DE4330960C2 - Kombination von DNA-Sequenzen, die in Pflanzenzellen und Pflanzen die Bildung hochgradig amylosehaltiger Stärke ermöglichen, Verfahren zur Herstellung dieser Pflanzen und die daraus erhaltbare modifizierte Stärke - Google Patents
Kombination von DNA-Sequenzen, die in Pflanzenzellen und Pflanzen die Bildung hochgradig amylosehaltiger Stärke ermöglichen, Verfahren zur Herstellung dieser Pflanzen und die daraus erhaltbare modifizierte StärkeInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Kombination von DNA-Sequenzen, die in
transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen den Amylosegehalt der Stärke
dahingehend verändert, daß eine hochgradig amylosehaltige Stärke gebildet wird.
Die Erfindung betrifft desweiteren ein Verfahren zur Herstellung von genetisch
veränderten Pflanzen, die bezüglich des Amylosegehalts der natürlich enthaltenen
Stärke infolge Expression künstlich eingeführter DNA-Sequenzen verändert sind, die
über dieses Verfahren erhältlichen Pflanzen und die aus diesen Pflanzen erhaltbare
hochgradig amylosehaltige Stärke.
Polysaccharide wie Stärke sind neben Ölen, Fetten und Proteinen die wesentlichen
nachwachsenden Rohstoffe aus Pflanzen.
Ein entscheidender Faktor, der der Verwendung von nachwachsenden Rohstoffen
als industrielle Rohstoffe im Wege steht, ist der Mangel an Stoffen, die in Form,
Struktur oder sonstigen physikalisch-chemischen Parametern den Erfordernissen
der chemischen Industrie genau entsprechen. Insbesondere wird von einem für die
technische Verwendung geeigneten Rohstoff verlangt, daß er in hoher Reinheit
vorliegt und chemisch einheitlich aufgebaut ist. Letzteres ist wichtig, um eine
homogene Reaktionsführung bei der Verarbeitung zu gewährleisten.
Obwohl die Stärke ein Polymer aus chemisch einheitlichen Grundbausteinen, den
Glukosemolekülen, ist, ist sie ein komplexes Gemisch aus sehr unterschiedlichen
Molekülformen, die sich hinsichtlich ihres Polymerisationsgrades und des Auftretens
von Verzweigungen der Glukoseketten unterscheiden. Stärke stellt daher keinen
einheitlichen Rohstoff dar. Insbesondere unterscheidet man die Amylose-Stärke, ein
im wesentlichen unverzweigtes Polymer aus α-1,4-verknüpften Glukosemolekülen,
von der Amylopektin-Stärke, die ihrerseits ein komplexes Gemisch aus
unterschiedlich verzweigten Glukoseketten darstellt. Die Verzweigungen kommen
durch das Auftreten von zusätzlichen α-1,6-Verknüpfungen zustande.
In typischen Pflanzen für die Stärkeproduktion, wie zum Beispiel Mais oder Kartoffel,
kommen die beiden Stärkeformen in einem Verhältnis von etwa 25 Teilen Amylose
zu 75 Teilen Amylopektin vor.
Im Hinblick auf die Einheitlichkeit eines Grundstoffes wie Stärke für seine
Anwendung im industriellen Bereich werden Pflanzen benötigt, die beispielsweise
nur noch die Komponente Amylose enthalten. Es besteht daher ein großes Interesse
an der Möglichkeit, natürlich in der Pflanze enthaltene Stärke dahingehend zu
verändern, daß eine hochgradig amylosehaltige Stärke gebildet wird.
Es ist bereits bekannt, daß für bestimmte Pflanzenspezies, beispielsweise den Mais,
durch Mutagenese, bei der einzelne Gene der Pflanze inaktiviert werden, Sorten
erzeugt werden können, die nur noch Amylopektin enthalten. Für Kartoffel wurde
durch chemische Mutagenese bei einer haploiden Linie ebenfalls ein Genotyp
erzeugt, der keine Amylose bildet (Hovenkamp-Hermelink et al., 1987, "Theor. Appl.
Genet." 75: 217-221). Haploide Linien, bzw. die daraus entwickelten homozygoten,
diploiden oder tetraploiden, sind landwirtschaftlich aber nicht einsetzbar. Für die
landwirtschaftlich interessanten heterozygot-tetraploiden Linien ist die Mutagenese-
Technik nicht anwendbar, da wegen des Vorliegens von vier verschiedenen
Erbgutkopien eine Inaktivierung aller Kopien eines Gens technisch nicht möglich ist.
Von Visser et al. (1991, "Mol. Gen. Genet.", 225: 289) ist bekannt, daß durch antisense-
Inhibition des Gens für die Stärkekorn-gebundene-Stärkesynthase in Kartoffel Sorten
erzeugt werden können, die weitgehend reine Amylopektinstärke bilden.
Ferner sind Mais- und Erbsensorten bekannt, die Amylosestärke produzieren
können. Die Amylosekonzentration in diesen Pflanzen beträgt jedoch nur 60-80%.
Das Mutageneseverfahren, das der Produktion dieser Sorten zugrundeliegt, ist auf
andere Pflanzen, wie z. B. Kartoffel, nicht anwendbar.
Aus der WO 92/14827 ist ein Verzweigungsenzym der Kartoffel bekannt. Dieses
Enzym wird als Q-Enzym von Solanum tuberosum bezeichnet. Weiterhin ist bekannt,
daß mit Hilfe von DNA-Sequenzen, die die Information für das in der WO 92/14827
beschriebene Verzweigungsenzym der Kartoffel enthalten, transgene Pflanzen
hergestellt werden können, bei denen das Amylose/Amylopektin-Verhältnis der
Stärke verändert ist. Eine hochgradig amylosehaltige Stärke wird von den in der
WO 92/14827 beschriebenen Pflanzen jedoch nicht gebildet.
Während für andere Spezies, z. B. Mais, das Vorkommen mehrerer Q-Enzyme
bekannt ist (Singh & Preiss, 1985, "Plant Physiol." 79: 34-40), konnte bei Solanum
tuberosum nur das in der WO 92/14827 beschriebene Verzweigungsenzym
nachgewiesen werden. Welche weiteren Enzyme der Kartoffel an der Synthese von
verzweigter Stärke beteiligt sind, ist nicht bekannt.
Die Synthese von Stärke erfolgt durch die Wirkung der Stärkesyntase, die im
wesentlichen ADP-Glukose als Substrat für eine Übertragung eines Glukoserestes
auf das nicht-reduzierende Ende eines Polyglucans nutzt.
An der Modifikation und dem Abbau der Stärke sind mehrere Enzyme beteiligt.
Die Stärkephosphorylasen, die anorganisches Phosphat als Kosubstrat nutzen,
bauen α-1,4-Bindungen bis vier Einheiten vor einer α-1,6-Verzweigung ab und
arbeiten vom nicht-reduzierenden Ende her. Die β-Amylase hat als Exoamylase eine
hohe Spezifität für α-1,4-Bindungen. Das am geringsten polymerisierte Substrat ist
Maltotetraose. Verzweigungsstellen bewirken ein Ende des Kettenabbaus, wobei die
letzte α-1,4-Bindung vor der Verzweigungstelle bestehen bleibt (Whelan, 1961,
"Nature", 190: 954-957). Die verbleibenden Polyglukane können von
Transglykosylasen bearbeitet werden, die gleichzeitig hydrolytische und
synthetisierende Enzymaktivität besitzen.
An der Modifikation der Stärke arbeiten als Transglykosylasen das Q-Enzym, das T-
Enzym und das D-Enzym. Das Minimalsubstrat für die vom T-Enzym katalysierte
Reaktion ist α-1,4-Maltose, die zum Trisaccharid Panose und Glukose umgesetzt
wird, wobei eine α-1,6-Bindung entsteht (Whelan, 1961; Abdullah & Whelan, 1960, "J.
Biochem", 75: 12P). Das Q-Enzym katalysiert die gleiche Transglykosylierung
ausschließlich an Glukanen einer Kettenlänge von mindestens 40 Einheiten. Das D-
Enzym wurde 1953 erstmals beschrieben (in: "Nature", 172: 158). Peat et al. (1956, "J.
Chem Soc.", Part XX: 44-55) beschreiben es als eine Transglykosylase, die
Maltodextrin-Substrate mit zwei oder mehr Einheiten überträgt und dabei
ausschließlich α-1,4-Bindungen erzeugt. Das Substrat muß aus mindestens drei
Einheiten aufgebaut sein; bezüglich des Akzeptors besteht eine geringe Spezifität.
Takaha et al. (1993, "J. Biol. Chem." 268: 1391-1396) beschreiben die Reinigung des D-
Enzyms von Kartoffel (EC 2.4.1.25) sowie die Klonierung einer cDNA. Das gereinigte
Enzym akzeptiert Glukose als Empfänger der zu übertragenden Kette, jedoch muß
der Donor aus mindestens drei Glukoseeinheiten aufgebaut sein. Die Autoren
beschreiben nicht, welche Art von Bindung bei der Transglykosylierung entsteht und
gehen davon aus, daß das D-Enzym oder "Disproportionierende Enzym" am
Stärkeabbau beteiligt ist.
Es ist bisher nicht bekannt, wie eine Pflanze gezielt dahingehend verändert werden
kann, daß in ihr eine hochgradig amylosehaltige Stärke produziert werden kann.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Kombination von DNA-Sequenzen
bereitzustellen, mit deren Hilfe Pflanzen dahingehend verändert werden können,
daß sie eine hochgradig amylosehaltige Stärke produzieren. Es ist ferner Aufgabe
der Erfindung, transgene Pflanzen mit hochgradig amylosehaltiger Stärke sowie ein
Verfahren zur Herstellung dieser Pflanzen bereitzustellen.
Es wurde nun überraschend gefunden, daß durch eine Kombination bekannter DNA-
Sequenzen eines Verzweigungsenzyms (WO 92/14827) mit DNA-Sequenzen eines
Disproportionierungsenzyms und Einführung dieser Kombination in ein pflanzliches
Genom unter Verwendung rekombinanter Plasmide, Pflanzen erzeugt werden
können, die befähigt sind, eine hochgradig amylosehaltige Stärke zu produzieren.
Eine Kombination von DNA-Sequenzen, die ein Verzweigungsenzym kodieren mit
solchen, die ein Disproportionierungsenzym kodieren, zur genetischen Veränderung
von Pflanzenzellen und Pflanzen mit dem Ziel, eine hochgradig amylosehaltige
Stärke in den genetisch veränderten Pflanzen zu bilden, wurde bisher nicht
beschrieben. Der Effekt, den die Einführung der neuen Kombination von DNA-
Sequenzen in ein pflanzliches Genom auf den Amylosegehalt der Stärke ausübt, ist
überraschend, da es bislang keinen Anhaltspunkt für eine Beteiligung des D-Enzyms
an der Produktion verzweigter Stärke gibt. Nach den Befunden von Peat et al. (1956)
besitzt das D-Enzym nämlich nicht die Fähigkeit zum Aufbau von α-1,6-Bindungen.
Bei der Untersuchung der enzymatischen Aktivität des D-Enzyms wurde eine
Proteinpräparation aus Kartoffelknollen verwendet, die neben dem
Disproportionierungsenzym auch das Q-Enzym enthält. Eine Trennung der beiden
enzymatischen Aktivität war nicht möglich. Die Unterscheidung der beiden
Aktivitäten beruhte auf der Bestimmung unterschiedlicher Temperaturoptima für die
katalysierten Reaktionen, wobei die Zunahme der Absorption eines Glukan/Jod-
Komplexes bei Inkubation von Maltopentaose als spezifisch für die Aktivität des
Disproportionierungsenzyms angesehen wurde. Die Aktivität des Q-Enzyms wurde
demgegenüber am Rückgang der spezifischen Färbung des Jod/Amylose-
Komplexes nachgewiesen.
Ein Nachweis der Beteiligung des D-Enzyms an der Amylopektinproduktion ist in
Kartoffelpflanzen, die eine Q-Enzymaktivität aufweisen, nicht möglich, da eine
eindeutige Zuordnung der α-1,6-Bindungen synthetisierenden Aktivität zu einem der
beiden Enzyme nicht möglich ist.
Mit der erfindungsgemäßen Kombination von DNA-Sequenzen, die aus:
- a) der Kodierregion eines Verzweigungsenzyms und
- b) der Kodierregion eines Disproportionierungsenzyms
besteht, die jeweils derart in antisense-Orientierung an geeignete Promotoren
fusioniert sind, daß deren Transkription in transgenen Pflanzen zu Transkripten
führt, kann der Amylosegehalt natürlich in Pflanzen enthaltener Stärke dahingehend
verändert werden, daß eine hochgradig amylosehaltige Stärke gebildet wird.
Die Kombination der DNA-Sequenzen besteht vorzugsweise aus den Kodierregionen
des Verzweigungs- und Disproportionierungsenzyms von Solanum tuberosum,
wobei die Kodierregion des Verzweigungsenzyms die auf dem rekombinanten
Plasmid p35S-anti-BE (DSM 6144) lokalisierte Sequenz und die Kodierregion des
Disproportionierungsenzyms die auf dem rekombinanten Plasmid p35SH-anti-D
(DSM 8479) lokalisierte Sequenz ist.
Die rekombinanten DNA-Sequenzen führen bei gleichzeitiger oder
aufeinanderfolgender Einführung in ein pflanzliches Genom in transgenen Pflanzen
zur Bildung von Transkripten, die die Bildung von Enzymen des Stärkemetabolismus
dahingehend verändern, daß bei der Stärkebiosynthese die Bildung von Amylopektin
unterdrückt ist und dadurch die Bildung einer hochgradig amylosehaltigen Stärke
ermöglicht wird.
Es ist auch möglich, die Kodierregionen des Verzweigungs- und des
Disproportionierungsenzyms mit Hilfe eines Plasmids in das pflanzliche Genom
einzuführen.
Transgene Pflanzen, die hochgradig amylosehaltige Stärke bilden, können über:
- A) ein einstufiges Verfahren hergestellt werden, das die folgenden Schritte
beinhaltet:
- a) Herstellung einer Kombination von DNA-Sequenzen aus folgenden
Teilsequenzen:
- a) je einem Promotor, der in Pflanzen aktiv ist und die Bildung einer RNA im vorgesehenen Zielgewebe oder den Zielzellen sicherstellt,
- b) je einer Kodierregion eines Verzweigungsenzyms und eines Disproportionierungsenzyms, derart an den unter i) genannten Promotor fusioniert, daß ein Transkript vom nicht-kodierenden Strang gebildet wird (antisense-Fusion) und
- c) je einer 3'-nichttranslatierten Sequenz, die in Pflanzenzellen zur Beendigung der Transkription sowie zur Addition von poly-A- Resten an das 3'-Ende der RNA führt, derart an die unter ii) genannte Sequenz fusioniert, daß die 3'-nicht-translatierte Sequenz an das 3'-Ende des unter ii) genannten, nicht- kodierenden Stranges anschließt,
- b) Transfer und Einbau der Kombinationen von DNA-Sequenzen in ein pflanzliches Genom unter Verwendung rekombinanter Plasmide zur Erzeugung transgener Pflanzenzellen und
- c) Regeneration von intakten, ganzen Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen
- a) Herstellung einer Kombination von DNA-Sequenzen aus folgenden
Teilsequenzen:
oder
- A) ein zweistufiges Verfahren hergestellt werden, bei dem zunächst eine DNA-
Sequenz, bestehend aus den Teilstücken:
- a) einem Promotor, der in Pflanzen aktiv ist und die Bildung einer RNA im vorgesehenen Zielgewebe oder den Zielzellen sicherstellt,
- b) einer Kodierregion eines Verzweigungs- oder Disproportionierungs enzyms, das derart an den unter iv) genannten Promotor fusioniert ist, daß ein Transkript vom nicht-kodierenden Strang gebildet wird (antisense-Fusion), und
- c) einer 3'-nichttranslatierten Sequenz, die in Pflanzenzellen zur Beendigung der Transkription sowie zur Addition von poly-A-Resten an das 3'-Ende der RNA führt, derart an die unter v) genannte Sequenz fusioniert, daß die 3'-nicht-translatierte Sequenz an das 3'-Ende des unter v) genannten, nicht-kodierenden Stranges anschließt,
- a) einem Promotor, der in Pflanzen aktiv ist und die Bildung einer RNA im vorgesehenen Zielgewebe oder den Zielzellen sicherstellt,
- b) einer Kodierregion eines Disproportionierungs- oder Verzweigungs enzyms, derart an den unter vii) genannten Promotor fusioniert, daß ein Transkript vom nicht-kodierenden Strang gebildet wird (antisense- Fusion) und
- c) einer 3'-nichttranslatierten Sequenz, die in Pflanzenzellen zur Beendigung der Transkription sowie zur Addition von poly-A-Resten an das 3'-Ende der RNA führt, derart an die unter viii) genannte Sequenz fusioniert, daß die 3'-nicht-translatierte Sequenz an das 3'-Ende des unter viii) genannten, nicht-kodierenden Stranges anschließt,
Die in der Kombination zur Anwendung kommenden und unter den
Verfahrensschritten i), iv) und vii) genannten Promotoren sind vorzugsweise der 35S-
Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus mit den Nukleotiden 6909 bis 7437 oder der
B33-Promotor eines Patatingens von Solanum tuberosum mit den Nukleotiden -1512
bis +14. Es ist aber auch die Verwendung anderer Promotoren denkbar.
Die im Verfahren als Kombination zur Anwendung kommenden, rekombinanten
Plasmide sind vorzugsweise das Plasmid p35S-anti-BE (DSM 6144) und das
Plasmid p35SH-anti-D (DSM 8479) oder Derivate davon.
Die durch das Verfahren erhältlichen, transgenen Pflanzen, die befähigt sind,
hochgradig amylosehaltige Stärke zu bilden, sind ebenfalls Gegenstand der
Erfindung.
Als Pflanzen, auf die das Verfahren zur Anwendung kommt, sind Nutzpflanzen, bei
denen an der Synthese von Amylopektin ein Verzweigungs- und ein
Disproportionierungsenzym beteiligt sind. Vorzugsweise ist dies die Nutzpflanze
Kartoffel.
Die Teilsequenzen aus der neuen Kombination von DNA-Sequenzen, die das
Verzweigungsenzym und das Disproportionierungsenzym von Solanum tuberosum
kodieren, können durch Klonierung in Vektorplasmide in Bakterien vermehrt werden.
Beispiele für Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, m13-mp-Serien usw. Die DNA-
Sequenzen können mit Linkern versehen werden, die ein einfaches Umklonieren in
andere Plasmide erlauben. Zum Zwecke der Einführung in Pflanzen (s. Ausfüh
rungsbeispiel 3) können bevorzugt, aber nicht ausschließlich, binäre Plasmide
verwendet werden, die ein Replikationssignal, beispielsweise für Escherichia coli und
für Agrobacterium tumefaciens, enthalten. Wenn die binären Plasmide T-DNA-
Elemente enthalten, ist eine Übertragung der Kombination von DNA-Sequenzen in
das Genom von dikotylen Pflanzen besonders einfach. Es stehen jedoch auch
andere Methoden zur Verfügung, beispielsweise die Transformation mit Hilfe
ballistischer Verfahren, die zur Transformation von Monokotylen eingesetzt wird
(Potrykus, 1991, "Ann. Rev. Plant. Mol. Biol. Plant. Physiol.", 42: 205-225).
Um eine Expression der übertragenen Kombination von DNA-Sequenzen in
genetisch veränderten Pflanzen sicherzustellen, werden die Kodierregionen des
Verzweigungsenzyms und des Disproportionierungsenzyms jeweils an einen
Promotor fusioniert. Grundsätzlich kommen alle Promotoren in Betracht, die in
Pflanzen aktiv sind. Präferenziell werden Promotoren eingesetzt, die in den
stärkespeichernden Organen der zu transformierenden Pflanzen aktiv sind. Bei Mais
sind dies die Maiskörner, während es bei Kartoffel die Knollen sind. Zur
Transformation von Kartoffel kann insbesondere, aber nicht ausschließlich, der
knollenspezifische 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus oder der B33-
Promotor eines Patatingens von Solanum tuberosum eingesetzt werden (s. o.). Die
Kodierregionen von Verzweigungsenzym und Disproportionierungsenzym werden
derart an den Promotor fusioniert, daß das 3'-Ende der Kodierregion an das 3'-Ende
des Promotors angefügt wird. Diese Anordnung bezeichnet man als antisense-
Orientierung. Die antisense-Orientierung bewirkt, daß bei der Expression des
Transgens der nicht-kodogene Strang zur Synthese eines Transkripts abgelesen
wird. Das nicht-kodierende Transkript kann in einer genetisch veränderten Pflanze
das endogene, kodierende Transkript neutralisieren, so daß es nicht zur Translation
in ein Peptid kommt. Dadurch entfällt die enzymatische Aktivität des Verzweigungs-
und des Disproportionierungsenzyms in den genetisch veränderten Pflanzen. Der
Erfolgt der Translationsinhibition hängt u. a. von der Menge der in der Zelle
wirksamen antisense-Transkripte ab. Zur Stabilisierung der Transkripte, die von der
eingeführten Kombination von DNA-Sequenzen gebildet werden, wird daher an die
Kodierregionen von Verzweigungsenzym und Disproportionierungsenzym ein
Terminations- und Polyadenylierungssignal angehängt. Dies kann beispielsweise
das Terminationssignal des Nopalinsynthase-Gens aus Agrobacterium tumefaciens
sein.
Durch Fusion von Promotor, Kodierregion des Verzweigungs- bzw. des
Disproportionierungsenzyms und Terminationssignals entstehen Konstrukte, die zur
Transformation von Pflanzen in geignete Plasmide integriert werden. Diese
rekombinanten Plasmide können die Kombination der Fusion enthalten oder jeweils
ein Element der Kombination. Wenn die rekombinanten Plasmide beide Elemente
der Kombination enthalten, können transgene Pflanzen, die die erfindungsgemäße
Kombination von DNA-Sequenzen enthalten, in einem einstufigen Verfahren
hergestellt werden. Wenn die rekombinanten Plasmide jeweils ein Element der
Kombination enthalten, können sie nacheinander zur Transformation eingesetzt
werden, so daß transgene Pflanzen, die die erfindungsgemäße Kombination von
DNA-Sequenzen enthalten, in einem zweistufigen Verfahren hergestellt werden
können.
Für die Transformation werden die DNA-Sequenzen zunächst in Pflanzenzellen
integriert, aus denen anschließend ganze Pflanzen regeneriert werden.
Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäße DNA-Sequenz-Kombination enthalten,
sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Infolge der Übertragung der neuen Kombination von DNA-Sequenzen, die je einen
Promotor, je eine Kodierregion des Verzweigungs- und des Disproportionierungs
enzyms in antisense-Orientierung zum Promotor und je ein Terminations-
/Polyadenylierungssignal enthalten, kommt es in den transgenen Pflanzen zur
Bildung zweier RNA, die durch Wechselwirkung mit den endogenen mRNA des
Verzweigungsenzyms und des Disproportionierenden Enzyms deren Synthese
unterdrücken. Dadurch wird eine hochgradig amylosehaltige Stärke zugänglich.
Amylose zeichnet sich durch eine stark geordnete Raumstruktur aus, was
insbesondere günstige Auswirkungen auf die Filmbildungseigenschaften hat.
Besonders geeignet für die Produktion von Amylose unter Ausnutzung der
erfindungsgemäßen Kombination von DNA-Sequenzen des Verzweigungs- und des
Disproportionierenden Enzyms ist Kartoffel. Die Anwendung der Erfindung ist aber
nicht auf Kartoffel beschränkt, sondern kann auch an anderen, stärkespeichernden
Nutzpflanzen erfolgen (s. o.).
Die in den transgenen Pflanzen gebildete, hochgradig amylosehaltige Stärke kann
mit gängigen Methoden aus den Pflanzen oder aus den Pflanzenzellen isoliert und
nach der Reinigung zur Herstellung von Nahrungsmitteln und industriellen Produkten
verarbeitet werden.
Am 20.08.1990 wurde das Plasmid p35-anti-BE (DSM 6144), am 26.08.1993 wurde
das Plasmid p35SH-anti-D (DSM 8479) bei der Deutschen Sammlung von
Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, hinterlegt.
Fig. 1 zeigt das 13,6 kb große Plasmid p35S-anti-BE (DSM 6144). Das Plasmid
enthält folgende Fragmente:
A = Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S-Promotor des Blumenkohl-
Mosaik-Virus (CaMV), Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV.
B = Fragment B (2909 bp) beinhaltet ein DNA-Fragment mit der Kodierregion des Verzweigungsenzyms von Solanum tuberosum.
C = Fragment (192 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5, Nukleotide 11749-11939.
B = Fragment B (2909 bp) beinhaltet ein DNA-Fragment mit der Kodierregion des Verzweigungsenzyms von Solanum tuberosum.
C = Fragment (192 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5, Nukleotide 11749-11939.
Fig. 2 zeigt das 12,165 kb große Plasmid p35SH-anti-D (DSM 8479). Das Plasmid
enthält folgende Fragmente:
A = Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S-Promotor des Blumenkohl-
Mosaik-Virus (CaMV), Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV.
B = Fragment B (1474 bp) beinhaltet ein DNA-Fragment mit der Kodierregion des Disproportionierenden Enzyms von Solanum tuberosum.
C = Fragment (192 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5, Nukleotide 11749-11939.
B = Fragment B (1474 bp) beinhaltet ein DNA-Fragment mit der Kodierregion des Disproportionierenden Enzyms von Solanum tuberosum.
C = Fragment (192 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5, Nukleotide 11749-11939.
Zum besseren Verständnis der dieser Erfindung zugrundeliegenden Ausführungs
beispiele werden vorab die wichtigsten, eingesetzten Verfahren erläutert.
Zur Klonierung wurden die Vektoren pUC18 (Yanisch-Perron et al. (1985), "Gene", 33,
103-119) benutzt.
Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären Vektor
BIN19 (Bevan (1984), "Nucl. Acids. Res.", 12, 8711-8720) kloniert.
Für die pUC-Vektoren wurden die E.-coli-Stämme BMH71-18 (Messing et al. (1977),
"Proc. Natl. Acad. Sci.", USA 24, 6342-6346) oder TB1 benutzt. TB1 ist ein
Rekombinations-negatives, Tetracyclin-resistentes Derivat des Stammes JM101
(Yanisch-Perron et al. (1985), "Gene2, 33, 103-119). Der Genotyp des TB1-Stammes ist
(Bart Barrel, pers. Mitteilung): F (traD36, proAB, lacI, lacZδM15, δ(lac, pro), SupE,
thiS, recA, Sr1::Tn10(Tcr).
Die Pflanzentransformation wurde mit Hilfe des Agrobacterium-tumefaciens-
Stammes LBA4404 (Bevan (1984), "Nucl. Acids. Res.", 12, 8711-8721), BIN19-Derivat)
durchgeführt.
Bei Bin19-Derivaten erfolgt die Einführung der DNA in die Agrobakterien durch
direkte Transformation nach der Methode von Holsters et al. (1978, "Mol Gen Genet",
163, 181-187). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der
Methode von Birnboim et al. (1979, "Nucl Acids Res.", 7, 1513-1523) isoliert und nach
geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch aufgetrennt.
10 kleine, mit einem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel-Sterilkultur wurden in
10 ml MS-Medium mit 2% Saccharose gelegt, welches 30-50 µl einer unter Selektion
gewachsenen Agrobacterium tumefaciens-Übernachtkultur enthielt. Nach 3-5-
minütigem, leichtem Schütteln wurden die Petrischalen bei 25°C im Dunkeln inkubiert.
Nach 2 Tagen wurden die Blätter auf MS-Medium mit 1,6% Glukose, 2 mg/l
Zeatinribose, 0,02 mg/l Naphthylessigsäure, 0,02 mg/l Giberellinsäure, 500 mg/l
Claforan, 50 mg/l Kanamycin und 0,8% Bacto-Agar ausgelegt. Nach einwöchiger
Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurde die Claforankonzentration im Medium um
die Hälfte reduziert. Die weitere Kultivierung erfolgte wie von Rocha-Sosa et al.
(1989, EMBO-Journal 8, 29) beschrieben.
Die Isolierung genomischer Pflanzen-DNA erfolgte nach Rogers et al. (1985, "Plant
Mol Biol.", 5, 69-76). Für die DNA-Analyse wurden 10-20 µg DNA nach geeigneter
Restriktionsspaltung mit Hilfe von "Southern Blots" auf Integration der zu
untersuchenden DNA-Sequenzen analysiert.
Die Isolierung pflanzlicher Gesamt-RNA erfolgte nach Logemann et al. (1987,
"Analytical Biochem.", 163, 16-20). Für die Analyse wurden je 50 µg Gesamt-RNA mit
Hilfe von "Northern Blots" auf die Anwesenheit der gesuchten Transkripte untersucht.
Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele erläutern den Gegenstand der Erfindung
ohne ihn einzuschränken, wobei zunächst die Konstruktion von binären Plasmiden
und anschließend die Herstellung von transgenen Pflanzen, die die DNA-Sequenz-
Kombination enthalten, gezeigt werden.
In analoger Verfahrensweise können auch andere Nutzpflanzen, bei denen ein
Verzweigungs- und ein Disproportionierungsenzym an der Amylopektinproduktion
beteiligt sind, transformiert werden.
Entsprechend der in der WO 92/14827 wiedergegebenen Vorschrift wurde das
Plasmid p35S-anti-BE (DSM 6144) hergestellt. Im einzelnen wurden dabei folgende
Schritte ausgeführt:
Aus einer im Expressionsvektor λgt11 angelegten cDNA Bank von Knollengewebe aus Solanum tuberosum var. Desirée wurden verschiedene Klone identifiziert, die von einem gegen das Verzweigungsenzym gerichteten Antiserum erkannt wurden (zur Durchführung der immunologischen Bestimmung s. Ausführungsbeispiel 3, "Western Blot"). Diese Klone wurden genutzt, um aus einer in der HindIII- Schnittstelle des Plasmids pUC19 angelegten cDNA-Bibliothek aus wachsenden Knollen von Solanum tuberosum Vollängenklone zu isolieren. Ein Klon mit einer Insertion der Größe 2909 bp wurde für die weitere Klonierung verwendet.
Aus einer im Expressionsvektor λgt11 angelegten cDNA Bank von Knollengewebe aus Solanum tuberosum var. Desirée wurden verschiedene Klone identifiziert, die von einem gegen das Verzweigungsenzym gerichteten Antiserum erkannt wurden (zur Durchführung der immunologischen Bestimmung s. Ausführungsbeispiel 3, "Western Blot"). Diese Klone wurden genutzt, um aus einer in der HindIII- Schnittstelle des Plasmids pUC19 angelegten cDNA-Bibliothek aus wachsenden Knollen von Solanum tuberosum Vollängenklone zu isolieren. Ein Klon mit einer Insertion der Größe 2909 bp wurde für die weitere Klonierung verwendet.
Zur Herstellung des Plasmids p35S-anti-BE wurde die cDNA-Insertion mit dem
Promotor der 35S-RNA des Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV) sowie dem
Polyadenylierungssignal der Octopinsynthase des Ti-Plasmids pTiACH5 versehen.
Dabei wurde die Orientierung der cDNA so gewählt, daß ausgehend vom Promotor
der nicht-kodierende Strang abgelesen wird (antisense-Orientierung). Das Plasmid
p35S-anti-BE hat eine Größe von 13,6 kb und besteht aus den drei Fragmenten A, B
und C, die in den Polylinker des Plasmids pBIN19 (Bevan, "Nucl Acids Res.", 12: 8711-8721)
insertiert sind (s. Fig. 1).
Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S-Promotor des CaMV. Das Fragment umfaßt
die Nukleotide 6909 bis 7437 (Franck et al., Cell 21: 285-294). Es wurde als
EcoRI/KpnI-Fragment aus dem Plasmid pDH51 (Pietrzak et al., "Nucl Acid Res.", 14,
5857-5868) isoliert und zwischen die EcoRI/KpnI-Schnittstellen des Polylinkers von
pBIN19 ligiert. Dabei entstand pBIN19-A.
Fragment C (192 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA
des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J 3: 835-846), Nukleotide 11749-11939,
welches als PvuII/HindIII-Fragment aus dem Plasmid pAGV40 (Herrera-
Estrella et al., "Nature", 303: 209-213) isoliert und nach Addition von SphI-Linkern an
die PvuII-Schnittstelle zwischen die SphI- und die HindIII-Schnittstelle von pBIN19-A
ligiert wurde. Dabei entstand pBIN19-AC.
Fragment B enthält die 2909 bp große cDNA des Verzweigungsenzyms von Solanum
tuberosum und wurde als HindIII/SmaI-Fragment aus dem oben beschriebenen
pUC19-Derivat isoliert. Nach Auffüllen der HindIII-Schnittstelle mit Hilfe der DNA-
Polymerase wurde das Fragment in die SmaI-Schnittstelle des zuvor beschriebenen
Derivats pBIN19-AC ligiert (s. Fig. 1).
Unter Verwendung zweier synthetisch hergestellter DNA-Oligonukleotide der
Sequenzen:
5'-GCCCCCGGGCTTTTAAGTTCCTTG-3'
und
5'-CAGGGTACCTAACATCTTAATCATC-3'
als Primer für eine Polymerase-Kettenreaktion an cDNA aus Knollengewebe von
Solanum tuberosum wurde eine Kopie der Kodierregion des Disproportionierungs
enzyms erzeugt, die wegen der spezifischen Sequenz der Oligonukleotide am 3'-
Ende des kodogenen Stranges mit einer KpnI-Schnittstelle und an dessen 5'-Ende
mit einer SmaI-Schnittstelle ausgestattet ist. Mit Hilfe dieser beiden Schnittstellen ist
es möglich, die Kodierregion des Disproportionierungsenzyms in antisense-
Orientierung zwischen die KpnI- und die SmaI-Schnittstelle des binären Plasmids
pBIN19-HYG zu klonieren. Das Plasmid pBIN19-HYG trägt das hphl-Gen für
Hygromicinresistenz in der T-DNA. Die Verwendung dieses Plasmids ist notwendig,
um Pflanzen, die bereits mit einem pBIN19-Derivat transformiert wurden, einer
erneuten Transformation und Selektion unterziehen zu können. Für die Herstellung
des Plasmids p35SH-anti-D wurde ein Derivat von pBIN19-HYG verwendet, das
entsprechend der in Ausführungsbeipiel 1 beschriebenen Vorgehensweise mit den
dort beschriebenen Fragmenten A und C ausgestattet worden war. Dies hatte zu
dem Plasmid pBin19-HYG-AC geführt.
Durch Ligation des mit KpnI und SmaI geschnittenen Produkts der Polymerase-
Kettenreaktion zur Vervielfältigung der Kodierregion des Disproportionierungs
enzyms zwischen die KpnI- und SmaI-Schnittstellen von pBIN19-HYG-AC entstand
das Plasmid p35SH-anti-D (s. Fig. 2), das wie das in Ausführungsbeispiel 1
beschriebene Plasmid p35S-anti-BE aus drei Fragmenten A, B und C, insertiert in
den Polylinker von pBIN19-HYG-AC, besteht. Die Fragmente A und C sind mit den
entsprechenden in Ausführungsbeipiel 1 identisch; das Fragment B beinhaltet die
Nukleotide 1777 bis 303 des Disproportionierungsenzyms von Solanum tuberosum
(Takaha et al., 1993).
Zur Transformation von Agrobacterium tumefaciens wurden die binären Plasmide
aus den Ausführungsbeispielen 1 bzw. 2 durch direkte Transformation nach der
Methode von Höfgen & Willmitzer (1988, "Nucl Acids Res.", 16: 9877) in die Zellen
eingeführt. Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode
von Birnboim et al. (1979, "Nucl Acids Res.", 7: 1513-1523) isoliert und nach geeigneter
Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch analysiert.
Agrobakterien, bei denen die Integrität der in den Ausführungsbeispielen 1 und 2
beschriebenen, binären Plasmide nach der Transformation durch Restriktionsanalyse
nachgewiesen worden war, wurden zur genetischen Veränderung von Pflanzen
eingesetzt.
Zur Transformation z. B. von Kartoffelpflanzen werden beispielsweise 10 kleine, mit
einem Skalpell verwundete Blätter einer Sterilkultur in 10 ml MS-Medium mit 2%
Saccharose gelegt, welches 30-50 µl einer unter Selektion gewachsenen
Agrobacterium-tumefaciens-Übernachtkultur enthält. Nach 3-5-minütigem, leichtem
Schütteln werden die Petrischalen bei 25°C im Dunkeln inkubiert. Nach 2 Tagen
werden die Blätter auf MS-Medium mit 1,6% Glukose, 2 mg/l Zeatinribose, 0,02 mg/l
Naphthylessigsäure, 0,02 mg/l Giberellinsäure, 500 mg/l Claforan, 50 mg/l
Kanamycin und 0,8% Bacto-Agar ausgelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C
und 3000 Lux wird die Claforankonzentration im Medium um die Hälfte reduziert. Die
weitere Kultivierung erfolgte wie von Rocha-Sosa et al. (1989, EMBO J I 8: 29)
beschrieben.
Um die erfindungsgemäße Kombination von DNA-Sequenzen in Pflanzen
einzuführen und diese zur Produktion einer hochgradig amylosehaltigen Stärke zu
veranlassen, wurden zwei aufeinanderfolgende Transformationen nach der oben
angegebenen Vorschrift durchgeführt.
Dabei wurde zweckmäßig zunächst mit dem in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen
Plasmid transformiert, da der Erfolg der antisense-Inhibition der Bildung des
Verzweigungsenzyms leicht mit dem in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen
Antiserum vorgenommen werden kann.
Solche Pflanzen, bei denen kein Verzweigungsenzym mehr nachweisbar ist, werden
für eine Superinfektion mit dem Plasmid p35SH-anti-D eingesetzt. Anstelle des
Kanamycins wird nun zur Selektion Hygromicin in einer Konzentration von 3 mg/l
verwendet.
Die Überprüfung des Erfolgs der genetischen Veränderung der Pflanzen ist durch
Analyse der Gesamt-RNA bezüglich des Ausbleibens der mRNA des Q- und des D-
Enzyms möglich. Im Falle der mit dem Konstrukt 35SH-anti-D transformierten
Pflanzen wurde diese Nachweismethode verwendet. Die Isolierung pflanzlicher
Gesamt-RNA erfolgt nach Logemann et al. (1987, "Anal Biochem.", 163: 16-20). Für die
Analyse werden je 50 µg Gesamt-RNA mit Hilfe von "Northern Blots" auf die
Abwesenheit des Q- und des D-Enzym-Transkripts untersucht.
Zur Überprüfung des Vorhandenseins des Q-Enzyms in transgenen Pflanzen
erfolgte eine Extraktion von Gesamtprotein aus Pflanzengewebe und anschließende
"Western Blot-Analyse" mit einem entsprechenden Antiserum. Hierzu werden
Proteinextrakte mittels Gelelektrophorese in SDS-PAAG nach Molekulargewicht
getrennt. Nach SDS-PAAG-Elektrophorese (PAGE) werden Proteingele für
15-30 Minuten in Transfer-Puffer für Graphitelektroden (48 g/l Tris, 39 g/l Glycin, 0,0375%
SDS, 20% Methanol) äquilibriert und anschließend bei 4°C auf einen Nitrozellulose-
Filter mit 1,3 mA/cm2 für 1-2 Stunden transferiert. Der Filter wird für 30 Minuten mit
3% Gelatine in TBS-Puffer (20 mM Tris/HCl pH 7,5; 500 mM NaCl) abgesättigt.
Anschließend wird der Filter für 2 Stunden mit dem Antiserum in geeigneter
Verdünnung (1 : 1.000-10.000 in TBS-Puffer) bei Raumtemperatur inkubiert. Danach
wird der Filter jeweils für 15 Minuten mit TBS-, TTBS-(TBS-Puffer mit 0,1%
Polyoxyethylen-(20)-Sorbitanmonolaurat und TBS-Puffer gewaschen. Nach dem
Waschen wird das Filter für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit Alkalische-
Phosphatase konjugierten Goat-anti-Rabbit (GAR)-Antikörpern (1 : 7.500 in TBS)
inkubiert. Anschließend wird das Filter wie obenstehend beschrieben gewaschen
und in AP-Puffer (100 mM Tris/HCl pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2) äquilibriert.
Die Alkalische Phosphatase-Reaktion wird durch Substratzugabe von 70 µl 4-
Nitrotetrazolium(NBT)-Lösung (50 mg/ml NBT in 70% Dimethylformamid) und 35 µl
5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat (BCIP) (50 mg/ml BCIP in Dimethylformamid) in
50 ml AP-Puffer gestartet. Nach 5 Minuten können in der Regel erste Signale
beobachtet werden.
Zur Bestimmung des Amylose/Amylopektin-Gehalts in der Stärke transgener
Kartoffelpflanzen, die hochgradig amylosehaltige Stärke produzieren, werden
Blattstückchen mit einem Durchmesser von 10 mm unter Dauerlicht auf 6%iger
Saccharoselösung 14 Stunden lang flotiert. Durch diese Lichtinkubation wird eine
stark erhöhte Stärkebildung in den Blattstückchen induziert. Nach der Inkubation
wird die Amylose- und Amylopektin-Konzentration nach Hovenkamp-Hermelink et al.
(1988, "Potato Research", 31: 241-246) bestimmt.
Die Bestimmung des Verzweigungsgrades (Gehalt an α-1,6-Bindungen), der
Kettenlänge sowie der Größe der Stärkekörner erfolgt nach Morrison et al. (1990,
"Methods in Plant Biochemistry", Academic Press Lmtd. 2: 323-352).
Claims (16)
1. Kombination von DNA-Sequenzen, dadurch gekennzeichnet, daß die
Kombination aus:
- a) der Kodierregion eines Verzweigungsenzyms und
- b) der Kodierregion eines Disproportionierungsenzyms besteht,
2. Kombination von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die Kodierregionen des Verzweigungs- und
Disproportionierungsenzyms von Solanum tuberosum stammen.
3. Kombination von DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch
gekennzeichnet, daß die Kodierregion des Verzweigungsenzyms auf dem
Plasmid p35S-anti-BE (DSM 6144) und die Kodierregion des
Disproportionierungsenzyms auf dem Plasmid p35SH-anti-D (DSM 8479)
lokalisiert sind, die bei gleichzeitiger oder aufeinanderfolgender Einführung in
ein pflanzliches Genom in transgenen Pflanzen Transkripte bilden, die die
Bildung von Enzymen des Stärkemetabolismus dahingehend verändern, daß
bei der Stärkebiosynthese die Bildung von Amylopektin unterdrückt ist und
dadurch die Bildung einer hochgradig amylosehaltigen Stärke ermöglicht wird.
4. Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen, die hochgradig
amylosehaltige Stärke bilden können, dadurch gekennzeichnet, daß man
diese über:
- A) ein einstufiges Verfahren herstellt, das die folgenden Schritte
beinhaltet:
- a) Herstellung einer Kombination von DNA-Sequenzen aus folgenden Teilsequenzen:
- b) je einem Promotor, der in Pflanzen aktiv ist und die Bildung einer RNA im vorgesehenen Zielgewebe oder den Zielzellen sicherstellt,
- c) je einer Kodierregion eines Verzweigungsenzyms und eines Disproportionierungsenzyms, derart an den unter i) genannten Promotor fusioniert, daß ein Transkript vom nicht-kodierenden Strang gebildet wird (antisense-Fusion) und
- d) je einer 3'-nichttranslatierten Sequenz, die in Pflanzenzellen zur Beendigung der Transkription sowie zur Addition von poly-A-Resten an das 3'-Ende der RNA führt, derart an die unter ii) genannte Sequenz fusioniert, daß die 3'-nicht-translatierte Sequenz an das 3'-Ende des unter ii) genannten, nicht-kodierenden Stranges anschließt,
- e) Transfer und Einbau der Kombinationen von DNA-Sequenzen in ein pflanzliches Genom unter Verwendung rekombinanter Plasmide zur Erzeugung transgener Pflanzenzellen und
- f) Regeneration von intakten, ganzen Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen
- B) ein zweistufiges Verfahren hergestellt, bei dem zunächst eine DNA-
Sequenz, bestehend aus den Teilstücken:
- a) einem Promotor, der in Pflanzen aktiv ist und die Bildung einer RNA im vorgesehenen Zielgeweben oder den Zielzellen sicherstellt,
- b) einer Kodierregion eines Verzweigungs- oder Disproportionie rungsenzyms, das derart an den unter iv) genannten Promotor fusioniert ist, daß ein Transkript vom nicht-kodierenden Strang gebildet wird (antisense-Fusion) und
- c) einer 3'-nichttranslatierten Sequenz, die in Pflanzenzellen zur Beendigung der Transkription sowie zur Addition von poly-A- Resten an das 3'-Ende der RNA führt, derart an die unter v) genannte Sequenz fusioniert, daß die 3'-nichttranslatierte Sequenz an das 3'-Ende des unter v) genannten, nicht- kodierenden Stranges anschließt,
- a) einem Promotor, der in Pflanzen aktiv ist und die Bildung einer RNA im vorgesehenen Zielgewebe oder den Zielzellen sicherstellt,
- b) einer Kodierregion eines Disproportionierungs- oder Verzweigungsenzyms, derart an den unter vii) genannten Promotor fusioniert, daß ein Transkript vom nicht-kodierenden Strang gebildet wird (antisense-Fusion) und
- c) einer 3'-nichttranslatierten Sequenz, die in Pflanzenzellen zur Beendigung der Transkription sowie zur Addition von poly-A- Resten an das 3'-Ende der RNA führt, derart an die unter viii) genannte Sequenz fusioniert, daß die 3'-nicht-translatierte Sequenz an das 3'-Ende des unter viii) genannten, nicht- kodierenden Stranges anschließt,
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der unter i), iv)
oder vii) genannte Promotor der 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus
mit den Nukleotiden 6909 bis 7437 ist.
6. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der unter i), iv)
oder vii) genannte Promotor der B33-Promotor eines Patatingens von
Solanum tuberosum mit den Nukleotiden -1512 bis +14 ist.
7. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die für die
Kombination verwendeten Plasmide die Plasmide p35S-anti-BE (DSM 6144)
und p35SH-anti-D (DSM 8479) oder Derivate davon sind.
8. Pflanzenzellen, enthaltend eine DNA-Sequenz-Kombination gemäß den
Ansprüchen 1 bis 3.
9. Verwendung von Pflanzenzellen gemäß Anspruch 8 zur Herstellung von
Pflanzen, die hochgradig amylosehaltige Stärke bilden.
10. Transgene Pflanzen, die hochgradig amylosehaltige Stärke bilden, erhältlich
durch das Verfahren gemäß den Ansprüchen 4 bis 7.
11. Pflanzen gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es die
Nutzpflanze Kartoffel ist.
12. Verwendung der DNA-Sequenz-Kombination gemäß den Ansprüchen 1 bis
3, zur Herstellung von Pflanzen, die hochgradig amylosehaltige Stärke bilden.
13. Verwendung der Plasmide p35S-anti-BE (DSM 6144) und p35SH-anti-D
(DSM 8479) in Kombination, zur Transformation von Pflanzenzellen mit dem
Ziel, in den Zellen die Bildung von hochgradig amylosehaltiger Stärke zu
ermöglichen.
14. Hochgradig amylosehaltige Stärke, isolierbar aus Pflanzen gemäß den
Ansprüchen 10 und 11.
15. Hochgradig amylosehaltige Stärke, isolierbar aus Pflanzenzellen gemäß
Anspruch 8.
16. Verwendung der Stärke gemäß den Ansprüchen 14 und 15, zur Herstellung
von Nahrungsmitteln und industriellen Produkten.
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