JP3469902B2

JP3469902B2 - 低温誘導性プロモーター配列

Info

Publication number: JP3469902B2
Application number: JP52418797A
Authority: JP
Inventors: 利喜峯; 暁男大山; 徹日吉; 啓介笠岡
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1995-12-27
Filing date: 1996-12-26
Publication date: 2003-11-25
Anticipated expiration: 2016-12-26
Also published as: DK0812917T3; EP0812917A1; DE69634875T2; US6084089A; KR100452853B1; EP0812917A4; CA2213991C; KR19980702463A; AU725727B2; CN1176661A; EP0812917B1; CN1137997C; AU1208597A; WO1997024449A1; CA2213991A1; DE69634875D1; ES2243954T3; ATE298368T1

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は、低温において遺伝子発現を誘導する性質を
有するプロモーター配列に関する。本発明の低温誘導性
プロモーター配列は、低温貯蔵中のバレイショ塊茎中の
還元糖量の抑制、バレイショ塊茎の発芽抑制及び植物へ
の低温耐性の付与等に有用である。

背景技術多くの作物は、収穫後、低温等の処理により品質を長
期間維持させることが必須である。しかし、バレイショ
塊茎では低温貯蔵中にLow temperature sweeteningとい
われる還元糖蓄積が起こり、その際生成された還元糖
が、フレンチフライ、ポテトチップス等の加工製品作成
時に呈色反応（メイラード反応）を引き起こし、商品価
値を著しく低下させることが広く知られている。また、
果実などではエチレン生成による軟化等が知られてお
り、これらの問題点を解決するための研究、すなわち収
穫後生理（Post−harvest physiology）は現在世界中で
広く行われている研究分野の一つである。

バレイショ塊茎で外来遺伝子を特異的に発現させる際
には、貯蔵タンパク質パタチン遺伝子のプロモーターが
世界的に広く使用されてきた（EMBO J.8（１）:23−29,
1989,Plant Mol.Biol.12:41−50,1989,Bio/Technology
12:1101−1105,1994等）。パタチン遺伝子の発現は塊茎
の生育、肥大に伴い増大するが、塊茎の肥大時は同時に
還元糖からデンプンへの転換をはじめとする種々の代謝
系が活性化している時期でもある。そのためパタチンプ
ロモーターに連結する遺伝子の種類によっては代謝系の
攪乱、さらには収量減等につながる恐れがある。このよ
うな問題を回避し、貯蔵時の品質維持を効率的に行うた
めには、通常条件下の植物体中では発現量が少なく、低
温貯蔵中の塊茎でのみ効率的な発現を可能にするプロモ
ーターを単離、利用することが必要と思われる。

低温誘導性遺伝子は、原核、真核生物を問わず、数多
くの種類が単離、報告されている（総説として、組織培
養19（10）:357−361,1993等がある）。また、バレイシ
ョ塊茎からも単離例がある（Plant Physiol.104:445−4
52,1994）。同じSolanum属植物からはオスモチン類似遺
伝子が単離され、これが低温で誘導されることが報告さ
れている（Plant Mol.Biol.21:729−735,1993）。バレ
イショ塊茎からの単離例は、上記１報のみである。

バレイショ塊茎から低温誘導性遺伝子（cDNA）は５種
類単離されており（Plant Physiol.104:445−452,199
4）、そのうち２種は他種植物のsmall heat−shock pro
teinあるいは他種植物低温誘導タンパク質、ABA誘導タ
ンパク質等の遺伝子と類似性が見いだされている。他の
３種については未解析である。これらcDNAの核遺伝子
（プロモーターを含む）は報告されていない。これらは
いずれも低温に対する反応が早い（１週間以内に反応す
る）遺伝子と思われる。

上記既知遺伝子のプロモーターを低温貯蔵する必要が
ある作物（バレイショ等）に応用することはもちろん可
能である。しかし、これらプロモーター（Plant Physio
l.104:445−452,1994等）が目的とする器官にのみ高発
現を誘導するかは明かではない（低温時に他の器官でも
誘導される可能性がある）。また、常温下においてもあ
る程度発現する可能性がある。すなわち、これら既知遺
伝子プロモーターが低温条件下のバレイショ塊茎等、貯
蔵を目的とする器官でのみ効率的な遺伝子発現を行える
かは明かではない。また、バレイショ塊茎の貯蔵期間は
数カ月間の長期に及ぶため、その間上記プロモーターが
機能するかどうかは不明である（Plant Physiol.104:44
5−452,1994、この文献では１カ月程度しか調査してい
ない。）。

発明の開示本発明の目的は、バレイショ塊茎中で、低温下におい
て遺伝子発現が誘導されるが、塊茎以外の他の器官及び
常温下においてはほとんど誘導されず、かつ、発現が５
カ月以上の長期にわたって持続する、新規な低温誘導性
プロモーターを提供することである。

さらに本発明は、バレイショもしくは他の植物中に存
在する新たな低温誘導性プロモータを見いだすためのプ
ローブとして有用なDNA断片を提供することも目的とす
るものである。

本願発明者らは、鋭意研究の結果、バレイショ塊茎中
で、低温下において遺伝子発現が誘導されるが、塊茎以
外の他の器官及び常温下においてはほとんど誘導され
ず、かつ、発現が５カ月以上の長期にわたって持続す
る、新規な低温誘導性プロモーター配列を見出し、か
つ、その塩基配列を決定することに成功し、本発明を完
成した。

すなわち、本発明は、配列表の配列番号１で表される
塩基配列のうち、第１番目〜第3546番目の塩基から成る
配列若しくは低温誘導性プロモーター活性を有するその
一部、又はこれらの配列のうち１個若しくは数個のヌク
レオチドが欠失し、置換し若しくはこれらの配列に１個
若しくは数個のヌクレオチドが挿入若しくは付加され
た、低温誘導性プロモーター活性を有するDNAを提供す
る。

また、本発明は、配列表の配列番号２で表される塩基
配列のうち、第１番目〜第4120番目の塩基から成る配列
若しくは低温誘導性プロモーター活性を有するその一
部、又はこれらの配列のうち１個若しくは数個のヌクレ
オチドが欠失し、置換し若しくはこれらの配列に１個若
しくは数個のヌクレオチドが挿入若しくは付加された、
低温誘導性プロモーター活性を有するDNAを提供する。

本発明により、バレイショ塊茎中で、低温下において
遺伝子発現が誘導されるが、塊茎以外の他の器官及び常
温下においてはほとんど誘導されず、かつ、発現が５カ
月以上の長期にわたって持続する、新規な低温誘導性プ
ロモーター配列が提供された。本発明のプロモーター配
列を利用することにより、低温貯蔵中のバレイショ塊茎
中の還元糖量の抑制、バレイショ塊茎の発芽抑制及び植
物への低温耐性の付与等が可能になる。

図面の簡単な説明図１は、LCIP2−10プロモータ導入のためのコンスト
ラクト作製手順を示した説明図である。

発明を実施するための最良の形態本発明の低温誘導性プロモーター配列は、配列表の配
列番号１で示される塩基配列のうち、第１番目〜第3546
番目の塩基から成る配列、又は配列番号２で示される塩
基配列のうち第１番目〜第4120番目の塩基から成る配列
中に含まれる。これらの配列は、その全体でも低温誘導
性プロモーター活性を発揮するが、これらの配列中の一
部であっても低温誘導性プロモーター活性を発揮するも
の、例えば、配列表の配列番号１に示される塩基配列の
うち、第2418番目〜第3541番目の塩基から成る配列等は
本発明の範囲に含まれる。また、この配列番号１の配列
中の第2418番目〜第3541番目の塩基からなる配列を含む
配列であって低温誘導性プロモータ活性を有するものも
本発明の範囲に含まれるものである。

なお、配列表の配列番号１の第3547番目〜第3549番
目、又は配列番号２の第4121番目〜4123番目の「ATG」
は翻訳開始コドンである。また、配列番号１で示される
配列の第3503番目以降のmRNA（cDNA）配列が、これがコ
ードする推定アミノ酸配列と共に配列番号３に示されて
いる。

本明細書において、「低温誘導性」とは、プロモータ
ーによる遺伝子の発現が６℃以下の温度において誘導さ
れ、かつ、温度を６℃以下に維持すれば、その発現が５
カ月以上持続することを意味する。

一般に、生理活性を有するDNAの塩基配列が小さく変
更された場合、すなわち、該塩基配列の中の１又は複数
のヌクレオチドが置換され若しくは欠失し又は１又は複
数のヌクレオチドが付加若しくは挿入された場合でも、
該DNAの生理活性が維持される場合があることは周知の
事実である。従って、上記した本発明の低温誘導性プロ
モーター配列にこのような修飾が加えられ、かつ、低温
誘導性プロモーター活性を有するDNAも本発明の範囲内
に含まれる。すなわち、配列表の配列番号１で表される
塩基配列のうち、第１番目〜第3546番目の塩基から成る
配列若しくは低温誘導性プロモーター活性を有するその
一部に加え、これらの配列のうち１個又は数個のヌクレ
オチドが欠失し、置換し又はこれらの配列に１個又は数
個のヌクレオチドが挿入若しくは付加された、低温誘導
性プロモーター活性を有するDNAも本発明の範囲に含ま
れる。また、この配列の一部である第2417番目〜第3541
番目の塩基から成る配列若しくは低温誘導性プロモータ
ー活性を有するその一部に加え、これらの配列のうち１
個又は数個のヌクレオチドが欠失し、置換し又はこれら
の配列に１個又は数個のヌクレオチドが挿入若しくは付
加された、低温誘導性プロモーター活性を有するDNAも
本発明の範囲に含まれる。

同様に、配列表の配列番号２で表される塩基配列のう
ち、第１番目〜第4120番目の塩基から成る配列若しくは
低温誘導性プロモーター活性を有するその一部に加え、
これらの配列のうち１個又は数個のヌクレオチドが欠失
し、置換し又はこれらの配列に１個又は数個のヌクレオ
チドが挿入若しくは付加された、低温誘導性プロモータ
ー活性を有するDNAも本発明の範囲に含まれる。

ヌクレオチドの付加、挿入、欠失又は置換は、例え
ば、周知技術である部位特異的変異誘発（例えばNuclei
c Acid Research,Vol.10,No.20,p6487−6500,1982）に
より実施することができ、本明細書において「１又は複
数のヌクレオチド」とは、部位特異的変異誘発法により
付加、挿入、欠失又は置換できる程度の数、すなわち、
１個ないし数個のヌクレオチドを意味する。

部位特異的変異誘発は、例えば、所望の変異である特
定の不一致の他は変異を受けるべき一本鎖ファージDNA
に相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて
次のように行うことができる。すなわち、プライマーと
して上記合成オリゴヌクレオチドを用いてファージに相
補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖DNAでファージ担
持性宿主細菌を形質転換する。形質転換された細菌の培
養物を寒天にプレートし、ファージを含有する単一細胞
からプラークを形成せしめる。そうすると、理論的に
は、50％の新コロニーが単鎖として変異を有するファー
ジを含有し、残りの50％が元の配列を有する。得られた
プラークを、上記所望の変異を有するDNAと完全に一致
するものとはハイブリッド形成するが、もとの鎖を有す
る不一致のものとはハイブリッド形成しない温度におい
て、キナーゼ処理された合成プローブとハイブリッド形
成せしめる。次に該プローブとハイブリド形成するプラ
ークを拾い、培養し、DNAを回収する。

なお、プロモーター配列に、低温誘導性プロモーター
活性を喪失せしめない１又は複数のヌクレオチドの置
換、欠失、付加又は挿入の方法としては、上記の部位特
異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異原で処理する方法
及び遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオ
チドを除去、付加、又は置換し、次いで連結する方法も
ある。

下記実施例において詳述するように、配列番号１及び
２に示される塩基配列は、次のような過程を踏んで決定
されたものである。

（１）長期間４℃で保存した塊茎由来のcDNAライブラリ
ーを作製し、生育中の種々のバレイショ組織（葉、茎、
根、カルス、生育中の塊茎）のmRNAとハイブリせず（厳
密ではない）、低温貯蔵中の塊茎mRNAとハイブリするcD
NAクローンを単離し、塩基配列を決定および解析した。

（２）上記（１）で使用したRNAを用いてノーザン分析
を行い、通常条件下で生育中のバレイショ植物体では殆
ど発現が認められないことを再度確認した。

（３）収穫後の塊茎を様々な温度（３、６、９、12、1
5、20℃）で長期（５〜６カ月程度）貯蔵し、これらの
塊茎から抽出したRNAを用いて、低温で誘導されるか、
どの温度以下にすれば誘導されるか、どれくらいの期間
発現しているか、低温から常温に戻すことにより発現が
解除されるか等をノーザン法によりチェックした。その
結果、６℃以下の低温で誘導され、発現は長期（少なく
とも５−６カ月）持続し、低温から常温に戻すことによ
り発現が解除されること等を確認した。

（４）低温下で塊茎以外の組織にも発現が誘導されるか
どうかをバレイショin vitro植物体を用いてチェックし
た。その結果、誘導は塊茎以外でも起こる可能性がある
が、殆ど問題にならないレベルと思われた（低温処理塊
茎に比べ著しく変化が少ない）。

（５）サザン分析により、シングルコピー遺伝子である
ことを確認した。また、イネ、トウモロコシ、タバコ等
ではバンドが検出されず、他植物としてはトマトに検出
された。

（６）ゲノムクローンを２種単離した。１つは開始ATG
前後の配列がcDNA配列と完全に一致する。もう一つは完
全には一致しないが、高い相同性を有し、同じ機能を有
する別の座位（locus）の遺伝子をコードするものと考
えられた。逆転写PCRにより解析した結果、２種の遺伝
子の発現パターンは殆ど同じと考えられた。

（７）ゲノムクローンのATG上流域の塩基配列解析の結
果、低温誘導性蛋白質でよく見受けられるABA誘導（反
応）モチーフは発見されず、GA反応モチーフが何れのク
ローンにも見受けられた。単離した２種のゲノムクロー
ンは、ATG上流約500bpまではお互いに高い相同性（80.3
％）を有していたが、その上流では高い相同性を示す領
域は見い出せなかった。

（８）単離したゲノムクローン２種のうち１種のプロモ
ーター配列の一部をルシフェラーゼ遺伝子（Science 23
4:856−859,1986）をレポーターとしてバレイショに導
入した。得られた形質転換体より作出したマイクロチュ
ーバーの低温貯蔵試験を行い、プロモーターの低温誘導
性を確認した。また、形質転換体の葉においてもわずか
ながら低温誘導性が見いだされた。

本発明のプロモーター配列は、（１）〜（８）の過程
からなる、下記実施例において詳述する方法により得る
ことができる。また、本発明により、該プロモーター配
列の塩基配列が明らかになったので、該プロモーター配
列を含むDNAは、バレイショのゲノムを鋳型とするPCR法
等により容易に得ることができる。

配列番号１ないし２に記載されている配列は、公知の
バレイショ塊茎由来の低温誘導性遺伝子とは相同性がな
い。従って、本発明のプロモーター配列は、公知のもの
とは異なるタイプの新規なプロモーター配列であると考
えられる。

また、本発明の低温誘導性プロモーター配列は、常温
（20℃）で生育中の葉、根、茎、塊茎では遺伝子発現が
非常に弱い。収穫した塊茎を低温（６℃以下）におくこ
とにより発現が誘導される。低温処理により塊茎以外の
器官（葉、茎、根）でも誘導されるが、わずかである。
ただし、低温貯蔵した塊茎からの萌芽にはかなり誘導さ
れる。一方、既報（Plant Physiol.104:445−452,199
4）では塊茎以外の器官についての発現までは言及して
いない。本発明の遺伝子は厳密な意味での低温貯蔵塊茎
特異的遺伝子とはいえないが、それに近いものと考えら
れ、収穫後の品質維持等に効果的な遺伝子（プロモータ
ー）といえる。

本発明の低温誘導性プロモーター配列は、低温で遺伝
子発現が誘導され、常温に戻すと発現が解除される。文
献（Plant Physiol.104:445−452,1994）の分類によれ
ば本遺伝子は、低温に対する反応が遅いグループに属す
るものと考えられる（低温処理１週間程度では発現がプ
ラトーに達することはない。van Berkelら（Plant Phys
iol.104:445−452,1994）は、このグループに属する遺
伝子の単離には成功していない）。従って、温度による
発現制御が可能である。

本発明の低温誘導性プロモーター配列は、低温貯蔵時
に長期間発現を誘導（少なくとも５カ月）する。一方、
既報（Plant Physiol.104:445−452,1994）の遺伝子で
は確認されていない。本発明のプロモーター配列を用い
ることにより長期の遺伝子制御が可能となる。

他の植物であるイネ、トウモロコシ、タバコには、本
発明の遺伝子と相同性の高い遺伝子は見受けられなかっ
た。トマトには存在する。従って、イネ、トウモロコ
シ、タバコ等への遺伝子導入に本発明のプロモーターを
使用することにより、ジーンサイレンシング（Proc.N
atl.Acad.Sci.USA,88:1770−1774,1991）の少ない遺伝
子発現を行える可能性がある。

以上のことから、本発明の低温誘導性プロモーター配
列は、下記の用途に用いることが可能である。

（ｉ）バレイショ低温貯蔵塊茎中の還元糖量の制御（還
元糖量の抑制）本発明のプロモーター配列の下流に、例えば酸性イン
ベルターゼインヒビター（Ovalle et al.,Plant Scienc
e 108（1995）133−141）遺伝子、液胞型酸性インベル
ターゼ（EMBL Data Library accession number X7694
6）アンチセンス遺伝子、PFK（EC 2.7.1.11、国際公開
番号:WO95/05457）遺伝子、スターチフォスフォリラー
ゼ（Brisson et al.,Plant Cell 1（1989）559−566;Mo
ri et al.,J.Biochem 266（1991）18446−18453,Sonnwa
ld et al.Plant Mol.Biol.27（1995）567−576）アンチ
センス遺伝子、β−あるいはα−アミラーゼ（Kreiberg
and Gaushing,12th Triennial Conerence of the Euro
pean Association for Potato Research,Abstracts（19
93）334−335）アンチセンス遺伝子、ADPグルコースポ
ロフォスフォリラーゼ（Stark et al.,Science 258（19
92）287−292）遺伝子等を連結することにより、バレイ
ショ塊茎を低温貯蔵した場合の塊茎中の還元糖量を抑制
することができる。これにより、フレンチフライやポテ
トフライに加工した時の着色が防止できる。

（ii）バレイショ塊茎の発芽抑制本発明のプロモーターは、低温で発現を誘導し、常温
に戻すと発現をストップする性質を有する。従って、例
えば酵母インベルターゼ遺伝子（Sonnewald et al.Plan
t J.1（1991）95−100）、大腸菌inorganic pyrophosph
atase遺伝子（Sonnewald,Plant J.2（1992）571−581;J
elitto et al.Planta 188（1992）238−244）、ent−ka
urene synthetase（ジベレリン生合成系遺伝子、Sun et
al.Plant Cell 4（1992）119−128）アンチセンス遺伝
子等を連結し、バレイショ、タマネギ等の植物に導入す
ることにより、低温下で遺伝子発現（発芽しない）、常
温下で発現解除（発芽する）といった生育制御を行うこ
とが可能である。

（iii）植物への低温耐性の付与低温下で、例えばグリセロール−３−リン酸アシルト
ランスフェラーゼ（Murata et al.Nature 356（1992）7
10−718）遺伝子、Flaveria brownii由来のPyruvate,or
thophosphate dikinase（PPDK,Usami et al.Plant Mol.
Biol.27（1995）969−980）遺伝子等の発現により植物
に低温耐性を付加することが可能である。

次に、本発明の他の側面である低温誘導性プロモータ
ー検索用プローブについて説明する。

本発明のプローブは、配列表の配列番号３記載の配列
のうち、第45番目〜第839番目の塩基配列中、もしくは
それらに相補的な塩基配列中の少なくとも連続する15塩
基の配列を有するDNA断片よりなるものである。上述し
た配列番号３中の第45番目〜第839番目までの配列もし
くはこの配列と相同性の高い配列は、低温誘導性プロモ
ータ配列の下流に存在する可能性が高い。したがって、
この配列もしくはその一部の配列をプローブとして用い
て植物ゲノムDNAを検索することにより、バレイショも
しくは他の植物中に存在する新たな低温誘導性プロモー
タを見いだすことが可能となる。

プローブは、上記配列に基づいて設計されるものであ
り、その長さは少なくとも連続する15塩基以上であるこ
とが好ましいが、15塩基以上であれば上記配列の全長ま
でのいずれの長さであってもよい。プローブは一本鎖で
も二本鎖でもよいが少なくとも使用時には一本鎖とな
る。さらに、上述した配列から選定されたDNA断片プロ
ーブを、上記配列もしくはこれと相同性の高い配列に対
し特異的にハイブリダイズする性質を失わないように塩
基の付加、欠失、挿入もしくは置換した配列も本発明に
含まれる。なお、この塩基配列の付加、欠失、挿入もし
くは置換の方法は、上述した本発明の低温誘導性プロモ
ーターで用いる方法と同様な方法で行なうことが可能で
ある。

本発明のプローブは、後述する実施例で詳述する方法
により得られる配列表の配列番号３に記載のDNA断片
を、適当な制限酵素によって切断することにより調製で
きる。また、この配列を含む試料を用いてPCR反応を行
なうことによって、調製することも可能である。あるい
は、市販のDNA合成機（例えば、パーキンエルマー社
製）により慣用された方法により、プローブとなる一本
鎖DNAを合成することも可能である。

本発明のプローブは慣用された方法により、例えば、
放射線同位元素、検出可能な酵素等により標識できる。
例えば³²Pを用いる場合、一般に配列表３記載のDNA断片
を用いる場合は、ランダムプライミングラベルにより標
識し、また、合成プライマーを使用する場合はリン酸化
酵素により5'末端標識すると都合がよい。

本発明のプローブを用いる際のハイブリダイゼーショ
ンは、慣用された方法により行なうことができる。一般
には、中程度のハイブリダイゼーション強度（42℃〜50
℃でハイブリダイゼーションを行い、0.1xSSCで洗浄）
によって行なう。

本発明のプローブを対象植物のゲノムライブラリーに
対して用い、ハイブリダイゼーションが検出された場合
は、この遺伝子の上流域を特定することにより新たな低
温誘導性プロモーターを得ることができる。

実施例以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明す
る。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるもので
はない。

実施例１ディファレンシャルスクリーニング（上記
（１）の過程）７ヶ月４℃で貯蔵したバレイショ塊茎（品種トヨシ
ロ）より全RNAをSDS/フェノール法により抽出し、Dynab
eads（Dynal社）によりpolyA⁺RNAを精製した。これを材
料としてcDNAを合成し、λ gt10ベクターに連結、ライ
ブラリーを作製した（Amersham λ gt10 cloning kit,A
mersham Japan）。ライブラリーの作製に使用したpolyA
⁺RNAおよび肥大中の塊茎より抽出したpolyA⁺RNAを³²Pに
より標識し、ディファレンシャルスクリーニングを行っ
た。

ハイブリダイゼーション、洗浄等は文献（Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 81:1991−1995,1984）の方法により行
い、上記２種のプローブにより得られたオートラジオグ
ラフを比較した。貯蔵中にシグナルが増大すると思われ
るcDNAクローンは、つまようじでプレーティングし直し
た後、再度ハイブリダイゼーションを行った。得られた
オートラジオグラフのシグナルをデンシトメーターによ
り測定し、シグナルの増大の著しいものをまず選抜し、
さらに、塊茎以外の器官（葉、茎、根、カルス）のmRNA
と強くハイブリダイズしないクローン（CIP353）を単離
した。

実施例２ノーザンブロット分析（上記（２）および
（３）の過程）種々のバレイショ組織（品種トヨシロの塊茎、葉、
茎、根および品種ケネベックの培養細胞）より総RNAをS
DS−フェノール法にて抽出し、グリオキサールゲル電気
泳動（Molecular cloning:A Laboratory Manual/Second
Edition,Cold Spring Harbor Laboratory,1989）によ
り分離後（３μg/lane）、Gene−screen Plus膜（Du Po
nt社）に転写した。プローブとしては、マルチプライム
標識（Molecular cloning:A Laboratory Manual/Second
Edition,Cold Spring Harbor Laboratory,1989）したc
DNA（CIP353）のEcoR I断片（完全長）を用いた。膜へ
の転写、ハイブリダイゼーション、洗浄等はGene−scre
en膜に添付のマニュアル（Du Pont社）通りに行った。
結果を表１から表３にまとめる。

表より明らかなように、通常育成中のバレイショの塊
茎、葉、茎、根および培養細胞では上記プローブはほと
んどハイブリダイズしなかった。また、種々の温度で５
〜６カ月間貯蔵したバレイショ塊茎では、６℃以下で貯
蔵したものについて明らかなハイブリダイゼーションが
認められたが、９℃以上で貯蔵したものについてはほと
んど認められなかった。

実施例３組織特異性の確認（上記（４）の過程） Linsmaier and Skoog（Physiol.Plant,18:100−127,1
965）の寒天培地上で、20℃、3000lux、16時間日長の
下、３−４週間培養した無菌シュートを材料に用いた。
これらを３℃あるいは20℃下におき、16時間日長、3000
luxで４週間培養し、培養後０、２、４週間後にサンプ
リング（葉、茎、根に分ける）、RNAを抽出した。ノー
ザン分析は上記と同様に行った。結果を表４および表５
にまとめる。

表から明らかなように、３℃で保存した、葉、茎及び
根では、ハイブリダイゼーションは僅かに認められるも
のの、同温度で保存した塊茎に比べればはるかに少なか
った。

実施例４サザンブロット分析（上記（５）の過程） DNAは、バレイショ品種トヨシロ、トマト品種ハウス
おどりこ、タバコ品種F104、トウモロコシ品種A188、イ
ネ品種朝の光等の若い葉からホットフェノール法により
調製した。各品種より抽出したDNA（10μｇ）は、制限
酵素EcoR IあるいはHind IIIで消化（バレイショゲノム
中のコピー数検定においては、他に、BamH I、Bgl II、
EcoR V、Xba Iを使用した。制限酵素は全てTakara社の
ものを使用。）、アガロースゲル電気泳動を行い、Hybo
nd N⁺膜（Amersham Japan）に転写した（Molecular clo
ning:A Laboratory Manual/Second Edition,Cold Sprin
g Harbor Laboratory,1989）。マルチプライム標識（Mo
lecular cloning:A Laboratory Manual/Second Editio
n,Cold Spring Horbor Laboratory,1989）したcDNA（CI
P353）のEcoR I断片（完全長）をプローブとし、実施例
１と同様にハイブリダイゼーションを行った。

その結果、該遺伝子はシングルコピー遺伝子であるこ
とが確認された。また、イネ、トウモロコシ、タバコで
はバンドが検出されず、トマトでは検出された。

実施例５ゲノミッククローンの単離（上記（６）の過
程）バレイショ品種トヨシロの若葉よりDNAをホットフェ
ノール法により抽出し、100μｇのDNAを0.0078あるいは
0.0156unitの制限酵素Sau3A I（Takara社）で１時間部
分消化した（反応bufferはTakara社添付のものを使
用）。反応は終濃度40mMのEDTAで停止させ、フェノール
／クロロホルム抽出、エタノール沈澱後、150μｌのTE
に消化したDNAを溶解させた。DNAは、65℃で10分間処理
後、10〜40％ショ糖密度勾配（20mM Tris,pH8.0,1mM ED
TA,200mM NaClからなるbufferに終濃度40,32.5,25,17.
5,10％のショ糖を溶かしたものを順次積んで作製）に重
層した。Hitachi SRP28SAローターを使用し、20,000rp
m、20℃で17時間以上遠心分離後、0.5mlずつ分画し、0.
5％アガロースゲルで分析した。15kb以上の断片を含む
分画は一つにまとめた後、エタノール沈澱により濃縮
し、そのうち0.4μｇをλ DASH II/BamH I（Stratagene
社）１μｇとライゲーションさせ、Gigapack II Gold
（Stratagene社）を用いてパッケージングした。ライゲ
ーション、パッケージング反応はStratagene社添付のプ
ロトコール通りに行った。約80万クローンをマルチプラ
イム標識（Molecular cloning:A Laboratory Manual/Se
cond Edition,Cold Spring Harbor Laboratory,1989）
したcDNA（CIP353）EcoR I断片をプローブとして実施例
１と同様にスクリーニングし、２個の陽性クローンを得
た（LCIP2−10およびLCIP1−２）。ファージからのDNA
抽出、プラスミドベクターへのサブクローニングは、文
献（Molecular cloning:A Laboratory Manual/Second E
dition,Cold Spring Harbor Laboratory,1989）に記載
の通りに行った。

実施例６逆転写PCR分析（上記（６）の過程）２種類のゲノムクローンのDNA配列解析の結果、ATG上
流、非翻訳領域中に数塩基の違いが見いだされた。そこ
で、この領域の配列を含む合成オリゴヌクレオチド12S
（5'−GAAAAAGGAAATAAAAA−3',LCIP1−２由来のmRNAに
特異的,Tm＝43℃）および210S（5'−GAAAAAATTAAGAGTAA
C−3',LCIP2−10由来のmRNAに特異的,Tm＝45℃）を作
製、cDNAの内部配列に由来する3'側のアンチセンス鎖プ
ライマー,325aR（２種のmRNAに共通に使用、5'−ATCACT
AGCAACGGGCAT−3',Tm＝54℃）と共に逆転写PCRを行っ
た。

逆転写PCRの材料としては、バレイショ品種トヨシロ
の各組織由来の総RNA10μｇを用い、oligo−dT 500ngと
混合後（水を加え、全量55μｌとする）、70℃で10分間
処理した。これに反応液（5xlst.strand buffer（BRL
社）20μl,10mM dNTPs 5μl,100mM DTT 10μl,RNase in
hibitor（Pharmacia社）５μl,Superscript RTase（BRL
社）５μｌ）を混ぜ（総量100μｌ）、37℃で１時間反
応後、95℃、５分間熱処理し、逆転写PCRの鋳型１本鎖c
DNAとした（この溶液中のcDNA濃度は100ng/μｌと仮
定）。

合成されたcDNA 1−100ngを鋳型としてPCR反応（cDNA
1−100ng,Primer 10pmolx2,2.5mM dNTPs 1.6μl,10xPC
R buffer（Takara社）２μl,rTaq（Takara社）0.2μl,
総量20μｌ）を行った。上記12Sおよび325aRプライマー
使用時の反応条件は、94℃ 30秒、45℃ 30秒、72℃
60秒、30サイクルとし、210Sおよび325aRプライマー使
用時には、94℃ 30秒、47℃ 30秒、72℃60秒、30サイ
クルとした。PCR産物はアガロースゲル電気泳動により
分析した。結果を表６にまとめる。（表６）表中のLCIP
2−10は後述する配列表の配列番号１に記載の配列に対
応し、LCIP1−２は配列番号２に対応する。表から明ら
かなように、いずれのゲノムクローン由来のmRNAにおい
ても、低温長期間貯蔵した塊茎のみ顕著な発現がみとめ
られた。これより、配列番号１および２の両配列共、低
温誘導性プロモータ活性を有することがわかる。

実施例７ DNA塩基配列の決定、解析（上記（１）、
（７）の過程）シークエンス反応、配列の決定は、プラスミドDNAを
鋳型としたジデオキシ法（ABI社,Taq DyeDeoxy Termina
tor Cycle Sequencing Kit）およびDNAシーケンサー（A
BI社,373A）により行った。配列の解析は、GENETYX（ソ
フトウェア開発株式会社）ソフトを介して行った。

その結果、上記２つのゲノムクローンのうちの１つか
ら、配列番号１に示す配列が、また他方のクローンから
配列番号２に示す配列が得られた。また、上記のcDNAク
ローン（CIP353）から配列番号３に示す配列が得られ
た。

実施例８形質転換用ベクターの作製および形質転換法
によるプロモーターの低温誘導性の確認（上記（８）の
過程）ゲノムクローンLCIP2−10を制限酵素Asp718（ベーリ
ンガー社）で消化し、開始ATG上流域約200bpを含むAsp7
18断片をpUC19プラスミドに導入し、組み換えプラスミ
ドp210A8を得た。次にこのプラスミド（p210A8）を鋳型
とし、M13プライマーRV（Takara社）および210Aプライ
マー（5'−GTTACTCTTAATTTTTTC−3'）を用いてPCR（94
℃20秒、55℃30秒、72℃60秒、25サイクル）を行った。
増幅産物をTAクローニングベクター（Invitrogen社）に
サブクローニングし、開始ATG上流約200bp領域のみ含む
ベクター、p210Pro（200）を作製した。このプラスミド
より制限酵素Hind III,Xho I（Takara社）消化により開
始ATG上流域約200bpを含む断片を単離し、pHSG399（Tak
ara社）のHind III,Sal Iサイトに挿入、プラスミドpHS
G210（200）を得た。このプラスミドをHind III,BamH I
（Takara社）消化し、単離されたATG上流域200bp断片
を、pB I 101ベクター（Clontech社）のベータグルクロ
ニダーゼ遺伝子をBamH I,Sac Iサイトを利用してルシフ
ェラーゼ遺伝子（Science 234:856−859,1986）に置換
したベクター（pLUC101）の5'上流域へHind III,BamH I
サイトを利用して挿入、pLUC210（200）を得た。他方、
ゲノムクローンLCIP2−10由来の開始ATG上流域約1000bp
を含むXba I（Takara社）消化断片を導入したpUC18ベク
ター（p210X1）を作製し、このベクターから制限酵素As
p718消化により単離した800bp断片（ATG上流約−200〜
−1000bpの領域）をpLUC210（200）のAsp718サイトに挿
入し、約1kbのプロモーター領域とルシフェラーゼ遺伝
子を連結した形質転換用ベクター、pLUC210（1000）を
作製した。形質転換用ベクター（pLUC101およびpLUC210
（A1000））は三系交雑法（植物遺伝子操作マニュア
ル、講談社、1990）により、細菌Agrobacterium tumefa
ciens LBA4404に導入し、植物の形質転換に使用した。

バレイショの形質転換は、文献（特開平６−133783）
に準じて行った。材料としてLinsmaierとSkoog（Physio
l.Plant.18:100−127,1965）の寒天培地で無菌増殖した
品種トヨシロの葉および茎を供試した。これらの組織
は、適当な大きさに切断し、Agrobacterium菌液中で２
日間共存培養後、インドール酢酸0.1mg/l、ゼアチンリ
ボシド1.0mg/l、カナマイシン100mg/l、セフォタキシム
250mg/lを含むLinsmaierとSkoog（Physiol.Plant.18:10
0−127,1965）の寒天培地上に置床した。20℃、16日間
日長下で培養後、細分化した植物体はカナマイシン100m
g/lを含むLinsmaierとSkoog（Physiol.Plant.18:100−1
27,1965）の寒天培地上で継代増殖した。

増殖した形質転換体は、単節ごとに切り出し、Linsma
ierとSkoog（Physiol.Plant.18:100−127,1965）の液体
培地上で３〜４週間培養し（20℃、16時間日長）、その
後培地をショ糖80g/lを含むLinsmaierとSkoog（Physio
l.Plant.18:100−127,1965）の液体培地に交換し、20
℃、暗黒下で４−５週間以上培養した。形成したマイク
ロチューバーは、水洗、水切り後、シャーレに入れて、
暗黒下、20℃あるいは４℃で貯蔵した。LinsmaierとSko
og（Physiol.Plant.18:100−127,1965）の寒天培地で育
成中の植物体も、暗黒下、20℃あるいは４℃の貯蔵試験
に供試した。

ルシフェラーゼ活性測定は、文献（Science 234:856
−859,1986）に準じて行った。生重あたり３−10倍量の
抽出緩衝液（100mM リン酸カリウム緩衝液（pH7.5）、1
mMジチオスレイトール）を加え、磨砕後、遠心（15000r
pm,5min）し、上清を粗抽出液とした。粗抽出液50μｌ
と活性測定用緩衝液（36mMグリシルグリシン緩衝液（pH
7.8）,1mg/ml牛血清アルブミン,20mM塩化マグネシウム,
12mM ATP）100μｌを混合後、0.4mMルシフェリンを100
μｌ添加し、ルミノメーター（モデル6100、パッカード
社）でルシフェラーゼ活性を測定した。結果を表７およ
び表８にまとめる。

表より明らかなように、低温（４℃）で４週間貯蔵し
たマイクロチューバにおいて、顕著な活性上昇が観察さ
れた。また、活性はマイクロチューバに劣るものの、葉
においても低温下での活性上昇がわずかに認められた。
従って、配列番号１記載の配列の内、第2418番目〜第35
41番目の塩基から成るDNA配列（プロモーター断片）
は、低温下で遺伝子発現を誘導する作用を有することが
明らかとなった。

配列表配列番号:1 配列の長さ:3600 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ゲノムDNA 起源：生物名：バレイショ（Solanum tuberosum L.）品種：トヨシロ直接の起源：ライブラリー名：緑葉ゲノムDNA由来λDASH IIゲノム
DNAライブラリー配列の特徴：配列配列番号:2 配列の長さ:4140 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ゲノムDNA 起源：生物種：バレイショ（Solanum tuberosum L.）品種：トヨシロ直接の起源：ライブラリー名：緑葉ゲノムDNA由来λDASH IIゲノム
DNAライブラリー配列の特徴：配列配列番号:3 配列の長さ:1132 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA 起源：生物名：バレイショ（Solanum tuberosum L.）品種：トヨシロ直接の起源：ライブラリー名：低温貯蔵塊茎mRNA由来λgt10cDNAラ
イブラリー配列の特徴：特徴を表す記号:CDS 存在位置:45−836 特徴を決定した方法：配列

フロントページの続き (72)発明者笠岡啓介静岡県磐田郡豊田町東原700 日本たばこ産業株式会社遺伝育種研究所内 (56)参考文献ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ, 1993，Ｖｏｌ．21，Ｎｏ．４，ｐ．729 −735 ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，1994, Ｖｏｌ．104，Ｎｏ．２，ｐ．445−452 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 - 15/90 C12Q 1/68 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号１で表される塩基配列の
うち、第１番目〜第3546番目の塩基から成る配列若しく
は低温誘導性プロモーター活性を有するその一部、又は
これらの配列のうち１個若しくは数個のヌクレオチドが
欠失し、置換し若しくはこれらの配列に１個若しくは数
個のヌクレオチドが挿入若しくは付加された、低温誘導
性プロモーター活性を有するDNA。
【請求項２】配列表の配列番号１で表される塩基配列の
うち、第１番目〜第3546番目の塩基から成る配列又は低
温誘導性プロモーター活性を有するその一部から成る、
請求項１記載のDNA。
【請求項３】配列表の配列番号１で表される塩基配列の
うち、第2418番目〜第3541番目の塩基から成る配列若し
くは低温誘導性プロモーター活性を有するその一部、又
はこれらの配列のうち１個若しくは数個のヌクレオチド
が欠失し、置換し若しくはこれらの配列に１個若しくは
数個のヌクレオチドが挿入もしくは付加された、低温誘
導性プロモーター活性を有するDNA。
【請求項４】配列表の配列番号１で表される塩基配列の
うち、第2418番目〜第3541番目の塩基から成る配列、ま
たはこの配列のうち１個若しくは数個のヌクレオチドが
欠失し、置換しもしくはこの配列に１若しくは複数のヌ
クレオチドが挿入もしくは付加された配列を含む低温誘
導性プロモーター。
【請求項５】配列表の配列番号２で表される塩基配列の
うち、第１番目〜第4120番目の塩基から成る配列若しく
は低温誘導性プロモーター活性を有するその一部、又は
これらの配列のうち１個若しくは数個のヌクレオチドが
欠失し、置換し若しくはこれらの配列に１個若しくは数
個のヌクレオチドが挿入若しくは付加された、低温誘導
性プロモーター活性を有するDNA。
【請求項６】配列表の配列番号２で表される塩基配列の
うち、第１番目〜第4120番目の塩基から成る配列又は低
温誘導性プロモーター活性を有するその一部から成る、
請求項５記載のDNA。
【請求項７】配列表の配列番号３記載の配列のうち、第
45番目〜第839番目の塩基配列中、もしくはそれらに相
補的な塩基配列中の少なくとも連続する15塩基の配列を
有するDNA断片よりなる低温誘導性プロモータ検索用プ
ローブ。