DE19618125A1 - Nucleinsäuremoleküle, die neue Debranching-Enzyme aus Kartoffel codieren - Google Patents
Nucleinsäuremoleküle, die neue Debranching-Enzyme aus Kartoffel codierenInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäuremoleküle, die
neue Proteine aus Kartoffel mit der enzymatischen Aktivität
eines Debranching-Enzyms codieren. Ferner betrifft die Er
findung transgene Pflanzen und Pflanzenzellen, in denen es
aufgrund der Expression einer zusätzlichen Debranching-En
zymaktivität aus Kartoffel oder der Inhibierung einer en
dogenen Debranching-Enzymaktivität zur Synthese eines Amylo
pektins mit einem veränderten Verzweigungsgrad kommt, sowie
die aus den besagten transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen
erhältliche Stärke.
Stärke spielt sowohl als Speicherstoff in einer Vielzahl von
Pflanzen als auch als nachwachsender, industriell verwertba
rer Rohstoff eine wichtige Rolle und gewinnt zunehmend an
Bedeutung. Für die industrielle Verwendung der Stärke ist es
erforderlich, daß diese hinsichtlich der Struktur, Form
und/oder sonstigen physikalisch-chemischen Parametern den
Erfordernissen der verarbeitenden Industrie entspricht. Für
den Einsatz in möglichst vielen Einsatzgebieten ist es dar
über hinaus erforderlich, eine große Stoffvielfalt zu errei
chen.
Das Polysaccharid Stärke ist aus chemisch einheitlichen
Grundbausteinen, den Glucosemolekülen, aufgebaut, stellt je
doch ein komplexes Gemisch aus unterschiedlichen Molekülfor
men dar, die Unterschiede hinsichtlich des Polymerisations
grades und des Auftretens von Verzweigungen aufweisen. Man
unterscheidet die Amylose-Stärke, ein im wesentlichen unver
zweigtes Polymer aus α-1,4-glycosidisch verknüpften Glucose
molekülen, von der Amylopektin-Stärke, ein verzweigtes Poly
mer, bei dem die Verzweigungen durch das Auftreten von zu
sätzlichen α-1,6-glykosidischen Verknüpfungen zustande kom
men.
In typischen für die Stärkeproduktion verwendeten Pflanzen,
wie z. B. Mais oder Kartoffel, kommen die beiden Stärkeformen
in einem Verhältnis von ca. 25 Teilen Amylose zu 75 Teilen
Amylopektin vor. Neben dem Amylopektin kommt beispielsweise
beim Mais ein weiteres verzweigtes Polysaccharid, das soge
nannte Phytoglycogen, vor, das sich vom Amylopektin durch
einen stärkeren Verzweigungsgrad und ein anderes Löslich
keitsverhalten unterscheidet (siehe z. B. Lee et al., Arch.
Biochem. Biophys. 143 (1971), 365-374; Pan und Nelson, Plant
Physiol. 74 (1984), 324-328). Im Rahmen dieser Anmeldung
wird der Begriff Amylopektin so verwendet, daß er das Phyto
glycogen umfaßt.
Im Hinblick auf die Einheitlichkeit des Grundstoffes Stärke
für seine Anwendung im industriellen Bereich werden Stärke
produzierende Pflanzen benötigt, die beispielsweise nur noch
die Komponente Amylopektin oder nur noch die Komponente Amy
lose enthalten. Für eine Reihe weiterer Verwendungen werden
Pflanzen benötigt, die unterschiedlich stark verzweigte Amy
lopektin-Formen synthetisieren.
Derartige Pflanzen können beispielsweise durch Züchtung oder
Mutagenesetechniken erzeugt werden. Für bestimmte Pflanzen
spezies, z. B. Mais, ist bekannt, daß durch Mutagenese Sorten
erzeugt werden können, die nur noch Amylopektin bilden. Für
die Kartoffel wurde ebenfalls durch chemische Mutagenese bei
einer haploiden Linie ein Genotyp erzeugt, der keine Amylose
bildet (Hovenkamp-Hermelink, Theor. Appl. Genet. 75 (1987),
217-221).
Neben den klassischen Züchtungs- und Mutagenesetechniken
werden inzwischen zunehmend gentechnische Methoden angewen
det, um gezielt in den Stärkemetabolismus stärkespeichernder
Pflanzen einzugreifen. Voraussetzung hierfür ist, daß
DNA-Sequenzen zur Verfügung stehen, die am Stärkemetabolismus
beteiligte Enzyme codieren. Bei der Kartoffel sind bei
spielsweise inzwischen DNA-Sequenzen, die Stärkekorn-gebun
dene Stärkesynthase oder Verzweigungsenzym (Q-Enzym) codie
ren, bekannt und zur gentechnischen Veränderung von Pflanzen
verwendet worden.
Für eine weitere gezielte Veränderung der Stärke in Pflan
zen, insbesondere des Verzweigungsgrades von in Pflanzen
synthetisierter Stärke mit Hilfe gentechnischer Verfahren
ist es nach wie vor erforderlich, DNA-Sequenzen zu identifi
zieren, die Enzyme codieren, die am Stärkemetabolismus, ins
besondere der Verzweigung von Stärkemolekülen, beteiligt
sind.
Neben den Q-Enzymen, die Verzweigungen in Stärkemoleküle
einführen, kommen in Pflanzen Enzyme vor, die Verzweigungen
auflösen können. Diese Enzyme werden als Debranching-Enzyme
bezeichnet.
In Zuckerrübe konnte von Li et al. (Plant Physiol. 98
(1992), 1277-1284) neben fünf Endo- und zwei Exoamylasen nur
ein Debranching-Enzym nachgewiesen werden. Dieses Enzym, das
eine Größe von ca. 100 kD und ein pH-Optimum von 5,5 auf
weist, ist in den Chloroplasten lokalisiert. Auch für Spinat
wurde ein Debranching-Enzym beschrieben. Sowohl das
Debranching-Enzym aus Spinat als auch das aus der Zuckerrübe
besitzen bei der Reaktion mit Amylopektin als Substrat ver
glichen mit Pullulan als Substrat eine 5fach geringere Ak
tivität (Ludwig et al., Plant Physiol. 74 (1984), 856-861;
Li et al., Plant Physiol. 98 (1992), 1277-1284). Für Spinat
wurde die Isolierung einer cDNA, die ein Debranching-Enzym
codiert, beschrieben (Renz et al, Plant Physiol. 108 (1995),
1342).
Für Mais wurde in der Literatur die Existenz eines
Debranching-Enzyms beschrieben. Die entsprechende Mutante
wird als su (sugary) bezeichnet. Das Gen des sugary-Locus
wurde kürzlich cloniert (siehe James et al., Plant Cell 7
(1995), 417-429).
Bei der landwirtschaftlich wichtigen stärkespeichernden Kul
turpflanze Kartoffel wurde die Aktivität eines Debranching-Enzyms
von Hobson et al. (LT. Chem. Soc., (1951), 1451) un
tersucht. Es gelang der Nachweis, daß das entsprechende En
zym im Gegensatz zum Q-Enzym keine kettenverlängernde Akti
vität besitzt, sondern lediglich α-1,6-glycosidische Bindun
gen hydrolysiert. Es wurden bereits Verfahren zur Reinigung
eines Debranching-Enzyms aus Kartoffel sowie partielle Pep
tidsequenzen des gereinigten Proteins beschrieben
(WO 95/04826).
Es gab bisher keinerlei Hinweise, daß in Kartoffel weitere
Debranching-Enzymformen vorkommen. Sollte dies der Fall
sein, so müßte man für die Herstellung transgener Kartoffel
pflanzen, die keinerlei Debranching-Enzymaktivität mehr auf
weisen, z. B. um eine Veränderung des Verzweigungsgrades der
Amylopektinstärke zu erzielen, alle in der Kartoffel vorkom
menden Debranching-Enzymformen identifizieren und die ent
sprechenden Gene oder cDNA-Sequenzen isolieren.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde,
weitere möglicherweise bei Kartoffel vorkommende Debran
ching-Enzyme zu identifizieren bzw. entsprechende Nuclein
säuremoleküle, die diese Enzyme codieren, zu isolieren.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Pa
tentansprüchen bezeichneten Ausführungsformen gelöst.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremole
küle, die Proteine mit der biologischen Aktivität eines
Debranching-Enzyms aus Kartoffel codieren.
Ein derartiges Nucleinsäuremolekül codiert vorzugsweise ein
Protein mit der biologischen Aktivität eines Debranching-Enzyms
aus Kartoffel, das die unter Seq ID No. 2 angegebene
Aminosäuresequenz aufweist. Besonders bevorzugt umfaßt ein
derartiges Nucleinsäuremolekül die unter Seq ID No. 1 ange
gebene Nucleotidsequenz insbesondere die codierende Region.
Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Nucleinsäuremolekü
le, die Proteine mit der biologischen Aktivität eines
Debranching-Enzyms aus Kartoffel codieren und die mit einem
der oben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle hybridisieren.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremo
leküle, deren Sequenzen sich aufgrund der Degeneration des
genetischen Codes von den Sequenzen der obengenannten
Nucleinsäuremoleküle unterscheidet, und die ein Protein co
dieren, das die biologische Aktivität eines Debranching-Enzyms
aus Kartoffel aufweist.
Der Begriff "aus Kartoffel" bedeutet, daß die durch die er
findungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codierten Debranching-Enzyme
typisch sind für die Spezies Solanum tuberosum, d. h.
entweder natürlicherweise in solchen Pflanzen vorkommen,
beispielsweise codiert durch genomische oder RNA-Moleküle,
oder von davon abgeleiteten Molekülen. Abgeleitete Moleküle
können beispielsweise durch reverse Transkription von
RNA-Molekülen, Amplifikation, Mutation, Deletion, Substitution,
Insertion etc. erzeugt werden. D.h. der Begriff umfaßt auch
Enzyme, die von Allelen oder Derivaten von natürlicherweise
in Kartoffel vorkommenden Sequenzen codiert werden. Diese
können beispielsweise durch gentechnische Methoden in vivo
oder in vitro erzeugt werden.
Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet im Rahmen dieser Er
findung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridi
sierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedin
gungen, wie sie beispielsweise in Sambrock et al., Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (1989) Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben
sind. Nucleinsäuremoleküle, die mit den erfindungsgemäßen
Nucleinsäuremolekülen hybridisieren, können prinzipiell aus
jeder beliebigen Kartoffelpflanze stammen.
Nucleinsäuremoleküle, die mit den erfindungsgemäßen Molekü
len hybridisieren, können z. B. aus genomischen oder aus
cDNA-Bibliotheken isoliert werden.
Die Identifizierung und Isolierung derartiger Nucleinsäure
moleküle kann dabei unter Verwendung der erfindungsgemäßen
Nucleinsäuremoleküle oder Teile dieser Moleküle bzw. der re
versen Komplemente dieser Moleküle erfolgen, z. B. mittels
Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe z. B. Sambrook
et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2.
Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY) oder durch Amplifikation mittels PCR.
Als Hybridisierungsprobe können z. B. Nucleinsäuremoleküle
verwendet werden, die exakt die oder im wesentlichen die un
ter Seq ID No. 1 angegebene Nucleotidsequenz oder Teile die
ser Sequenz aufweisen. Bei den als Hybridisierungsprobe ver
wendeten Fragmenten kann es sich auch um synthetische Frag
mente handeln, die mit Hilfe der gängigen Synthesetechniken
hergestellt wurden und deren Sequenz im wesentlichen mit der
eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls übereinstimmt.
Hat man Gene identifiziert und isoliert, die mit den erfin
dungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen hybridisieren, ist eine
Bestimmung der Sequenz und eine Analyse der Eigenschaften
der von dieser Sequenz codierten Proteine erforderlich.
Die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridi
sierenden Moleküle umfassen insbesondere Fragmente, Derivate
und allelische Varianten der oben beschriebenen DNA-Molekü
le, die ein Protein codieren mit der enzymatischen Aktivität
eines Debranching-Enzyms aus Kartoffel oder ein biologisch,
d. h. enzymatisch aktives Fragment davon. Unter Fragmenten
werden dabei Teile der Nucleinsäuremoleküle verstanden, die
lang genug sind, um ein Polypeptid mit der enzymatischen Ak
tivität eines Debranching-Enzyms zu codieren. Der Ausdruck
Derivat bedeutet in diesem Zusammenhang, daß die Sequenzen
dieser Moleküle sich von den Sequenzen der oben beschrie
benen Nucleinsäuremoleküle an einer oder mehreren Positionen
unterscheiden und einen hohen Grad an Homologie zu diesen
Sequenzen aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenz
identität von mindestens 70%, insbesondere eine Identität
von mindestens 80%, vorzugsweise über 90% und besonders
bevorzugt über 95%. Die Abweichungen zu den oben beschrie
benen Nucleinsäuremolekülen können dabei durch Deletion, Ad
dition, Substitution, Insertion oder Rekombination entstan
den sein.
Homologie bedeutet ferner, daß funktionelle und/oder struk
turelle Äquivalenz zwischen den betreffenden Nucleinsäuremo
lekülen oder den durch sie codierten Proteinen, besteht. Bei
den Nucleinsäuremolekülen, die homolog zu den oben beschrie
benen Molekülen sind und Derivate dieser Moleküle darstel
len, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Mo
leküle, die Modifikationen darstellen, die dieselbe biologi
sche Funktion ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürli
cherweise auftretende Variationen handeln, beispielsweise um
Sequenzen aus anderen Kartoffelpflanzen oder -sorten, oder
um Mutationen, wobei diese Mutationen auf natürliche Weise
aufgetreten sein können oder durch gezielte Mutagenese ein
geführt wurden. Ferner kann es sich bei den Variationen um
synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Bei den alleli
schen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende
Varianten handeln, als auch um synthetisch hergestellte oder
durch rekombinante DNA-Techniken erzeugte Varianten.
Die von den verschiedenen Varianten der erfindungsgemäßen
Nucleinsäuremoleküle codierten Proteine weisen bestimmte ge
meinsame Charakteristika auf. Dazu können z. B. Enzymaktivi
tät, Molekulargewicht, immunologische Reaktivität, Konforma
tion etc. gehören, sowie physikalische Eigenschaften wie
z. B. das Laufverhalten in Gelelektrophoresen, chromatogra
phisches Verhalten, Sedimentationskoeffizienten, Löslich
keit, spektroskopische Eigenschaften, Stabilität; pH-Opti
mum, Temperatur-Optimum etc.
Der Nachweis der enzymatischen Aktivität des Debranching-En
zyms kann beispielsweise durch einen Färbetest erfolgen, wie
in der WO 95/04826 beschrieben. Dieser beruht darauf, daß
sich ein Protein mit einer stärkemodifizierenden Aktivität
nachweisen läßt, wenn Proteinextrake, beispielsweise aus
Kartoffelknollen, in nicht-denaturierenden, amylopektinhal
tigen Polyacrylamidgelen (PAAG) aufgetrennt werden und das
Gel, nach Inkubation in einem geeigneten Puffer, an
schließend einer Jodfärbung unterzogen wird. Während unver
zweigte Amylose mit Jod einen blauen Komplex bildet, ergibt
Amylopektin eine rötlich-violette Färbung. In amylopektin
haltigen Polyacrylamidgelen, die mit Jod rötlich-violett
färben, kommt es an Orten, an denen eine Debranching-Aktivi
tät lokalisiert ist, zu einer Farbverschiebung hin zu einer
Blaufärbung des Gels, da die Verzweigungen des violettfär
benden Amylopektins von dem Debranching-Enzym abgebaut wer
den.
Alternativ kann der Nachweis der Debranching-Enzymaktivität
mit Hilfe des DNSS-Tests (siehe Ludwig et al., Plant
Physiol. 74 (1984), 856-861) erfolgen.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können beliebige
Nucleinsäuremoleküle sein, insbesondere DNA- oder RNA-Mole
küle handeln, beispielsweise cDNA, genomische DNA, mRNA etc.
Sie können natürlich vorkommende Moleküle sein, oder durch
gentechnische oder chemische Syntheseverfahren hergestellte.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codieren ein bis
her unbekanntes neues Protein aus Kartoffel mit der enzyma
tischen Aktivität eines Debranching-Enzyms. Bisher war für
Kartoffel lediglich ein Debranching-Enzym beschrieben wor
den. In der Literatur gab es bisher keinerlei Hinweise, daß
es in Kartoffel Gene gibt, die weitere Debranching-Enzyme
codieren. Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß es
neben dem bisher bekannten Debranching-Enzym in Kartoffel
zumindest ein weiteres Enzym mit Debranching-Aktivität gibt.
Somit codieren die erfindungsgemäßen Moleküle einen neuen
Typ von Debranching-Enzymen aus Kartoffel. Mit Hilfe dieser
Moleküle ist es nun möglich gezielt in den Stärkemetabolis
mus von Kartoffel und anderen stärkespeichernden Pflanzen
einzugreifen und somit die Synthese einer in ihren chemi
schen oder physikalischen Eigenschaften modifizierten Stärke
zu ermöglichen. Dies kann zum einen durch Überexpression der
erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in beliebigen, vor
zugsweise stärkespeichernden Pflanzen, erfolgen oder durch
Reduktion der Debranching-Enzymaktivität in Kartoffelpflan
zen durch Einsatz der erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequen
zen, beispielsweise mittels antisense- oder Ribozymeffekte.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremole
küle von mindestens 15, vorzugsweise mehr als 50 und beson
ders bevorzugt mehr als 200 Basenpaaren Länge, die spezi
fisch mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybri
disieren. Spezifisch hybridisieren bedeutet hierbei, daß
diese Moleküle mit Nucleinsäuremolekülen hybridisieren, die
die neuen Debranching-Enzyme aus Kartoffel codieren, jedoch
nicht mit Nucleinsäuremolekülen, die andere Proteine codie
ren. Hybridisieren bedeutet dabei vorzugsweise Hybridisieren
unter stringenten Bedingungen (s. o.). Insbesondere betrifft
die Erfindung solche Nucleinsäuremoleküle, die mit Trans
kripten von erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridi
sieren und dadurch deren Translation verhindern können. Sol
che Nucleinsäuremoleküle, die spezifisch mit den erfindungs
gemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridisieren, können bei
spielsweise Bestandteile von mRNA-Konstrukten oder Ribozymen
sein oder können als Primer für die Amplifikation mittels
PCR verwendet werden.
Weiterhin betrifft die Erfindung Vektoren, insbesondere
Plasmide, Cosmide, Viren, Bacteriophagen und andere in der
Gentechnik gängige Vektoren, die die oben beschriebenen er
findungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in den Vekto
ren enthaltenen Nucleinsäuremoleküle verknüpft mit regulato
rischen Elementen, die die Transkription und Translation in
prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen gewährleisten.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung
Wirtszellen, insbesondere prokaryontische oder eukaryonti
sche Zellen, die mit einem oben beschriebenen Nucleinsäure
molekül oder einem Vektor transformiert wurden, und Zellen,
die von derartigen Wirtszellen abstammen und die beschriebe
nen Nucleinsäuremoleküle oder Vektoren enthalten. Die Wirts
zellen können Bakterien- oder Pilzzellen, sowie pflanzliche
oder tierische Zellen sein.
Die Erfindung betrifft auch Proteine mit der biologischen
Aktivität eines Debranching-Enzyms aus Kartoffel, die durch
die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codiert werden,
oder biologisch aktive Fragmente davon.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Her
stellung eines Proteins mit der biologischen Aktivität eines
Debranching-Enzyms aus Kartoffel oder eines biologisch ak
tiven Fragmentes davon, bei dem erfindungsgemäße Wirtszellen
unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden und das Pro
tein aus der Kultur, d. h. aus den Zellen und/oder dem Kul
turmedium gewonnen wird.
Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nucleinsäure
moleküle besteht nun die Möglichkeit, pflanzliche Zellen
mittels gentechnischer Methoden dahingehend zu verändern,
daß sie eine neue oder eine gesteigerte Debranching-Enzymak
tivität aufweisen im Vergleich zu Wildtyp-Zellen oder dahin
gehend, daß sie im Vergleich zu Wildtyp-Zellen eine verrin
gerte Debranching-Enzymaktivität aufweisen.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich daher
bei den erfindungsgemäßen Wirtszellen um transgene pflanzli
che Zellen, die aufgrund der Gegenwart und Expression eines
eingeführten erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls im Ver
gleich zu nichttransformierten Zellen entweder eine neue
oder eine gesteigerte Debranching-Enzymaktivität aufweisen.
Solche transgenen Pflanzenzellen unterscheiden sich von
nicht-transformierten Zellen dadurch, daß das eingeführte
Nucleinsäuremolekül entweder heterolog zu der transformier
ten Zelle ist, d. h. aus einer Zelle mit einem anderen geno
mischen Hintergrund stammt, oder dadurch daß das eingeführte
Nucleinsäuremolekül, wenn es homolog zur transformierten
Pflanzenspezies ist, im Genom an einem Ort lokalisiert ist,
an dem es in nicht-transformierten Zellen natürlicherweise
nicht vorkommt. Dabei kann das eingeführte Nucleinsäuremole
kül entweder unter der Kontrolle seines natürlichen Promo
tors stehen oder mit regulatorischen Elementen fremder Gene
verknüpft sein.
Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls transgene Pflanzen,
die die oben beschriebenen transgenen Pflanzenzellen enthal
ten.
Bei der Pflanze, die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäure
molekülen transformiert ist, und in der aufgrund der Einfüh
rung eines solchen Moleküls ein Debranching-Enzym aus Kar
toffel synthetisiert wird, kann es sich im Prinzip um jede
beliebige Pflanze handeln. Vorzugsweise ist es eine monoko
tyle oder dikotyle Nutzpflanze, insbesondere eine stärke
speichernde Pflanze, wie z. B. Getreidepflanzen, Leguminosen,
Kartoffeln oder Maniok.
Unter Getreidepflanzen werden insbesondere monokotyle Pflan
zen verstanden, die zur Ordnung Poales, bevorzugt solche,
die zur Familie der Poaceae gehören. Beispiele hierfür sind
die Pflanzen, die zu den Gattungen Avena (Hafer), Triticum
(Weizen), Secale (Roggen), Hordeum (Gerste), Oryza (Reis),
Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorghum (Hirse), Zea (Mais)
etc. gehören. Stärkespeichernde Leguminosen sind z. B. manche
Arten der Gattung Pisum (z. B. Pisum sativum), Vicia (z. B.
Vicia faba), Cicer (z. B. Cicer arietinum), Lens (z. B. Lens
culinaris), Phaseolus (z. B. Phaseolus vulgaris und Phaseolus
coccineus), etc.
Die Expression einer neuen oder zusätzlichen Debranching-En
zymaktivität aus Kartoffel in den erfindungsgemäßen transge
nen Pflanzenzellen und Pflanzen hat einen Einfluß auf den
Verzweigungsgrad des in den Zellen und Pflanzen syntheti
sierten Amylopektins. Daher besitzt eine in diesen Pflanzen
synthetisierte Stärke veränderte physikalische und/oder che
mische Eigenschaften im Vergleich zu Stärke aus
Wildtyp-Pflanzen. Somit betrifft die Erfindung auch die aus den
transgenen Pflanzenzellen oder Pflanzen erhältliche Stärke.
Gegenstand der Erfindung ist ferner Vermehrungsmaterial von
erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen, beispielsweise Samen,
Früchte, Stecklinge, Knollen, Wurzelstöcke etc., wobei die
ses Vermehrungsmaterial oben beschriebene transgene Pflan
zenzellen enthält. Im Fall von Kartoffelpflanzen handelt es
sich bei dem Vermehrungsmaterial vorzugsweise um die Knol
len.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung transgene Pflan
zenzellen von Kartoffel, bei denen die Aktivität des erfin
dungsgemäßen Debranching-Enzyms verringert ist aufgrund der
Inhibition der Transkription oder Translation von endogenen
Nucleinsäuremolekülen, die ein derartiges neues Debranching-Enzym
codieren. Dies wird vorzugsweise dadurch erreicht, daß
ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül oder ein Teil da
von in den entsprechenden Pflanzenzellen in antisense-Orien
tierung exprimiert wird und es aufgrund eines antisense-Ef
fektes zur Verringerung der beschriebenen Debranching-En
zymaktivität kommt. Eine weitere Möglichkeit zur Verringe
rung der Debranching-Enzymaktivität in pflanzlichen Zellen
besteht in der Expression von geeigneten Ribozymen, die spe
zifisch Transkripte der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle spal
ten. Die Herstellung derartiger Ribozyme mit Hilfe der er
findungsgemäßen DNA-Moleküle ist dem Fachmann geläufig. Mög
lich ist auch die Expression von Molekülen, die sowohl einen
antisense- als auch einen Ribozymeffekt in Kombination aus
üben. Alternativ kann die Verringerung der Debranching-En
zymaktivität in den Pflanzenzellen auch durch einen Co
supressionseffekt erfolgen.
Andere Möglichkeiten, die Aktivität der beschriebenen neuen
Debranching-Enzyme in pflanzlichen Zellen zu reduzieren,
sind dem Fachmann bekannt, beispielsweise die Mutagenese ge
nomischer Sequenzen, die derartige Enzyme codieren, z. B.
durch "gene tagging" oder Transposon-Mutagenese oder die Ex
pression von Antikörpern, die spezifisch die neuen
Debranching-Enzyme erkennen. Die Mutagenese genomischer Se
quenzen kann sowohl codierende Bereiche des Gens (Introns
oder Exons) betreffen, als auch regulatorische Bereiche,
insbesondere die für die Initiation der Transkription erfor
derlichen.
Die Erfindung betrifft ferner transgene Kartoffelpflanzen,
die die oben beschriebenen transgenen Pflanzenzellen mit
verringerter Debranching-Enzymaktivität enthalten.
Die Amylopektinstärke der transgenen Zellen und Pflanzen
weist aufgrund der verringerten Debranching-Enzymaktivität
einen veränderten Verzweigungsgrad auf im Vergleich zu
Stärke aus nichttransformierten Pflanzen. Gegenstand der Er
findung ist daher ebenfalls die aus den transgenen Zellen
oder Pflanzen erhältliche modifizierte Stärke.
Die Erfindung betrifft auch Vermehrungsmaterial der vorste
hend beschriebenen transgenen Pflanzen, insbesondere Samen
und Knollen, wobei diese vorstehend beschriebene transgene
Pflanzenzellen enthalten.
Transgene Pflanzenzellen, die aufgrund der Expression einer
neuen oder zusätzlichen Debranching-Enzymaktivität eine Amy
lopektinstärke mit einem veränderten Verzweigungsgrad bilden
im Vergleich zu in Wildtyp-Pflanzen synthetisierter Amylo
pektinstärke, können beispielsweise durch ein Verfahren her
gestellt werden, das folgende Schritte umfaßt:
- (a) Herstellung einer Expressionskassette, die folgende
DNA-Sequenzen umfaßt:
- (i) einen Promotor, der die Transkription in pflanzli chen Zellen gewährleistet;
- (ii) mindestens eine erfindungsgemäße Nucleinsäurese quenz, die ein Protein mit der enzymatischen Akti vität eines Debranching-Enzyms codiert oder ein biologisch aktives Fragment davon und in sense-Orientierung an das 3′-Ende des Promotors gekop pelt ist; und
- (iii) gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Ter mination der Transkription und die Addition eines poly-A-Schwanzes an das entstehende Transkript, das an das 3′-Ende der codierenden Region gekop pelt ist; und
- (b) Transformation pflanzlicher Zellen mit der in Schritt (a) hergestellten Expressionskassette.
Transgene Pflanzenzellen, die aufgrund der Verringerung der
beschriebenen Debranching-Enzymaktivität eine Amylopek
tinstärke mit einem im Vergleich zu in Wildtyp-Pflanzen syn
thetisierter Amylopektinstärke veränderten Verzweigungsgrad
bilden, können beispielsweise durch ein Verfahren herge
stellt werden, das folgende Schritte umfaßt:
- (a) Herstellung einer Expressionskassette, die folgende
DNA-Sequenzen umfaßt:
- (i) einen Promotor, der die Transkription in pflanzli chen Zellen gewährleistet;
- (ii) mindestens eine erfindungsgemäße Nucleinsäurese quenz, die ein Protein mit der enzymatischen Akti vität eines Debranching-Enzyms codiert oder einen Teil eines solchen Proteins und die in antisense-Orientierung an das 3′-Ende des Promotors gekop pelt ist; und
- (iii) gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Ter mination der Transkription und die Addition eines poly-A-Schwanzes an das entstehende Transkript, das an das 3′-Ende der codierenden Region gekop pelt ist; und
- (b) Transformation pflanzlicher Zellen mit der in Schritt (a) hergestellten Expressionskassette.
Für den unter (i) genannten Promotor kommt im Prinzip jeder
in den für die Transformation gewählten Pflanzen funktionale
Promotor in Betracht. Der Promotor kann homolog oder hetero
log in bezug auf die verwendete Pflanzenspezies sein. Ge
eignet ist beispielsweise der 35S-Promotor des
Cauliflower-Mosaik-Virus (Odell et al., Nature 313 (1985), 810-812), der
eine konstitutive Expression in allen Geweben einer Pflanze
gewährleistet und das in der WO/9401571 beschriebene Promo
torkonstrukt. Ein anderes Beispiel sind die Promotoren der
Polyubiquitingene aus Mais (Christensen et al., Plant Mol.
Biol. 18 (1992) 675-689. Es können jedoch auch Promotoren
verwendet werden, die nur zu einem durch äußere Einflüsse
determinierten Zeitpunkt (siehe beispielsweise WO/9307279).
Von besonderem Interesse können hierbei Promotoren von heat
shock-Proteinen sein, die eine einfache Induktion erlauben.
Ferner können die Promotoren verwendet werden, die in einem
bestimmten Gewebe der Pflanze zu einer Expression nachge
schalteter Sequenzen führen (siehe z. B. Stockhaus et al.,
EMBO J. 8 (1989), 2245-2251). Präferentiell werden Promoto
ren eingesetzt, die in den stärkespeichernden Organen der zu
transformierenden Pflanzen aktiv sind. Dies sind z. B. bei
Mais die Maiskörner, während es bei der Kartoffel die Knol
len sind. Zur Überexpression der erfindungsgemäßen Nuclein
säuremoleküle in der Kartoffel kann beispielsweise der
knollenspezifische B33-Promotor (Rocha-Sosa et al., EMBO J.
8 (1989), 23-29) verwendet werden.
Samenspezifische Promotoren sind bereits für verschiedene
Pflanzenspezies beschrieben worden. So z. B. der USP-Promotor
aus Vicia faba, der eine samenspezifische Expression in V.
faba und anderen Pflanzen gewährleistet (Fiedler et al.,
Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Bäumlein et al., Mol
Gen. Genet. 225 (1991), 459-467). In Mais gewährleisten bei
spielsweise Promotoren der Zein-Gene eine spezifische Ex
pression im Endosperm der Maiskörner (Pedersen et al., Cell
29 (1982), 1015-1026; Quattrocchio et al., Plant Mol. Biol.
15 (1990), 81-93).
In dem Fall, daß die unter Verfahrensschritt (a) (ii) ge
nannte, Nucleinsäuresequenz, die ein Protein mit der enzyma
tischen Aktivität eines Debranching-Enzyms aus Kartoffel co
diert, in sense-Orientierung mit dem Promotor verknüpft ist,
kann diese Nucleinsäuresequenz sowohl nativen bzw. homologen
Ursprungs als auch fremden bzw. heterologen Ursprungs in be
zug auf die zu transformierende Pflanzenspezies sein, d. h.
es können sowohl Kartoffelpflanzen als auch beliebige andere
Pflanzen mit der beschriebenen Expressionskassette transfor
miert werden, vorzugsweise die obengenannten stärkespei
chernden Pflanzen.
Es besteht grundsätzlich die Möglichkeit, daß das syntheti
sierte Protein in jedem beliebigen Kompartiment der pflanz
lichen Zelle lokalisiert sein kann. Pflanzliche Debranching-Enzyme
sind in der Regel in den Plastiden lokalisiert und
besitzen daher eine Signalsequenz für die Translokation in
diese Organellen. Um die Lokalisation in einem anderen Kom
partiment der Zelle zu erreichen, muß die DNA-Sequenz, die
diese Signalsequenz codiert, entfernt werden und die codie
rende Region mit DNA-Sequenzen verknüpft werden, die die Lo
kalisierung in dem jeweiligen Kompartiment gewährleisten.
Derartige Sequenzen sind bekannt (Siehe beispielsweise Braun
et al., EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald et al.,
Plant J. 1 (1991), 95-106).
In dem Fall, daß die unter Verfahrensschritt (a) (ii) ge
nannte Nucleinsäuresequenz aus Kartoffel, die ein Protein
mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms co
diert, in antisense-Orientierung mit dem Promotor verknüpft
ist, handelt es sich bei dieser vorzugsweise um eine
Nucleinsäuresequenz homologen Ursprungs in bezug auf die zu
transformierende Pflanzen. Es können jedoch auch Nucleinsäu
resequenzen verwendet werden, die einen hohen Grad an Homo
logie zu endogen vorhandenen Debranching-Enzym-Genen haben,
insbesondere Homologien höher als 80%, vorzugsweise Homolo
gien zwischen 90% und 100% und besonders bevorzugt Homolo
gien über 95%.
Es können Sequenzen bis zu einer Mindestlänge von 15 bp ver
wendet werden. Eine inhibierende Wirkung ist aber auch bei
der Verwendung kürzerer Sequenzen nicht ausgeschlossen. Be
vorzugt werden längere Sequenzen zwischen 100 und 500 Basen
paaren verwendet, für eine effiziente antisense-Inhibition
werden insbesondere Sequenzen mit einer Länge über 500 Ba
senpaaren verwendet. In der Regel werden Sequenzen verwen
det, die kürzer als 5000 Basenpaare sind, bevorzugt Sequen
zen, die kürzer als 2500 Basenpaare sind.
Terminationssignale für die Transkription in pflanzlichen
Zellen sind beschrieben und sind beliebig gegeneinander aus
tauschbar. Verwendet werden kann beispielsweise die Termina
tionssequenz des Octopinsynthase-Gens aus Agrobacterium
tumefaciens.
Der Transfer der gemäß Verfahrensschritt (a) konstruierten
Expressionskassette in pflanzliche Zellen erfolgt vorzugs
weise unter Verwendung von Plasmiden, insbesondere mit Hilfe
von Plasmiden, die eine stabile Integration der Expressions
kassette in das pflanzliche Genom gewährleisten.
Das oben beschriebene Verfahren zur Überexpression eines
neuen Debranching-Enzyms aus Kartoffel kann prinzipiell auf
alle Pflanzenspezies angewendet werde. Von Interesse sind
sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen, insbesondere
die oben beschriebenen stärkespeichernden Pflanzen. Das oben
beschriebene Verfahren zur Reduktion der Debranching-En
zymaktivität wird bevorzugt aufzweikeimblättrige Pflanzen,
insbesondere auf Kartoffel angewandt.
Infolge der Einführung einer gemäß den beschriebenen Verfah
ren konstruierten Expressionskassette kommt es in den trans
formierten Pflanzenzellen zur Bildung einer RNA. Ist die ein
Debranching-Enzym aus Kartoffel codierende Nucleinsäurese
quenz in der Expressionskassette in sense-Orientierung mit
dem Promotor verknüpft, kommt es zur Synthese einer mRNA,
die als Matrize für die Synthese eines zusätzlichen oder
neuen Debranching-Enzyms aus Kartoffel in den pflanzlichen
Zellen dienen kann. Als Folge davon weisen diese Zellen eine
Aktivität bzw. eine erhöhte Aktivität des Debranching-Enzyms
aus Kartoffel auf, was zu einer Veränderung des Verzwei
gungsgrades des in den Zellen gebildeten Amylopektins führt.
Dadurch wird eine Stärke zugänglich, die sich gegenüber der
natürlich vorkommenden Stärke durch eine stärker geordnete
Raumstruktur sowie eine gesteigerte Einheitlichkeit aus
zeichnet. Dies kann unter anderem günstige Auswirkungen auf
die Filmbildungseigenschaften haben.
Ist die ein Debranching-Enzym aus Kartoffel codierende
Nucleinsäuresequenz dagegen in antisense-Orientierung mit
dem Promotor verknüpft, so kommt es in transgenen Pflanzen
zellen zur Synthese einer antisense-RNA, die die Expression
von endogenen Debranching-Enzym-Genen inhibiert. Als Folge
weisen diese Zellen eine reduzierte Aktivität des neuen
Debranching-Enzyms aus Kartoffel auf, was zur Bildung einer
modifizierten Stärke führt. Mit Hilfe der antisense-Technik
ist es möglich Pflanzen herzustellen, bei denen die Expres
sion eines endogenen Debranching-Enzym-Gens in Kartoffel in
unterschiedlichem Maße inhibiert ist in einem Bereich von 0%
bis zu 100%. Dies ermöglicht insbesondere die Herstellung
von Kartoffelpflanzen, die Amylopektinstärke mit verschie
densten Variationen im Verzweigungsgrad synthetisieren. Dies
stellt einen Vorteil gegenüber herkömmlichen Züchtungs- und
Mutageneseverfahren dar, bei denen die Bereitstellung einer
derartigen Vielfalt nur mit erheblichem Zeit- und Kostenauf
wand möglich ist. Stark verzweigtes Amylopektin hat eine be
sonders große Oberfläche und eignet sich dadurch als Copoly
mer in besonderem Maße. Ein starker Verzweigungsgrad führt
außerdem zu einer Verbesserung der Wasserlöslichkeit des
Amylopektins. Diese Eigenschaft ist für bestimmte technische
Anwendungen sehr vorteilhaft.
Besonders geeignet für die Produktion von verändertem Amylo
pektin unter Ausnutzung der erfindungsgemäßen Nucleinsäure
moleküle die Debranching-Enzyme codieren ist Kartoffel. Die
Anwendung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Pflanzen
spezies beschränkt. Für die Überexpression kann jede belie
bige andere Pflanzenspezies verwendet werden.
Die in den transgenen Pflanzen synthetisierte modifizierte
Stärke kann mittels gängiger Methoden aus den Pflanzen oder
aus den Pflanzenzellen isoliert und nach der Reinigung zur
Herstellung von Nahrungsmitteln und industriellen Produkten
verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Stärken können nach dem Fachmann be
kannten Verfahren modifiziert werden und eignen sich in un
modifizierter oder modifizierter Form für verschiedene Ver
wendungen im Nahrungsmittel- oder Nicht-Nahrungsmittelbe
reich.
Grundsätzlich läßt sich die Einsatzmöglichkeit der Stärke in
zwei große Bereiche unterteilen. Der eine Bereich umfaßt die
Hydrolyseprodukte der Stärke, hauptsächlich Glucose und Glu
canbausteine, die über enzymatische oder chemische Verfahren
erhalten werden. Sie dienen als Ausgangsstoff für weitere
chemische Modifikationen und Prozesse, wie Fermentation. Für
eine Reduktion der Kosten kann hierbei die Einfachheit und
kostengünstige Ausführung eines Hydrolyseverfahrens von Be
deutung sein. Gegenwärtig verläuft es im wesentlichen enzy
matisch unter Verwendung von Amyloglucosidase. Vorstellbar
wäre eine Kosteneinsparung durch einen geringeren Einsatz
von Enzymen. Eine Strukturveränderung der Stärke, z. B. Ober
flächenvergrößerung des Korns, leichtere Verdaulichkeit
durch geringeren Verzweigungsgrad oder eine sterische Struk
tur, die die Zugänglichkeit für die eingesetzten Enzyme be
grenzt, könnte dies bewirken.
Der andere Bereich, in dem die Stärke wegen ihrer polymeren
Struktur als sogenannte native Stärke verwendet wird, glie
dert sich in zwei weitere Einsatzgebiete:
Stärke ist ein klassischer Zusatzstoff für viele Nah
rungsmittel, bei denen sie im wesentlichen die Funktion
des Bindens von wäßrigen Zusatzstoffen übernimmt bzw.
eine Erhöhung der Viskosität oder aber eine erhöhte
Gelbildung hervorruft. Wichtige Eigenschaftsmerkmale
sind das Fließ- und Sorptionsverhalten, die Quell- und
Verkleisterungstemperatur, die Viskosität und Dickungs
leistung, die Löslichkeit der Stärke, die Transparenz
und Kleisterstruktur, die Hitze-, Scher- und Säuresta
bilität, die Neigung zur Retrogradation, die Fähigkeit
zur Filmbildung, die Gefrier/Taustabilität, die Verdau
lichkeit sowie die Fähigkeit zur Komplexbildung mit
z. B. anorganischen oder organischen Ionen.
In diesem großen Bereich kann die Stärke als Hilfsstoff
für unterschiedliche Herstellungsprozesse bzw. als Zu
satzstoff in technischen Produkten eingesetzt. Bei der
Verwendung der Stärke als Hilfsstoff ist hier insbeson
dere die Papier- und Pappeindustrie zu nennen. Die
Stärke dient dabei in erster Linie zur Retardation (Zu
rückhaltung von Feststoffen), der Abbindung von Füll
stoff- und Feinstoffteilchen, als Festigungsstoff und
zur Entwässerung. Darüber hinaus werden die günstigen
Eigenschaften der Stärke in bezug auf die Steifigkeit,
die Härte, den Klang, den Griff, den Glanz, die Glätte,
die Spaltfestigkeit sowie die Oberflächen ausgenutzt.
Innerhalb des Papierherstellungsprozesses sind vier An
wendungsbereiche, nämlich Oberfläche, Strich, Masse und
Sprühen, zu unterscheiden.
Die Anforderungen an die Stärke in bezug auf die Ober
flächenbehandlung sind im wesentlichen ein hoher Weiße
grad, eine angepaßte Viskosität, eine hohe Viskositäts
stabilität, eine gute Filmbildung sowie eine geringe
Staubbildung. Bei der Verwendung im Strich spielt der
Feststoffgehalt, eine angepaßte Viskosität, ein hohes
Bindevermögen sowie eine hohe Pigmentaffinität eine
wichtige Rolle. Als Zusatz zur Masse ist eine rasche,
gleichmäßige, verlustfreie Verteilung, eine hohe mecha
nische Stabilität und eine vollständige Zurückhaltung
im Papierfließ von Bedeutung. Beim Einsatz der Stärke
im Sprühbereich sind ebenfalls ein angepaßter Fest
stoffgehalt, hohe Viskosität sowie ein hohes Bindever
mögen von Bedeutung.
Ein großer Einsatzbereich der Stärken besteht in der
Klebstoffindustrie, wo man die Einsatzmöglichkeiten in
vier Teilbereiche gliedert: die Verwendung als reinem
Stärkeleim, die Verwendung bei mit speziellen Chemika
lien aufbereiteten Stärkeleimen, die Verwendung von
Stärke als Zusatz zu synthetischen Harzen und Polymer
dispersionen sowie die Verwendung von Stärken als
Streckmittel für synthetische Klebstoffe. 90% der
Klebstoffe auf Stärkebasis werden in den Bereichen
Wellpappenherstellung, Herstellung von Papiersäcken,
Beuteln und Tüten, Herstellung von Verbundmaterialien
für Papier und Aluminium, Herstellung von Kartonagen
und Wiederbefeuchtungsleim für Briefumschläge, Brief
marken usw. eingesetzt.
Ein großes Einsatzfeld für die Stärken als Hilfmittel
und Zusatzstoff ist der Bereich Herstellung von Tex
tilien und Textilpflegemitteln. Innerhalb der Textilin
dustrie sind die folgenden vier Einsatzbereiche zu un
terscheiden: Der Einsatz der Stärke als Schlichtmittel,
d. h. als Hilfstoff zur Glättung und Stärkung des Klett
verhaltens zum Schutz gegen die beim Weben angreifenden
Zugkräfte sowie zur Erhöhung der Abriebfestigkeit beim
Weben, Stärke als Mittel zur Textilaufrüstung vor allem
nach qualitätsverschlechternden Vorbehandlungen, wie
Bleichen, Färben usw., Stärke als Verdickungsmittel bei
der Herstellung von Farbpasten zur Verhinderung von
Farbstoffdiffusionen sowie Stärke als Zusatz zu Ket
tungsmitteln für Nähgarne.
Der vierte Einsatzbereich ist die Verwendung der Stär
ken als Zusatz bei Baustoffen. Ein Beispiel ist die
Herstellung von Gipskartonplatten, bei der die im Gips
brei vermischte Stärke mit dem Wasser verkleistert, an
die Oberfläche der Gipsplatte diffundiert und dort den
Karton an die Platte bindet. Weitere Einsatzbereiche
sind die Beimischung zu Putz- und Mineralfasern. Bei
Transportbeton werden Stärkeprodukte zur Verzögerung
der Abbindung eingesetzt.
Ein weiterer Markt für die Stärke bietet sich bei der
Herstellung von Mitteln zur Bodenstabilisation an, die
bei künstlichen Erdbewegungen zum temporären Schutz der
Bodenpartikel gegenüber Wasser eingesetzt werden. Kom
binationsprodukte aus der Stärke und Polymeremulsionen
sind nach heutiger Kenntnis in ihrer Erosions- und ver
krustungsmindernden Wirkung den bisher eingesetzten
Produkten gleichzusetzen, liegen preislich aber deut
lich unter diesen.
Ein Einsatzbereich liegt bei der Verwendung der Stärke
in Pflanzenschutzmitteln zur Veränderung der spezifi
schen Eigenschaften der Präparate. So kann die Stärke
zur Verbesserung der Benetzung von Pflanzenschutz- und
Düngemitteln, zur dosierten Freigabe der Wirkstoffe,
zur Umwandlung flüssiger, flüchtiger und/oder übelrie
chender Wirkstoffe in mikrokristalline, stabile, form
bare Substanzen, zur Mischung inkompatibler Verbindun
gen und zur Verlängerung der Wirkdauer durch Verminde
rung der Zersetzung eingesetzt werden.
Ein weiteres Einsatzgebiet besteht im Bereich der Phar
maka, Medizin und Kosmetikindustrie. In der pharmazeu
tischen Industrie kann die Stärke als Bindemittel für
Tabletten oder zur Bindemittelverdünnung in Kapseln
eingesetzt werden. Weiterhin kann die Stärke als Ta
blettensprengmittel dienen, da sie nach dem Schlucken
Flüssigkeit absorbieren und nach kurzer Zeit soweit
quellen, daß der Wirkstoff freigesetzt wird. Medizini
sche Gleit- und Wundpuder basieren aus qualitativen
Gründen auf Stärke. Im Bereich der Kosmetik werden
Stärken beispielsweise als Träger von Puderzusatzstof
fen, wie Düften und Salicylsäure eingesetzt. Ein rela
tiv großer Anwendungsbereich für die Stärke liegt bei
Zahnpasta.
Einen Einsatzbereich bietet die Stärke als Zusatzstoff
zu Kohle und Brikett. Kohle kann mit einem Stärkezusatz
quantitativ hochwertig agglomeriert bzw. brikettiert
werden, wodurch ein frühzeitiges Zerfallen der Briketts
verhindert wird. Der Stärkezusatz liegt bei Grillkohle
zwischen 4 und 6%, bei kalorierter Kohle zwischen 0,1
und 0,5%. Des weiteren gewinnen Stärken als Bindemit
tel an Bedeutung, da durch ihren Zusatz zu Kohle und
Brikett der Ausstoß schädlicher Stoffe deutlich vermin
dert werden kann.
Die Stärke kann ferner bei der Erz- und Kohleschlamm
aufbereitung als Flockungsmittel eingesetzt werden.
Ein weiterer Einsatzbereich besteht als Zusatz zu
Gießereihilfsstoffen. Bei verschiedenen Gußverfahren
werden Kerne benötigt, die aus Bindemittel-versetzten
Sänden hergestellt werden. Als Bindemittel wird heute
überwiegend Bentonit eingesetzt, das mit modifizierten
Stärken, meist Quellstärken, versetzt ist.
Zweck des Stärkezusatzes ist die Erhöhung der Fließfe
stigkeit sowie die Verbesserung der Bindefestigkeit.
Darüber hinaus können die Quellstärken weitere produk
tionstechnische Anforderungen, wie im kalten Wasser
dispergierbar, rehydratisierbar, gut in Sand mischbar
und hohes Wasserbindungsvermögen, aufweisen.
In der Kautschukindustrie kann die Stärke zur Verbesse
rung der technischen und optischen Qualität eingesetzt
werden. Gründe sind dabei die Verbesserung des Oberflä
chenglanzes, die Verbesserung des Griffs und des Ausse
hens, dafür wird Stärke vor der Kaltvulkanisation auf
die klebrigen gummierten Flächen von Kautschukstoffen
gestreut, sowie die Verbesserung der Bedruckbarkeit des
Kautschuks.
Eine weitere Absatzmöglichkeit der modifizierten Stär
ken besteht bei der Herstellung von Lederersatzstoffen.
Auf dem Kunststoffsektor zeichnen sich folgende Ein
satzgebiete ab: die Einbindung von Stärkefolgeprodukten
in den Verarbeitungsprozeß (Stärke ist nur Füllstoff,
es besteht keine direkte Bindung zwischen synthetischem
Polymer und Stärke) oder alternativ die Einbindung von
Stärkefolgeprodukten in die Herstellung von Polymeren
(Stärke und Polymer gehen eine feste Bindung ein).
Die Verwendung der Stärke als reinem Füllstoff ist vergli
chen mit den anderen Stoffen wie Talkum nicht wettbewerbsfä
hig. Anders sieht es aus, wenn die spezifischen Stärkeeigen
schaften zum Tragen kommen und hierdurch das Eigen
schaftsprofil der Endprodukte deutlich verändert wird. Ein
Beispiel hierfür ist die Anwendung von Stärkeprodukten bei
der Verarbeitung von Thermoplasten, wie Polyäthylen. Hierbei
werden die Stärke und das synthetische Polymer durch Koex
pression im Verhältnis von 1 : 1 zu einem ′master batch′
kombiniert, aus dem mit granuliertem Polyäthylen unter An
wendung herkömmlicher Verfahrenstechniken diverse Produkte
hergestellt werden. Durch die Einbindung von Stärke in Poly
äthylenfolien kann eine erhöhte Stoffdurchlässigkeit bei
Hohlkörpern, eine verbesserte Wasserdampfdurchlässigkeit,
ein verbessertes Antistatikverhalten, ein verbessertes Anti
blockverhalten sowie eine verbesserte Bedruckbarkeit mit
wäßrigen Farben erreicht werden.
Eine andere Möglichkeit ist die Anwendung der Stärke in Po
lyurethanschäumen. Mit der Adaption der Stärkederivate sowie
durch die verfahrenstechnische Optimierung ist es möglich,
die Reaktion zwischen synthetischen Polymeren und den Hydro
xygruppen der Stärken gezielt zu steuern. Das Ergebnis sind
Polyurethanfolien, die durch die Anwendung von Stärke fol
gende Eigenschaftsprofile erhalten: eine Verringerung des
Wärmeausdehnungskoeffizienten, Verringerung des Schrumpfver
haltens, Verbesserung des Druck/Spannungsverhaltens, Zunahme
der Wasserdampfdurchlässigkeit ohne Veränderung der Wasser
aufnahme, Verringerung der Entflammbarkeit und der Aufriß
dichte, kein Abtropfen brennbarer Teile, Halogenfreiheit und
verminderte Alterung. Nachteile, die gegenwärtig noch vor
handen sind, sind verringerte Druckfestigkeit sowie eine
verringerte Schlagfestigkeit.
Die Produktentwicklung beschränkt sich inzwischen nicht mehr
nur auf Folien. Auch feste Kunststoffprodukte, wie Töpfe,
Platten und Schalen, sind mit einem Stärkegehalt von über 50%
herzustellen. Des weiteren sind Stärke/Polymermischungen
günstig zu beurteilen, da sie eine sehr viel höhere biologi
sche Abbaubarkeit aufweisen.
Außerordentliche Bedeutung haben weiterhin auf Grund ihres
extremen Wasserbindungsvermögen Stärkepfropfpolymerisate ge
wonnen. Dies sind Produkte mit einem Rückgrat aus Stärke und
einer nach dem Prinzip des Radikalkettenmechanismus auf
gepfropften Seitengitters eines synthetischen Monomers. Die
heute verfügbaren Stärkepfropfpolymerisate zeichnen sich
durch ein besseres Binde- und Rückhaltevermögen von bis zu
1000 g Wasser pro g Stärke bei hoher Viskosität aus. Die An
wendungsbereiche für diese Superabsorber haben sich in den
letzten Jahren stark ausgeweitet und liegen im Hygienebe
reich mit Produkten Windeln und Unterlagen sowie im land
wirtschaftlichen Sektor, z. B. bei Saatgutpillierungen.
Entscheidend für den Einsatz der neuen, gentechnisch verän
derten Stärken sind zum einen die Struktur, Wassergehalt,
Proteingehalt, Lipidgehalt, Fasergehalt,
Asche/Phosphatgehalt, Amylose/Amylopektinverhältnis, Molmas
senverteilung, Verzweigungsgrad, Korngröße und -form sowie
Kristallinität, zum anderen auch die Eigenschaften, die in
folgende Merkmale münden: Fließ- und Sorptionsverhalten,
Verkleisterungstemperatur, Viskosität, Dickungsleistung,
Löslichkeit, Kleisterstruktur und -transparenz, Hitze-,
Scher- und Säurestabilität, Retrogradationsneigung, Gelbil
dung, Gefrier/Taustabilität, Komplexbildung, Jodbindung,
Filmbildung, Klebekraft, Enzymstabilität, Verdaulichkeit und
Reaktivität.
Die Erzeugung modifizierter Stärken mittels gentechnischer
Eingriffe in einer transgenen Pflanze kann zum einen die
Eigenschaften der aus der Pflanze gewonnenen Stärke dahinge
hend verändern, daß weitere Modifikationen mittels chemi
scher oder physikalischer Verfahren nicht mehr notwendig er
scheinen. Zum anderen können die durch gentechnische Verfah
ren veränderte Stärken weiteren chemischen Modifikationen
unterworfen werden, was zu weiteren Verbesserungen der Qua
lität für bestimmte der oben beschriebenen Einsatzgebiete
führt. Diese chemischen Modifikationen sind grundsätzlich
bekannt. Insbesondere handelt es sich dabei um Modifikatio
nen durch
- - Hitzebehandlung,
- - Säurebehandlung,
- - Oxidation und
- - Veresterungen,
welche zur Entstehung von Phosphat-, Nitrat-, Sulfat-,
Xanthat-, Acetat- und Citratstärken führen. Weitere organi
sche Säuren können ebenfalls zur Veresterung eingesetzt wer
den:
- - Erzeugung von Stärkeethern Stärke-Alkylether, O-Allylether, Hydroxylalkylether, O-Carboxylmethylether, N-haltige Stärkeether, P-haltige Stärkeether, S-haltige Stärkeether
- - Erzeugung von vernetzten Stärken
- - Erzeugung von Stärke-Pfropf-Polymerisaten
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können prinzipi
ell ferner auch dazu verwendet werden, Pflanzen herzustel
len, bei denen die Aktivität des erfindungsgemäßen
Debranching-Enzyms erhöht oder verringert ist und gleichzei
tig die Aktivitäten anderer, an der Stärkebiosynthese betei
ligter Enzyme verändert sind. Dabei sind alle Kombinationen
und Permutationen denkbar. Beispielsweise können Nucleinsäu
remoleküle, die für ein erfindungsgemäßes Protein codieren
oder entsprechende antisense-Konstrukte, in Pflanzenzellen
eingebracht werden, bei denen bereits die Synthese endogener
Debranching-Enzyme, GBSS I-, SSS I-, II- oder GBSS II-Pro
teine aufgrund eines antisense-Effektes oder einer Mutation
inhibiert ist oder die Synthese des Verzweigungsenzyms inhi
biert ist (wie z. B. beschrieben in WO 92/14827 oder der
ae-Mutante von Mais (Shannon und Garwood, in Whistler, BeMiller
und Paschall, Starch: Chemistry and Technology, Academic
Press, London, 2nd Edition (1984), 25-86)).
Soll die Inhibierung der Synthese mehrerer Debranching-Enzyme
in transformierten Pflanzen erreicht werden, so kön
nen DNA-Moleküle zur Transformation verwendet werden, die
gleichzeitig mehrere, die entsprechenden Debranching-Enzyme
codierenden Regionen in antisense-Orientierung unter der
Kontrolle eines geeigneten Promotors enthalten. Hierbei kann
alternativ jede Sequenz unter der Kontrolle eines eigenen
Promotors stehen, oder die Sequenzen können als Fusion von
einem gemeinsamen Promotor transkribiert werden. Letztere
Alternative wird in der Regel vorzuziehen sein, da in diesem
Fall die Synthese der entsprechenden Proteine in etwa glei
chem Maße inhibiert werden sollte.
Weiterhin ist die Konstruktion von DNA-Molekülen möglich,
bei denen neben DNA-Sequenzen, die Debranching-Enzyme codie
ren, weitere DNA-Sequenzen, die andere Proteine, die an der
Stärkesynthese oder -modifikation beteiligt sind, in anti
sense-Orientierung an einem geeigneten Promotor gekoppelt
sind. Die Sequenzen können hierbei wiederum hintereinander
geschaltet sein und von einem gemeinsamen Promotor transkri
biert werden. Für die Länge der einzelnen codierenden Regio
nen, die in einem derartigen Konstrukt verwendet werden,
gilt das, was oben bereits für die Herstellung von anti
sense-Konstrukten ausgeführt wurde. Eine obere Grenze für
die Anzahl der in einem derartigen DNA-Molekül von einem
Promotor aus transkribierten antisense-Fragmente gibt es
nicht. Das entstehende Transkript sollte aber in der Regel
eine Länge von nicht mehr als 20 kb, vorzugsweise von nicht
mehr als 5 kb haben.
Codierende Regionen, die in derartigen DNA-Molekülen in Kom
bination mit anderen codierenden Regionen in anti
sense-Orientierung hinter einem geeigneten Promotor lokalisiert
sind, können aus DNA-Sequenzen stammen, die für folgende
Proteine codieren: Stärkekorn-gebundene (GBSS I und II) und
lösliche Stärkesynthasen (z. B. SSS I und II), Verzweigungs
enzyme, andere Debranching-Enzyme, Disproportionierungsen
zyme und Stärkephosphorylasen. Dies ist nur eine beispiel
hafte Aufzählung. Auch die Verwendung anderer DNA-Sequenzen
im Rahmen einer derartigen Kombination ist denkbar.
Mit Hilfe derartiger Konstrukte ist es möglich, in Pflanzen
zellen, die mit diesen transformiert wurde, die Synthese
mehrerer Enzyme gleichzeitig zu inhibieren.
Weiterhin können die Konstrukte in klassische Mutanten ein
gebracht werden, die für ein oder mehrere Gene der Stärke
biosynthese defekt sind. Diese Defekte können sich z. B. auf
folgende Proteine beziehen: Stärkekorn-gebundene (GBSS I und
II) und lösliche Stärkesynthasen (z. B. SSS I und II), Ver
zweigungsenzyme (BE I und II), Debranching-Enzyme, Dispro
portionierungsenzyme und Stärkephosphorylasen. Dies ist wie
derum nur eine beispielhafte Aufzählung.
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere
Pflanzen stehen eine große Anzahl von Clonierungsvektoren
zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E.coli und ein
Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen ent
halten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322,
pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz
kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den
Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die
Transformation von E.coli-Zellen verwendet. Transformierte
E.coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet,
anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wieder
gewonnen. Als Analysemethode zur Charakterisierung der ge
wonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsana
lysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-molekular
biologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation
kann die Plasmid DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente
mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden. Jede
Plasmid-DNA-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden clo
niert werden.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle
stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese
Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen
mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens
oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die
Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation
von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen
Methode sowie weitere Möglichkeiten.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzen
zellen werden an sich keine speziellen Anforderungen an die
verwendeten Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide
wie z. B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus der
artig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert wer
den, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens
notwendig.
Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzen
zelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden
z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder
Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begren
zung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der Ti- und
Ri-Plasmid T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführen
den Genen verbunden werden.
Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß
die einzuführende DNA in spezielle Plasmide cloniert werden,
und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in
einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können auf
grund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA
sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plas
mid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält
außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Re
gion. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien
replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der interme
diäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden
(Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als
auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selek
tionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von
der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden.
Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden
(Holsters et al. Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). Das
als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das
eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den
Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzli
che T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte
Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen
verwendet.
Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflan
zenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in
EP 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offset
drukkerÿ Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V;
Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46 und An et al.
EMBO LT. 4 (1985), 277-287 beschrieben worden.
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflan
zen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium
tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert wer
den. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke,
Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Sus
pensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem
geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Se
lektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze
Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen kön
nen dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht
werden. Andere Möglichkeiten der Einführung fremder DNA un
ter Verwendung des biolistischen Verfahrens oder durch Pro
toplastentransformation sind bekannt (vgl. z. B. Willmitzer,
L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-
Volume Comprehensive Treatise (H.LT. Rehm, G. Reed, A.
Pühler, P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New
York-Basel-Cambridge).
Während die Transformation dikotyler Pflanzen über Ti-Plas
mid-Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens
wohl etabliert ist, weisen neuere Arbeiten darauf hin, daß
auch monokotyle Pflanzen der Transformation mittels Agrobac
terium basierender Vektoren sehr wohl zugänglich sind (Chan
et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei et al.,
Plant LT. 6 (1994), 271-282, Deng et al., Science in China 33
(1990), 28-34; Wilmink et al, Plant Cell Reports 11 (1992),
76-80; May et al., Bio/Technology 13 (1995), 486-492; Conner
und Domisse; Int. LT. Plant Sci. 153 (1992), 550-555; Ritchie
et al., Transgenic Res. 2 (1993), 252-265).
Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen
Pflanzen sind die Transformation mittels des biolistischen
Ansatzes (Wan und Lemaux, Plant Physiol. 104 (1994), 37-48;
Vasil et al., Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558; Ritala et
al., Plant Mol. Biol. 24 (1994), 317-325; Spencer et al.,
Theor. Appl. Genet. 79 (1990), 625-631), die Protoplasten
transformation, die Elektroporation von partiell permeabili
sierten Zellen, die Einbringung von DNA mittels Glasfasern.
Spezifisch die Transformation von Mais wird in der Literatur
verschiedentlich beschrieben (vgl. z. B. WO 95/06128,
EP 0 513 849; EP 0 465 875; Fromm et al., Biotechnology 8
(1990), 833-844; Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2 (1990),
603-618; Koziel et al., Biotechnology 11 (1993), 194-200)
In EP 292 435 wird ein Verfahren beschrieben, mit Hilfe des
sen, ausgehend von einem schleimlosen, weichen (friable)
granulösen Mais-Kallus, fertile Pflanzen erhalten werden
können. Shillito et al. (Bio/Technology 7 (1989), 581) haben
in diesem Zusammenhang beobachtet, daß es ferner für die Re
generierbarkeit zu fertilen Pflanzen notwendig ist, von Kal
lus-Suspensionskulturen auszugehen, aus denen eine sich tei
lende Protoplastenkultur, mit der Fähigkeit zu Pflanzen zu
regenerieren, herstellbar ist. Nach einer in vitro Kultivie
rungszeit von 7 bis 8 Monaten erhalten Shillito et al.
Pflanzen mit lebensfähigen Nachkommen, die jedoch Abnormali
täten in der Morphologie und der Reproduktivität aufweisen.
Prioli und Söndahl (Bio/Technology 7 (1989), 589) beschrei
ben die Regeneration und die Gewinnung fertiler Pflanzen aus
Mais-Protoplasten der Cateto Mais-Inzuchtlinie Cat 100-1.
Die Autoren vermuten, daß die Protoplasten-Regeneration zu
fertilen Pflanzen abhängig ist von einer Anzahl verschiede
ner Faktoren, wie z. B. von Genotyp, vom physiologischen Zu
stand der Donor-Zellen und von den Kultivierungsbedingungen.
Auch die erfolgreiche Transformation anderer Getreidearten
wurde bereits beschrieben, z. B. für Gerste (Wan und Lemaux,
s. o.; Ritala et al., s. o.) und für Weizen (Nehra et al.,
Plant J. 5 (1994), 285-297).
Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle
integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt
auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten
Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektions
marker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz ge
genüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin,
G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin u. a. ver
mittelt. Der individuelle gewählte Marker sollte daher die
Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die
eingeführte DNA fehlt, gestatten.
Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in
der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al., Plant Cell
Reports 5 (1986), 81-84). Die resultierenden Pflanzen können
normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche
transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen,
gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen
haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften. Von
den Pflanzenzellen können Samen gewonnen werden.
Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden,
um sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil
beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet
werden, um sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp
oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.
Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der erfindungs
gemäßen Nucleinsäuremoleküle zur Herstellung von Pflanzen,
die eine Amylopektinstärke mit einem veränderten Verzwei
gungsgrad im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen synthetisieren.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die
Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder
Teile dieser Moleküle bzw. der reversen Komplemente dieser
Moleküle zur Identifizierung und Isolierung homologer Mole
küle, die Proteine mit der enzymatischen Aktivität eines De
branching-Enzyms codieren oder Fragmente derartiger Pro
teine, aus Pflanzen oder anderen Organismen. Für die Defini
tion des Begriffs "Homologie" siehe oben.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
In den Beispielen werden die folgenden Methoden verwendet:
Zur Clonierung in E.coli wurde der Vektor pBluescript II
SK (Stratagene) verwendet.
Für den Bluescript-Vektor und für die pUSP-Konstrukte
wurde der E.coli-Stamm DH5α (Bethesda Research Laborato
ries, Gaithersburgh, USA) verwendet. Für die in vivo
excision wurde der E.coli-Stamm XL1-Blue verwendet.
Die radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten wurde mit
Hilfe eines DNA-Random Primer Labelling Kits der Firma
Boehringer (Deutschland) nach den Angaben des Herstel
lers durchgeführt.
Zur Isolierung von cDNA-Molekülen, die ein neues
Debranching-Enzym aus Solanum tuberosum codieren, wurde eine
cDNA-Bibliothek ausgehend von polyA⁺-RNA aus Knollenmaterial
in dem Vektor Lambda ZAPII (Stratagene) erstellt und in
Phagenköpfe verpackt. E. coli-Zellen des Stammes XL1-Blue
wurden anschließend mit den die cDNA-Fragmente enthaltenden
Phagen infiziert (1 × 10⁶ pfu) und auf Medium in Petrischa
len in einer Dichte von ca. 30 000 pro 75 cm² ausplattiert.
Nach ca. 8 stündiger Inkubation wurden Nitrozellulosemembra
nen auf den lysierten Bakterienrasen aufgelegt, die nach
einer Minute abgenommen wurden. Die Filter wurden für 2 min
in 0,5 M NaOH; 1,5 M NaCl, dann für 2 min in 0,5 M Tris/HCl
pH 7,0 und anschließend für 2 min in 2 × SSC inkubiert. Nach
Trocknung und Fixierung der DNA durch UV-Crosslinking wurden
die Filter 3 h lang in Hybridisierungspuffer bei 48°C inku
biert, bevor radioaktiv markierte Probe zugesetzt wurde.
Als Probe wurde eine cDNA-Sequenz aus Mais verwendet, die
ein Debranching-Enzym codiert (siehe James et al., Plant
Cell 7 (1995), 417-429, Nucleotide 1150-2128)].
Die Hybridisierung wurde bei 48°C durchgeführt in 2 × SSC,
10 × Dehnhardts-Lösung; 50 mM Na₂HPO₄, pH 7,2; 0,2% SDS; 5
mM EDTA und 250 µg/ml denaturierte Heringssperma-DNA.
Hybridisierende Phagenclone wurden unter Anwendung von
Standardverfahren vereinzelt und weiter gereinigt. Mit Hilfe
der in-vivo-excision Methode wurden von positiven Phagenclo
nen E. coli-Clone gewonnen, die ein doppelsträngiges
pBluescript-Plasmid mit der jeweiligen cDNA-Insertion ent
halten. Nach Überprüfung der Größe und des Restriktionsmu
sters der Insertion wurde von geeigneten Clonen Plasmid-DNA
isoliert. Ein derart isoliertes Plasmid, Iso5, besaß eine
Insertion von 2295 bp.
Bei dem entsprechend Beispiel 1 isolierten Plasmids Iso5
wurde die Nucleotidsequenz der cDNA-Insertion durch
Standardverfahren mittels der Didesoxymethode (Sanger et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467) be
stimmt. Die Insertion ist 2295 bp lang und die Nucleotidse
quenz von 2133 bp dieser Insertion sowie die abgeleitete
Aminosäuresequenz ist in Seq ID No. 1 angegeben.
Homologievergleiche ergaben, daß es sich bei dem codierten
Protein um ein neues Debranching-Enzym aus Kartoffel han
delt.
Die unter Seq ID No. 1 angegebene Nucleotidsequenz repräsen
tiert eine partielle cDNA, die ein bisher unbekanntes De
branching-Enzym aus Kartoffel codiert. Mit Hilfe dieser Se
quenz ist es möglich mittels konventioneller Methoden eine
vollständige cDNA-Sequenz oder eine genomische Sequenz aus
geeigneten cDNA- oder genomischen Bibliotheken zu isolieren.
Claims (23)
1. Nucleinsäuremolekül, das ein Protein mit der biologi
schen Aktivität eines Debranching-Enzyms aus Solanum
tuberosum codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus:
- (a) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die unter SeqID No. 2 angegebene Aminosäuresequenz aufweist;
- (b) Nucleinsäuremolekülen, die die unter Seq ID No. 1 angegebene Nucleotidsequenz enthalten;
- (c) Nucleinsäuremolekülen, die mit einem Nucleinsäuremo lekül nach (a) oder (b) hybridisieren; und
- (d) Nucleinsäuremolekülen, deren Nucleotidsequenz auf grund der Degeneration des genetischen Codes von der Nucleotidsequenz eines Nucleinsäuremoleküls nach (a), (b) oder (c) abweicht.
2. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das ein cDNA-Mole
kül ist.
3. Nucleinsäuremolekül von mindestens 15 bp Länge, das spe
zifisch mit einem Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1
oder 2 hybridisiert.
4. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 3, das spezifisch mit
einem Transkript eines Nucleinsäuremoleküls nach An
spruch 1 oder 2 hybridisiert und dadurch dessen Transla
tion verhindert.
5. Vektor enthaltend ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch
1 oder 2.
6. Vektor nach Anspruch 5, wobei das Nucleinsäuremolekül in
sense-Orientierung mit regulatorischen Elementen ver
knüpft ist, die die Transkription und Translation in
prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen ermögli
chen.
7. Wirtszelle, die mit einem Nucleinsäuremolekül nach An
spruch 1 oder 2 oder mit einem Vektor nach Anspruch 5
oder 6 transformiert wurde, oder von einer solchen Zelle
abstammt.
8. Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit der biolo
gischen Aktivität eines Debranching-Enzyms aus Solanum
tuberosum, bei dem Wirtszellen nach Anspruch 7 unter ge
eigneten Bedingungen kultiviert werden und das syntheti
sierte Protein aus der Kultur gewonnen wird.
9. Protein mit der biologischen Aktivität eines Debran
ching-Enzyms aus Solanum tuberosum, das codiert wird von
einem Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2.
10. Wirtszelle nach Anspruch 7, die eine transgene Pflanzen
zelle ist und wobei ein Nucleinsäuremolekül nach An
spruch 1 oder 2 stabil, im Genom integriert vorliegt und
exprimiert wird.
11. Transgene Pflanze enthaltend transgene Pflanzenzellen
nach Anspruch 10.
12. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 11, die eine stär
kespeichernde Pflanze ist.
13. Transgene Pflanze nach Anspruch 12, die eine Getreide
pflanze ist.
14. Transgene Pflanze nach Anspruch 12, die eine Kartoffel
pflanze ist.
15. Stärke erhältlich aus Pflanzenzellen nach Anspruch 10
oder aus Pflanzen nach einem der Ansprüche 11 bis 14.
16. Transgene Pflanzenzelle, bei der die Aktivität eines
Debranching-Enzyms, das durch ein Nucleinsäuremolekül
nach Anspruch 1 oder 2 codiert wird, reduziert ist im
Vergleich zu nichttransformierten Zellen aufgrund der
Inhibition der Transkription oder Translation von endo
genen Nucleinsäuremolekülen, die ein Debranching-Enzym
codieren.
17. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 16, enthaltend ein
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2 oder einen
Teil eines solchen Nucleinsäuremoleküls, wobei das
Nucleinsäuremolekül oder der Teil davon in
antisense-Orientierung mit regulatorischen Elementen verknüpft
ist, die die Transkription in pflanzlichen Zellen ge
währleisten.
18. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 16 oder 17, expri
mierend ein Ribozym, das spezifisch Transkripte von
Nucleinsäuremolekülen nach Anspruch 1 oder 2 spaltet.
19. Transgene Pflanzen enthaltend Pflanzenzellen nach einem
der Ansprüche 16 bis 18.
20. Transgene Pflanze nach Anspruch 19, die eine Kartoffel
pflanze ist.
21. Stärke erhältlich aus Pflanzenzellen nach einem der An
sprüche 16 bis 18 oder aus Pflanzen nach Anspruch 19
oder 21.
22. Vermehrungsmaterial von Pflanzen nach einem der Ansprü
che 11 bis 14 oder nach Anspruch 19 oder 20 enthaltend
Pflanzenzellen nach Anspruch 10 oder einem der Ansprüche
16 bis 18.
23. Verwendung der Stärke nach Anspruch 15 oder 21 zur Her
stellung von Lebensmitteln oder industriellen Produkten.
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