CN103374059B

CN103374059B - 烟草neip1蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN103374059B
Application number: CN201210105261.0A
Authority: CN
Inventors: 张劲松; 陈受宜; 陶建军; 曹扬荣; 马彪; 张万科; 林晴
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2012-04-11
Filing date: 2012-04-11
Publication date: 2014-11-26
Anticipated expiration: 2032-04-11
Also published as: CN103374059A

Abstract

本发明公开了一种烟草NEIP1蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物生物量或莲座大小相关的由序列2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，该蛋白可以调控植物叶片和莲座等表型，对培育叶片和莲座增加的植物品种，特别是培育食用十字花科等蔬菜类植物品种有重要意义。

Description

烟草NEIP1蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种烟草NEIP1蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

在非生物和生物逆境的胁迫下，高等植物细胞有多种途径感受和应答外界环境中物化参数的变化，将胞外的信号变为胞内信号，经过一系列磷酸化级联反应将信号传递到细胞核，经转录因子调控相关的功能基因，启动逆境应答基因的表达，提高植物的耐逆性。已经证实，植物中特异的激素乙烯作为一种重要的植物激素，参与调控植物生长发育的诸多方面，包括植物应答非生物和生物逆境胁迫的信号传递途径。1999年申请人已证明烟草乙烯II类受体NTHK1与上述信号传导相关，其过表达提高了植物耐逆性，同时转基因植株的生物量也有明显提高，例如，莲座和叶面积。(张劲松，陈受宜，两组分信号系统基因NTHK1及其所编码的蛋白质，授权号：ZL99119096.3，授权日：2004.4.28，申请日：1999.9.16；Wanhong Cao，Jinsong Zhang&Shouyi Chen，et al.，Expression of tobacco ethylene receptor NTHK1alters plant responses to salt stress，Plant，Cell and Environment(2006)29，1210-1219)。之后，申请人克隆并鉴定了乙烯受体NTHK1作用的下游蛋白一种与植物耐逆性相关的乙烯受体NTHK1互作蛋白及其编码基因与应用，An ethylene receptor-interacting protein related to abiotic stress tolerance andit’s applications.申请号：200910089971.7，申请日期：2009.7.30

发明内容

本发明的一个目的是提供一种烟草NEIP1蛋白及其编码基因。

本发明提供的蛋白，来源于烟草(Nicotiana tabacum var.Xanthi)，名称为NEIP1，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物莲座或叶片大小相关的由序列2衍生的蛋白质。

上述(a)或(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表2所示的标签的编码序列得到。

上述蛋白的氨基酸序列中一个或几个氨基酸残基的取代、替换和/或添加，有的是由于自然发生的变异引起的，有的是由人工诱变处理引起的。

序列表中序列2氨基酸残基序列是由168个氨基酸残基组成的蛋白质，是烟草中的一类与乙烯受体蛋白NTHK1互作的蛋白。

编码所述蛋白(NEIP1)的基因(NEIP1)也属于本发明的保护范围。

所述基因(NEIP1)可为如下1)-4)中任一一种的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列1自5’端第1到第504位碱基所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码植物莲座或叶片大小相关蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码植物莲座或叶片大小相关蛋白的DNA分子。

序列表中序列1的DNA序列由507个碱基组成，该基因的读码框分别为自5’末端第1到第504位碱基。

所述特异性杂交条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的编码乙烯受体互作蛋白的基因NEIP1导入植物细胞，可获得叶片/莲座增大的转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。携带有本发明NEIP1基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、白菜、菠菜、杨树、苜宿等。

含有上述基因的重组载体A、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围；

上述重组载体A具体为将上述基因插入pROK II载体BamH I和KpnI酶切位点，得到表达上述蛋白的重组载体。

扩增上述基因全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围，其中所述引物对中的一条引物的核苷酸序列具体为序列表中的序列3，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列具体为序列表中的序列4。

上述蛋白、上述基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调节植物莲座或叶片大小中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述调剂具体为如下1)或2)：1)为提高植物莲座或叶片大小；2)为减小植物莲座或叶片大小；

所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物进一步具体为烟草。

本发明的第二个目的是提供一种培育转基因植物A的方法。

本发明提供的方法，为将上述蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物A，

所述转基因植物A具有如下1)或2)的特征：

1)所述转基因植物A的莲座大于所述目的植物；

2)所述转基因植物A的叶片大于所述目的植物。

上述蛋白的编码基因具体通过上述重组载体A导入目的植物中。

所述目的植物具体为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物进一步具体为烟草等。

本发明的第三个目的是提供一种培育转基因植物B的方法。

本发明提供的方法，为抑制目的植物中的上述蛋白编码基因的表达或所述蛋白的活性，得到转基因植物B，

所述转基因植物B具有如下1)或2)的特征：

1)所述转基因植物B的莲座小于所述目的植物；

2)所述转基因植物B的叶片小于所述目的植物；

所述抑制目的植物中的上述蛋白编码基因的表达或所述蛋白的活性具体为将重组载体B导入所述目的植物；

所述重组载体B具体为将DNA分子1和DNA分子2分别插入pZH01载体SacI/KpnI和SalI/XbaI位点间中，得到的载体；所述DNA分子1的核苷酸序列为序列1的自5’末端第44位至504位核苷酸；所述DNA分子2的核苷酸序列为所述DNA分子1的反向互补序列；

本发明的第四个目的是提供一种重组载体B。

本发明提供的重组载体B，为将DNA分子1和DNA分子2分别插入pZH01载体中，得到的载体；所述DNA分子1的核苷酸序列为序列1的自5’末端第44位至504位核苷酸；所述DNA分子2的核苷酸序列为所述DNA分子1的反向互补序列。

本发明的实验证明，本发明发现了一种蛋白来源于烟草(Nicotiana tabacum var.Xanthi)，名称为NEIP1，将其转入烟草中，可得到植物叶片/莲座均增大的转基因植物，将其沉默，可以得到植物叶片/莲座均变小的转基因植物，说明该蛋白可以调控植物叶片和莲座大小的表型，对培育叶片/莲座增大的植物品种，特别是培育食用十字花科等蔬菜类植物品种有重要意义。

附图说明

图1为CytoTrap酵母双杂原理示意图

图2为NTHK1的酵母bait载体pSOS的构建

图3为CytoTrap酵母双杂系统验证NTHK1与NEIP1的相互作用

图4为NEIP1的过量表达载体(A)和RNAi载体(B)的示意图

图5为NEIP1过表达植株和RNAi植株的分子鉴定

图6为NEIP1转基因植株和对照的表型分析

图7为NEIP1过表达、RNAi植株和对照的莲座直径统计

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

载体pROKII(双元表达载体)记载在D.C.Baulcombe，G.R.Saunders，M.W.Bevan，M.A.Mayo and B.D.Harrison，Expression of biologically active viral satelliteRNA from the nuclear genome of transformed plants.Nature 321(1986)，pp.446-449中，公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

载体pZH01记载在Han Xiao，et al.Functional analysis of the rice AP3homologue OsMADS16by RNA interference，Plant Molecular Biology，2003，52，957-966，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

所有植物材料均生长于22-25℃每天的光照为16h/8h(光照/黑暗)。

实施例1、蛋白NEIP1的获得

1、运用酵母双杂交系统获得与乙烯受体NTHK1互作的蛋白NEIP1

以去掉跨膜区的区段的NTHK1为模板，运用CytoTrap酵母双元杂交系统，获得与NTHK1互作的蛋白NEIP1。

1)CytoTrap酵母双元杂交系统

CytoTrap酵母双元杂交系统是利用一个温度敏感的酿酒酵母突变体cdc25H进行相互作用蛋白的筛选。cdc25H造成的温度敏感是由于一个与人类hSos同源基因cdc25一个点突变造成的。cdc25编码鸟苷酸交换因子，它可以结合并激活Ras信号通路，使酵母可以在37℃下生长，而带有cdc25点突变的宿主酵母则只能在22-25℃下生长。由于人类的hSos可以互补cdc25H的功能，因此可以利用在膜上表达hSos使酵母在37℃正常生长。将目标蛋白的基因序列构建到pMyr载体上，由于在该载体的5’端有编码肉豆蔻基化的序列可以将目标蛋白锚定到细胞膜上，如果与hSos融合的诱饵蛋白能与定位于膜上的目标蛋白相互作用，hSos就可以起作用，从而使酵母在37℃下生长(图1)。

2)烟草cDNA表达文库对构建

先前的研究表明，NTHK1是烟草II类乙烯受体，其在拟南芥和烟草中的过量表达，提高了转基因植株的生物量，包括叶片和莲座增大。构建了烟草cDNA文库，经检测其滴度大约为2×10⁵cfu，插入片断大小平均为1.2kb左右。诱饵蛋白的构建选择了去掉跨膜区段的NTHK1(145-762aa)，与hSOS形成融合蛋白。

将烟草(Nicotiana tabacum var.Xanthi)种子播种于蛭石中，用含有1/4MS无机盐营养液浇灌，温室中培养，光照16小时，温度22-25℃。待烟草小苗生长4周左右，取营养生殖的叶片，将去掉中脉的叶片剪成1-2cm²的碎片，将碎片放在1/2MS液体培养基中缓慢摇动3小时；另外取烟草成体植株不同发育时期的花器官。以上材料收集后液氮速冻，于-80℃低温冰箱储存用于RNA的提取。

总RNA的提取用异硫氰酸胍—酚—氯仿的方法进行提取，mRNA的纯化使用Promega试剂盒PolyAT tract mRNA isolation system IV进行分离，分离得到的mRNA用紫外分光光度计定量。cDNA文库的构建按照CytoTrap cDNA library construction试剂盒的方法进行。5μg mRNA用于第一链的合成，然后进行第二链的合成，用pfu高保真Taq酶补平末端，合成的双链DNA进行EcoR I接头的连接，酚氯仿抽提后沉淀收集，用XhoI酶切，将含有EcoR I和Xho I的双链的DNA直接连接pMyr XR载体中(预先用EcoR I和Xho I双切并脱磷的载体)。将连接产物转化XL-gold Kan^r大肠杆菌中。根据大肠杆菌阳性克隆菌落的个数确定cDNA文库的滴度。随即挑取10个单克隆提质粒，用pMyr载体上的通用引物扩增，引物序列为，pMyrF：5’-ACTACTAGCAGCTGTAATAC-3’和pMyrR：5’-CGTGAATGTAAGCGTGACAT-3’。检测所构建文库插入片断的大小。

3)Bait质粒的构建

以原始的NTHK1的质粒(pBK-CMV)为模板，以去掉跨膜区的区段(145-762aa)的两端设计引物，正向为BaitK1F：5’-AGGGGATCCTTATGCTGAAAAAGAAAAC-3’(含有BamHI)，反向为BaitK1R：5’-ACAGTCGACCGTGATTATGCTTGCCTG-3’(含有Sal I位点)。PCR扩增直接用BamH I和SalI双酶切，连至pSOS载体中，测序验证。

4)酵母转化

首先用大量法提取烟草cDNA文库质粒和Bait质粒，调整所提质粒的浓度为1μg/μl。采用质粒共转化的方法进行文库的筛选。转化后的酵母涂在SD/glu(-UL)固体培养基平板上，24℃培养两天，然后用灭菌的滤纸将酵母菌落复制至SD/gal(-UL)固体培养基的平板上，37℃培养大约7天，生长出的克隆即为候选克隆，同时将平板继续放置37℃培养至10天。将生长出的每个克隆转移至SD/glu(-UL)平板上，24℃生长2-3天，长出的克隆用25μl灭菌水彻底混匀，分别取5μl点在两个SD/glu(-UL)和两个SD/gal(-UL)平板上，分别放在24℃和37℃培养3-5天。在24℃培养的两个平板上酵母都会正常生长，而在37℃培养的平板，如果SD/gal(-UL)平板上有克隆生长而对应的克隆斑点在SD/glu(-UL)平板上并没有生长，该克隆即为经过进一步筛选的阳性克隆。将该克隆挑至SD/glu(-UL)液体培养基中，24℃振荡培养3-5天，收集酵母菌体进行质粒提取，提取的质粒进行大肠杆菌的电激转化，每个转化的平板要挑取10个单菌落，首先用通用引物进行PCR扩增，看10个单菌落中扩增的条带是否一致。将提取的大肠杆菌质粒，再次转化至酵母中按照上述操作步骤进行双杂的验证，如果得到了相互作用的结果，该克隆即为最终的阳性克隆，进行测序分析。

在大量的测序结果中分析发现，在多次重复出现的基因中，选择其中一个基因，将其命名为NEIP1(Nicotiana tabacum var ethylenereceptor-interactingproteins)，NEIP1在测序中共出现3次重复，该基因的核苷酸序列为序列表中的序列1，该基因的读码框分别为自3’端第1到第504位碱基，其编码的蛋白命名为NEIP1，其氨基酸序列为序列表中的序列2。

2、NTHK1蛋白与NEIP1蛋白相互作用的验证

酵母双元杂交所得到的阳性克隆，一般需要进行进一步验证才能确信其相互作用。体外分析NTHK1与NEIP1的相互作用

首先构建了NTHK1的酵母Bait载体。如图2所示，所用引物为：正向为BaitK1F：5’-AGGGGATCCTTATGCTGAAAAAGAAAAC-3’(含有BamH I)，反向为BaitK1R：5’-ACAGTCGACCGTGATTATGCTTGCCTG-3’(含有Sal I位点)。PCR扩增直接用BamH I和Sal I双酶切，连至pSOS载体中，测序验证。

如图3显示了pSOS-NTHK1可以和NEIP1相互作用。

实施例2、NEIP1蛋白的应用

为了鉴定NEIP1的功能，构建了该基因的过量表达和RNAi载体，过量表达用的载体为pROKII，RNAi干涉载体为pZH01。

一、重组载体的获得

1、重组过表达载体pROKII-NEIP1的构建

提取烟草(Nico tiana tabacum var.Xanthi，记载在Hong SH，Kim KI，Chung HY，Kim YJ，Sunter G，Bisaro DM，Chung IS，Expression of recombinant endostatedleaf disks of Nicotiana tabacum var.Xanthi，Biotechnology Letters，2004，26(18)，1433-1439，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)叶片RNA，反转录得到cDNA。

以cDNA为模板，用NtNEIP1-F1和NtNEIP1-R1作为引物进行PCR扩增，得到的PCR产物，经测序鉴定包含NEIP1基因的cDNA全长序列1自5’末端第1-504位核苷酸。

NtNEIP1-F1：CAGGATCCATGTTGGTTTATCAGGATCTTCTC(序列3，下划线为BamH I)

NtNEIP1-R1：ACGGGTACCACACTTGACCTCCTTGAGTCC(序列4，下划线为Kpn I)

用限制性内切酶BamHI和Kpn I双酶切上述PCR产物，回收酶切产物，将该酶切产物与经过同样酶切植物表达载体pROK II得到的载体骨架连接，得到连接产物。将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子。提取转化子的质粒，送去测序，该质粒为将序列表中的序列1自5’末端第1-504位核苷酸插入pROKII的BanHI和KpnI酶切位点之间得到的载体，将该载体命名为pROKII-NEIP1，且序列表中的序列1位于CaMV 35S启动子之后，将该质粒命名为pROKII-NEIP1，得到重组表达载体，其结构示意图如图4A所示。

2、重组RNAi干涉载体pZH01-NEIP1-RNAi的获得

选择了N端的NEIP1DNA片断461bp作为RNAi载体的构建。根据序列1设计引物NEIP1-RF和NEIP1-RR：

NEIP1-RF：TGCTCTAGAGAGCTCCGGATTCATTTCCCTACACTG

XbaI Sac I

NEIP1-RR：ACGCGTCGACGGTACCACACTTGACCTCCTTGAGTCC

SalI Kpn I

以烟草叶片的cDNA为模板，用NEIP1-RF和NEIP1-RR作为引物进行PCR扩增，得到PCR产物；

经过测序，该PCR产物具有序列表中序列1的自5’末端第44位至504位核苷酸。

将PCR产物与RNAi载体pZH01的链接，具体如下：第一链用SacI和KpnI双酶切链接，然后使用XbaI和SalI双酶切将反链连接到第一链阳性克隆上，获得反向插入的含NEIP1-RNAi的植物表达载体pZH01-NEIP1-RNAi。

经过测序，pZH01-NEIP1-RNAi为将序列1的自5’末端第44位至504位核苷酸插入pZH01载体的SacI和KpnI酶切位点，且将序列1的自5’末端第44位至504位核苷酸的反向互补序列插入pZH01载体的SalI和XbaI位点间，得到的载体，具体结构示意图如图4B所示。

二、转基因株系的获得及鉴定

1、转基因株系的获得

分别将上述得到的重组过表达载体pROKII-NEIP1和重组RNAi干涉载体pZH01-NEIP1-RNAi经叶圆盘法转入烟草(Nicotiana tabacum var.Xanthi，以下简称为野生型烟草)中，分别获得28株T0代过表达转NEIP1烟草和21株T0代RNA干扰转NEIP1烟草。

2、转基因株系Real Time PCR鉴定

将上述转基因烟草用Real Time PCR和Northern blot的方法进行检测，所用引物为：

QRT-NEIP1F1：CAGGGAGCTGTTGATGTGAACAT

QRT-NEIP1R1：TGCTCCTGAAGCCTGAAAGTGT

作为标准对照的Tublin引物为：

QRT-NttubA1F1：ACGTGCTTTCGTGCACTGGTAT

QRT-NttubA1R1：GCACCAACTTCCTCGTAATCCT

以烟草(Nicotiana tabacum var.Xanthi，以下简称为野生型烟草)为对照。

结果如图5所示，可以看出，筛选出NEIP1过表达较高阳性T0代过表达转NEIP1烟草的2个株系OX2、OX13和表达量较弱的OX4；筛选出几乎未能检测出T0代RNA干扰转NEIP1烟草株系R16和R20。

说明上述株系均为阳性转基因植物。

3、转基因株系Northern鉴定

用Northern方法对上述5个株系作进一步分子验证：

分别提取OX2、OX13、R16和R20的RNA，分别将20μg总RNA经含有1％甲醛变性胶电泳后，转到Hybrond N⁺尼龙膜上，紫外交联后，用0.1％的亚甲基蓝进行RNA染色确认膜上各泳道RNA的上样量。杂交在65℃进行，探针标记使用随机引物标记试剂盒(TaKaRa)，NEIP1杂交使用的探针为NEIP1的cDNA序列(序列1)。杂交信号用磷屏记录。

图5的结果显示过量表达植株OX2、OX4和OX13中NEIP1的表达量明显高于对照，而RNAi植株R16和R20中没有检测出NEIP1的表达。

因此进一步证明，上述筛选的转基因植物为阳性，选择OX2、OX4、OX13、R16和R20转基因株系作进一步表型分析。

采用同样的方法将空载体pROK II和载体pZH01分别转入野生型烟草中，分别得到T0代转pROKII烟草和T0代转pZH01烟草，分别提取这两种烟草的RNA，用上述RealTime PCR鉴定，结果均没有目的片段，说明均为阳性。

三、转基因植株的表型分析

将上述阳性T0代过表达转NEIP1烟草OX2、OX4、OX13、阳性T0代RNA干扰转NEIP1烟草R16和R20、野生型烟草(CK)、T0代转pROKII烟草和T0代转pZH01烟草种子分别种于蛭石中，22℃每天的光照为16h/8h(光照/黑暗)。

分别于生长21、29、34、39和50天时拍照，并于21、25、29、31和37天时统计其莲座直径。重复3次，每个样本每次20株，结果取平均值±标准差。

拍照结果如图6所示，可以看出，3个阳性T0代过表达转NEIP1烟草OX2、OX4、OX13的叶片和莲座明显大于野生型烟草，而阳性T0代RNA干扰转NEIP1烟草R16和R20的叶片和莲座明显小于野生型烟草。

进一步对莲座直径的统计如图7和表1所示：

表1为NEIP1过表达、RNAi和对照植株莲座直径统计(mm)

生长天数

野生型烟草

OX13

OX2

OX4

R16

R20

21

25±4

29±2*

27±5

26±5

22±3*

25

41±8

47±11

48±12

44±5

34±6*

31±6*

29

67±11

81±6*

82±6*

69±9

53±10**

48±9**

33

102±13

124±11*

115±11*

107±12

73±12**

57±10**

37

125±25

150±8**

150±12**

126±20

87±18**

79±21**

从表1看出，生长21天时，NEIP1的两个RNAi株系的莲座直径明显小于对照和过表达株系，而过表达株系OX2和OX13则略大于对照。生长29天时，两个RNAi株系的莲座直径均极显著下降，直至生长至37天。OX2和OX13株系从生长29天开始，其莲座直径明显大于对照，至37天时，呈极显著。过表达株系OX4，虽然其莲座直径的平均值均大于对照，但是没有明显差别，是其NEIP1基因的表达量较低所致。

野生型烟草、T0代转pROK II烟草和T0代转pZH01烟草结果无显著差异。

上述结果表明，过表达株系的高生物量是由于NEIP1基因的过量表达所致。因此NEIP1基因可作为目的基因在经基因工程培育高生物量植物品种，例如大叶烟草和白菜等十字花科蔬菜中应用。

Claims

1.一种蛋白，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下1)或2中任一一种的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列1自5’端第1到第504位碱基所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体A、表达盒、转基因细胞系或重组菌；

所述重组载体A具体为将权利要求2或3所述基因插入pROKⅡ载体中，得到表达权利要求1所述蛋白的重组载体。

5.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因或权利要求4所述重组载体A、表达盒、转基因细胞系或重组菌在提高植物莲座或叶片大小中的应用；所述植物为双子叶植物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物为烟草。

7.一种培育转基因植物A的方法，为将权利要求1所述蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物A，

所述转基因植物A具有如下1)或2)的特征：

1)所述转基因植物A的莲座大于所述目的植物；

2)所述转基因植物A的叶片大于所述目的植物；

所述将权利要求1所述蛋白的编码基因具体通过权利要求4所述重组载体A导入目的植物；

所述目的植物为双子叶植物；所述双子叶植物为烟草。

8.一种培育转基因植物B的方法，抑制目的植物中的权利要求1所述蛋白编码基因的表达或所述蛋白的活性，得到转基因植物B，

所述转基因植物B具有如下1)或2)的特征：

1)所述转基因植物B的莲座小于所述目的植物；

2)所述转基因植物B的叶片小于所述目的植物；

所述抑制目的植物中的权利要求1所述蛋白编码基因的表达或所述蛋白的活性具体为将重组载体B导入所述目的植物；

所述重组载体B具体为将DNA分子1和DNA分子2分别插入pZH01载体中，得到的载体；所述DNA分子1的核苷酸序列为序列1的自5’末端第44位至504位核苷酸；所述DNA分子2的核苷酸序列为所述DNA分子1的反向互补序列；

所述目的植物为双子叶植物；所述双子叶植物为烟草。

9.一种重组载体B，为将DNA分子1和DNA分子2分别插入pZH01载体中，得到的载体；所述DNA分子1的核苷酸序列为序列1的自5’末端第44位至504位核苷酸；所述DNA分子2的核苷酸序列为所述DNA分子1的反向互补序列。

10.权利要求9所述重组载体B在降低植物莲座或叶片大小中的应用；所述植物为双子叶植物。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物为烟草。