SE467160B

SE467160B - Genetisk foeraendring av potatis foer bildning av staerkelse av amylostyp

Info

Publication number: SE467160B
Application number: SE9004095A
Authority: SE
Inventors: P Hofvander
Original assignee: Amylogene Hb
Priority date: 1990-12-21
Filing date: 1990-12-21
Publication date: 1992-06-01
Also published as: EP0563201A1; SE9004095L; AU9109791A; PL169859B1; WO1992011375A1; SE9004095D0

Description

“467 160 lO 15 20 25 30 35 2 idag normalt ej används. Stärkelse från sådan gentekniskt förändrad potatis har stor potential som livsmedelstill- sats, eftersom den inte genomgått någon kemisk modifie- ringsprocess.

Stärkelsesyntes Syntesen av stärkelse och regleringen därav studeras för närvarande med stort intresse, både på grundforsk- ningsnivå och med tanke på industriell tillämpning. Fastän man känner till mycket om vissa enzymers medverkan i om- vandlingen av sackaros till stärkelse, är stärkelsens bio- syntes ännu inte klarlagd. Genom undersökning av framför- allt majs har man dock kunnat klarlägga en del av syntes- vägarna och de enzymer som deltar i dessa reaktioner. De viktigaste stärkelsesyntetiserande enzymerna för uppbygg- nad av stärkelsekornen är stärkelsesyntas och "branching enzyme". I majs har man hittills påvisat och studerat tre former av stärkelsesyntas, varav två är lösliga och en är olösligt associerad till stärkelsekornen. Även "branching enzyme" i majs består av tre former, vilka troligen kodas av tre olika gener.

"Branching enzyme" i olika växtslag Stärkelsekornen innehåller en blandning av linjära och förgrenade molekyler, vilka bildar stärkelsekomponen- terna amylos respektive amylopektin. Amylopektin produce- ras genom en interaktion mellan stärkelsesyntas och "branching enzyme", alfa-l,4-glukan;alfa-l,4-glukan-6-glu- kosyltransferas (EC 2.4.l.l8). "Branching enzyme" (BE) hydrolyserar alfa-1,4-bindningar och syntetiserar alfa- -1,6-bindningar (Mac Donald & Preiss, 1985; Preiss, 1988).

Endosperm av normalmajs innehåller tre former av BE- -protein, betecknade BE I, BE IIa samt BE IIb. Mutationen "amylosextender" (ae) inhiberar aktiviteten av enzymet BE Ilb, vilket resulterar i ett reducerat innehåll av amylo- pektin och en motsvarande ökning av halten amylos. ae-en- dosperm har därmed ett annat förhållande mellan amylos och amylopektin än normal majs, nämligen 65:35 i stället för 25:75 (De Vries Kuranda, 1987). 10 15 20 25 30 35 467 160 3 Fastän likheterna mellan de tre enzymformerna är sto- ra har de var för sig egenskaper i sin primära struktur som gör dem unika. Generna för respektive enzymform har hittills inte identifierats, men genom isolering av cDNA- -kloner för varje BE-form kan respektive gen med stor san- nolikhet karaktäriseras.

I ärt av normaltyp har man identifierat två former av "branching enzyme" (BE). En mutation i r-locus, som medför en skrynklig ärt, påverkar aktiviteten av BE så att den ena enzymformen inhiberas. Detta resulterar i en förändrad stärkelsesammansättning med 30% amylopektin och 70% amylos jämfört med det omvända förhållandet i rund normal ärt (Smith, 1988).

"Branching enzyme" (BE) i potatis är ett monomert protein, dvs det består av en enda enzymform. Molekylvik- ten för potatis-BE varierar mellan 79 och 103 kD beroende på vilket reningsförfarande som används. Det finns indika- tioner på att potatis-BE skulle bestå av flera former, men antagligen är flera av formerna nedbrytningsprodukter fràn det egentliga proteinet (Vos-Scheperkeuter, 1989; Blennow & Johansson, 1990).

Peptidsekvensering av tre BE-former, separerade med elektrofores, visar så stor homologi mellan enzymformerna att dessa antas ha samma ursprung. Serologiska test stöder detta antagande, eftersom antisera fràn de tre enzymfor- merna korsreagerar med varandra.

Inhiberingfav "branching enzyme" Genom att inhibera någon av formerna av "branching enzyme" i majs och ärt kan stärkelsesammansättningen änd- ras så att halten av amylos kraftigt ökar på bekostnad av amylopektinproduktionen.

I potatis har man hittills inte funnit någon naturlig genotyp med ett förhöjd innehåll av amylos. Det är dock möjligt att i varierande grad reducera innehållet av BE, vilket resulterar i att stärkelsen i potatisknölen har förhöjda halter av amylos i jämförelse med vanlig potatis. \4e7 160 10 15 20 25 30 35 4 Reduktionen av bildning av enzym kan åstadkommas pá flera sätt, t ex genom: - mutagenbehandling, vilket medför en förändring av gen- sekvensen som kodar för bildningen av enzymet - införlivande av en transposon i gensekvensen som kodar för enzymet - genteknisk modifiering så att uttrycket av genen som ko- dar för enzymet modifieras genom s k antisens-geninhibe- ring.

I fig 1 visas ett specifikt undertryckande av normal genexpression genom att en komplementär antisens-nukleotid får hybridisera med mRNA för en målgen. Antisens-nukleoti- den är således antisens-RNA, som transkriberas in vivo från en "omvänd" gensekvens (Izant, 1989).

Genom användning av antisens-teknik har olika gen- funktioner i växter inhiberats. Antisens-konstruktionen för chalkon-syntas, polygalakturonas och fosfinotricin- -acetyltransferas har använts för att inhibera motsvarande enzym i växtslagen petunia, tomat respektive tobak (Van der Krol et al, 1990; Sheehy et al, 1988; Cornelissen, 1989). Ändamålet med uppfinningen är att åstadkomma en i olika grad ökad amylosproduktion i potatisknöl genom an- vändning av antisens-gen-inhibering.

Sammanfattning av uppfinningen Enligt uppfinningen inhiberas i varierande grad funk- tionen av BE-genen och därmed amylopektinproduktionen i potatis genom användning av nya antisens-konstruktioner.

Antisens-konstruktionerna enligt uppfinningen omfattar en knölspecifik promotor, transkriptionsstart samt första exon av genen som kodar för bildning av "branching enzyme" (BE-genen) i potatis, insatt i antisens-riktning.

Uppfinningen omfattar även en gen som kodar för bild- ning av "branching enzyme" i potatis, den s k BE-genen.

Uppfinningen omfattar likaså vektorer, vilka inbegri- per antisens-konstruktionerna enligt uppfinningen. lO 15 20 25 30 35 467 160 5 I ytterligare aspekter av uppfinningen omfattar denna celler, plantor, knölar, mikroknölar respektive frön, vil- kas genom innehåller antisens-konstruktionerna enligt upp- finningen.

I ytterligare andra aspekter omfattar uppfinningen stärkelse av amylostyp, både nativ och derivatiserad.

Slutligen omfattar uppfinningen ett förfarande för undertryckande av bildning av stärkelse av amylopektintyp i potatis, varigenom potatisknölarna bildar i varierande grad ökad andel stärkelse av amylostyp.

Uppfinningen beskrivs närmare med hjälp av bifogade figurer, vari fig 1 visar principen för antisens-geninhibering; fig 2 visar antisens-konstruktioner enligt uppfin- ningen (enligt Bevan, 1984).

Dessutom visas sekvensen för en knölspecifik promotor i SEQ ID nr 1.

Isolering_av genomisk BE-gen i potatis Utgående från en känd peptidsekvens från BE-genen i potatis framställs två syntetiska oligonukleotider som överlappar varandra. Oligonukleotiderna (producerade vid Institutet för cellbiologi, Uppsala, Sverige, på uppdrag av sökanden) används för identifiering av cDNA-kloner från ett cDNA-bibliotek i lambda gt ll (framställt för sökan- dens räkning av Clontech, USA). Dessa cDNA-kloner utnytt- jas för isolering av den genomiska BE-genen från ett geno- miskt bibliotek i EMBL 3 (framställt för sökande av Clon- tech, USA).

Antisens-konstruktioner En varierande förhöjning av amyloshalten i potatis- knölar eftersträvas, varför olika typer av antisens-gener konstrueras, vilka mer eller mindre inhiberar uttrycket av BE-genen in vivo. Man utgår från den isolerade genomiska BE-genen, varigenom antisens-konstruktionerna omfattar delar av BE-genen motsvarande sekvenser i regionen kring promotor, transkriptionsstart samt första exon.

För att uppnå såväl variation i amyloshalt som väv- 4e7 160 10 15 20 25 30' 35 6 nadsspecificitet, dvs produktionen av amylopektin skall reduceras enbart i potatisknölen, kopplas olika knölspeci- fika promotorer till antisens-genen. Förutom den egna BE- -promotorn används följande promotorer i olika kombinatio- ner: 35S CaMV, patatin I (erhàllen från Dr. M. Bevan, Eng-, land) samt potatis-GBSS-promotorn.

Isolering och karaktärisering av potatis-GBSS-promo- torn är beskriven i den samtidigt inlämnade patentansökan med titeln "Genteknisk förändring av potatis för bildning av stärkelse av amylopektintyp" av föreliggande sökande och dess nukleotidsekvens framgår av SEQ ID nr 1. GBSS- -promotorn ingår i den potatisgen som kodar för bildning av stärkelsekornbundet stärkelsesyntas (granule bound starch synthase). Det är detta enzym som huvudsakligen är ansvarigt för bildningen av amylos i potatis.

De binära Ti-plasmiderna pBI 121 och pBI 101 (till- handahàllna av Clontech, USA) ligger till grund för samt- liga genkonstruktioner (fig 2), vilket betyder att NPT-II och GUS-genen utgör selektionsmarkörer. GUS-genen är den gen som kodar för beta-glukuronidas.

Transformation Antisens-konstruktionerna överförs till bakterier, lämpligen medelst "frys-upptinings"-metoden (An et al, 1988). Överföringen av den rekombinanta bakterien till potatisvävnad sker genom inkubation av potatisvävnanden med den rekombinanta bakterien i lämpligt medium efter det att någon form av skada tillförts potatisvävnaden. Under inkuberingen går T-DNA från bakterien in i värdväxtens DNA. Efter inkuberingen dödas bakterierna och potatisväv- naden överförs på fast medium för kallusinduktion och in- kuberas för kallustillväxt.

Efter lämpliga passager genom ytterligare medier bil- das skott, vilka skärs bort från potatisvävnaden.

Som en första kontroll av att antisens-konstruktio- nerna har överförts till potatisvävnaden analyseras denna med avseende på närvaron av den använda markören. 10 15 20 25 30 35 467 160 7 Ytterligare kontroller för test av antisens-konstruk- tionernas expression samt överföring till potatisgenomet utförs med exempelvis southern och northern hybridisering (Maniatis et al (1982)). Antalet kopior av antisens-konst- ruktionen som överförts bestäms med southern hybridise- ring. I Kontrollen av expressionen pà proteinnivà utförs lämpligen pà mikroknölar inducerade in vitro pá de trans- formerade skotten för att man så snabbt som möjligt skall kunna genomföra kontrollen.

Karaktärisering av stärkelsen Stärkelsesammansättningen i mikroknölar är identisk- med den i vanliga potatisknölar och därför kan antisens- -konstruktionernas inverkan pà amylopektinproduktionen undersökas i mikroknölar. Förhållandet mellan amylos och amylopektin kan bestämmas med en spektrofotometrisk metod (t ex enligt Hovenkamp-Hermelink et al, 1988).

Utvinning av amylos ur amylospotatis Amylos utvinns ur den s k amylospotatisen (potatis vari bildningen av amylopektin har undertryckts i varie- rande grad genom införandet av antisens-konstruktionerna enligt uppfinningen) på känt sätt.

Derivatisering av amylos Beroende på amylosets slutliga användning kan dess fysikaliska och kemiska egenskaper förändras genom deri- vatisering. Med derivatisering avses här såväl kemisk som fysikalisk och enzymatisk behandling samt kombinationer av dessa (Modified starches).

Den kemiska derivatiseringen, dvs kemisk förändring av amyloset, kan ske pà olika sätt, exempelvis genom oxi- dation, syrahydrolys, dextrinisering, olika former av för- etring, t ex katjonisering, hydroxipropylering och hyd- roxietyleing, olika former av förestring, t ex med vinyl- acetat, ättiksyraanhydrid, eller genom monofosfatering, difosfatering och oktenylsuccinering, samt kombinationer av dessa. "4e7 160 10 15 20 25 30 35 8 Fysikalisk förändring av amyloset kan exempelvis åstadkommas genom valstorkning eller extrudering.

Vid enzymatisk derivatisering utförs en nedbrytning (minskning av viskositeten) och kemisk modifiering av amy- loset med hjälp av förekommande enzymatiska system.

Derivatiseringen genomförs vid olika temperaturer, allt efter vilken slutprodukt som man önskar framställa.

Det vanliga temperaturomràdet som man arbetar inom är 20-45°C, men temperaturer upp till l80°C kan användas.

Uppfinningen beskrivs närmare i följande exempel.

Exempel 1 Framställning av mikroknölar med insatta antisens-konst- ruktioner enligt uppfinningen Antisens-konstruktionerna (se fig 2) överförs till Agrobacterium tumefaciens stam LBA 4404 med hjälp av "frys-upptiningsmetoden" (An et al, 1988). Överföringen till potatisvävnad utförs enligt ett modifierat protokoll från Rocha-Sosa et al (1989).

Bladdiskar från potatisplantor odlade in vitro inku- beras i mörker pà flytande MS-medium (Murashige & Skoog, 1962) med 3% sackaros och 0,5% MES tillsammans med 100 pl av en suspension av rekombinant Agrobacterium per 10 ml medium i två dygn. Efter dessa två dygn dödas bakterierna.

Bladdiskarna överförs pà fast medium för kallusinduktion och inkuberas i 4-6 veckor beroende på kallustillväxt. Det fasta mediet har följande sammansättning: MS + 3% sackaros 2 mg/l zeatinribosid 0,02 mg/l "NAA" 0,02 mg/l "GA3“ 500 mg/l "Claforan" 50 mg/l kanamycin 0,25% “Gellan" Härefter överförs bladdiskarna till ett medium med annan hormonsammansättning, vilket medium omfattar: 10 15 20 25 30 35 467 160 MS + 3% sackaros 5 mg/l "NAA" 0,1 mg/1 "BAP" 500 mg/l “Claforan" 50 mg/1 kanamycin 0,25% "Gellan" Bladdiskarna förvaras på detta medium i ca 4 veckor, varefter de överförs till ett medium där "Claforan"-kon- centrationen reducerats till 250 mg/1. Om det behövs flyt- tas bladdiskarna därefter till färskt medium var 4:e till 5:e vecka. Efter skottbildning skärs skotten bort frán bladdiskarna och överförs till ett identiskt medium.

Att antisens-konstruktionen har överförts till blad- diskarna kontrolleras först genom analys av närvaron av GUS-genen. Bladextrakt från de regenererade skotten ana- lyseras med avseende pá glukuronidasaktivitet med de substrat som beskrivits av Jefferson et al (1987). Aktivi- teten påvisas genom visuell bedömning.

Ytterligare kontroller av antisens-konstruktionernas expression samt överföring därav till potatisgenomet ut- förs med southern och northern hybridisering enligt Mania- tis et al (1982). Antalet kopior av antisens-konstruktio- nerna som överförts bestäms med southern hybridisering.

När det konstaterats att antisens-konstruktionerna överförts till och uttryckts i potatisgenomet vidtar kont- rollen av expressionen pá proteinnivà. För att inte behöva vänta på utvecklingen av en fullständig potatisplanta med potatisknölar utförs kontrollen på mikroknölar som induce- rats in vitro pà de transformerade skotten.

Stambitar av potatisskotten klipps av vid noderna och placeras pà modifierat MS-medium. Där bildar de mikroknö- lar efter 2-3 veckor vid inkubering i mörker vid 19°C (Bourque et al, 1987). Mediet har följande sammansättning: MS + 6% sackaros 2,5 mg/l kinetin 2,5 mg/l "Gellan" “4e7 1eo 10 15 20 25 30 35 10 Antisens-konstruktionernas inverkan på BE-genens funktion med avseende på BE-proteinets aktivitet analy- seras med hjälp av elektrofores pá polyakrylamidgel (Hovenkamp-Hermelink et al, 1987). Stärkelse utvinns ur mikroknölarna och analyseras med avseende på närvaron av fm BE-proteinet.

Stärkelsesammansättningen, dvs förhållandet mellan amylos och amylopektin, bestäms med en spektrofotometrisk metod enligt Hovenkamp-Hermelink et al (1988), varvid hal- ten av respektive stärkelsekomponent bestäms utifrån en standardkurva.

Exempel 2 Utvinning av amylos ur amylospotatis Potatis, vars huvudsakliga stärkelsekomponent utgörs av amylos, här kallad amylospotatis, gentekniskt förändrad enligt uppfinningen, rivs så att stärkelsen friläggs från cellväggarna.

Cellväggarna (fibrerna) avskiljs från fruktsaft och stärkelse i centrisiler. Fruktsaften avskiljs från stär- kelsen i två steg, nämligen först i hydrocykloner och där- efter i speciellt konstruerade vakuumbandfilter.

Därefter utförs en slutraffinering i hydrocykloner, där resten av fruktsaften och fibrerna avskiljs.

Produkten torkas i två steg, först genom en förtork- ning pà vakuumfilter och därefter en sluttorkning i varm- luftström.

Exempel 3 Kemisk derivatisering av amylos Amylos uppslammas i vatten till en koncentration av 20-50%. pH-värdet justeras till 10,0-12,0 och en kvartär ammoniumförening tillsätts i en sådan mängd att slutpro- T av 0,004-0,2. Reaktions- temperaturen inställs till 20-45°C. Då reaktionen är klar É justeras pH-värdet till 4-8, varefter produkten tvättas och torkas. På detta sätt erhålles det katjoniska stärkel- sederivatet 2-hydroxi-3-trimetylammoniumpropyleter. dukten får en substitutionsgrad 10 15 20 25 30 35 467 160 ll Exempel 4 Kemisk derivatisering av amylos Amylos uppslammas i vatten till en vattenhalt av 10-25 vikt%. pH-värdet justeras till 10,0-12,0 och en kvartär ammoniumförening tillsätts i en sådan mängd att slutprodukten får en substitutionsgrad av 0,004-0,2. Reak- tionstemperaturen inställs pá 20-45°C. Då reaktionen är klar justeras pH-värdet till 4-8. Slutprodukten är 2-hyd- roxi-3-trimetylammoniumpropyleter.

Exempel 5 Kemisk derivatisering av amylos Amylos uppslammas i vatten till en koncentration av. 20-50 vikt%. pH-värdet justeras till 5,0-12,0 och natrium- hypoklorit tillsätts så att slutprodukten får önskad vis- kositet. Reaktionstemperaturen inställs pà 20-45°C. Dá reaktionen är klar justeras pH-värdet till 4-8, varefter slutprodukten tvättas och torkas. På detta sätt erhålles oxiderad stärkelse.

Exempel 6 Fysikalisk derivatisering av amylos Amylos uppslammas i vatten till en koncentration av 20-50 vikt%, varefter uppslamningen anbringas pá en upp- värmd vals, där den torkas till en film.

Exempel 7 Kemisk och fysikalisk derivatisering av amylos Amylos beandlas enligt de förfaranden som beskrivs i något av exemplen 3-5 för kemisk modifiering och behandlas därefter vidare enligt exempel 6 för fysikalisk derivati- sering. '4e7 160 10 15 20 25 30 35 12 Litteraturreferenser: Blennow, A. & Johansson;, G., 1990. Phytochemistry (in press) fi: De Vries Kuranda, K., 1987. Immunological characteriza- tion of normal and amylose-extender alleles of Zea mays L.: Effects on the starch branching enzymes.

Doktorsavhandling. The Pennsylvania State University.

Mac Donald, F. D. & Preiss, J., 1985. Plant Physiol 78:849-852.

Preiss, J., 1988. In Biochemistry of Plants: 14 (Carbohydrates) Ed. J. Preiss, Academic Press; 181-254.

Smith, A., 1988. Planta 175:270-279.

Vos-Scheperkeuter, G. H., de Wit, J. G., Ponstein, A.

S., Feenstra, W. J. & Witholt, B., 1989. Plant Physiol 90:75-84. ' Cornelissen, M., 1989. Nucleic Acids Res l7(18):7203-7209.

Izant, J. G., 1989. Cell Motility and Cytosceleton 14:81-91.

Sheehy, R. E., Kramer, M., Hiatt, W. R., 1988. Proc.

Natl. Acad. Sci., USA, 85(23):8805-8809.

Van der Krol, A. R., Mur, L. A., de Lange,, P., Gerats, A. G. M., Mol, J. N. M. & Stuitje, A. R., 1990. Mol.

Gen. 220:204-212.

An, G., Ebert, P. R., Mitra, A. & Ha, S. B., 1988. Plant Mol Biol. Manual A3:l-19.

Murashige, T. & Skoog, F., 1962. Physiol. Plant 15:473-497.

Rocha-Sosa, M., Sonnewald, U., Frommer, W., Stratmann, M., Shell, J. & Willmitzer, L., 1989. EMBO J.

Genet. 8(l):23-29. Û Jefferson, R. A., Kavanagh, R. A. & Bevan, M. W., 1987.

Emso J. s=s9ø1-ssøv. ° Maniatis, T., Fritsch, E. F. & Sambrock, J., 1982.

Molecular Cloning. A Laboratory Handbook. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.

Bourque, J. E., Miller, J. C. & Park, W. D., 1987. In 5 10 15 20 25 30 35 467 160 13 Vitro Cellular & Development Biology_23(5):38l-386.

- Hovenkamp-Hermelink, J. H. M., de Vries, J. N., Adamse, P., Jacobsen, E., Witholt, B. & Feenstra, W. J., 1988.

Potato Research 31:241-246.

- Modified starches: Properties and use, D. B. Wurzburg.

- Bevan, M. W., 1984. Nucleic Acids Res. l2:87ll-8721.

A 67 160 SEQ 14 ID nr 1 Sekvenserad molekyl: genomiskt DNA Namn: Promotor till GBSS-genen fràn potatis Sekvenslängd: 629 bp AACCATCCTT ACTCAATCTT GTAATGTATT TCGTAAAAAA GGGGGAAGTA AGATATTATT GGAATGTCAA TAGGAGACAG GTGAATCAAC TAATACAGTG CTCTTGACAC CATTCTCACT TCTCCTCCAA CCTTTTAGCA AATACTAAAA CAACCTTTAG TTAGAAAATA ACTAATATTC TTTAATTACT GTGGTAGCGT AACCGGACGG AAAGAGAGGG TCCACAGTTG GTGTCACTGA CACTCACTCA TTATTTCTGA GTGTATCAAT TGCAACTTAA AATTGTGCAT TATTTACAGT TAGTGGAGGG ATAATAATAA AGGAGGGAGT CCCATTGCAA CCCATAATAC CCTTCTGCTA AACCTGCTAC CACAGCTCAA TTTCATGCA TTTGTAATAG TATAGGCTAA TCATAATTAG AATTTGGAAT AGGGACCAGT TTTAATTAAC TGGTTTAGTT GGCCAAGTTG TGTCGATGAG AGGGATAGCC AAATAAGGCA CAAGTGGTAA AACCATGCAT ACCAAGTAAA ATCTTGTTTG ACAAAGCTAA ACCAGTACCT ACGAGACATA TT T TAGATAC AAGTCCAGCC CATTTCCCTA ACCCGCTATT GGCACCTCCT CTTTTACTCA 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 629 'ru Ix

Claims

10 15 20 25 30 35 467 160 15 PATENTKRAV

1. Antisens-konstruktion för inhibering i varierande grad av uttrycket av genen som kodar för bildning av "branching enzyme" (BE-genen) i potatis, vilken antisens- -konstruktion omfattar en knölspecifik promotor, tran- skriptionsstart samt första exon av BE-genen, insatt i antisens-riktning.

2. Antisens-konstruktion enligt krav 1, vilken dess- utom omfattar en selekteringsmarkör.

3. Antisens-konstruktion enligt krav 1 eller 2, vari promotorn är en promotor till den gen i potatis som kodar för stärkelsekornbundet stärkelsesyntas (GBSS) och som har väsentligen den nukleotidsekvens som anges i SEQ ID nr 1.

4. Antisens-konstruktion enligt krav 1 eller 2, vari promotorn är vald bland CaMV 358-promotorn och patatinl- -promotorn.

5. Gen som kodar för bildning av "branching enzyme" i potatis.

6. Vektor omfattande en antisens-konstruktion enligt ett eller flera av kraven 1-4.

7. Cell av potatisplanta, vars genom omfattar en antisens-konstruktion enligt ett eller flera av kraven 1-4.

8. Potatisplanta, vars genom omfattar en antisens- -konstruktion enligt ett eller flera av kraven 1-4.

9. Potatisknölar, vilkas genom omfattar en antisens- -konstruktion enligt ett eller flera av kraven 1-4.

10. Frön från potatisplanta, vilkas genom omfattar en antisens-konstruktion enligt ett eller flera av kraven 1-4.

11. Mikroknölar av potatis, vilkas genom omfattar en antisens-konstruktion enligt ett eller flera av kraven l-4. .467 160 10 15 20 25 30 35 16

12. Nativ stärkelse av amylostyp, k ä n n e - t e c k n a d av att den erhållits från potatis som för- ändrats gentekniskt för undertryckande av bildning av stärkelse av amylopektintyp. k ä n - n e t e c k n a d av att den utgöres av stärkelse av amy-

13. Derivatiserad stärkelse av amylostyp, lostyp, vilken utvunnits ur potatis som förändrats gentek- niskt för undertryckande av bildning av stärkelse av amy- lopektintyp, vilken stärkelse av amylostyp därefter har derivatiserats på kemisk, fysikalisk och/eller enzymatisk väg.

14. Förfarande för undertryckande av bildning av stärkelse av amylopektintyp i potatis, k ä n n e - t e c k n a t av att potatisen förändras gentekniskt genom att man i potatisvävnadens genom inför en antisens- -konstruktion omfattande en knölspecifik promotor, tran- skriptionsstart samt första exon av genen som kodar för bildning av "branching enzyme" (BE-genen) i potatis, vil- ken exon är insatt i antisens-riktning. ö)