚状。

11）将胚状体转移至生根培养基上，然后置于25℃培养室见光培养，待产生再生苗。

12）待再生苗长至约3 cm后，将其转移至含有生根培养基的玻璃管中，继续于25℃培养室见光培养。

13）待再生苗长至约12 cm 后，将其移栽至温室中生长繁殖，直至结实收获种子。

（4）玉米基因组DNA小量提取（CTAB法）

1）取生长至 5 叶期后的玉米叶片 3-5 cm，加液氮研磨成粉末后放入1.5 mL离心管；加入600-700 μL预热上述2×CTAB 提取液，65℃水浴30-60 min，期间每 15 min振荡一次。

2）加入等体积氯仿，轻轻振荡混匀，静置分层后，12,000 rpm，离心 10 min。

3）取上清（约 500 μL）至新的 1.5 mL 离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，颠倒混匀。

4）12,000 rpm，离心 10 min，去上清。

5）加入 1 mL 75%乙醇清洗 1-2 次，8000 rpm，离心 5 min。

6）室温干燥 10 min后溶于50 μL ddH₂O，4℃保存。

（5）植物总RNA提取

RNA 的提取按照 TransZol Up Plus RNA Kit。

（6）反转录

反转录按照 MonScript™ RTIII All-in-One Mix with dsDNase 试剂盒说明书进行。

（7）Western blot。

3.实验结果及分析

（1）转基因植株的获得

对BC1F1代材料表型观察，授粉24天后可以观察到红色籽粒。

（2）PCR鉴定

设计跨IGG2序列的引物（引物序列见表1，引物位置见图2），进行PCR验证以及测序。

所有检测植株 PCR 结果均为阳性，且存在IGG2序列。

（3）转基因植物转录分析

设计跨IGG2序列的引物（引物序列见表1，引物位置见图2），对红色籽粒的转录本进行鉴定，结果表明由IGG2序列连接的两个基因转录本连接在一起。

表1

引物名称	序列
		CrtZ-R	GGTCATGTGCATGGCGAATC
BKT-F	CCACCGCAAACACTGGGAGC
		CrtI-F	AGCTTTCTCCGTGGAACCAG
PSY-R	GTAGACCTTCTGCTCGGACG
		PSY-R1	TCCTGGCCCTCTTGATCTGC

（4）转基因植物翻译分析

对转基因玉米成熟籽粒的 Western blot 分析结果显示，PSY1蛋白可以单独表达。

（5）虾青素含量测定

对转基因玉米成熟籽粒中虾青素含量进行测定，结果显示，红色籽粒中存在3种形式的虾青素。

结果说明IGG2序列可以用于植物多顺反子的构建，在玉米中转入虾青素合成相关基因后能够在玉米籽粒中合成并积累虾青素。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种多顺反子间隔区元件，其特征在于，包括IGG2，其核苷酸序列为5’-CAATCAAAC-3’；IGG4，其核苷酸序列为5’-GAGTCAATCAAACACTC-3’。

2.根据权利要求1所述多顺反子间隔区元件，其特征在于，所述多顺反子中开放阅读框的数量为2-6个。

3.权利要求1所述多顺反子间隔区元件在植物育种中的应用。

4.根据权利要求3所述多顺反子间隔区元件在植物育种中的应用，其特征在于，构建包含植物基因多顺反子的植物表达载体，所述多顺反子的开放阅读框序列之间插入多顺反子间隔区元件。

5.根据权利要求3所述多顺反子间隔区元件在植物育种中的应用，其特征在于，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

6.一种多顺反子间隔区元件在异源表达中的应用，其特征在于，所述多顺反子间隔区元件序列为5’-CAATCAAAC-3’或5’-GAGTCAATCAAACACTC-3’。

7.如权利要求6所述的多顺反子间隔区元件在异源表达中的应用，其特征在于，所述异源表达在植物中进行。

8.如权利要求7所述的多顺反子间隔区元件在异源表达中的应用，其特征在于，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。