JP2001514491A

JP2001514491A - デンプン分枝酵素発現のアンチセンスイントロン阻害

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Publication number: JP2001514491A
Application number: JP53643798A
Authority: JP
Inventors: ポウルゼン，ピーター
Original assignee: ダニスコエイ／エス
Priority date: 1997-02-21
Filing date: 1998-02-23
Publication date: 2001-09-11
Also published as: AU738272B2; BR9808647A; AU6225598A; CN1248292A; WO1998037213A1; CA2280230A1; US6483009B1; NZ336608A; EP1007707A1

Abstract

(57)【要約】遺伝子発現の阻害方法が記載される。植物において酵素活性に影響を及ぼすこの方法は、植物(またはその細胞、組織、もしくは器官)中でのヌクレオチド配列を発現させる工程を包含し、ここで、このヌクレオチド配列は、クラスＡのSBEのイントロンをアンチセンス方向に、部分的または完全にコードし；そしてここでこのヌクレオチド配列は、イントロンに正常に結合したエキソン配列に対してアンチセンスである配列を含まない。

Description

【発明の詳細な説明】デンプン分枝酵素発現のアンチセンスイントロン阻害本発明は、遺伝子発現の阻害(特に、植物における遺伝子発現の阻害)の方法に関する。本発明はまた、本方法において有用なヌクレオチド配列にも関する。さらに、本発明は、ヌクレオチド配列の発現のために有用なプロモーターに関する。デンプンは、植物(特に、高等植物)における主な貯蔵炭水化物の１つである。デンプンの構造は、アミロースおよびアミロペクチンからなる。アミロースは、本質的には、α-1-4結合されたグリコシル残基の直鎖からなる。アミロペクチンは、いくつかのα-1-6分枝を有するα-1-4結合されたグリコシル残基の鎖を含む。アミロペクチンの分枝する性質は、とりわけデンプン分枝酵素(「SBE」)として一般に公知である酵素の作用により達成される。SBEは、α-1,6グルコシド分枝結合を介したα-1,4グルカンの付加によりアミロペクチン分子の分枝点の形成を触媒する。アミロースおよびアミロペクチンの生合成は、図１に模式的に示され、一方、α-1-4結合およびα-1-6結合は、図２に示される。ジャガイモ(potato)では、２つのクラスのSBEの存在が公知である。本発明者らの係属国際特許出願PCT/EP96/03052およびPCT/EP96/03053では、クラスＢのジャガイモSBEおよびそれをコードする遺伝子が、議論されている。国際特許出願W O96/34968では、クラスＡのジャガイモSBE、およびそれをコードするcDNAが開示されている。デンプンは重要な原料であることが公知である。デンプンは、食品産業、製紙産業、および化学産業において広く使用される。しかし、これらの産業への適応において使用される大部分のデンプンは、必要とされる特定の機能特性を有するデンプンを得るために、化学的、物理的、または酵素学的手法により、収穫後改変される。過去数年以内に、収穫後改変されたデンプンと同じであり得る、改変デンプンの産生が可能である遺伝的に改変された植物を作製することが所望されるようになった。アンチセンスヌクレオチドをコードする配列の発現により、このような遺伝的に改変された植物の作製が可能であり得ることもまた公知である。これに関して、June Bourqueは、植物における遺伝子操作のためのアンチセンスストラテジーの詳細な要旨を提供している(Bourque 1995 Plant Science 105 125-149) 。この段階において、提唱されるアンチセンス-RNA阻害機構の１つの模式図である図３を参照し得る。詳細には、WO/92/11375は、アミロース型のデンプンを形成するためにジャガイモを遺伝的に改変する方法について報告している。この方法は、ジャガイモにおける分枝酵素の形成をコードする遺伝子の発現を、種々の程度で明らかに阻害し得るアンチセンス構築物の使用を含む。WO 92/11375に記載のアンチセンス構築物は、塊茎特異的なプロモーター、転写開始配列、およびアンチセンス方向における分枝酵素の最初のエキソンからなる。しかし、WO 92/11375は、アンチセンス配列のいかなるデータも提供していない。さらに、WO 92/11375は、ジャガイモGBSSプロモーターの使用を開示するのみである。 WO 92/14827は、植物のゲノムに挿入を行った後に、再生植物における炭水化物濃度および炭水化物組成(例えば、アミロースおよびアミロペクチンの濃度ならびに組成)において明らかに変化を引き起こし得るプラスミドについて報告している。プラスミドは、アンチセンス方向に分枝酵素のコード配列の一部分を含む。 EP-A-0647715は、観用植物の特徴および代謝経路を変化させるための内因性のアンチセンスmRNAをコードするDNAの使用について報告している。 EP-A-0467349は、遺伝子発現を制御するためのプロモーター上流の配列に対してアンチセンスである配列の発現について報告している。 EP-A-0458367および米国特許第5107065号は、植物における遺伝子発現を調節するためのヌクレオチド配列の発現について報告している。ヌクレオチド配列は mRNAの遺伝子配列に相補的であり、遺伝子の非コード領域の全てまたは一部を包含し得る。換言すれば、EP-A-0458367および米国特許第5107065号に記載のヌクレオチド配列は、コード領域に対して相補的である配列を少なくとも含まなければならない。EP-A-0458367および米国特許第5107065号は、最小の配列情報を含む。 W096/34968は、ジャガイモ植物におけるSBEの発現をダウンレギュレートするためのクラスAおよびクラスBのジャガイモSBEをコードする配列に対して相補的なアンチセンス配列の使用を議論する。使用される配列は、SBEコード配列に相補的である。 KuipersらのMol．Gen．Genet.[1995]246 745-755は、ジャガイモの顆粒結合デンプンシンテターゼのゲノムイントロン配列の部分に対してアンチセンスである一連のヌクレオチドの発現について報告している。ここでアンチセンスイントロン配列は、アンチセンスエキソン配列の一部に付着され、ここで、イントロン配列とエキソン配列は、当然にお互いと結合する。さらに、発現されたアンチセンスイントロン配列は、せいぜい231bp長である。同様に、KullらのJ．Genet.&Breed.[1995]49 69-76は、ジャガイモの顆粒結合デンプンシンテターゼのゲノムイントロン配列の部分に対してアンチセンスである一連のヌクレオチドの発現について報告している。同様に、ここでアンチセンスイントロン配列はアンチセンスエキソン配列の一部分に付着され、ここでイントロン配列とエキソン配列は、当然にお互いと結合する。さらに、同様に、発現されたアンチセンスイントロン配列はせいぜい231bp長である。 SimadaらのTheor．Appl．Genet．[1993]86 665-672は、イネ顆粒結合デンプンシンテターゼのゲノムイントロン配列の部分に対してアンチセンスである一連のヌクレオチドの発現につい報告している。ここで、アンチセンスイントロン配列は、アンチセンスエキソン配列の一部に付着され、ここで、イントロン配列とエキソン配列は、当然にお互いと結合する。さらに、発現されたアンチセンスイントロン配列は、350bp未満の長さである。特定のヌタレオチド配列の発現により、どのようにして酵素活性が影響を及ぼされ得るかについての総説は、FinneganおよびMcElroy[1994]Biotechnology 128 83-888；ならびにMatazkeおよびMatazke[1995]TIG 11 1-3の教示に見出され得る。酵素活性が、特定のヌクレオチド配列の発現により影響を及ぼされ得ることが公知であるが、より確実に、および/またはより効率的に、および/またはより特異的に、酵素活性に影響を及ぼし得る方法がなお必要である。本発明の第１の局面により、植物(またはその細胞、組織、もしくは器官)中で酵素活性に影響を及ぼす方法が提供される。本方法は、植物中(またはその細胞、組織、もしくは器官)でヌクレオチド配列を発現する工程を包含し、ここで、このヌクレオチド配列は、クラスＡのジャガイモのSBE遺伝子のイントロンをアンチセンス方向に部分的もしくは完全にコードし(そのようなイントロンであり) 、必要に応じて、クラスＢのデンプン分枝酵素のイントロンを、アンチセンス方向またはセンス方向に部分的もしくは完全にコードするヌクレオチド配列を有する；そして、ここでヌクレオチド配列は、イントロンに正常に結合するエキソン配列に対してアンチセンスである配列を含まない。本発明の第２の局面により、デンプン産生生物(またはその細胞、組織、もしくは器官)における酵素活性に影響を及ぼす方法が提供され、本方法は、デンプン産生生物(またはその細胞、組織、もしくは器官)においてヌクレオチド配列を発現する工程を包含する。ここで、このヌクレオチド配列は、クラスＡのジャガイモのSEB遺伝子のイントロンをアンチセンス方向に部分的または完全にコードし、必要に応じて、アンチセンスまたはセンス方向に、クラスＢのデンプン分枝酵素のイントロンを部分的または完全にコードするヌクレオチド配列を有する；そして、ここでデンプン分枝酵素の活性は影響を受け、および/またはアミロペクチンレベルは影響を受け、および/またはデンプンの組成は変化する。好ましくは、クラスＡのSBE遺伝子のアンチセンスのイントロン構築物は、PCT /EP96/03052に規定されるジャガイモのクラスＢのSBE遺伝子のアンチセンスのイントロンの構築物と組み合わせて使用される。しかし、これはまた、ジャガイモ植物におけるデンプンの性質をさらに操作するために、クラスＡのSBE単独、または他の導入遺伝子と組み合わせて標的化にするために、独立して使用され得る。従って、本発明の第３の局面により、配列番号15〜配列番号27および配列番号 38の相補体のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列またはそれらの改変体、誘導体もしくはホモログを含むアンチセンス配列が提供される。本発明の第４の局面により、配列番号14で示される配列、またはその改変体、誘導体、もしくはホモログを含むプロモーターが提供される。本発明の第５の局面により、本発明を含むか、または発現し得る構築物が提供される。本発明の第６の局面により、本発明を含むか、または発現するベクターが提供される。本発明の第７の局面により、本発明を含むか、または発現する、細胞、組織、または器官が提供される。本発明の第８の局面により、本発明を含むか、または発現するトランスジェニックデンプン産生生物が提供される。本発明の第９の局面により、本発明から得られたデンプンが提供される。本発明の第10の局面により、pSS17およびpSS18が提供される。本発明の第11の局面により、クラスAのSBEから入手可能なイントロン配列の任意の１つ以上に対して、および特に配列番号38で示されるクラスA SBEのイントロン１から入手可能なイントロン配列に対してアンチセンスであるヌクレオチド配列を提供する。本発明の重要な利点は、デンプンの収穫後改変の必要性に依存しない改変デンプンの調製方法を提供することである。従って、本発明の方法は、デンプンの収穫後改変において通常に用いられる危険な化合薬品の使用の必要性を取り除く。さらに、本発明は、とりわけ、種々の産業的必要性を満たす性質を有する、改変されたおよび/または新規および/または改善されたデンプンの産生が可能な遺伝的に改変された植物を提供する。従って、本発明は、収穫後改変されたデンプンと代替可能である、あつらえた (tailor-made)デンプンを植物中で調製する方法を提供する。本発明はまた、危険な化学薬品および大量のエネルギーの使用に依存する公知の収穫後改変の方法よりも、環境に対してより有益な効果を有し得る方法により改変デンプンの調製を可能にする方法を提供する。本発明の他の重要な利点は、酵素活性に影響を及ぼす公知の方法と比較した場合に、酵素活性に、より確実に、および/またはより効率的に、および/またはより特異的に、影響を及ぼし得る方法を提供することである。本発明のこの利点に関して、SBEをコードする領域間の相同性が、ある程度存在することが注目されるべきである。しかし、SBEのイントロン配列との相同性は、ほとんどないか、または全くない。従って、アンチセンスのイントロン発現は、特定のクラスAのSBEの発現に選択的に影響を及ぼすための機構を提供する。この有利な局面は、例えば、特定のSB E酵素、特にクラスＡのSBE酵素を減少または消去させるために、およびその酵素を別の分枝酵素であり得る別の酵素、または影響される酵素の組み換え型もしくはハイブリッド酵素(例えば、１つの供給源由来のSBE酵素の一部、および別の供給源由来の別のSBE酵素の少なくとも一部を含み得る)でさえあり得る別の酵素と置換するために使用され得る。本発明の特定の特徴は、以下でより詳細に議論される本発明の組み合わせの局面により、包含される。従って、本発明は、選択的にクラスAのSEB活性に影響を及ぼす機構を提供する。これは、例えば、アンチセンスエキソンの発現の使用に依存する先行技術の方法(これにより、その活性にも影響を与えずには新しいSBE活性を誘導することはできない)とは対照的である。本発明の文脈において、クラスＢのSBEは、SBE Iと同義である：クラスＡのSB Eは、SBE IIと同義である。クラスＡのSBEは本明細書中で参考として援用される WO96/34968に規定される。好ましくは、使用されるアンチセンスイントロンの構築物は、クラスＡのSBEのイントロン１を含み、これは2.0kb長であり、そしてクラスＡのSBEのコード配列の残基45で開始する位置にある。イントロンの境界は、コンセンサスイントロンの境界配列の検索により計算され得、そして、添付の図13に示される。クラスＢのSEBは、実質的には、本明細書中に与えられる配列、およびPCT/EP96/03053において規定される。好ましくは本発明の第１の局面により、デンプン分枝酵素の活性は影響を受け、そして/またはアミロペクチンのレベルは影響を受け、そして/またはデンプンの組成は変化する。好ましくは本発明の第２の局面により、ヌクレオチド配列は通常イントロンに結合したエキソン配列に対してアンチセンスである配列を含まない。好ましくは本発明の第４の局面により、プロモーターは目的の遺伝子(「GOI」) との組み合わせである。好ましくは、酵素活性は、減少または消去される。好ましくは、ヌクレオチド配列は、アンチセンス方向において少なくとも１つイントロンの、少なくとも実質的に全てをコードする。好ましくは、ヌクレオチド配列は、２以上のイントロンを部分的にまたは完全にコードし、そしてここで各イントロンはアンチセンス方向である。好ましくは、ヌクレオチド配列は、少なくとも350ヌクレオチド(例えば、少なくとも350bp)、より好ましくは少なくとも500ヌクレオチド(例えば、少なくとも 500bp)を含む。好ましくは、ヌクレオチド配列は、配列番号38として示される配列の相補体またはそのフラグメントを含む。好ましくは、ヌクレオチド配列は、配列番号14で示される配列、またはその改変体、誘導体もしくはホモログを有するプロモーターにより発現される。好ましくは、トランスジェニックのデンプン産生生物は植物である。従って、本発明の好ましい局面は、植物(またはその細胞、組織もしくは器官) において酵素活性に影響を及ぼす方法に関する。この方法は、植物(またはその細胞、組織もしくは器官)中でヌクレオチド配列を発現させる工程を包含し、ここで、ヌクレオチド配列は、イントロンをアンチセンス方向で、部分的にまたは完全にコードする。そして、このヌクレオチド配列は、このイントロンに通常結合するエキソン配列に対してアンチセンスである配列を含まず、そして、デンプン分枝酵素の活性が影響され、そして/またはアミロペクチンのレベルが影響され、そして/またはデンプンの組成が変化される。従って、本発明のより好ましい局面は、植物(またはその細胞、組織もしくは器官)中でヌクレオチド配列を発現する工程を包含する、植物(またはその細胞、組織もしくは器官)において酵素活性に影響を及ぼす方法に関する。ここで、ヌクレオチド配列は、イントロンをアンチセンス方向で、部分的にまたは完全にコードし、そして、このヌクレオチド配列は、イントロンに通常結合するエキソン配列に対してアンチセンスである配列を含まず、ここで、デンプン分枝酵素活性が影響され、そして/またはアミロペクチンレベルが影響され、そして/またはデンプンの組成が変化され、そして、ヌクレオチド配列は、配列番号15〜配列番号 27のいずれかに示される配列またはその改変体、誘導体、もしくはホモログ(これらの組み合わせを含む)を含む。本発明に関連する用語「ヌクレオチド」は、DNAおよびRNAを含む。好ましくは、 DNAを意味し、より好ましくは、組換えDNA技術の使用により調製されるDNAを意味する。用語「イントロン」は、通常の意味において、転写されるが、発現されるタンパク質もしくは酵素の部分または全てをコードしないヌクレオチド(通常、DNA)のセグメントを意味するものとして使用される。用語「エキソン」は、通常の意味において、発現されるタンパク質もしくは酵素の部分または全てをコードするヌクレオチド(通常、DNA)のセグメントを意味するものとして使用される。従って、用語「イントロン」は、RNA分子に転写されるが、RNAがタンパク質に翻訳される前にRNAの外にスプライシングされる遺伝子領域をいう。対照的に、用語「エキソン」は、RNAに転写され、続いてタンパク質に翻訳される遺伝子領域をいう。本発明のヌクレオチド配列に関連して、用語「改変体」または「ホモログ」または「フラグメント」は、それぞれのヌクレオチド配列からのまたはこれに対する、１つまたはそれ以上の核酸の置換、改変、修飾、交換、欠失または付加のいずれかを含み、ただし、得られるヌクレオチド配列は、植物、またはその細胞、もしくは組織中で酵素活性に影響し得、好ましくは、得られたヌクレオチド配列は、少なくとも、配列番号38に示される配列の相補体と同じ効果を有する。詳細には、用語「ホモログ」は、構造類似性および/または機能類似性に関して相同性を包含する。ただし得られるヌクレオチド配列は、本発明に従って酵素活性に影響する能力を有する。配列の相同性(すなわち、類似性)に関して、好ましくは、80％を超える相同性があり、より好ましくは少なくとも85％の相同性、より好ましくは少なくとも90％の相同性、よりなお好ましくは少なくとも95％の相同性、より好ましくは少なくとも98％の相同性がある。上記の用語はまた、配列の対立遺伝子改変体と同義である。同様に、本発明のプロモーターに関連する用語「改変体」または「ホモログ」または「フラグメント」は、それぞれのプロモーター配列からのまたはそれぞれのプロモーター配列への、１またはそれ以上の核酸の任意の置換、改変、修飾、交換、欠失、付加を含むが、ただし、得られたプロモーター配列は、GOIの発現を可能にし、好ましくは、得られたプロモーター配列は、少なくとも、配列番号14と同様の効果を有する。詳細には、用語「ホモログ」は、構造類似性および/または機能類似性に関する相同性を包含し、ただし、得られるプロモーター配列が、GOI を発現させる能力(例えば、本発明によるヌクレオチド配列)を有する。配列相同性(すなわち、類似性)に関して、好ましくは80％を超える相同性、より好ましくは少なくとも85％の相同性、より好ましくは少なくとも90％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも95％の相同性、より好ましくは少なくとも98％の相同性が存在する。上記の用語はまた、配列の対立遺伝子改変体と同義である。用語「アンチセンス」は本発明のイントロン配列(その部分配列を含む)の任意の１つまたは全てと相補的であり、従ってハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を意味する。本発明に関して、アンチセンスイントロンは、阻害されるべき遺伝子のイントロン全体に対して相補的であり得る。しかし、いくつかの環境において部分的なアンチセンス配列が使用され得(すなわち、全相補的配列ではないか、または全相補的配列を含まない配列)、ただし、部分配列は酵素活性に影響を及ぼす。部分配列の適切な例は、配列番号38の全相補体よりも短いが、それぞれのエキソンに隣接するセンスイントロン配列に対して少なくともアンチセンスであるヌクレオチドを含む配列を含む配列を含む。本発明の第２の局面(すなわち、SBE活性に特異的に影響すること)に関して、本発明のヌクレオチド配列は、SBE遺伝子の１つ以上のセンスエキソン配列またはアンチセンスエキソン配列(その完全配列または部分配列を含む)を含み得る。ただし、このヌクレオチド配列はSBE活性に影響し得、好ましくは、このヌクレオチド配列は、SBE活性を低下させるか、または消去する。好ましくは、本発明の第２の局面のヌクレオチド配列は、アンチセンスエキソン配列を含まない。用語「ベクター」は、発現ベクターおよび形質転換ベクターを含む。用語「発現ベクター」は、インビボ発現またはインビトロ発現し得る構築物を意味する。用語「形質転換ベクター」は、ある種から他の種へ(例えば、E.coliプラスミドから真菌もしくは植物細胞へ、またはAgrobacteriumから植物細胞へ)移入され得る構築物を意味する。用語「構築物」は、「結合体」、「カセット」および「ハイブリッド」のような用語と同義であり、本発明のアンチセンスヌクレオチド配列の局面に関して、直接的または間接的にプロモーターに結合した本発明によるヌクレオチド配列を含む。間接的結合の例としては、本発明のプロモーターおよびヌクレオチド配列の間に介在するイントロン配列(例えば、ShlイントロンまたはADHイントロン)のような適切なスペーサー基の提供が挙げられる。直接的なまたは間接的な結合を含む、本発明に関する用語「融合された」についても同様である。天然環境において野生型 SBE遺伝子プロモーターと結合している場合、これらの用語は、野生型SBE遺伝子の天然の組み合わせを包含しない。構築物は、例えば、構築物が移入された植物細胞において、遺伝子構築物の選択を可能にするマーカーをさらに含み得るか、または発現し得る。例えば、植物において使用され得る、種々のマーカー、例えばマンノース、が存在する。マーカーの他の例には、抗生物質耐性(例えば、G418、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシンおよびゲンタマイシン耐性)を提供するマーカーが挙げられる。本発明の構築物は、好ましくはプロモーターを含む。用語「プロモーター」は、当該分野の通常の意味(例えば、遺伝子発現のJacob-Monod理論におけるRNAポリメラーゼ結合部位)において使用される。適切なプロモーターの例は、本発明のヌクレオチド配列の効率的な発現を指向し得るプロモータであるか、および/または特定の細胞型におけるものである。組織特異的なプロモーターのいくつかの例は、WO 92/11375に開示される。プロモーターはさらに、PribnowボックスまたはTATAボックスのような保存領域を含み得る。プロモーターは、本発明のヌクレオチド配列の発現レベルに影響 (例えば、保持、増強、低下)する他の配列をさらに含み得る。このような配列の適切な例には、ShlイントロンまたはADHイントロンが挙げられる。他の配列は、温度、化学薬品、光またはストレス誘導性エレメントのような誘導性エレメントが挙げられる。また、転写または翻訳を増強するために適切なエレメントが、存在し得る。後者のエレメントの例としては、TMV5'リーダー配列がある(Sleat、G ene 217[1987]217-225；およびDawson、Plant Mol.Blol.23[1993]97を参照)。記述したように、本発明の構築物および/またはベクターは、調節された発現または構成的発現を提供し得る転写開始領域を含み得る。任意の適切なプロモーター(例えば、組織特異的プロモーター)は、転写開始領域のために使用され得る。１つの局面において、好ましくはプロモーターは、パタチンプロモーターまたはE35Sプロモーターである。別の局面において、好ましくは、プロモーターはSB Eプロモーターである。例えば、生物が植物である場合、このときプロモーターは、種子、塊茎、茎、芽、根および葉の１以上の任意の組織(好ましくは、塊茎)における、ヌクレオチド配列の発現に影響するプロモーターであり得る。例として、本発明のヌクレオチド配列についてのプロモーターは、1994年10月21日に出願された本発明者らの同時係属中のイギリス特許出願第9421292.5号に記載されるように、α-Amy 1プロモーター（別名、Amy 1プロモーター、Amy 637プロモーターまたはα-Amy 637 プロモーターとして公知)であり得る。あるいは、本発明のヌクレオチド配列についてのプロモーターは、本発明者らの1994年10月21日に出願された同時係属中のイギリス特許出願第9421286.7号に記載されるα-Amy 3プロモーター(別名、Am y 3プロモーター、Amy 351プロモーターまたはα-Amy 351プロモーターとして公知)であり得る。本発明はまた、本発明によるヌクレオチド配列を発現させるためのプロモーターの使用を包含する。ここで、プロモーターの一部分は不活化されているが、そのプロモーターはなお、プロモーターとして機能し得る。プロモーターの部分的な不活化は、いくつかの場合において有利である。特に前述のAmy 351プロモーターを用いる場合、部分的に不活化されたプロモーターが、例えば、ただ１つの特異的な組織型または器官においてのように、より特異的な様式で本発明のヌクレオチド配列を発現するように、プロモーターの一部分を不活性化することが可能である。用語「不活化された」は、プロモーターの発現パターンは改変されるが、部分的に不活化されたプロモーターはなおプロモーターとして機能するという意味において、部分的な不活化を意味する。しかし、前述のように、改変されたプロモーターは、元のプロモーターの少なくとも１つの(しかし全てではない)特異的組織において、本発明の酵素をコードする遺伝子を発現し得る。部分的な不活化の例は、プロモーター配列の折りたたみパターンの変化、またはヌクレオチド配列の部分に対する結合種の変化を含み、その結果、ヌクレオチド配列の一部は、例えば、RNAポリメラーゼにより認識されない。別のそして好ましい、プロモーターの部分的な不活化方法は、プロモータを短縮化し、そのフラグメントを形成することである。別の方法は、配列の少なくとも一部分を変異させ、その結果、RNAポリメラーセが、その部分にも別の部分にも結合し得なくすることである。別の改変は、調節タンパク質、例えば、糸状真菌由来で炭素異化代謝産物抑制を発揮するとして公知のCreAタンパク質についての結合部位を変異させ、したがって、天然プロモーターの異化代謝産物抑制を消去することである。本発明の構築物および/またはベクターは、転写終結領域を含み得る。本発明によるヌクレオチドは、さらなる構築物との組み合わせ(しかし、必ずしも同時ではない)で発現され得る。したがって、本発明はまた、第１のプロモーターに作動可能に連結された本発明によるヌクレオチド配列を含む第１の構築物を含む構築物；および第２のプロモーター(第１のプロモーターと同じである必要はない)に作動可能に連結されたGOIを含む第２の構築物の組み合わせを提供する。本発明のこの局面において、構築物の組み合わせは、同じベクター、プラスミド、細胞、組織、器官または生物に存在し得る。本発明のこの局面はまた、構築物の組み合わせを、好ましくは生物(代表的には植物)の特定の細胞または組織において発現させる方法(例えば、ただ１つの特定の細胞または組織における発現)を包含する。本発明のこの局面において、第２の構築物は、野生型遺伝子プロモーターに通常結合される酵素をコードする遺伝子の天然の組み合わせを、それらの両方が天然環境中に存在する場合には、包含しない。適切な組み合わせの例は、本発明のヌクレオチド配列および本発明のプロモーターのようなプロモーターを含む第１の構築物、ならびに本発明のプロモーターのようなプロモーターおよびGOIを含む第２の構築物であり、ここで、GOIは、センスまたはアンチセンス方向のいずれかで、別のデンプン分枝酵素をコードする。本発明のアンチセンスヌクレオチドの局面についての用語「構築物」に関する上記の所見は、本発明のプロモーターの局面についての用語「構築物」に等しく適応できる。この点に関して、この用語は、直接的または間接的にGOIに結合した本発明によるプロモーターを含む。本発明のプロモーターの局面または本発明の組み合わせの局面に関する用語「G OI」は、目的の任意の遺伝子を意味し、これは以後に説明されるように、タンパク質または酵素をコードすることを必ずしも必要としない。GOIは、問題の生物( 例えば植物)に対して、外来性または天然性のいずれかである任意のヌクレオチド配列であり得る。 GOIの代表的な例は、代謝および異化代謝プロセスを改変する他のタンパク質または酵素をコードする遺伝子を含む。GOIは、病原体耐性を導入または増加する因子をコードし得る。 GOIは、関連組織に存在する天然の転写物の発現を改変するためのアンチセンス構築物でさえあり得る。このようなGOIの例は、本発明によるヌクレオチド配列である。 GOIは、宿主生物(例えば、植物)に対して非天然であるタンパク質さえコードし得る。GOIは、動物またはヒトに対して有益である化合物をコードし得る。例えば、GOIは、薬学的に活性なタンパク質または酵素(例えば、治療化合物であるインシュリン、インターフェロン、ヒト血清アルブミン、ヒト成長因子および血液凝固因子のいずれか)をコードし得る。GOIは、食物、食餌または穀物に、追加的な栄養価を与えるタンパク質さえコードし得る。代表的な例は、抗栄養因子の形成を阻害し得る植物タンパク質およびより望ましいアミノ酸組成(例えば、非トランスジェニック植物より高いリシン含量)を有する植物タンパク質を含む。G0I は、キシラナーゼおよびα-ガラクトシダーゼのように食物加工に使用され得る酵素をコードしさえし得る。GOIは、ペスト毒素、アンチセンス転写物(例えば、 α-アミラーゼのアンチセンス転写物)、プロテアーゼ、またはグルカナーゼのいずれかをコードする遺伝子であり得る。あるいは、GOIは、本発明によるヌクレオチド配列であり得る。 GOIは、本発明者らの同時係属中のイギリス特許出願第9505479.7号の主題であるアラビノフラノシダーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列であり得る。GOI は、本発明者らの同時係属中のイギリス特許出願第9505475.5号の主題であるグルカナーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列であり得る。GOIは、本発明者らの同時係属中のイギリス特許出願第9413439.2号の主題であるα-アミラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列であり得る。GOIは、本発明者らの同時係属中のイギリス特許出願第9421290.9号の主題であるα-アミラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列であり得る。GOIは、本発明者らの同時係属中のPCT特許出願PCT/ EP94/03397に記載されるα-グルカンリアーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列のいずれかであり得る。１つの局面において、GOIは、本発明によるヌクレオチド配列でさえあり得る( ただし、異なるプロモーターに作動可能に連結されている場合)。 GOIは、キシラーゼ、アラビナーゼ、アセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、グルカナーゼ、ペクチナーゼ、分枝酵素または別の炭水化物改変酵素もしくはプロテイナーゼの１つ以上をコードする配列を含み得る。あるいは、GO Iは、配列のいずれかに対してアンチセンスである配列であり得る。上記の通り、本発明は特定の酵素活性に選択的に影響を与える機構を提供する。本発明の重要な適用において、ゲノムタンパタ質またはゲノム酵素のアンチセンスイントロン構築物の発現、および(例えば、同時に)そのゲノム酵素またはゲノムタンパク質組換え体の発現によって(換言すれば、GOIはゲノム酵素またはゲノムタンパク質をコードする組換えヌクレオチド配列である)、その特定のゲノムタンパク質またはゲノム酵素をコードするゲノムヌクレオチド配列の発現を減少または除去することが、今や可能になる。この適用により、各々のゲノム酵素またはゲノムタンパク質の非存在下で(または減少したレベルで)、所望の組換え酵素および組換えタンパク質の発現が可能である。従って、所望の組換え酵素および組換えタンパク質は、宿主生物から容易に分離および精製され得る。本発明のこの特定の局面は、例えば、その方法がまた、組換え酵素の発現に影響を与えるような、アンチセンスエキソン発現の使用に依存する先行技術の方法を超えて、非常に有利である。従って、本発明のさらなる局面は、宿主生物内における組換えタンパク質または組換え酵素の発現の方法に関する。その方法は、組換えタンパク質または組換え酵素をコードするヌクレオチド配列を発現する工程；およびさらなるヌクレオチド配列を発現する工程であって、ここで、さらなるヌクレオチド配列は、部分的にまたは完全に、アンチセンス方向でイントロンをコードし；ここで、イントロンが、組換えタンパク質または組換え酵素に対応するタンパク質または酵素をコードするゲノム遺伝子と通常結合しているイントロンであり；そしてここでさらなるヌクレオチド配列はイントロンと通常結合しているエキソン配列に対してアンチセンスである配列を含まない、工程を包含する。さらなる局面は、構築物、ベクター、細胞、組織およびトランスジェニック生物へのそれらの配列の組み込みを含む、ヌクレオチド配列の組み合わせを含む。それゆえに、本発明はまた、ヌクレオチド配列の組み合わせに関する。このヌクレオチド配列は、組換え酵素をコードする第１のヌクレオチド配列；およびアンチセンス方向のイントロンに対応する第２のヌクレオチド配列であって；ここでイントロンが、組換え酵素に対応する酵素をコードしているゲノム遺伝子と結合しているイントロンであり；そして第２のヌクレオチド配列がイントロンと通常結合しているエキソン配列に対してアンチセンスである配列を含まない配列を、含有する。 GOIは、例えば添付の配列表に示す任意の一つ以上のイントロン配列のような、１つ以上のイントロンでさえもコードし得る。例えば、本発明はまた、好ましくはアンチセンスイントロン配列と相補的ではない、例えば、センスイントロン (例えば、配列番号2または別のクラスA SBEイントロン)と組み合わせた、例えばアンチセンスイントロン(例えば、配列番号38の相補体)の発現を含む。用語「細胞」、「組織」および「器官」は、細胞、組織、および器官自体を含み、そして生物内にある場合を含む。用語「生物」は本発明に関連して、本発明に従ったヌクレオチド配列を含み得る任意の生物、および/または生物中に存在する場合に、本発明に従ったヌクレオチド配列が発現され得る任意の生物を含む。好ましくはこの生物はデンプン産生生物(例えば、植物、藻類、真菌、酵母および細菌の任意の１つ、ならびにそれらの細胞株)である。好ましくは、生物は植物である。用語「デンプン産生生物」は、デンプンを生合成し得る任意の生物を含む。好ましくは、デンプン産生生物は植物である。本明細書で使用される用語「植物」は、任意の適切な被子植物、裸子植物、単子葉植物および双子葉植物を含む。適切な植物の代表例としては、ジャガイモのような野菜；コムギ、トウモロコシおよびオオムギのような穀物；果実；樹木；花；および他の植物作物を含む。好ましくは、この用語は「ジャガイモ」を意味する。用語「トランスジェニック生物」は本発明に関連して、本発明に従ったヌクレオチド配列および/またはそれから得られる産物を含む任意の生物、および/またはここで本発明に従ったヌクレオチド配列がその生物内で発現され得る任意の生物を含む。好ましくは本発明のヌクレオチド配列は生物のゲノムに組み込まれる。好ましくはトランスジェニック生物は植物であり、さらに好ましくはジャガイモである。宿主生物を調製するために、原核生物または真核生物を使用し得る。適切な原核生物宿主の例は、E．coliおよびBacillus Subtilisを含む。原核生物宿主の形質転換についての教示は、当該分野においてよく考証されている。例えば、Samb rookら(Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第２版、1989、 Cold Spring Harbor Laboratory Press)を参照。本発明に従う酵素およびそれをコードするヌクレオチド配列が、EP-B-0470145 およびCA-A-2006454において開示されていないとしても、これら２つの文書は、本発明に従ってトランスジェニック植物を調製するために使用され得る技術の型 qに対するいくつかの有益な背景の説明を提供する。これらの背景の教示のいくつかは、ここで以下の説明中に含まれる。遺伝的に改変される植物の構築の基本原理は、植物ゲノムの中に遺伝情報を挿入し、その結果挿入された遺伝物質の安定な維持を得ることである。遺伝情報を挿入するためには、いくつかの技術が存在しており、２つの主要な原理は、遺伝情報の直接導入、およびベクター系の使用による遺伝情報の導入である。一般的な技術の概説は、Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Bi ol[1991]42：205-225)による論文、およびChristou(Agro-Food-Industry Hi-Tec h March/April 199417-27)による論文に見いだされ得る。このように、１つの局面において、本発明はベクター系に関する。このベクター系は、本発明に従ったヌクレオチド配列または構築物を有し、そしてヌクレオチド配列または構築物を、植物のような生物のゲノムに導入し得る。ベクター系は１つのベクターを含み得るが、２つのベクターを含み得る。２つのベクターの場合、ベクター系は、通常バイナリーベクター系と呼ばれる。バイナリーベクター系は、Gynheung Anら(1980)，Binary Vectors，Plant Molecular Biology Manual A3，1-19にさらに詳細に記載されている。所定のプロモーターまたはヌクレオチド配列または構築物での植物細胞の形質転換のために、広範に使用されている系の１つは、Agrobacterium tumefaciens 由来のTiプラスミドまたはAgrobacterium rhizogenes由来のRiプラスミドの使用に基づいている(Anら(1986)、Plant Physiol.81，301-305およびButcher D.N.ら (1980)、Tissue Culture Methods for Plant Pathologists、D.S.Ingramsおよび J.P.Helgeson編、203-208頁)。上記の植物または植物細胞構築物の構築に適する、いくつかの異なるTiおよびRiプラスミドが構築されている。そのようなTiプラスミドに非限定例は、pGV3850である。本発明のヌクレオチド配列または構築物は、T-DNAボーダー(border)に隣接した周囲の配列の破壊を避けるために、好ましくはTiプラスミドにT-DNAの末端配列の間またはT-DNA配列に隣接して挿入されるべきである。なぜなら、少なくとも１つのこれらの領域が植物ゲノムへの改変したT-DNAの挿入に必須であるようだからである。上記の説明から理解されるように、生物が植物である場合、本発明のベクター系は、好ましくは植物への感染に必須の配列(例えば、vir領域)およびT-DNA配列の少なくとも１つのボーダー部分(このボーダー部分は遺伝的構築物と同じベクターに位置する)を含むベクター系である。さらに、ベクター系は、好ましくはAgrobacterium tumefaciens TiプラスミドまたはAgrobacterium rhizogenes Riプラスミドまたはそれらの誘導体を含む。これらのプラスミドは、周知で、そしてトランスジェニック植物の構築に広く使用されているため、これらのプラスミドまたはその誘導体を基礎とした、多くのベクター系が存在する。トランスジェニック植物の構築において、本発明のヌクレオチド配列または構築物は、まず微生物中に構築され得る。この微生物中でベクターは複製し得、そして微生物は、植物に挿入する前に操作することが容易である。有用な微生物の１例はE．coliであるが、上記の特性を有する他の微生物が使用され得る。上で定義したようなベクター系のベクターが、E．coli中で構築された場合、必要に応じて、適切なAgrobacterium株、例えばAgrobacterium tumefaciensに移される。従って、本発明のヌクレオチド配列または構築物を有するTiプラスミドは、好ましくは適切なAgrobacterium株、例えばA．tumefaciensに移され、その結果、本発明のプロモーターまたはヌクレオチド配列または構築物を有するAgrobacter ium細胞を得、そのDNAは続いて改変されるべき植物細胞に移される。例えば、形質転換のために、植物細胞のTiプラスミドまたはRiプラスミドが使用される場合、TiプラスミドおよびRiプラスミドのT-DNAの少なくとも右側の境界、しかし、しばしば右側および左側の境界が、導入する遺伝子の隣接する領域として連結され得る。植物細胞の形質転換のための、T-DNAの使用は、徹底的に研究されており、そしてEP-A-120516:Hoekema，The Binary Plant Vector Syste m Offset-drukkerij Kanters B.B.，Alblasserdam，1985,第５章;Fraleyら、Crl t．Rev．Plant Sci.，4：1-46；およびAnら、EMBO J.(1985)4：277-284に記載されている。 Agrobacteriumによる植物組織の直接感染は、広く用いられ、そしてButcher D .N.ら、(1980)Tissue Culture Methods for Plant Pathologists，D.S.Ingrams およびJ.P.Helgeson編，203-208によって記載されている、単純な技術である。この話題に関するさらなる教示について、Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Pl ant Mol Biol[1991]42：205-225)およびChristou(Agro-Food-Industry Hi-TechM arch/April 1994 17-27)を参照。この技術を用いて、植物の特定の部分または組織の中または上(すなわち、葉、根、茎の一部または植物の別の部分の上)で、植物の感染が行われ得る。代表的には、GOI(例えば、本発明によるヌクレオチド配列)および必要に応じてプロモーターを有するAgrobacteriumによる植物組織の直接感染では、(例えば、カミソリの刃で植物を切り刻むか、または針で植物に穴を開けるか、またはヤスリで植物を擦ることにより)感染されるべき植物は傷つけられる。次いで傷にAgr obacteriumを接種する。次いで、接種された植物または植物の部分を、適切な培養培地中で増殖させ、そして成熟植物に生長させる。植物細胞が構築される場合、これらの細胞は、例えば、アミノ酸、植物ホルモン、ビタミン等のような必要な成長因子が供給された、適切な培養培地中で細胞を培養することにより、周知の組織培養方法に従って増殖および維持され得る。細胞または組織培養から植物を再生させるための公知の方法を用いて、例えば、形質転換されたシュートを抗生物質を用いて選抜することによって、およびシュートを適切な栄養素、植物ホルモン等を含む培地で継代培養することによって、形質転換された細胞の、遺伝的に改変された植物への再生は達成され得る。植物形質転換についてのさらなる教示はEP-A-0449375に見い出され得る。 CA-A-2006454に報告されるように、E．coliの複製系および形質転換細胞の選択を可能にするマーカーを含む、クローニングベクターが大量に利用可能である。このベクターは、例えばpBR 322、pUCシリーズ、M13 mpシリーズ、pACYC 184 等を含む。このような方法で、本発明のヌクレオチドまたは構築物はベクター中の適切な制限位置に導入され得る。次いで含まれたプラスミドはE．coli中で形質転換のために使用される。E．coli細胞は適切な栄養培地中で培養され、次いで採集および溶解される。次にプラスミドが回収される。分析の方法として、一般的に使用される配列分析、制限分析、電気泳動、およびさらなる生化学的−分子生物学的方法がある。各々の操作の後、使用したDNA配列は制限(酵素切断)されそして次のDNA配列と連結され得る。各々の配列は同じまたは異なるプラスミドにクローニングされ得る。本発明に従うヌクレオチド配列または構築物の植物への導入後、さらなるDNA 配列の存在および/または挿入が(例えば、上記で要約した組合せ系(例えば、構築物の組合せを含む生物)を作製するために)必要であり得る。本発明のヌクレオチド配列を用いる、原核生物および植物の形質転換に対する上記の注釈は、本発明のプロモーターを用いるこれらの生物の形質転換に対しても、等しく適用可能である。要約すれば、本発明は、アンチセンスイントロン配列を発現することにより、酵素活性に影響を与えることに関する。また、本発明は、これらのアンチセンスイントロン配列の発現のために有用なプロモーターに関する。次のサンプルは、ブダペスト条約に従って、認定された寄託機関であるThe Na tional Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited(NCIMB)，23S t Machar Drive，Aberdeen，Scotland，AB2 1RY，United Kingdomに1995年7月13 日に寄託された。 NCIMB 40753(本明細書中ではpBEA 8と呼ぶ)； NCIMB 40751(本明細書中ではλ-SBE3.2と呼ぶ)、および NCIMB 40752(本明細書中ではλ-SBE3.4と呼ぶ)；次のサンプルは、ブダペスト条約に従って、認定された寄託機関であるTheNat ional Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited(NCIMB)，23St Machar Drive，Aberdeen，Scotland，AB2 1RY，United Kingdomに1996年7月9日に寄託された。 NCIMB 40815(本明細書中ではpBEA 9と呼ぶ)。それゆえ、本発明の非常に好ましい実施態様は、植物(またはその細胞、組織または器官)において酵素活性に影響を与える方法に関し、この方法は、植物(またはその細胞、組織または器官)においてヌクレオチド配列を発現する工程であって、ここでこのヌクレオチド配列が部分的にまたは完全に、アンチセンス方向でイントロンをコードし；ここでこのヌクレオチド配列は、このイントロンに通常結合しているエキソン配列に対してアンチセンスである配列は含有せず；ここでデンプン分枝酵素活性が影響を受け、そして/またはアミロペクチンのレベルが影響を受け、そして/またはデンプンの組成が変化し；ならびに、ここでこのヌクレオチド配列が、配列番号38に示したクラスA SBEのイントロン１、またはクラスA SBEの任意の他のイントロン(これは、そのフラグメントを含み、かつクラスAアンチセンスイントロン配列およびクラスBアンチセンスイントロン配列の組合せを含む)に対してアンチセンスである工程、を包含する。イントロン１以外のクラスA SBEのイントロンの配列は、例えば、当該分野で周知で、かつ、例えばSambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harb or，1989に示す方法に従ってWO96/34968によって得られ得るクラスA SBE cDNAを用いた、ゲノムDNAライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングにより単離可能な、ジャガイモクラスA SBEゲノムDNAの配列決定により得られ得る。本発明はここで例示の目的のみにより記載され、次の添付図が引用される。図１は、アミロースおよびアミロペクチンの生合成の模式図である；図２は、アミロペクチンのα-1-4結合およびα-1-6結合の図である；図３は、可能性のあるアンチセンスRNA阻害機構の図である；図４は、ゲノムSBEクローンのエキソン−イントロン構造の図である；図５は、3936bpのサイズである、pPATA1のプラスミド地図である；図６は、5106bpのサイズである、pABE6のプラスミド地図である；図７は、7080bpのサイズである、pVictorIV Manのプラスミド地図である；図８は、9.54kbのサイズである、pBEA8のプラスミド地図である；図９は、9.54kbのサイズである、pBEA9のプラスミド地図である；図１０は、10.32kbのサイズである、pBEP2のプラスミド地図である；図１１は、9.12kbのサイズである、pVictor5aのプラスミド地図である；図１２は、プロモーター、エキソンおよびイントロンを含む、SBEの完全ゲノムヌクレオチド配列を示す；図１３は、クラスAおよびクラスB SBE遺伝子中のイントロン１の位置を示す；図１４は、ジャガイモタラスA SBEのイントロン１の配列を示す；図１５は、pSS17の構造を示す；および図１６は、pSS18の構造を示す。図１および図２を、上記でデンプンに関する序論的な記載において一般的に言及した。図３は、上記でアンチセンス発現に関する序論的な記載において言及した。先に述べたように、図４は、図１２にその配列を示す、ゲノムSBEクローンのエキソン-イントロン構造の図である。このクローンは、約11.5k塩基対を有し、 14個のエキソンおよび13個のイントロンを含む。イントロンは、5'末端から3'末端に向かって昇順で番号を付け、そして、それぞれ配列番号１〜１３に対応する。それらのそれぞれのアンチセンスイントロン配列を、配列番号１５〜２７に示す。より詳細には、図４および図１２は、ジャガイモSBE遺伝子の11478塩基対の情報を提示する。ヌクレオチド1〜2082の5'領域は、SBE遺伝子のプロモーター領域を含む。ヌクレオチド2048〜2051のTATAボックスの候補は枠で囲まれている。ジャガイモSBE cDNAクローン(PoulsenおよびKreiberg(1993)Plant Physiol 102：１053-1054)とエキソンDNAとの間の相同性は、2083bpで始まり、9666bpで終わる。 cDNAとエキソンDNAとの間の相同性は大文字のヌクレオチドで示し、一方、翻訳されるアミノ酸配列はエキソンDNAの下に一文字コードで示す。イントロン配列は小文字で示す。図５〜７は以下で議論する。先に述べたように、図８は、9.54k塩基対のサイズである、pBEA8のプラスミド地図である；そして図９は、9.54k塩基対のサイズである、pBEA9のプラスミド地図である。pBEA8およびpBEA9の各々が、ジャガイモのSBE遺伝子の第１のイントロン配列にアンチセンスな配列を含む。この1177 塩基対を有する第１のイントロン配列は、図４に示され、そして第１のエキソンと第２のエキソンとの間に存在する。本発明のこれらの実験および局面は、これから、より詳細に議論する。実験プロトコールゲノムクラスＢ SBEクローンの単離、プラスミドへのサブクローニングおよび配列決定ジャガイモサブクラスＢ SBE遺伝子を含む種々のクローンを、放射能標識したジャガイモSBEcDNA(PoulsenおよびKreiberg(1993)Plant Physiol．102：1053-10 54)をプローブとして使用して、Desireeジャガイモゲノムライブラリー(Clontec h Laboratories Inc.，Palo Alto CA，USA)より単離する。SBE DNAを含む、単離されたλ-ファージのフラグメント(λSBE 3.2-NCIMB 40751-およびλSBE-3.4-NC IMB 40752)を、サザン分析によって同定し、次いでpBluescript IIベクター(Clo ntech Laboratories Inc.，Palo Alto CA，USA)にサブクローニングする。λSBE 3.2は15kbジャガイモDNA挿入断片を含み、そしてλSBE-3.4は13kbジャガイモDNA 挿入断片を含む。得られたプラスミドはpGB3、pGB11、pGB15、pGB16およびpGB25 と呼ぶ(下の議論を参照)。次いで、それぞれの挿入断片を、Pharmacia Autor ead Sequencing Kit(Pharmacia，Uppsala)およびA.L.F.DNAシークエンサー(Phar macia，Uppsala)を用いて、配列決定する。全体では、クラスB SBE遺伝子の11.5kbのストレッチを配列決定した。配列は、上記のプラスミドより推定され、そこでは：pGB25は1bp〜836bpの配列を含み、pGB15は735bp〜2580bpの配列を含み、pGB16は2580bp〜5093bpの配列を含み、p GB11は3348bp〜7975bpの配列を含み、そしてpGB3は7533bp〜11468bpの配列を含む。より詳細には、pGB3を、λSBE 3.2より単離した4kbのEcoRIフラグメントをpBl uescript II SK(+)のEcoRI部位へ挿入することにより構築する。pGB11を、λSBE 3.4より単離した4.7kbのXhoIフラグメントをpBluescript II SK(+)のXboI部位へ挿入することにより構築する。pGB15を、λSBE 3.4より単離した1.7kbのSpeI フラグメントをpBluescript II SK(+)のSpeI部位へ挿入することにより構築する。pGB16を、λSBE 3.4より単離した2.5kbのSpeIフラグメントをpBluescript II SK(+)のSpeI部位へ挿入することにより構築する。pGB25の構築のために、PCRフラグメントをプライマー 5' GGA ATT CCA GTC GCA GTC TAC ATT AC 3'(配列番号３０) および 5' CGG GAT CCA GAG GCA TTA AGA TTT CTG G 3'(配列番号３１) ならびにλSBE 3.4を鋳型として用いて、産生する。 PCRフラグメントをBamHIおよびEcoRIで消化し、そして同じ制限酵素で消化したpBluescript II SK(+)に挿入する。クラスA SBEクローンを同様にして得る。クラスB SBEアンチセンスイントロンプラスミドpBEA8およびpBEA9の構築 SBEイントロン１を、オリゴヌクレオチド 5' CGG GAT CCA AAG AAA TTC TCG AGG TTA CAT GG 3'(配列番号３２) および 5' CGG GAT CCG GGG TAA TTT TTA CTA ATT TCA TG 3'(配列番号３３) ならびに、SBE遺伝子を含むλSBE 3.4ファージを鋳型として用いてPCRにより増幅する。 PCR産物をBamHIで消化し、そしてプラスミドpPATA1(WO 94/24292に記載)のパタチン(patatin)プロモーターおよび35Sターミネーター間のBamHI部位に、アンチセンス方向に挿入する。この構築物pABE6を、KpnIで消化し、そして2.4kbの「パタチンプロモーター-SBEイントロン1-35Sターミネーター」KpnIフラグメントを単離し、そして植物形質転換ベクターpVictorIV ManのKpnI部位に挿入する。Kpn Iフラグメントを２つの方向に挿入し、プラスミドpBEA8およびpBEA9を得る。pVi ctorIV Manを図７に示し、このプラスミドは、プラスミドpVictorIV SGiN Man(W O 94/24292)より単離されたE35Sプロモーター-manA-35Sターミネーターカセットを含む充填されたXbaIフラグメントを、pVictorIVの充填されたXhoI部位へ挿入することにより、形成されている。pVictorIV ManのpVictor領域は、座標2.52bp 〜0.32bpの間に含まれていた(図７を参照)。クラスA SBEアンチセンスイントロンプラスミドpSS17およびpSS18の構築プラスミドpSS17の構築ジャガイモSBEII遺伝子の2122bpのイントロン１配列を、プライマー5'-CGG GA T CCC GTA TGT CTC ACT GTG TTT GTG GC-3'(配列番号３４)および5'-CGG GAT CC C CCT ACA TAC ATA TAT CAG ATT AG-3'(配列番号３５)を用いて、ゲノムSBE II サブクローンからPCRにより増幅する。PCR産物をBamHIで消化し、そして、NPT I I遺伝子が選択マーカーとして使用される植物形質転換ベクターのBamHI部位のパタチンプロモーターの後方に、アンチセンス方向に挿入する(図15を参照)。プラスミドpSS18の構築ジャガイモSBEII遺伝子の2122bpのイントロン１配列を、プライマー5'-CGG GA T CCC GTA TGT CTC ACT GTG TTT GTG GC-3'(配列番号３４)および5'-CGG GAT CC C CCT ACA TAC ATA TAT CAG ATT AG-3'(配列番号３５)を用いて、ゲノムSBE II サブクローンからPCRにより増幅する。PCR産物をBamHIで消化し、そして、manA 遺伝子が選択マーカーとして使用される植物形質転換ベクターのBamHI部位のパタチンプロモーターの後方に、アンチセンス方向に挿入する(図１６を参照)。トランスジェニックジャガイモ植物の産生無菌貯蔵培養物 Solanum tuberosum「Bintje」および「Dianella」のシュート培養物を、Linsmaler ,E.U.およびSkoog，F.(1965)，Physiol．Plant．18：100-127に従う処方に、さらに２μMチオ硫酸銀を含む基質(LS)上で、25℃および16時間明/8時間暗条件で維持する。培養物を約40日後継代培養する。次いで、葉をシュートから切り落とし、そしてそれぞれが１つの節を含むように、節のセグメント(約0.8cm)に切断する。ジャガイモ組織の接種約40日齢のシュート培養物(高さ約5〜6cm)由来のシュートを節間のセグメント (約0.8cm)に切断する。このセグメントを目的のバイナリーベクターを含む、形質転換されたAgrobacterium tumefaciensを含む液体LS-基質上に置く。Agrobact eriumを、適切な抗生物質(Agrobacterium株の耐性遺伝子に対応する)を含むYMB- 基質(リン酸水素二カリウム三水和物(0.66g/l)；硫酸マグネシウム六水和物(0.2 0g/l)；塩化ナトリウム(0.10g/l)；マンニトール(10.0g/l)；および酵母抽出物( 0.40g/l))中で一晩、660nmにおける光学密度(OD-660)が約0.8になるまで増殖させ、遠心分離し、そしてOD-660が0.5になるようにLS-基質に再懸濁する。セグメントを30分間、Agrobacteriumの懸濁液に残し、次いで、セグメントを滅菌した濾紙にブロットして余分の細菌を除去する。同時培養シュートセグメントを寒天(8.0g/l)、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(2.0mg/l) およびトランスゼアチン(trans-zeatin)(0.5mg/l)を含むLS-基質上で、細菌と共に48時間直接的に同時培養する。基質および外植片もまた、滅菌した濾紙で覆い、ペトリ皿を25℃および16時間明/8時間暗条件に置く。「洗浄」手順同時培養基質上に48時間置いた後、セグメントを800mg/lカルベニシリンを含む液体LS-基質を含む容器に移す。容器は穏やかに振盪させ、そしてこの手順によってAgrobacteriumの大部分をセグメントから洗い流し、そして/または死滅させる。選択洗浄手順の後、セグメントをLS-基質、寒天(8g/l)、トランス-ゼアチン(1〜5m g/l)、ジベレリン酸(0.1mg/l)、カルベニシリン(800mg/l)、および硫酸カナマイシン(50〜100mg/l)またはホスフィノトリシン(phosphinotricin)(1〜5mg/l)、またはマンノース(5g/l)(使用するベクター構築物に依存する)を含むプレートに、移す。毎にセグメントを新鮮な基質に各３〜４週間継代培養する。３〜４週間で、シュートはセグメントから発生し、そして３〜４ケ月間新しいシュートの形成が続く。再生シュートの根付け再生シュートを、LS-基質、寒天(8g/l)およびカルベニシリン(800mg/l)から構成される根付け基質に移す。再生シュートのトランスジェニック遺伝子型を硫酸カナマイシン(200mg/l)を含む上記の基質上での根付けの可能性を試験することにより、NPTIIアッセイ(Ra dke，S.E．ら、Theor．Appl．Genet.(1988)，75：685-694)を行うことにより、またはWangら(1993，NAR 21 4153-4154頁)に従うPCR分析を行うことにより、確認する。これらのアッセイのいずれかで陽性でない植物を、廃棄するか、またはコントロールとして使用する。あるいは、トランスジェニック植物は、Hodal,L. ら(Pl．Sci.(1992)87：115-122)に従って、同時導入されるβ-グルクロダーゼ遺伝子のGUSアッセイを行うことにより確認され得る。土への移動新しく根付いた植物(高さ約2〜3cm)を根付け基質から土へ植えかえ、そして生長チャンバーに置く(21℃、16時間光200-400μE/m²/秒)。植物がうまく定着する場合、温室に移し、ここで塊茎が発達し、そして植物の上部が老化するまで生長させる。収穫ジャガイモを約３ヶ月後に収穫し、次いで分析する。分枝酵素分析トランスジェニックジャガイモ系統中のクラスAおよびクラスB SBE発現を、Bl ennowおよびJohanssonによって記載されたSBEアッセイ(Phytochemistry(1991)30 ：437-444)を用いて、およびジャガイモSBEに対して指向される抗体を用いる、標準的なウェスタン手順によって測定する。デンプン分析デンプンをジャガイモの塊茎から単離し、そしてアミロース：アミロペクチン比を分析する(Hovenkamp-Hermelinkら、(1988)Potato Reseach 31：241-246)。アミロペクチンの鎖の長さの分布を、さらに、Dionex HPAECによるイソアミラーゼ消化デンプンの分析により決定する。イソアミラーゼ消化デンプンにおける減少した末端の数は、N．Nelson(1944)J .Biol．Chem．153：375-380によって記載された方法によって決定する。結果は、トランスジェニック植物において、SBEの合成のレベルおよび/または SBEの活性のレベルおよび/またはデンプンSBEの組成が減少していることを示す。 SBEプロモーター構築物の構築 SBEプロモーターフラグメントを、λ-SBE 3.4から、プライマー 5' CCA TCG ATA CTT TAA GTG ATT TGA TGG C 3'(配列番号３６) および 5' CGG GAT CCT GTT CTG ATT CTT GAT TTC C 3'(配列番号３７) を用いて増幅する。 PCR産物を、ClaIおよびBamHIで消化する。次いで、得られる1.2kbフラグメントをClaIおよびBglIIで線状化したpVictor5a(図１１を参照)に挿入し、pBEP2を得る(図１０を参考のこと)。ジャガイモ塊茎のデンプン分枝酵素測定 pBEA8、pBEA9、pSS17、またはpSS18で形質転換したジャガイモ植物由来のジャガイモを小片に切断し、そして抽出緩衝液(50mM Tris-HCl pH7.5、ジチオナイトナトリウム(0.1g/l)および２mM DTT)中で、Ultra-Turaxホモジナイザーを用いて均質化する；塊茎10gあたり1gのDowex xl.を加える。粗ホモジネートをミラクロスフィルター(miracloth filter)を通して濾過し、そして4℃において10分間、24,700gで遠心分離する。上清をデンプン分枝酵素アッセイに使用する。デンプン分岐酵素アッセイを、25℃で、0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝液pH7.0 、0.75mg/mlアミロース、5mg/mlウシ血清アルブミンおよびジャガイモ抽出物から構成される、400μlの容量で行う。0、15、30および60分後に50μlのアリコートを反応から除去し、20μ2の3N HClに移す。1mlのヨウ素溶液を添加し、そして 620nmでの吸光度の減少をELISA分光光度計を用いて測定する。プラスミドpBEA8、pSS17、およびpSS18で形質転換した、34のトランスジェニックDianellaジャガイモ植物由来の塊茎抽出物中のデンプン分枝酵素(SBE)レベルを測定する。形質転換されたトランスジェニック系統は、形質転換していないDianella植物で見い出される適切なクラスAおよびクラスBのSBEレベルの10％から15％のSBEレベルを有する塊茎を産生する。さらなる実験において、上記のように、プラスミドpSS17およびpBEA8を、ジャガイモ植物に同時トランスフェクトする。同時トランスフェクトにおいては、上記のように分析する場合、クラスA SBEレベルおよびクラスB SBEレベルの同時減少が観察される。要約上記の実施例は、ジャガイモクラスAおよびクラスB SBEの遺伝子に由来するアンチセンスイントロン構築物の単離、配列決定、および利用に関する。これらの SBEイントロンアンチセンス構築物は、ジャガイモ植物のような植物に導入され得る。導入後、SBE合成のレベルおよび/またはSBE活性のレベルおよび/または植物中のデンプンの組成の減少が達成され得る。理論に縛られることを望むことなく、本発明の発現されたアンチセンスヌクレオチド配列は、プレ-mRNAのセンスイントロンに結合し、そしてそれによってプレ-mRNAスプライシングおよび/または引き続くmRNAの翻訳を防止している、と考えられる。それゆえに、この結合は、植物酵素活性(特にクラスAおよびクラスB SBE活性)のレベルを下げると考えられ、次にはSBE活性はアミロース：アミロペクチン比に影響を与え、従ってアミロペクチンの分枝パターンに影響を与えると考えられる。従って、本発明は、ジャガイモ塊茎のような、植物、またはその組織もしくは細胞において、アンチセンスイントロン配列を使用して、アンチセンス-RNA技術を用いることによって、SBE活性のレベルの減少によって、デンプン組成の操作を可能にする方法を提供する。２重に形質転換したジャガイモ植物由来の、クラスAおよびB SBE配列の同時減少または除去は、さらに、異なるSBE遺伝子で意のままにそのような植物を形質転換する可能性を提供し、従って、所望の結果に従ってデンプンにおける分枝操作を可能にする。本発明の他の改変は、本発明の範囲から逸脱することなく、同業者には明らかである。続く頁は、配列番号１〜配列番号３８と連続的に番号を付けた、多くの配列表を示す。手短に言えば、配列番号１〜配列番号１３はセンスイントロン配列(ゲノムDNA)を示す；配列番号１４はSBEプロモーター配列(ゲノム配列)を示す；配列番号１５〜配列番号２７はアンチセンスイントロン配列を示す；および配列番号２８はSBEプロモーター配列に相補的な配列-すなわち、アンチセンス方向のSB Eプロモーター配列を示す。プロモーター、エキソンおよびイントロンを含む、クラスB SBEの完全なゲノムヌクレオチド配列は、配列番号２９に示され、そして特定の遺伝子の特色を強調する図４および図１２に説明される。配列番号３０〜３７は、上記の方法で使用したプライマーを示す。配列番号３８は、クラスA SBEのイントロン１の配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．植物(またはその細胞、組織、もしくは器官)において酵素活性に影響を及ぼす方法であって、該植物(またはその細胞、組織、もしくは器官)中でヌクレオチド配列を発現させる工程を包含し、ここで該ヌクレオチド配列は、クラスＡのジャガイモのデンプン分枝酵素のイントロンをアンチセンス方向に部分的にまたは完全にコードし、必要に応じて、クラスＢのデンプン分枝酵素のイントロンをアンチセンス方向またはセンス方向に部分的にまたは完全にコードするヌクレオチド配列を有し；そしてここで該ヌクレオチド配列は、該イントロンに正常に結合したエキソン配列に対してアンチセンスである配列を含まない、方法。２．デンプン分枝酵素の活性が影響を受け、および/またはアミロペクチンのレベルが影響を受け、および/またはデンプンの組成が変化される、請求項１に記載の方法。３．デンプン産生生物(またはその細胞、組織、もしくは器官)において酵素活性に影響を及ぼす方法であって、該デンプン産生生物(またはその細胞、組織、もしくは器官)中で、ヌクレオチド配列を発現させる工程を包含し、ここで該ヌクレオチド配列は、クラスＡのデンプン分枝酵素のイントロンをアンチセンス方向に部分的にまたは完全にコードし、必要に応じて、クラスＢのデンプン分枝酵素のイントロンをアンチセンスまたはセンス方向に部分的にまたは完全にコードするヌクレオチド配列を有し；そしてここで、デンプン分枝酵素の活性が影響を受け、および/またはアミロペクチンのレベルが影響を受け、および/またはデンプンの組成が変化される、方法。４．前記ヌクレオチド配列が、前記イントロンに正常に結合されるエキソン配列に対してアンチセンスである配列を含まない、請求項３に記載の方法。５．前記酵素活性が減少または消去される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。６．前記ヌクレオチド配列が、アンチセンス方向に少なくとも１つのイントロンの、少なくとも実質的に全てをコードする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。７．前記ヌクレオチド配列が、アンチセンス方向に少なくとも１つのイントロンの全てをコードする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。８．前記ヌクレオチド配列が配列番号38の相補体、またはそのフラグメントを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。９．前記ヌクレオチド配列が、配列番号14で示される配列を有するプロモーター、またはその改変体、誘導体、もしくはホモログにより発現される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。１０．請求項８に記載のヌクレオチド配列、またはその改変体、誘導体、もしくはホモログを含む、アンチセンス配列。１１．配列番号14に示される配列を有する、プロモーター、またはその改変体、誘導体もしくはホモログ。１２．目的の遺伝子(「GOI」)と組み合わせる、請求項１１に記載のプロモーター。１３．請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の本発明を含み得るか、または発現し得る、構築物。１４．請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の本発明を含むか、または発現する、ベクター。１５．組換え酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、およびアンチセンス方向でイントロンに対応する第２のヌクレオチド配列を含む、ヌクレオチド配列の組み合わせであって；ここで、該イントロンは該組換え酵素に対応する酵素をコードするゲノム遺伝子に結合されるイントロンであり；そしてここで該第２のヌクレオチド配列は、該イントロンに正常に結合したエキソン配列に対してアンチセンスである配列を含まない、ヌクレオチド配列の組み合わせ。１６．請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の本発明を含むか、または発現する、細胞、組織、または器官。１７．請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の本発明を含むか、または発現する、トランスジェニックデンプン産生生物。１８．前記生物が植物である、請求項１７に記載のトランスジェニックデンプン産生生物。１９．請求項１〜１８のいずれか１項に記載の本発明から得られる、デンプン。２０．クラスＡのSBEのイントロンに対してアンチセンスである、ヌクレオチド配列。２１．生物におけるデンプン産生を改変するための方法であって、該方法は、クラスＡのSBEに関するアンチセンスイントロン配列を発現し得る導入遺伝子およびクラスＢのSBEに関するアンチセンスイントロン配列を発現し得る導入遺伝子を用いて該生物を形質転換し、これにより内因性のクラスＡおよびクラスＢの産生を減少または消去し、そして異種供給源由来のSBEをコードするさらなる配列を用いて該生物を形質転換すること、を包含する、方法。