ES2243954T3 - Secuencias promotoras inducibles por frio. - Google Patents
Secuencias promotoras inducibles por frio.Info
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Abstract
Una secuencia de ADN que tiene una secuencia de nucleótidos desde el primer nucleótido hasta el 3546º en la secuencia de nucleótidos que se muestra en la ID. SEC. Núm. 1, o una parte de ella que tiene una actividad promotora inducible por frío.
Description
Secuencias promotoras inducibles por frío.
La presente invención se refiere a una secuencia
promotora que induce la expresión de genes a bajas temperaturas. La
secuencia promotora inducible por frío de acuerdo con la presente
invención es útil para disminuir la cantidad de azúcar reductor en
los tubérculos de patata durante el almacenamiento de las patatas a
temperaturas bajas, para la inhibición de la germinación de los
tubérculos de patata, para proporcionar resistencia al frío a las
plantas, y
similares.
similares.
Es indispensable para varias cosechas mantener
sus cualidades durante un largo tiempo después de la cosecha
almacenándolas en un lugar frío o similar. Sin embargo, se conoce
que si se almacenan los tubérculos de patata a una temperatura baja,
ocurre la acumulación del azúcar reductor, lo que se llama
endulzamiento a baja temperatura, y el azúcar reductor generado
causa una reacción de coloreado (reacción de Maillard) mientras se
procesan como patatas fritas, patatas chips o similares, de modo que
se disminuyen enormemente los valores de los productos comerciales.
También se conoce que se endulzan las frutas por generación de
etileno. Para superar estos problemas, se estudia ahora ampliamente
en todo el mundo la fisiología después de la cosecha.
Expresando específicamente un gen foráneo en
tubérculos de patata, se ha usado ampliamente en todo el mundo el
promotor del gen para la proteína de almacenamiento patatín (EMBO
J. 1989, 8(1), 23-29;
Plant Mol. Biol. 1989, 12,
41-50; Bio/Technology 1994, 12,
1101-1105, y así sucesivamente). La expresión del
gen patatín aumenta con el desarrollo del tubérculo. Sin embargo, en
la etapa en que se desarrollan los tubérculos, se activan varios
sistemas metabólicos tales como aquéllos para convertir el azúcar
reductor en almidón. Por lo tanto, es posible que el gen ligado al
promotor del patatín pueda perturbar un sistema metabólico, lo que
puede conducir a una disminución en el rendimiento. Para evitar tal
problema, se cree que es necesario aislar y utilizar un promotor que
promocione eficientemente la expresión de los genes sólo en
tubérculos que se han almacenado a temperaturas bajas y que
difícilmente promocione la expresión de los genes en la planta bajo
condiciones normales.
Se ha informado de un número de tipos de genes
inducibles por frío a partir de organismos procarióticos y
eucarióticos (Existen revisiones incluyendo Tissue Culture
1993, 19(10), 357-361). También
se han aislado genes inducibles por frío a partir de tubérculos de
patata (Plant Physiol. 1994, 104,
445-452). Se ha informado de que se aísla un gen de
tipo osmotina a partir de una especie de patata silvestre, y que se
induce su expresión a temperaturas bajas (Plant Mol. Biol.
1993, 21, 729-735). El informe que se
ha mencionado arriba es el único que informa del aislamiento de
genes inducibles por frío a partir de tubérculos de patata.
Se han aislado cinco tipos de genes inducibles
por frío (cADNs) a partir de tubérculos de patata (Plant
Physiol. 1994, 104, 445-452). Dos
de ellos tienen similitudes respecto a genes para pequeñas proteínas
de schock térmico que se conocen, o a genes para proteínas
inducibles en frío y proteínas inducibles por ABA de otras plantas.
No se han secuenciado otros tres genes. No se han aislado los ADNs
genómicos (incluyendo los promotores) de estos cADNs. Se cree que
todos estos genes responden rápidamente (en menos de una semana) a
temperaturas bajas.
No es necesario decir, que se pueden aplicar los
promotores de los genes que se conocen que se han descrito arriba a
cosechas (tales como la patata) que requieran ser almacenadas a una
temperatura baja. Sin embargo, no se conoce si estos promotores
(Plant Physiol. 1994, 104,
445-452 o similares) inducen una expresión elevada
en el órgano deseado únicamente (es posible que se induzcan estos
promotores también en otros órganos a temperaturas bajas). Además,
se pueden expresar los genes que controlan estos promotores a una
temperatura normal hasta cierto grado. Así pues, no se conoce si se
puede llevar a cabo una expresión eficiente sólo en los órganos que
se van a almacenar a una temperatura baja, tales como los tubérculos
de patata. Además, aunque se almacenan los tubérculos de patata
durante tanto como varios meses, no se conoce si los promotores que
se han descrito arriba funcionan durante un tiempo tan largo
(Plant Physiol. 1994, 104,
445-452. En esta referencia, se prueban las
actividades de los promotores durante sólo un mes
aproximadamente).
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un nuevo promotor inducible por frío que induzca la
expresión de los genes a temperaturas bajas en tubérculos de patata
pero que se induzca escasamente en otros órganos que no sean
tubérculos o a temperatura normal, y que induzca la expresión de los
genes durante un largo tiempo no menor que cinco meses.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un fragmento de ADN útil como una sonda para descubrir
un promotor nuevo inducible por frío que existe en la patata o en
otras plantas.
Los presentes inventores estudiaron
intensivamente para descubrir una secuencia promotora que se induzca
a temperaturas bajas en los tubérculos de patatas pero que se
induzca escasamente en otros órganos que no sean tubérculos o a
temperatura normal, y que induzca la expresión de los genes durante
un largo tiempo no menor que cinco meses, completando de este modo
la presente invención.
Esto es, la presente invención proporciona una
secuencia de ADN que tiene una secuencia de nucleótidos desde el
primer nucleótido hasta el número 3546º en la secuencia de
nucleótidos que se muestra en la ID. SEC. Núm. 1, o una parte de
ello que tiene una actividad promotora inducible por frío.
La presente invención también proporciona una
secuencia de ADN que tiene una secuencia de nucleótidos desde el
primer nucleótido hasta el número 4120º en la secuencia de
nucleótidos que se muestra en la ID. SEC. Núm. 2, o una parte de
ello que tiene una actividad promotora inducible por frío.
Mediante la presente invención, se proporcionó
una secuencia promotora que se induce a temperaturas bajas en los
tubérculos de patatas pero que se induce escasamente en otros
órganos que no sean tubérculos o a temperatura normal, y que induce
la expresión de genes durante un tiempo largo no menor que cinco
meses. Utilizando la secuencia promotora de acuerdo con la presente
invención, se puede conseguir la reducción de la cantidad del azúcar
reductor en los tubérculos de patata durante el almacenamiento de
las patatas a temperaturas bajas, la inhibición de la germinación de
los tubérculos de patata, y dar resistencia frente al frío a las
plantas, y similares.
La Fig. 1 es un dibujo para explicar el proceso
de preparación de un constructo en el que se introduce el promotor
LCIP2-10.
La secuencia promotora inducible por frío de
acuerdo con la presente invención está contenida en la región desde
el primer nucleótido hasta el 3546 en la secuencia de nucleótidos
que se muestra en la ID. SEC. Núm. 1 en el Listado de Secuencias, o
en la región desde el primer nucleótido hasta el 4120 en la
secuencia de nucleótidos que se muestra en la ID. SEC. Núm. 2. Cada
una de estas secuencias exhibe actividad promotora inducible por
frío en su totalidad. Sin embargo, partes de estas secuencias, que
exhiben actividades promotoras inducibles por frío, e.g., la
región desde el nucleótido 2418 hasta el 3541º de la secuencia de
nucleótidos que se muestra en la ID. SEC. Núm. 1 en el Listado de
Secuencias, también están dentro del alcance de la presente
invención. Además, las secuencias que contienen la región desde el
nucleótido 2418 hasta el 3541º de la secuencia de nucleótidos que se
muestra en la ID. SEC. Núm. 1, que tienen actividades promotoras
inducibles por frío, también están dentro del alcance de la presente
invención.
Los "ATG"s en los nucléotidos desde el 3547
hasta el 3549º en la secuencia que se muestra en la ID. SEC. Núm. 1
en el Listado de Secuencias y en los nucleótidos desde el 4121 hasta
el 4123º en la secuencia que se muestra en la ID. SEC. Núm. 2 en el
Listado de Secuencias son codones de iniciación de la traducción. La
secuencia de mARN (cADN) del nucleótido 3503º y la dirección 3' de
ello de la secuencia que se muestra en la ID. SEC. Núm. 1 se muestra
en la ID. SEC. Núm. 3 junto con la secuencia de aminoácidos deducida
que se ha codificado de este modo.
En la presente especificación, el término
"inducible por frío" significa que se induce la expresión de un
gen por el promotor a una temperatura no superior a 6ºC, y que
manteniendo la temperatura a no más de 6ºC, se mantiene la expresión
durante no menos de 5 meses.
Se conoce bien en la técnica que hay casos donde
se mantiene la actividad fisiológica de una secuencia de ADN
fisiológicamente activa incluso si se modifica la secuencia de
nucleótidos del ADN en una pequeña extensión, es decir, incluso si
se sustituyen o se borran uno o más nucleótidos, o incluso si se
añaden o se insertan uno o más nucleótidos. En consecuencia, se
incluyen dentro del alcance de la presente invención los fragmentos
de ADN que tengan la misma secuencia de nucleótidos que las
secuencias promotoras inducibles por frío que se han mencionado
arriba, de acuerdo con la presente invención, excepto en que los
fragmentos de ADN tienen tales modificaciones, que tienen las
actividades promotoras inducibles por frío. Es decir, se incluyen
dentro del alcance de la presente invención los fragmentos de ADN
que tengan la misma secuencia de nucleótidos que la región desde el
primer nucleótido hasta el 3546º de la secuencia que se muestra en
la ID. SEC. Núm. 1 o una parte de ello que tenga la actividad
promotora inducible por frío excepto en que se borren o se
sustituyan uno o más nucleótidos, o se inserten o se añadan uno o
más nucleótidos, que tengan las actividades promotoras inducibles
por frío. Además, se incluyen dentro del alcance de la presente
invención los fragmentos de ADN que tengan la misma secuencia de
nucleótidos que la región desde el nucleótido 2417 hasta el 3541º de
la secuencia que se muestra en la ID. SEC. Núm. 1, cuya región es
una parte de la región que se ha mencionado arriba, o una parte de
ello que tenga la actividad promotora inducible por frío excepto en
que se borren o se sustituyan uno o más nucleótidos, o se inserten o
se añadan uno o más nucleótidos, que tengan las actividades
promotoras inducibles por frío.
Similarmente, se incluyen dentro del alcance de
la presente invención los fragmentos de ADN que tengan la misma
secuencia de nucleótidos que la región desde el primer nucleótido
hasta el 4120º de la secuencia que se muestra en la ID. SEC. Núm. 2
o una parte de ello que tenga la actividad promotora inducible por
frío excepto en que se borren o se sustituyan uno o más nucleótidos,
o se inserten o se añadan uno o más nucleótidos, que tengan las
actividades promotoras inducibles por frío.
Se puede alcanzar la modificación del ADN que
cause la adición, inserción, eliminación o sustitución mediante la
mutagénesis específica de sitio que se conoce bien en la técnica
(e.g., Nucleic Acid Research, 1982,
10(20), 6487-6500). En la presente
especificación, "uno o más nucleótidos" significa el número de
nucleótidos que se pueden añadir, insertar, eliminar o sustituir
mediante la mutagénesis específica de sitio.
Se puede llevar a cabo la mutagénesis específica
de sitio, por ejemplo, usando un cebador de tipo oligonucleótido
sintético complementario al ADN de un fago de una sola hebra excepto
en que la mutación que se desea es tal como sigue. Es decir, usando
el oligonucleótido sintético que se ha mencionado arriba como
cebador, un fago produce una cadena complementaria, y se transforman
las células bacterianas huésped con el ADN de doble hebra que se ha
obtenido. Se colocó en una placa el cultivo de las células
bacterianas transformadas sobre agar y se forman placas a partir de
una sola célula que contenía el fago. Teóricamente, un 50% de las
nuevas colonias contiene el fago que tiene una cadena de una sola
hebra que lleva la mutación y el 50% restante de las colonias
contiene el fago que tiene la secuencia original. Se someten
entonces las placas que se han obtenido a la hibridización con una
sonda sintética que se ha tratado con quinasa a una temperatura en
que se hibridiza la sonda con el ADN que tiene exactamente la misma
secuencia que el ADN que tiene la mutación que se desea pero no con
la secuencia de ADN original que no es completamente complementaria
con la sonda. Entonces se recogen las placas en que se ha observado
la hibridización, se cultivan y se recoge el ADN.
Además de la mutagénesis específica de sitio que
se ha mencionado arriba, los métodos para sustituir, eliminar o
añadir uno o más nucleótidos sin perder la función incluyen un
método en que se trata el gen con un mutágeno y un método en que se
rompe selectivamente el gen, se elimina, se añade o se sustituye un
nucléotido seleccionado y entonces se liga el gen.
Tal como se detalla en los ejemplos que se
describen abajo, se determinaron las secuencias de nucleótidos que
se muestran en las ID. SEC. Núm. 1 y 2 mediante los siguientes
pasos:
(1) Se preparó una librería de cADN que se
originó a partir de los tubérculos que se almacenaron a 4ºC durante
un largo tiempo. Entonces se aislaron los clones de cADN que no se
hibridizaron (no riguroso) con mARNs de varios tejidos de patata en
crecimiento (hoja, tallo, raíz, callo, y tubérculo en crecimiento)
pero que se hibridizaron con un mARN en el tubérculo que se almacenó
a una baja temperatura, y se determinaron y se analizaron sus
secuencias.
(2) Se llevó a cabo el análisis Northern usando
los ARNs que se usaron en (1) para confirmar de nuevo que no se
expresaron sustancialmente en las plantas de patatas bajo
condiciones normales los transcritos correspondientes a los clones
aislados.
(3) Se almacenaron los tubérculos después de la
cosecha a varias temperaturas (3, 6, 9, 12, 15, 20ºC) durante un
largo tiempo (5 - 6 meses). Se comprobó mediante el análisis
Northern si se inducía la expresión a una temperatura baja, a que
temperatura se inducía la expresión, durante cuanto tiempo se
expresaba el gen, y si se paraba la expresión restableciendo la
temperatura hasta temperatura normal, usando ARNs que se extrajeron
de estos tubérculos. Como resultado, se confirmó que se inducía el
transcrito homólogo al cADN clonado a una temperatura baja no mayor
que 6ºC, que se expresaba durante un largo tiempo (como mínimo 5 - 6
meses), y que se paba la expresión restableciendo la temperatura
hasta temperatura normal.
(4) Usando plantas de patata in vitro, se
comprobó si se inducía la expresión del gen a una temperatura baja
en otros tejidos que no fueran tubérculos. Como resultado, aunque
era posible que la inducción ocurriera en otros tejidos que no
fueran tubérculos, se pensó que el nivel de expresión era
insustancial (el cambio era extremadamente más pequeño que en el
tubérculo que se almacenó a una temperatura baja).
(5) Mediante análisis Southern, se confirmó que
cada uno de los genes era un gen de copia única. No se detectó la
banda en arroz, maíz, tabaco o similares, pero se detectó en
tomate.
(6) Se aislaron dos clones genómicos. La
secuencia en la vecindad del codón de iniciación ATG de uno de los
clones genómicos era completamente idéntica a la secuencia en el
cADN. La secuencia del otro clon genómico no era completamente
idéntica a la secuencia del cADN. Sin embargo, puesto que la
homología era alta, se pensó que cada clon codificaba un gen que
tenía la misma función pero situado en un locus diferente. Se
pensó que los patrones de expresión de los dos genes que se
analizaron por PCR con transcripción inversa eran sustancialmente
idénticos.
(7) Se analizaron las secuencias de nucleótidos
de la región en dirección ascendente del ATG de los clones
genómicos. Como resultado, no se observó el motivo de la inducción
(reacción) por ABA que se observaba a menudo en los genes inducibles
por frío sino que se observó el motivo de reacción por GA en ambos
clones. Los dos clones genómicos aislados tenían una alta homología
(80,3%) hasta de 500 bp en la dirección ascendente del ATG, pero no
se observaron regiones que tuvieran una alta homología en la
dirección ascendente del mismo.
(8) Se introdujo una parte de la secuencia
promotora de uno de los dos clones genómicos aislados en la patata
usando el gen luciferasa (Science 1986, 234,
856-859) como un reportero. Se sometieron los
microtubérculos que se produjeron en los transformantes que se
obtuvieron a una prueba de almacenamiento en frío para confirmar la
inductividad por frío del promotor. También se observó la
inductividad, aunque ligeramente, en las hojas de los
transformantes.
Se puede obtener la secuencia promotora de
acuerdo con la presente invención mediante el proceso que se detalla
en los ejemplos de abajo, proceso que comprende los pasos desde (1)
hasta (8). Además, se puede obtener fácilmente un ADN que contenga
la secuencia promotora mediante el PCR o similares usando el genoma
de patata como plantilla, puesto que se determinó la secuencia de
nucleótidos de la secuencia promotora mediante la presente
invención.
invención.
Las secuencias que se muestran en la ID. SEC.
Núm. 1 y 2 no tienen homología con genes inducibles por frío
conocidos que se hayan originado a partir del tubérculo de patata.
En consecuencia, se cree que las secuencias promotoras de acuerdo
con la presente invención son nuevas secuencias promotoras de un
nuevo tipo que es diferente a las secuencias promotoras
conocidas.
La expresión de un gen mediante la secuencia
promotora inducible por frío de acuerdo con la presente invención en
la hoja, la raíz, el tallo y el tubérculo de una patata en
crecimiento a temperatura normal (20ºC) es muy débil. Se induce la
expresión colocando el tubérculo que se ha cosechado a temperaturas
bajas (6ºC o menos). Aunque se induce la expresión colocando un
órgano (hoja, tallo o raíz) que no sea un tubérculo a temperaturas
bajas, la expresión es ligera. Sin embargo, se induce la expresión
considerablemente en el brote que ha germinado a partir del
tubérculo almacenado en frío. Por otra parte, el informe (Plant
Physiol. 1994, 104, 445-452) es
silencioso respecto a la expresión en otros órganos que no sean
tubérculos. Aunque el gen no es de acuerdo con la presente
invención, en un sentido estricto, un gen específico para un
tubérculo almacenado en frío, es próximo a eso, y es un gen
(promotor) útil para mantener la calidad después de la cosecha.
Se induce la expresión de los genes a
temperaturas bajas y se para restableciendo la temperatura a la
temperatura normal, mediante la secuencia promotora inducible por
frío de acuerdo con la presente invención. De acuerdo con la
clasificación por una referencia (Plant Physiol. 1994,
104, 445-452), se cree que se clasifica el
gen en el grupo que es lento en reaccionar a temperatura baja (La
expresión no alcanza la meseta después de una semana aproximadamente
a partir del comienzo del tratamiento frío). Van Berkel et
al. (Plant Physiol. 1994, 104,
445-452) no tuvieron éxito en el aislamiento de un
gen perteneciente a este grupo. En consecuencia, se puede controlar
la expresión controlando la temperatura.
La secuencia promotora inducible por frío de
acuerdo con la presente invención induce la expresión durante un
largo tiempo (5 meses como mínimo) durante el almacenamiento en
frío. Por otra parte, el informe (Plant Physiol. 1994,
104, 445-452,) es silencioso sobre la
expresión a largo plazo del gen del que se informa. Usando la
secuencia promotora de acuerdo con la presente invención, se puede
conseguir el control de un gen a largo plazo.
En arroz, maíz y tabaco, no se encontraron genes
que tuvieran alta homología con los genes de acuerdo con la presente
invención. En el tomate, se halló tal gen. En consecuencia, se puede
conseguir, usando el promotor de acuerdo con la presente invención,
la expresión genética con silenciamiento genético bajo (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 1991, 88,
1770-1774) en la introducción de los genes en arroz,
maíz, tabaco o similares.
Así, se puede aplicar el promotor inducible por
frío de acuerdo con la presente invención en los siguientes
usos:
Se puede reducir la cantidad del azúcar reductor
en los tubérculos de patata que se han almacenado a una temperatura
baja ligando en la región en dirección 3' de la secuencia promotora
de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, un gen inhibidor
de la invertasa ácida (Ovalle et al., Plant Science
1995, 108, 133-141), un gen
antisentido del gen de la invertasa ácida vacuolar (EMBL Data
Library accession Number X76946), un gen PFK (EC 2.7.1.11,
WO95/05457), un gen antisentido de la fosforilasa del almidón
(Brisson et al., Plant Cell 1989, 1,
559-566; Mori et al., J. Biochem.
1991, 266, 18446-18453, Sonnwald et
al., Plant. Mol. Biol. 1995, 27,
567-576), un gen antisentido de la \beta o
\alpha-amilasa (Kreiberg and Gaushing, 12th
Triennial Conference of the European Association for Potato
Research, Abstracts (1993) 334-335), un gen
de la pirofosforilasa de la ADP glucosa (Stark et al.,
Science 1992, 258, 287-292) o
similares. Mediante esto, se puede evitar el colorante de las
patatas fritas o las patatas chips que se han hecho a partir de los
tubérculos de patata.
El promotor de acuerdo con la presente invención
tiene una propiedad para inducir la expresión a temperaturas bajas y
para parar la expresión cuando se hace volver a la temperatura
normal. En consecuencia, se puede conseguir la regulación del
crecimiento para expresar el gen (no germinado) a una temperatura
baja y parar la expresión (germinado) a temperatura normal, ligando
con esto, por ejemplo, un gen de la invertasa de levadura
(Sonnenwald et al., Plant J. 1992, 1,
95-100), el gen de la pirofosfatasa inorgánica de
E. coli (Sonnenwald, Plant J. 1992, 2,
571-581; Jelitto et al. Planta
1992, 188, 238-244), el gen
antisentido de la sintetasa del ent-kaureno
(participa en la biosíntesis de la giberelina, Sun et al.,
Plant Cell 1992, 4, 119-128) o
similares, e introduciendo el gen ligado en una planta tal como una
patata o un ajo.
Se puede dar la resistencia frente al frío a las
plantas expresando, por ejemplo, el gen de la
glicerol-3-fosfato aciltransferasa
(Murata et al., Nature 1992, 356,
710-718), el piruvato, o el gen de la ortofosfato
diquinasa (PPDK, Usami et al., Plant Mol. Biol.
1995, 27, 969-980) que se ha originado
a partir de Flaveria brownii, o simila-
res.
res.
Se describirá ahora la sonda para buscar
promotores inducibles por frío, de acuerdo con otro aspecto de la
presente invención.
La sonda de acuerdo con la presente invención es
un fragmento de ADN que tiene como mínimo 15 nucleótidos
consecutivos en la región desde el nucleótido 45 hasta el 839º en la
secuencia que se muestra en la ID. SEC. Núm. 3 en el Listado de
Secuencias o en una secuencia complementaria a ello. Es altamente
probable que la secuencia de la región desde el nucleótido 45 hasta
el 839º en la secuencia que se muestra en la ID. SEC. Núm. 3 o una
secuencia que tenga una elevada homología con esta secuencia exista
en una región en dirección descendente de una secuencia promotora
inducible por frío. En consecuencia, se puede descubrir un nuevo
promotor inducible por frío que exista en la patata o en otras
plantas, examinando sistemáticamente los ADNs genómicos de planta
usando esta secuencia o parte de ella como una sonda.
Se diseña la sonda basándose en la secuencia que
se ha mencionado arriba y su tamaño es como mínimo de 15 nucleótidos
consecutivos. Mientras su tamaño no sea de menos de 15 nucleótidos,
la sonda puede tener cualquier tamaño hasta la longitud completa de
la secuencia que se ha mencionado arriba. La sonda puede ser de una
sola hebra o de dos hebras, aunque cuando se usa la sonda es de una
sola hebra. Los fragmentos de ADN que tienen la misma secuencia de
nucleótidos que la sonda que se ha mencionado arriba excepto en que
se añaden, eliminan, insertan o sustituyen uno o más nucleótidos,
que se hibridizan específicamente con la secuencia que se ha
mencionado arriba o una secuencia que tenga una elevada homología a
ésta, también están dentro del alcance de la presente invención. Se
puede llevar a cabo la adición, eliminación, inserción o sustitución
de los nucleótidos del mismo modo que se ha descrito arriba para el
promotor inducible por frío de acuerdo con la presente inven-
ción.
ción.
Se puede preparar la sonda de acuerdo con la
presente invención digiriendo el fragmento de ADN que se muestra en
la ID. SEC. Núm. 3 en el Listado de Secuencias que se obtuvo
mediante el proceso que se detalla en los ejemplos que se describen
abajo con un enzima de restricción apropiado. También se puede
preparar la sonda mediante PCR usando una muestra que contenga la
secuencia. Alternativamente, se puede sintetizar un ADN de una sola
hebra para usarlo como la sonda mediante un método convencional
usando un sintetizador de ADN disponible comercialmente
(e.g., uno disponible comercialmente en Perkin Elmer).
Se puede marcar la sonda de acuerdo con la
presente invención con, por ejemplo, Un radioisótopo, un enzima
detectable o similares mediante un método convencional. Por ejemplo,
cuando se usa ^{32}P como el marcador, en los casos en que se
marca el fragmento de ADN que se muestra en la ID. SEC. Núm. 3, se
puede marcar convenientemente mediante el marcaje por la técnica de
cebadores al azar , y en los casos en que se marca una sonda
sintética, se puede marcar convenientemente marcando el extremo 5'
de ello usando un enzima fosforilante.
Usando la sonda, se puede llevar a cabo la
hibridización mediante un método convencional. En general, se
utiliza una intensidad de hibridización media (se lleva a cabo la
hibridización a 42 - 50ºC y se realiza el lavado con 0,1 x SSC).
Si se observa la hibridización cuando se examina
sistemáticamente una librería genómica de una planta objetivo con la
sonda de acuerdo con la presente invención, se puede obtener un
nuevo promotor inducible por frío especificando la región en
dirección ascendente de los genes hibridizados.
Ahora se describirá la presente invención más
concretamente por medio de ejemplos de ello. Se debe mencionar, sin
embargo, que la presente invención no se limita a los ejemplos.
Ejemplo
1
Se extrajeron los ARNs totales de los tubérculos
de patata (variedad: Toyoshiro) almacenados a 4ºC durante 7 meses
mediante el método de SDS/fenol, y se purificaron los
poliA^{+}ARNs usando Dynabeads (Dynal). Usando los poliA^{+}ARNs
obtenidos, se prepararon cADNs y se ligaron al vector \lambdagt10
para obtener una librería (kit de clonación Amersham \lambdagt10,
Amersham Japan). Se marcaron con ^{32}P los poliA^{+}ARNs que se
usaron en la preparación de la librería y los poliA^{+}ARNs que se
extrajeron de los tubérculos en crecimiento, y se llevó a cabo la
examinación sistemática diferencial.
\newpage
Se llevó a cabo la hibridización, el lavado y
similares tal como se describe en una referencia (Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 1995, 81,
1991-1995), y se compararon las autoradiografías que
se obtuvieron usando los dos tipos de sondas que se han descrito
arriba. Se colocaron en una placa de nuevo los clones de cADN cuyas
señales se cree que se incrementaron durante el almacenamiento
usando palillos y se llevó a cabo de nuevo la hibridización. Se
midieron las señales en las autoradiografías con un densitómetro. Se
seleccionaron primero los clones cuyas señales incrementaron
prominentemente y se aisló un clon (CIP353) que no se hibridizaba
con mARNs en órganos (hoja, tallo, raíz y callo) que no fueran un
tubérculo.
Ejemplo
2
Se extrajeron los ARNs totales a partir de varios
tejidos de patata (tubérculo, hoja, tallo y raíz de la variedad
Toyoshiro y células cultivadas de la variedad Kennebec) mediante el
método SDS-fenol. Se separaron los ARNs obtenidos (3
\mug/división) mediante electroforesis en gel con glioxal
(Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Segunda edición, Cold
Spring Harbor Laboratory, 1989) y se transfirieron a la membrana
Gene-screen Plus (Du Pont). Como una sonda, se usó
el fragmento EcoRI (longitud total) del cADN (CIP353), que se
marcó mediante el método multiprimer (Molecular Cloning: A
Laboratory Manual/Segunda edición, Cold Spring Harbor
Laboratory, 1989). Se llevó a cabo la transferencia de las bandas
hacia la membrana, la hibridización, el lavado y similares de
acuerdo con las instrucciones que se adjuntan a la membrana
Gene-screen (Du Pont). Se muestran los resultados en
las Tablas de la
1 a la 3.
1 a la 3.
\vskip1.000000\baselineskip
| Órgano | Nivel de mARN |
| Hoja*1 | \pm |
| Tallo*1 | \pm |
| Raíz*1 | \pm |
| Células Suspendidas*2 | \pm |
| Tubérculo en Crecimiento | \pm |
| Tubérculo Almacenado en Frío durante 7 meses | +++++ |
| *1: originado a partir de plántulas que se cultivaron in vitro. | |
| *2: variedad Kennebec. Para los otros, se utilizó la variedad Toyoshiro. |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Período de Almacenamiento | 2 semanas | 4 semanas | 2 meses | 3 meses |
| 20ºC | \pm | \pm | \pm | \pm |
| 15ºC | \pm | \pm | \pm | \pm |
| 12ºC | \pm | \pm | \pm | \pm |
| 9ºC | \pm | \pm | \pm | \pm |
| 6ºC | ++ | ++ | + (+) | + (+) |
| 3ºC | + (+) | +++ | +++ (+) | ++++ |
| Almacenados a 20ºC durante 1 semana después de almacenados a 6ºC durante 2 meses \pm | ||||
| Almacenados a 20ºC durante 2 semanas después de almacenados a 6ºC durante 2 meses \pm | ||||
| Almacenados a 20ºC durante 4 semanas después de almacenados a 6ºC durante 2 meses \pm |
| Período de Almacenamiento | 3 meses | 5 meses | 6 meses |
| 20ºC | - | - | \pm |
| 6ºC | + (+) | +++ | + (+) |
| 3ºC | ++++ | +++++ | ++++ |
| Almacenados a 20ºC durante 1 mes después de almacenados a 3ºC durante 5 meses \pm | |||
| Almacenados a 20ºC durante 1 mes después de almacenados a 6ºC durante 5 meses \pm | |||
| Almacenados a 3ºC durante 1 mes después de almacenados a 20ºC durante 5 meses +++ | |||
| Almacenados a 6ºC durante 1 mes después de almacenados a 20ºC durante 5 meses + (+) | |||
| Brote germinado a partir de los tubérculos almacenados a 20ºC durante 5 meses \pm | |||
| Brote germinado a partir de los tubérculos almacenados a 6ºC durante 5 meses + (+) |
Como es aparente a partir de las tablas, la sonda
que se ha mencionado arriba no se hibridizó sustancialmente con los
mARNs en tubérculos, hojas, tallos y raíces de patatas en
crecimiento normal y en células cultivadas. Además, se observó
hibridización en los tubérculos de patata que se almacenaron durante
5 - 6 meses a una temperatura no superior a 6ºC, mientras que no se
observó sustancialmente hibridización en los tubérculos de patata
que se almacenaron durante 5 - 6 meses a una temperatura no superior
a 9ºC.
Ejemplo
3
Se usaron como materiales retoños estériles que
se cultivaron en el medio de agar de Linsmaier y Skoog (Physiol.
Plant 1965, 18, 100-127) a 20ºC,
3000 lux, bajo iluminación durante 16 horas al día durante 3 - 4
semanas. Se situaron los retoños a 3ºC o 20ºC y se cultivaron bajo
iluminación durante 16 horas al día y 3000 lux durante 4 semanas. Se
tomaron muestras (hoja, tallo y raíz separadamente), 0, 2, y 4
semanas a partir del comienzo del cultivo, y se extrajeron de ellas
los ARNs. Se realizó el análisis Northern tal como se ha descrito
arriba. Se muestran los resultados en las Tablas 4 y 5.
| Período de Almacenamiento | no almacenado | 2 semanas | 4 semanas |
| Hoja*1 | - | - | (\pm) |
| Tallo*1 | - | - | (\pm) |
| Raíz*1 | (\pm) | \pm | \pm |
| *1: originado a partir de plántulas que se cultivaron in vitro |
\vskip1.000000\baselineskip
| Período de Almacenamiento | no almacenado | 2 semanas | 4 semanas |
| Hoja*1 | - | \pm | \pm |
| Tallo*1 | - | \pm | + |
| Raíz*1 | (\pm) | \pm | \pm |
| *1: originado a partir de plántulas que se cultivaron in vitro |
Como es aparente a partir de las tablas, aunque
se observó ligeramente la hibridización en hojas, tallos y raíces
almacenados a 3ºC, la cantidad de mARN hibridizado era mucho más
pequeña que en los tubérculos almacenados a la misma
temperatura.
\newpage
Ejemplo
4
Se prepararon los ADNs mediante el método de
fenol caliente a partir de hojas jóvenes de la variedad de patata
Toyoshiro, la variedad de tomate House Odoriko, la variedad de
tabaco F104, la variedad de maíz A188 y la variedad de arroz
Asanohikari. Se digirieron los ADNs (10 \mug) que se extrajeron de
cada una de las variedades con el enzima de restricción EcoRI
o HindIII (En el ensayo del número de copia en el genoma de
patata, también se usaron BamHI, BglII, EcoRV y
XbaI además de los enzimas de restricción que se han
mencionado arriba. Todos los enzimas de restricción que se usaron
estaban disponibles comercialmente en Takara y se sometió lo
resultante a electroforesis en gel con agarosa, seguido de la
transferencia de las bandas (Molecular cloning: A Laboratory
Manual/Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) a
la membrana Hybond N^{+} (Amersham Japan). Se uso como sonda el
fragmento EcoRI (longitud total) del cADN (CIP353), que se
marcó mediante el método multiprimer, y se llevó a cabo la
hibridización como en el Ejemplo 1.
Como resultado, se confirmó que el gen era un gen
de una sola copia. Además, no se observaron bandas en el arroz, el
maíz y el tabaco, y se observaron en el tomate.
Ejemplo
5
Se extrajeron ADNs de hojas jóvenes de la
variedad de patata Toyoshiro, mediante el método de fenol caliente,
y se digirieron parcialmente 100 \mug de los ADNs obtenidos con
0,0078 unidades o 0,0156 unidades del enzima de restricción Sau3AI
(Takara) durante 1 hora (como el tampón de reacción, se usó aquél
que estaba incluido en el producto comercial de Takara). Se paró la
reacción mediante EDTA a una concentración final de 40 mM y se
sometió el producto de reacción a extracción en fenol/cloroformo y
precipitación en etanol, seguido de la disolución de los ADNs
digeridos en 150 \mul de TE. Se trataron los ADNs a 65ºC durante
10 minutos y se superpusieron sobre un gradiente de densidad de
sucrosa de 10 - 40% (preparado superponiendo secuencialmente
soluciones de sucrosa al 40%, 32,5%, 25%, 17,5% y 10% en un tampón
que contenga Tris 20 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM y NaCl 200 mM). Se
centrifugó lo resultante a 20,000 rpm a 20ºC durante 17 horas o más
usando el rotor Hitachi SRP28SA, y se fraccionó en 0,5 ml cada uno,
seguido del análisis sobre gel de agarosa al 0,5%. Se combinaron las
fracciones que contenían fragmentos de ADN que tenían un tamaño de
no menos de 15 kb y se concentraron mediante precipitación en
etanol. Entonces se ligaron 0,4 \mug de alícuota de lo resultante
con 1 \mug de \lambdaDASHII/BamHI (Stratagene) y se sometió el
producto obtenido al empaquetamiento usando GigapackII Gold
(Stratagene). Se llevaron a cabo las reacciones de ligamiento y
empaquetamiento de acuerdo con las instrucciones que se adjuntan al
producto comercial de Stratagene. Se examinaron sistemáticamente
800.000 clones aproximadamente como en el Ejemplo 1 con la sonda que
es el framento de EcoRI (longitud total) del cADN (CIP353),
que se marcó mediante el método multiprimer (Molecular cloning: A
Laboratory Manual/Segunda Edición, Cold Spring Harbor
Laboratory, 1989), para obtener dos clones positivos
(LCIP2-10 y LCIP1-2). Se llevó a
cabo la extracción de los ADNs del fago y la subclonación en el
vector plásmido tal como se describe en una referencia (Molecular
cloning: A Laboratory Manual/Segunda Edición, Cold Spring Harbor
Laboratory, 1989).
Ejemplo
6
Como resultado del análisis de las secuencias de
ADN de los dos clones genómicos, se encontraron diferencias en
varios nucleótidos en la región en dirección 5' no translacional del
ATG. En consecuencia, se prepararon los oligonucleótidos sintéticos
12S (5'-GAAAAAGGAAATAAAAA-3',
específico para el mARN originado a partir del
LCIP1-2, Tm = 43ºC) y 210S
(5'-GAAAAAATTAAGAGTAAC-3',
específico para el mARN originado a partir del
LCIP2-10, Tm = 45ºC), y se realizó el PCR con
transcripción inversa usando los oligonucleótidos sintéticos y un
cebador antisentido 325aR del lado 3' (usado para ambos mARNs,
5'-ATCACTAGCAACGGGCAT-3', Tm = 54ºC)
originado a partir de la secuencia interior del cADN.
Como material para el PCR con transcripción
inversa, se usaron 10 \mug de los ARNs totales originados a partir
de varios tejidos de la variedad de patata Toyoshiro. Se mezclaron
los ARNs con 500 ng de oligo-dT (se añadió agua
hasta un volumen total de 55 \mul) y se trató la mezcla obtenida a
70ºC durante 10 minutos. Se mezcló lo resultante con una solución de
reacción (20 \mul del tampón 5x1ª hebra (BRL), 5 \mul de dNTPs
10 mM, 10 \mul de DTT 100 mM, 5 \mul de inhibidor de RNasa
(Pharmacia), y 5 \mul de Superscript RTasa (BRL) (volumen total de
100 \mul), y se permitió que la mezcla obtenida reaccionara a 37ºC
durante 1 hora, seguido del tratamiento a 95ºC durante 5 minutos
para obtener cADNs de una sola hebra que se usaron como plantillas
en el PCR con transcripción inversa (se asumió que el nivel de cADN
en esta solución era 100 ng/ \mul).
Se realizó la reacción PCR (1 - 100 ng de cADNs,
10 pmol x 2 de cebadores, 1,6 \mul de dNTPs 2,5 mM, 2 \mul de
tampón 10xPCR (Takara), 0,2 \mul de rTaq (Takara), volumen total
de 20 \mul), usando 1 - 100 ng de los cADNs sintetizados como
plantillas. Cuando se usaron los cebadores 12S y 325aR que se han
mencionado arriba, se llevó a cabo la reacción repitiendo 30 veces
el ciclo térmico de 94ºC durante 30 segundos, 45ºC durante 30
segundos y 72ºC durante 60 segundos. Cuando se usaron los cebadores
210S y 325aR que se han mencionado arriba, se llevó a cabo la
reacción repitiendo 30 veces el ciclo térmico de 94ºC durante 30
segundos, 47ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 60 segundos. Se
analizaron los productos de PCR mediante electroforesis en gel con
agarosa. Se muestran los resultados en la Tabla 6. En esta tabla,
LCIP2-10 corresponde a la secuencia que se muestra
en la ID. SEC. Núm. 1 en el Listado de Secuencias que se describe
aquí abajo, y LCIP1-2 corresponde a la secuencia ID.
SEC. Núm. 2. Tal como es aparente en la tabla, se observó una
expresión sobresaliente sólo en los tubérculos que se almacenaron a
temperaturas bajas durante un largo tiempo para ambos mARNs
originados a partir de los ADNs genómicos. A partir de esto, se ve
que las dos secuencias que muestran en las ID. SEC. Núm. 1 y 2
tienen actividades promotoras inducibles por frío.
| LCIP2-10 mARN | LCIP1-2 mARN | |
| Hoja*1 almacenada a 20ºC durante 4 semanas | (\pm) | - |
| Tallo*1 almacenado a 20ºC durante 4 semanas | (\pm) | - |
| Raíz*1 almacenada a 20ºC durante 4 semanas | (\pm) | (\pm) |
| Hoja*1 almacenada a 3ºC durante 4 semanas | \pm | (\pm) |
| Tallo*1 almacenado a 3ºC durante 4 semanas | + | (\pm) |
| Raíz*1 almacenada a 3ºC durante 4 semanas | (\pm) | \pm |
| Brote germinado a partir del tubérculo almacenado a 20ºC durante 5 meses | + | + |
| Brote germinado a partir del tubérculo almacenado a 6ºC durante 5 meses | + (+) | + |
| Tubérculo en crecimiento | (\pm) | \pm |
| Tubérculo maduro inmediatamente después de la cosecha | - | - |
| Tubérculo (maduro) almacenado a 20ºC durante 5 meses | - | - |
| Tubérculo almacenado a 3ºC durante 5 meses | ++ (+) | +++ |
| *1: originado a partir de plántulas que se cultivaron in vitro |
Ejemplo
7
Se llevó a cabo la reacción de secuenciación y la
secuenciación mediante el método dideoxi (ABI, Taq DyeDeoxy
Terminator Cycle Sequencing Kit) usando un ADN de plásmido como
plantilla, usando un secuenciador de ADN (ABI, 373A). Se llevó a
cabo el análisis de las secuencias usando un software GENETYX
(Software Development Co., Ltd).
Como resultado, uno de los dos clones genómicos
contenía la secuencia que se muestra en la ID. SEC. Núm. 1 y el otro
clon contenía la secuencia que se muestra en la ID. SEC. Núm. 2.
Además, el clon de cADN que se ha descrito arriba (CIP353) contenía
la secuencia que se muestra en la ID. SEC. Núm. 3.
Ejemplo
8
Se digirió el clon genómico
LCIP2-10 con un enzima de restricción Asp718
(Boehringer) y se introdujo un fragmento de Asp718 que contenía
aproximadamente 200 bp en dirección 5' del codón ATG de iniciación
en un plásmido pUC19 para obtener un plásmido recombinante p210A8.
Se realizó el PCR (94ºC durante 20 segundos, 55ºC durante 30
segundos, 72ºC durante 60 segundos, 25 ciclos) usando este plásmido
(p210A8) como una plantilla y usando el cebador RV M13 (Takara) y el
primer 210A
(5'-GTTACTCTTAATTTTTTC-3'). Se
subclonó el producto amplificado en un vector de clonación TA
(Invitrogen) para preparar un vector p210Pro (200) que contenía sólo
200 bp en dirección 5' aproximadamente del codón ATG de iniciación.
A partir de este vector, se aisló el fragmento que contenía
aproximadamente 200 bp en dirección 5' del codón ATG de iniciación
mediante la digestión con los enzimas de restricción HindIII
y XhoI (Takara) y se insertó en el HindIII, el site
SalI de pHSG399 (Takara) para obtener un plásmido pHSG210
(200). Se digirió este plásmido con HindIII y BamHI
(Takara) y se insertó el fragmento aislado de aproximadamente 200 bp
en dirección 5' del codón ATG en la región 5' en dirección 5' de
un vector (pLUC101) que se preparó sustituyendo el gen de la
\beta-glucuronidasa del vector pBI101 (Clonetech)
con un gen luciferasa (Science 1986, 234,
856-859) para obtener pLUC210 (200). Por otra parte,
se insertó el fragmento de XbaI (Takara) que contenía
aproximadamente 1000 bp en dirección 5' del codón ATG de iniciación
del clon genómico LCIP2-10 en el vector pUC18 para
obtener un vector (p210X1) y se aisló un fragmento de 800 bp
(aproximadamente desde -200 hasta -1000 bp, en dirección 5' del
codón ATG) de este vector mediante la digestión con el enzima de
restricción Asp718. Se insertó este fragmento en el sitio Asp718 de
pLUC210(200) para obtener un vector pLUC210 (1000) para la
transformación, vector que contenía la región promotora de
aproximadamente 1 kb y un gen luciferasa como reportero. Se
introdujeron los vectores para la transformación (pLUC101 y
pLUC210(1000)) en una bacteria Agrobacterium
tumefaciens LBA4404 mediante la conjugación triparental
(Plant Gene Manipulation Manual, Kodansha, 1990) y se usó lo
resultante para la transformación de plantas.
Se llevó a cabo la transformación de la patata de
acuerdo con una referencia (Japanese Laid-open
Patent Application (Kokai) Núm. 6-133783). Se usaron
como materiales tallos y hojas de la variedad de plantas Toyoshiro
que se propagaron asépticamente en el medio de agar de Linsmaier y
Skoog (Physiol. Plant. 1965, 18,
100-127). Se cortaron estos tejidos en segmentos del
tamaño apropiado y se cultivaron con Agrobacterium durante 2
días. Después de esto, se colocaron los tejidos en el medio de agar
de Linsmaier y Skoog (Physiol. Plant. 1965, 18,
100-127) que contenía 0,1 mg/l de ácido
indoleacético, 1,0 mg/l de ribósido de zeatina, 100 mg/l de
kanamicina y 250 mg/l de cefotaxima y se cultivaron a 20ºC bajo
iluminación durante 16 horas por día. Se subcultivaron las plantas
regeneradas en el medio de agar de Linsmaier y Skoog (Physiol.
Plant. 1965, 18, 100-127) que
contenía 100 mg/l de kanamicina.
Se cortaron los transformantes adultos en
secciones individuales y se cultivaron las secciones en el medio
líquido de Linsmaier y Skoog (Physiol. Plant. 1965,
18, 100-127) desde 3 hasta 4 semanas (20ºC,
16 horas de iluminación por día). Entonces se sustituyó el medio por
el medio líquido de Linsmaier y Skoog (Physiol. Plant.
1965, 18, 100-127) que contenía 80 g/l
de sucrosa y se cultivaron las plantas a 20ºC en la oscuridad
durante 4 ó 5 semanas o más. Se lavaron los microtubérculos formados
con agua, se secaron y se situaron en placas de petri, y se
almacenaron a 20ºC o 4ºC en la oscuridad. También se sometieron las
plantas que crecían en el medio de agar de Linsmaier y Skoog
(Physiol. Plant. 1965, 18,
100-127) a la prueba de almacenamiento en la
oscuridad a 20ºC o 4ºC.
Se midió la actividad de la luciferasa de acuerdo
con una referencia (Science 1986, 234,
856-859). Se añadió un tampón de extracción (tampón
de fosfato potásico 100 mM (pH 7,5) que contenía ditiotreitol 1mM) a
los tejidos de la planta en una cantidad de 3 - 10 veces el peso
fresco de los tejidos. Se molió y se centifrugó la mezcla obtenida
(15.000 rpm, 5 minutos), y se recuperó el sobrenadante como un
extracto crudo. Entonces se mezclaron 50 \mul del extracto crudo y
100 \mul de un tampón para medir la actividad (tampón de
glicilglicina 36 mM (pH 7,8) que contenía 1 mg/ml de albúmina de
suero bovino, cloruro de magnesio 20 mM, ATP 12 mM) y se añadió
luciferina 0,4 mM, seguido de la medida de la actividad de la
luciferasa con un luminómetro (Modelo 6100, Packard). Se muestran
los resultados en las Tablas 7 y 8.
| Línea | Constructo Usado para la | Condiciones de | Actividad de la Luciferasa |
| Transformación | Almacenamiento | (cps/mg de proteína) | |
| LUC1000-1-1 | pLUC210 (1000) | No almacenado | 25900 |
| LUC1000-1-1 | pLUC210 (1000) | 4ºC, 4 semanas | 36000 |
| Línea | Constructo Usado para la | Condiciones de | Actividad de la Luciferasa |
| Transformación | Almacenamiento | (cps/mg de proteína) | |
| LUC101-2-1 | pLUC 101* | No almacenado | 217 |
| LUC101-2-1 | pLUC 101* | 20ºC, 4 semanas | 166 |
| LUC101-2-1 | pLUC 101* | 4ºC, 4 semanas | 245 |
| LUC1000-1-1 | pLUC 210 (1000) | No almacenado | 78200 |
| LUC1000-1-1 | pLUC 210 (1000) | 20ºC, 4 semanas | 23800 |
| LUC1000-1-1 | pLUC 210 (1000) | 4ºC, 4 semanas | 149000 |
| *: constructo sin presencia de promotor, control. |
Como es aparente a partir de las tablas, se
observó un incremento sobresaliente en la actividad en los
microtubérculos almacenados a una temperatura baja (4ºC) durante 4
semanas. Además, aunque la actividad era más baja que en los
microtubérculos, la actividad en las hojas aumentó ligeramente a una
temperatura baja. En consecuencia, se demostró que la secuencia de
ADN (secuencia promotora) que era la región desde el nucleótido 2418
hasta el 3541º en la secuencia que se muestra en la ID. SEC. Núm. 1
tenía una función para inducir la expresión de los genes a
temperaturas bajas.
| ID. SEC. Núm.: 1 |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 3600 |
| TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico |
| CARACTERÍSTICA DE LA HEBRA: doble |
| TOPOLOGÍA: lineal |
| TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: |
| \hskip1cm ORGANISMO: patata (Solanum tuberosum L.) |
| \hskip1cm VARIEDAD: Toyoshiro |
| FUENTE INMEDIATA |
| LIBRERÍA: librería genómica de ADN \lambdaDASHII originada a partir del ADN genómico en la hoja verde |
| CARACTERÍSTICA: |
| DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| ID. SEC. Núm.: 2 |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 4140 |
| TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico |
| CARACTERÍSTICA DE LA HEBRA: doble |
| TOPOLOGÍA: lineal |
| TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: |
| \hskip1cm ORGANISMO: patata (Solanum tuberosum L.) |
| \hskip1cm VARIEDAD: Toyoshiro |
| FUENTE INMEDIATA |
| LIBRERÍA: librería genómica de ADN \lambdaDASHII originada a partir del ADN genómico en la hoja verde |
| CARACTERÍSTICA: |
| DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA |
\vskip1.000000\baselineskip
| ID. SEC. Núm.: 3 |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1132 |
| TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico |
| CARACTERÍSTICA DE LA HEBRA: doble |
| TOPOLOGÍA: lineal |
| TIPO DE MOLÉCULA: cADN |
| FUENTE ORIGINAL: |
| \hskip1cm ORGANISMO: patata (Solanum tuberosum L.) |
| \hskip1cm VARIEDAD: Toyoshiro |
| FUENTE INMEDIATA |
| LIBRERÍA: librería de cADN \lambdagt10 originada a partir de mARNs en tubérculos almacenados en frío |
| CARACTERÍSTICA: |
| \hskip1cm CARACTERÍSTICA QUE EXPRESA LOS SÍMBOLOS: CDS |
| \hskip1cm SITUACIÓN: 45-836 |
| \hskip1cm CARACTERÍSTICA QUE DETERMINA EL MÉTODO: |
| DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (5)
1. Una secuencia de ADN que tiene una secuencia
de nucleótidos desde el primer nucleótido hasta el 3546º en la
secuencia de nucleótidos que se muestra en la ID. SEC. Núm. 1, o una
parte de ella que tiene una actividad promotora inducible por
frío.
2. Una secuencia de ADN que tiene una secuencia
de nucleótidos desde el nucleótido 2418 hasta el 3541º en la
secuencia de nucleótidos que se muestra en la ID. SEC. Núm. 1, o una
parte de ella que tiene una actividad promotora inducible por
frío.
3. Una secuencia promotora inducible por frío que
tiene una secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 2418 hasta el
3541º en la secuencia de nucleótidos que se muestra en la ID. SEC.
Núm. 1.
4. Una secuencia de ADN que tiene una secuencia
de nucleótidos desde el primer nucleótido hasta el 4120º en la
secuencia de nucleótidos que se muestra en la ID. SEC. Núm. 2, o una
parte de ella que tiene una actividad promotora inducible por
frío.
5. Uso de un fragmento de ADN que tiene como
mínimo 15 nucleótidos consecutivos en la región desde el nucleótido
45 hasta el 839º en la secuencia que se muestra en la ID. SEC. Núm.
3 en el Listado de Secuencias o una secuencia complementaria a ello,
para la preparación de una sonda para examinar sistemáticamente
promotores inducibles por frío.
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