HUT77470A - Növényekből származó elágazást megszüntető enzimeket kódoló DNS molekulák - Google Patents

Növényekből származó elágazást megszüntető enzimeket kódoló DNS molekulák Download PDF

Info

Publication number
HUT77470A
HUT77470A HU9800236A HU9800236A HUT77470A HU T77470 A HUT77470 A HU T77470A HU 9800236 A HU9800236 A HU 9800236A HU 9800236 A HU9800236 A HU 9800236A HU T77470 A HUT77470 A HU T77470A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
starch
dna
leu
plant
ser
Prior art date
Application number
HU9800236A
Other languages
English (en)
Inventor
Michael Emmermann
Jens Kossmann
Andreas Renz
Ivar Virgin
Original Assignee
Hoechst Schering Agrevo Gmbh.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Schering Agrevo Gmbh. filed Critical Hoechst Schering Agrevo Gmbh.
Publication of HUT77470A publication Critical patent/HUT77470A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/30—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols, e.g. xylitol; containing starch hydrolysates, e.g. dextrin
    • A23L29/35—Degradation products of starch, e.g. hydrolysates, dextrins; Enzymatically modified starches
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
    • C12N9/2457—Pullulanase (3.2.1.41)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
    • C12N9/246—Isoamylase (3.2.1.68)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/16—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an alpha-1, 6-glucosidase, e.g. amylose, debranched amylopectin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01041—Pullulanase (3.2.1.41)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01068—Isoamylase (3.2.1.68)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Növényekből származó elágazást megszüntető enzimeket kódoló DNS molekulák
Hoechst Schering AgrEvo GmbH, BERLIN, DE
Feltalálók: KOSSMANN Jens, BERLIN, DE EMMERMANN Michael, BERLIN, DE
VIRGIN Ivar,
STOCKHOLM, SE
RENZ Andreas,
BAYREUTH, DE
A bejelentés napja: 1995. 12. 22.
Elsőbbsége: 1994. 12. 22. (P 44 47 387.7) DE
A nemzetközi bejelentés száma: PCT/EP95/05091
A nemzetközi közzététel száma: WO 96/19581
A jelen találmány egy elágazást megszüntető enzim (R enzim) enzimatikus aktivitásával rendelkező növényekből származó proteineket kódoló DNS molekulákkal kapcsolatos. A jelen találmány továbbá kapcsolatos a növényekben szintetizált amilopektin elágazásának módosítására szolgáló eljárással is, valamint •·· ·· · olyan növényekkel és növényi sejtekkel, melyekben módosított elágazási fokú amilopektin szintetizálódik egy további elágazást megszüntető enzim aktivitásának vagy egy endogén elágazást megszüntető enzim aktivitás gátlása expressziójának köszönhetően, valamint az említett növényi sejtekből és növényekből nyerhető keményítővel.
A keményítő fontos szerepet játszik egy sor növény raktározó anyagaként, valamint reproduktív, kereskedelmi szempontból hasznos nyersanyagként és jelentősége egyre nő. A keményítő ipari alkalmazásához szükség van arra, hogy a keményítő megfeleljen a feldolgozó ipar követelményeinek a keményítő szerkezetét, formáját és/vagy egyéb fiziko-kémiai paramétereit tekintve. A lehető legtöbb területen való hasznosításhoz a keményítő a lehető legtöbb formában kell kinyerhető legyen.
Míg a poliszacharid keményítő kémiailag egységes alkotórészekből áll, a glükóz molekulákból, ez különböző molekula formák komplex keveréke, mely különbségeket mutat a polimerizáció foka és az elágazások jelenlétét tekintve. Megkülönböztethető az amilóz keményítő, az amilopektin keményítőből származó alfa-1,4 glükozidosan kapcsolódó glükóz molekulák egy alapjában véve elágazás mentes polimere, egy elágazó polimer, melynek elágazásai a további alfa-1,6 glüközidos kötések eredményei.
A kifejezetten keményítő termelésre használt növényekben, például a kukoricában vagy a burgonyában, mind a két keményítő forma jelen van 25 rész amilóz : 75 rész amilopektin arányban. Az amilopektinen túl a kukorica például egy másik elágazó poliszacharidot tartalmaz, az úgynevezett fitoglikogént, ami az amilopektintől abban tér el, hogy magasabb az elágazási foka és különböző az oldékonysága (lásd például Lee et al., Arch. Biochem. Biophys. 143 (1971), 365-374; Pan and Nelson, Plenat Physiol. 74 (1984), 324-328). A jelen találmányban az amilopektin kifejezésen fitoglikogént értünk.
A keményítő alapvető vegyülete uniformitásának tekintetében ipari alkalmazásához a keményítő termelő növényektől elvárják, hogy például vagy csak amilopektin alkotórészeket vagy csak amilóz alkotórészeket tartalmazzanak. Más alkalmazásokhoz a növénnyel szemben követelmény, hogy különböző elágazási fokú amilopektin formákat szintetizáljon.
Ilyen növények hozhatók létre például nemesítéssel vagy mutagenezises technikákkal. Bizonyos növény fajokról, például a kukoricáról, ismert, hogy a mutagenezis felhasználható csupán amilopektint termelő változatok létrehozására. Burgonya esetében kémiai mutagenezissel egy genotípust hoztak létre egy haploid vonalhoz, mely nem termel amilózt (Hovenkamp-Hermelink, Theor. Appl. Génét. 75 (1987), 217-221 ).A haploid vonalak azonban vagy az ezekből származó homozigóta diploid vagy tetraploid vonalak nem megfelelőek mezőgazdasági célokra. A mutagenezises technikák azonban, nem alkalmazhatók a tetraploid vonalak esetében, melyek viszont a mezőgazdaság számára érdekesek, mivel a négy különböző genotípus jelenléte miatt egy gén összes kópiájának inaktiválása technikailag nem megvalósítható. Ezért, burgonya esetében más technikákat kell alkalmazni, például a növények specifikus génsebészeti módosítását.
Például Visser és munkatársaitól (Mól. Gén. Génét. 225 (1991), 289) és a WO 92/11376 szabadalomból ismert, hogy a keményítő szemcséhez kötött keményítő szintetáz gén antisense gátlásával burgonyában olyan változatok hozhatók létre, melyek lényegében tiszta amilopektin keményítőt szintetizálnak.
A WO 92/14827 szabadalom elágaztató enzimet (Q enzim) kódoló DNS szekvenciákat ír le, melyek alfa-1,6 elágazásokat juttatnak be az amilopektin keményítőbe. Ezekkel a DNS szekvenciákkal lehetőség van olyan transzgenikus növények létrehozására, melyek módosított amilóz/amilopektin arányú keményítőt tartalmaznak.
• ·· • a ·
Azért, hogy még specifikusáéban módosíthassuk a növényekben szintetizálódott keményítő elágazási fokát génsebészeti eljárást használva, szükség van az olyan enzimeket kódoló DNS szekvenciák azonosítására, melyek részt vesznek a keményítő metabolizmusban, különösen a keményítő molekulák elágaztatásában részt vevő enzimekét.
A keményítő molekulákba elágazásokat bejuttatni képes Q enzimeken túl a növények olyan enzimeket is tartalmaznak, melyek képesek az elágazásokat megszüntetni. Ezekre az enzimekre elágazást megszüntető enzimekként utalunk és szubsztrát specifitásuk tekintetében három csoportra osztjuk ezeket:
(a) Pollulanázok, melyek az amilopektint használják szubsztrátként a pullulánon kívül, olyan mikroorganizmusokban találhatók, mint például a Klebsiella, valamint a növények. Növényekben ezekre az enzimekre gyakran utalunk R enzimekként.
(b) Izoamilázok, melyek nem a pullulánt, hanem a glikogént és az amilopektint használják szubsztrátként, szintén megtalálhatók mikroorganizmusokban és növényekben. Izoamilázokat írtak le például kukoricából (Manners and Rowe, Carbohydr. Rés. 9 (1969), 107) és burgonyából (Ishizaki et al., Agric. Bioi. Chem. 47 (1983), 771-779).
(c) Az Amilo-1,6-glükozidázokat emlősök és élesztőgombák esetében írták le és a határ dextrineket használják szubsztrátként.
Li és munkatársai (Plánt Physiol. 98 (1992), 1277-1284) cukorrépában csupán egyetlen pullulanáz típusú elágazást megszüntető enzimet detektáltak öt endoamiláz és két exoamiláz enzimen kívül. Miután mérete körülbelül 100 kD és pH optimuma 5,5, ez az enzim a kloroplasztiszokban helyezkedik el. Spenót esetében szintén két elágazást megszüntető enzimet írtak le, melyek szubsztrátként a pullulánt használják. A spenót elágazást megszüntető enzimjei és a cukorrépa enzimjei olyan aktivitással rendelkeznek, melyek 5 faktorral alacsonyabbak, ha az amilopektinnel reagálnak szubsztrátként a pullulán helyett (Ludwig et al., Plánt. Physyiol. 74 (1984), 856-861; Li etal., Plánt. Physiol. 98 (1992), 1277-1284).
Egy elágazást megszüntető enzim aktivitását Hobson és munkatársai (J. Chem. Soc. (1951), 1451) vizsgálták burgonya esetében, mely egy keményítőraktározó termesztett növény, mely mezőgazdasági szempontból is fontos növény. Sikerült biztosítaniuk, hogy a megfelelő enzim - a Q enzimmel szemben - nem rendelkezik lánc meghosszabbító tulajdonsággal, csupán az alfa-1,6 glikozidos kötéseket hidrolizálja. Azonban nem tudták részletesebben jellemezni az enzimet.
A burgonyához az elágazást megszüntető enzim tisztítására szolgáló eljárás és a tisztított protein részleges pepiid szekvenciája is felvetődött már (Német szabadalmi alkalmazás P 43 27 165.0 és PCT/EP94/026239). Elméletileg, lehetséges kellene legyen a megfelelő proteineket kódoló DNS szekvenciák azonosítása ismert peptid szekvenciák segítségével ha degenerált oligonukleotid próbákat használunk. Azonban gyakorlatilag gyakran merül fel az a probléma, hogy a próba degeneráltsági foka túl magas vagy a próba túl rövid a kívánt proteint kódoló szekvenciák specifikus azonosításához.
A burgonya elágazást megszüntető enzimjének javasolt peptid szekvenciája ismerete ellenére a kutatók ezideig nem tudták a növények elágazást megszüntető enzimjét kódoló DNS molekulákat izolálni a degenerált oligonukleotidokhoz való hibridizációval vagy más genetikai vagy immunológiai megközelítésekkel, mint például amilyeneket a P 43 27 165.0 Német szabadalmi alkalmazás ad meg.
Spenót esetében sem - mely növénynél az elágazást megszüntető enzim tisztítását Ludwig és munkatársai leírták (Plánt Physiol. 74 (1984), 856-861) - tudták a kutatók meghatározni a peptid szekvenciát vagy az említett proteint kódoló DNS molekulákat azonosítani.
A jelen találmány problémáját így az olyan DNS molekulák biztosítása jelenti, melyek olyan növényi proteineket kódolnak, melyek egy elágazást megszüntető enzim aktivitásával rendelkeznek és lehetővé teszik transzgenikus növényi sejtek és olyan növények létrehozását, melyek egy elágazást megszüntető enzim fokozott vagy csökkentett aktivitásával rendelkeznek.
A problémát az igénypontokban lírt megvalósulások biztosításával oldjuk meg.
A jelen találmány így olyan növényi proteineket kódoló DNS molekulákkal kapcsolatos, melyek egy elágazást megszüntető enzim enzimatikus aktivitásával rendelkeznek, vagy ennek egy biológiailag aktív fragmentjével.
Egy ilyen DNS molekula előnyösen egy növényi elágazást megszüntető enzimet kódol, melynek szekvenciáját a 18. vagy 24. számú szekvenciában mutatjuk be. Még előnyösebben egy ilyen DNS molekula a 17. számú szekvenciában vagy a 23. számú szekvenciában bemutatott nukleotid szekvenciát tartalmazza, különösen ezek kódoló régióját.
A jelen találmány tárgyát képezik továbbá, az olyan DNS molekulák, melyek egy elágazást megszüntető enzim biológiai aktivitásával rendelkező növényi proteineket kódolnak, vagy ezek egy biológiailag aktív fragmentjét, és melyek a fent leírt bármelyik DNS molekulához hibridizálódnak.
A “hibridizáció” fogalma ebben a szöveg összefüggésben hagyományos hibridizációs körülmények közötti hibridizációt jelent, előnyösen olyan szigorú körülmények közötti hibridizációt, melyet például Sambrook és munkatársai írnak le (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). A jelen találmány DNS molekuláihoz hibridizálódó DNS molekulák elméletileg származhatnak bármilyen olyan növényből, mely ilyen DNS molekulával rendelkezik. Előnyösen, ezek egyszikű vagy kétszikű ··· növényekből származnak, előnyösen haszonnövényekből, és még előnyösebben keményítőt raktározó növényekből.
A jelen találmány DNS molekuláihoz hibridizálódó DNS molekulák izolálhatok, például különböző növények genom könyvtáraiból vagy cDNS könyvtáraiból.
A növényekből származó ilyen DNS molekulák azonosíthatók és izolálhatok a jelen találmány DNS molekuláinak használatával vagy ezen molekulák fragmentjeivel, vagy ezen molekulák reverz komplementjeivel, például standard technikáknak megfelelően történő hibridizációval (lásd például Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Hibridizációs próbaként például olyan DNS molekulák használhatók, melyek lényegében azonosak a 17. számú szekvenciában vagy a 23. számú szekvenciában jelzett DNS szekvenciákkal vagy az említett szekvenciák fragmentjaivel. A hibridizációs próbaként használt DNS fragmentek lehetnek szintetikus, hagyományos DNS szintézises technikák segítségével létrehozott DNS fragmentek, melyek szekvenciája lényegében azonos a jelen találmány szerinti DNS molekulák DNS szekvenciájával. Ha a jelen találmány DNS molekuláihoz hibridizálódó géneket azonosítottuk és izoláltuk, szükséges meghatározni szekvenciájukat és az említett szekvencia által kódolt proteinek tulajdonságait analizálni.
A “hibridizálódó DNS molekulák kifejezés a fent leírt DNS molekulák fragmentjeit, származékait és alléi variánsait foglalják magukba, melyek a fent leírt proteint vagy ennek egy biológiailag aktív fragmentjét kódolják. A fragmenteket úgy ismerjük, mint a DNS molekulák olyan részeit, melyek elegendő hosszúságúak ahhoz, hogy a leírt proteint vagy annak egy biológiailag aktív fragmentjét kódolják. A “származék” kifejezés ebben a szöveg összefüggésben azt jelenti, hogy ezen molekulák DNS szekvenciája egy vagy több pozícióban tér el a fent leírt DNS ··· ··· molekulák szekvenciájától és erős homológiát mutatnak az említett DNS molekulával. A homológián azt értjük, hogy a szekvencia azonosság legalább 40%os, különösen legalább 60%-os, még előnyösebben legalább 80%-os és még előnyösebben legalább 90%-os. A fent leírt DNS molekuláktól való eltérés lehet deléció, szubsztitúció, inzertáció, addició vagy rekombináció eredménye. A homológia a továbbiakban azt jelenti, hogy a megfelelő DNS szekvenciák vagy a kódolt proteinek funkcionálisan és/vagy strukturálisan is azonosak. A fent leírt DNS molekulákkal homológ DNS molekulák, valamint az említett DNS molekulák származékai gyakran az említett DNS molekulák variációi, melyek azonos biológiai funkció módosításait képviselik. Ezek lehetnek természetesen előforduló variációk, mint például más növény fajok szekvenciái, vagy mutációk. Ezek a mutációk bekövetkezhetnek a természetben, vagy elérhetők specifikus mutagenezis révén. Ezenkívül, ezek a variációk lehetnek szintetikusan létrehozott szekvenciák is.
Az allál variánsok lehetnek természetesen előforduló variánsok, valamint szintetikusan létrehozott vagy génsebészetileg létrehozott variánsok.
A jelen találmány DNS molekuláinak különböző variánsai által kódolt proteinek specifikus közös tulajdonságokkal rendelkeznek, mint például enzimatikus aktivitással, molekulasúllyal, immunológiai reaktivitással, konformációval stb., valamint fizikai tulajdonságokkal, mint például elektroforetikus mobilitással, kromatográfiás viselkedéssel, szedimentációs koefficienssel, oldékonysággal, spektroszkópos tulajdonságokkal, stabilitással, pH optimummal, hőmérséklet optimummal, stb.
Az elágazást megszüntető enzim enzimatikus aktivitása egy jód festési teszttel detektálható az 5. példában leírtaknak megfelelően. Ez a teszt arra a megállapításra alapul, hogy egy keményítő módosítási képességgel rendelkező protein úgy detektálható, hogy a protein extraktumokat szeparáljuk, például • ·· ··« gumókból, nem denaturáló amilopektint tartalmazó poliakrilamid géleken (PAAG) majd ezt követően megfestjük a gélt megfelelő pufferben való inkubálás után jóddal. Míg a nem elágazó amilóz kék komplexet képez a jóddal, az amilopektin vörösesbíbor elszíneződést eredményez. A vöröses-bíbor színt adó amilopektin tartalmú poliakrilamid gélek jóddal való reagáltatása színváltozást eredményez, a gél kékre színeződik azokon a helyeken, ahol az elágazást megszüntető aktivitás található, miután a bíbor-festődésű amilopektin elágazásait az elágazást megszüntető enzim megemészti.
Másik lehetőségként az elágazást megszüntető enzim aktivitás detektálható DNSS teszttel (lásd Ludwig et al., Plánt., Physiol. 74 (1984), 856-861).
A jelen találmány továbbá kapcsolatos még olyan DNS molekulákkal, melyek szekvenciája eltér a fent leírt DNS molekulák szekvenciájától a genetikai kód degeneráltsága következtében, valamint melyek egy elágazást megszüntető enzim biológiai aktivitásával rendelkező növényi proteint, vagy annak egy biológiailag aktív fragmentjét kódolják.
Egy előnyben részesített megvalósulás szerint a jelen találmány szerinti DNS molekulák által kódolt protein legalább egy az 1. - 14. számú szekvenciákban leírt peptid szekvenciát tartalmaz.
Egy másik előnyben részesített megvalósulás szerint a jelen találmány szerinti DNS molekulák által kódolt növényi elágazást megszüntető enzimek izolálhatok növényi protein kivonatokból frakcionált ammónium szulfátos kicsapatással és ezt követő affinitás kromatográfiával béta-ciklodextrinen.
Előnyösen, a jelen találmány DNS molekulái olyan proteineket kódolnak, melyek 50 - 150 kD molekulasúlyúak SDS gél elektroforézissel, előnyösen 70 - 130 kD és még előnyösebben 90-110 kD közöttiek.
···· ···· • · • · · · · ·
...·. .· ··· ·
Elméletileg a jelen találmány szerinti DNS molekulák származhatnak bátmilyen olyan növényből, mely expresszálja a leírt proteineket, előnyösen taxonómiailag magasabbrendű növényekből, különösen egyszikű vagy kétszikű növényekből, előnyösen olyan növényekből, melyek keményítőt szintetizálnak. Leginkébb például a gabonák (mint például az árpa, a rozs, a zab, a búza stb) a kukorica, a rizs, a borsó, a kaszava stb részesülnek előnyben.
Egy előnyben rézesített megvalósulásban a jelen találmány DNS molekulái a Solanaceae családba tartozó növényekből származnak, vagy a Chenopodiaceae családba tartozó növényekből, előnyösen a Solanum tuberosum-bő\, vagy a Spinacia oleracea-bó\.
A jelen találmány továbbá vonatkozik vektorokra, különösen plazmidokra, kozmidokra, vírusokra, bakteriofágokra és más olyan a génsebészetben hagyományos vektorokra, melyek a jelen találmány DNS molekuláit tartalmazzák.
A jelen találmány előnyben részesített megvalósulása szerint a vektorokban tartalmazott DNS molekulák szabályozó DNS szekvenciákhoz kapcsolódnak lehetővé téve a prokarióta vagy eukarióta sejtekben való transzkripciót és transzlációt.
A jelen találmány egy másik előnyben részesített megvalósulása szerint a találmány gazdasejtekre is vonatkozik, különösen prokarióta vagy eukarióta sejtekre, melyeket a fent leírt DNS molekulával vagy vektorral transzformáltunk és az ilyen gazdasejtekből származó sejtekre.
Ezenkívül, a jelen találmány vonatkozik egy elágazást megszüntető enzim biológiai aktivitásával rendelkező növényi protein vagy egy biológiailag aktív fragmentje előállítására szolgáló módszerre, ahol a jelen találmány szerinti gazdasejtet megfelelő körülmények között tenyésztjük és a tenyészetből a proteint kinyerjük.
··» «·» ···
A jelen találmány egy másik tárgyát képezik az említett eljárással nyerhető proteinek.
A találmány ezenkívül vonatkozik még egy elágazást megszüntető enzim biológiai aktivitásával rendelkező növényi proteinekre is, melyeket a találmány DNS molekulái kódolnak, kivéve a már leírt spenótból és burgonyából nyert proteineket.
A jelen találmány DNS molekuláinak biztosításával lehetőség nyílt a növényi sejtek génsebészeti manipulálására úgy, hogy ezek megnövekedett vagy csökkent elágazást megszüntető enzim aktivitással rendelkeznek a vad típusú sejtekhez viszonyítva. Egy ilyen módosított keményítő különböző célokra használható.
Egy előnyben részesített megvalósulás szerint a találmány gazdasejtjei transzgenikus növényi sejtek, melyek megnövekedett elágazást megszüntető enzim aktivitással rendelkeznek a nem transzformált sejtekhez képest a jelen találmány egy hozzáadott, bejuttatott DNS molekulájának jelenléte és expressziója következtében.
A jelen találmány egy másik tárgyát képezik a fent leírt transzgenikus növényi sejteket tartalmazó transzgenikus növények.
A jelen találmány továbbá vonatkozik a transzgenikus növényi sejtekből vagy növényekből nyerhető keményítőre is. A fokozott elágazást megszüntető enzim aktivitásnak köszönhetően a transzgenikus sejtek vagy növények által szintetizált amilopektin keményítő a nem transzformált növények által termelt keményítő tulajdonságaitól eltérő tulajdonságokkal rendelkezik. Például ha ezen keményítő vizes oldatának viszkozitását analizáljuk kezelés során, ezek maximális viszkozitása alacsonyabb, mint a nem tarnszformált növények keményítőjének viszkozitása. Előnyösen a maximális viszkozitási érték legalább 40%-kal, előnyösen legalább 55%-kal és még előnyösebben legalább 65%-kal csökken a vad típusú növényekből származó keményítő maximális viszkozitásához hasonlítva. Ezenkívül, a módosított keményítő vizes oldatának végső viszkozitása hűtés után magasabb, mint a vad típusú keményítőé. Előnyösen a végső viszkozitás legalább 10%-kal, előnyösen legalább 30%-kal, és még előnyösebben legalább 50%-kal magasabb, mint a vad típusú növényekből származó keményítőé.
Ezenkívül, a módosított keményítőt tartalmazó gélek stabilitása magasabb, mint a vad típusú keményítőt tartalmazó géleké. A gélek deformálásához szükséges erő legalább 2,5-szer, előnyösen legalább 3,5-ször és még előnyösebben legalább 5,5-ször nagyobb kell legyen, mint a vad típusú keményítőt tartalmazó gélek deformálásához szükséges erő.
A jelen találmány egy további tárgyát képezi az élelmiszeripari és ipari termékek előállításához való leírt keményítő használata.
A jelen találmány egy másik tárgyát képezi a jelen találmány növényi anyagainak szaporítása, például magok, termések, dugványok, gumók, gyökérek, stb., és ez a szaporító anyag a fent leírt transzgenikus növényi sejteket tartalmazza.
A jelen találmány a továbbiakban olyan transzgenikus növényi sejtekkel is kapcsolatos, melyekben az elágazást megszüntető enzim aktivitása az elágazást megszüntető enzimet kódoló endogén nukleinsav molekulák transzkripciója vagy transzlációja gátlásának köszönhető. Ezt előnyösen úgy érjük el, hogy a jelen találmány DNS molekuláját antisense irányban expresszáljuk a megfelelő növényi sejtekben. Az antisense hatásnak köszönhetően, az elágazást megszüntető enzim aktivitása csökken. Az elágazást megszüntető enzim aktivitás csökkentésének egy másik lehetősége növényi sejtekben a megfelelő ribozimok - melyek specifikusan hasítják a jelen találmány DNS molekuláinak transzkriptjeit - expresszálása. Az ilyen ribozimek termelése a jelen találmány DNS molekuláinak felhasználásával ismert a tudomány e területén. Másik lehetőségként a növényi sejtekben az elágazást megszüntető enzim aktivitás csökkenthető ko-szuppressziós hatással is.
·*» • · «
A jelen találmány ezenkívül kapcsolatos csökkent elágazást megszüntető enzim aktivitással rendelkező fent leírt transzgenikus növényi sejteket tartalmazó transzgenikus növényekkel is. A jelen találmány egy további tárgyát képezik a transzgenikus sejtekből vagy növényekből nyerhető módosított keményítő is. A transzgenikus sejtek és növények amilopketin keményítője megváltozott elágazási fokot mutat a nem transzformált növények keményítőjéhez képest a csökkent elágazást megszüntető enzim aktivitásnak köszönhetően. Ezenkívül, a leírt transzgenikus növényekből nyerhető módosított keményítő több szempontból is eltérhet a vad típusú növények keményítőjétől. Például, ha ezen keményítő vizes oldatának viszkozitását analizáljuk hevítés hatására, olyan maximális viszkozitás mutatnak, mely alacsonyabb, mint a nem transzgenikus növényekből származó keményítőé. Előnyösen, a maximális viszkozitás értéke legalább 35%-kal, előnyösen legalább 40%-kal és még előnyösebben legalább 50%-kal csökken a vad típusú növényekből származó keményítő maximális viszkozitásához képest.
A csökkent elágazást megszüntető enzim aktivitással rendelkező növények által szintetizált módosított keményítő keményítő szemcséi lehetnek durva, repedezett, vagy horzsolt felületű.
Ezenkívül, a módosított keményítőt úgy jellemezzük, hogy az ezen keményítőből készült gél stabilabb, mint a vad típusú keményítőből készült gélek. A módosított keményítőből készült gélek deformálásához szükséges erő legalább 2,3szor, előnyösen, legalább 3,8-szor és még előnyösebben legalább 6,0-szor nagyobb, mint a vad típusú keményítőt tartalmazó gélek deformálásához szükséges erő.
A módosított keményítő foszfát tartalma előnyösen magasabb, mint a vad típusú keményítőé. A foszfát tartalomban bekövetkező növekedés az elágazást megszüntető enzim aktivitás csökkenésének mértékétől függ. Előnyösen, a foszfát ·* ··· * * ··· tartalom legalább 15%-kal, még előnyösebben legalább 25%-kal és még előnyösebben legalább 60%-kal magasabb, mint a vad típusú keményítőé.
A jelen találmány egy másik tárgyát képezi a leírt keményítő élelmiszeripari és ipari termékek előállításában való használata.
A jelen találmány kapcsolatos a fent leírt transzgenikus növények szaporító anyagával is, mint például magokkal, termésekkel, dugványokkal, gumókkal, gyökértörzsek, stb., a szaporító anyag a fent leírt transzgenikus növényi sejteket tartalmazza.
Előállíthatok, olyan transzgenikus növényi sejtek, melyek az elágazást megszüntető enzim hozzáadott expressziójának köszönhetően módosult elágazási fokkal rendelkező amilopektint hoznak létre a vad típusú növények által szintetizált amilopektin keményítőhöz viszonyítva, például egy olyan folyamat segítségével, mely a következő lépésekből áll:
(a) a következő DNS szekvenciákat tartalmazó expressziós kazetta előállítása:
(i) egy növényi sejtekben a transzkripciót lehetővé tevő promótert;
(ii) egy elágazást megszüntető enzim enzimatikus aktivitásával rendelkező proteint kódoló legalább egy DNS szekvenciát, mely a sense orientációban levő promóter 3’ végéhez van fúzionáltatva; és (iii) tetszés szerint a transzkripció terminációjához való terminációs jelet, valamint egy a létrejött transzkripthez egy poli-A farok hozzáadását, mely a kódoló régió 3’ végéhez kapcsolódik; és (b) növényi sejtek az (a) lépésben létrehozott expressziós kazettával való transzformációját.
Előállíthatok, olyan transzgenikus növényi sejtek, melyek az elágazást megszüntető enzim csökkentett aktivitásának köszönhetően módosult elágazási fokkal rendelkező amilopektint hoznak létre a vad típusú növények által szintetizált amilopektin keményítőhöz viszonyítva, például egy olyan folyamat segítségével, mely a következő lépésekből áll:
(a) a következő DNS szekvenciákat tartalmazó expressziós kazetta előállítása:
(i) egy növényi sejtekben a transzkripciót lehetővé tevő promótert;
(ii) egy elágazást megszüntető enzim enzimatikus aktivitásával rendelkező proteint kódoló legalább egy DNS szekvenciát, vagy egy ilyen protein legalább egy részét, mely az antisense orientációban levő promóter 3’ végéhez van fúzionáltatva; és (iii) tetszés szerint a transzkripció terminációjához való terminációs jelet, valamint a létrejött transzkripthez egy poli-A farok hozzáadását, mely a (ii) részben leírt DNS szekvencia 3’ végéhez kapcsolódik; és (b) növényi sejtek az (a) lépésben létrehozott expressziós kazettával való transzformációját.
Elméletileg, bármilyen a növényekben funkcionáló promóter felhasználható az (I) pontban említett promóterként. A promóter lehet homológ vagy heterológ a használt növény fajt tekintve. Egy megfelelő promóter, például a karfiol mozaik vírus 35S promótere (Odell et al., Natúré 313 (1985), 810-812), mely lehetővé teszi egy növény összes szövetében a konstitutív expressziót és a WO 94/01571 szabadalomban leírt promóter szerkezet. Azonban, olyan promóterek is felhasználhatók, melyek csupán külső faktorok által meghatározott időpontban (lásd például a WO 93/07179), vagy a növény bizonyos szövetében (lásd például Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2245-2251) későbbi szekvenciák expressziójához vezetnek. Előnyösen, olyan promótereket használunk, melyek aktívak a transzformálandó növények keményítő-raktározó szerveiben. Ezek a keményítő-raktározó szervek például a kukorica szemcsék a kukoricában, burgonyában pedig a gumó. A burgonya transzformálásához a gumó specifikus B33 promótert (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) részesítjük előnyben de, nem kizárólagosan használjuk.
Feltételezve, hogy a folyamat (a) lépése (ii) pontjában egy elágazást megszüntető enzim enzimatikus aktivitásával rendelkező, említett DNS szekvencia a promóterhez sense orientációban kapcsolódik, ez a DNS szekvencia natív vagy homológ eredetű lehet vagy idegen vagy heterológ eredetű a transzformálandó növényt tekintve.
Előnyben részesítjük a jelen találmány DNS molekuláinak használatát. Elméletileg a szintetizált protein a növényi sejt bármely alkotójában lokalizálódhat. A növények elágazást megszüntető enzimjei általában a plasztiszokban lokalizálódnak és így az ezen alkotókban való transzlokációhoz tartalmaznak jel szekvenciát. A 17. számú szekvenciában leírt aminosav szekvencia esetében a jel szekvencia 64 Nterminális aminosavból áll. A sejt egy másik alkotójában való lokalizációjához a jel szekvenciát kódoló DNS szekvenciát el kell távolítani és a kódoló régiót a DNS szekvenciához kell kapcsolni, hogy a megfelelő alkotóban való lokalizációt lehetővé tegyük. Az ilyen szekvenciák ismertek (lásd például Braun et al., EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 (1988), 846-850; Sonnewald etal., Plánt J. 1 (1991),95-106).
Feltéve, hogy a folyamat (a) lépése (ii) pontjában említett, egy elágazást megszüntető enzim enzimatikus aktivitásával rendelkező proteint kódoló DNS szekvencia antisense orientációban kötődik a promóterhez, ez a DNS szekvencia előnyösen homológ eredetű a transzformálandó növénnyel. Azonban olyan DNS szekvenciák is használhatók, melyek endogén módon jelenlevő elágazást megszüntető enzim génekkel mutatnak magas fokú homológiát, különösen 80% feletti, előnyösen 90% feletti és 100% feletti, legelőnyösebben 95% feletti homológiát.
• · · · ·
Minimálisan legalább 15 bázispár hosszúságú szekvenciák használhatók. A gátló hatás, azonban nem zárható ki, még a rövidebb szekvenciák használatakor sem. A hosszabb szekvenciák részesülnek előnyben, melyek 100-500 bázispár hosszúságúak; egy hatékony anti-sense gátláshoz az 500 bázispárnál hosszabb szekvenciák használatát részesítjük előnyben. Általában olyan szekvenciákat használunk, melyek 5000 bázispárnál rövidebbek, előnyösen 2500 bázispárnál rövidebb szekvenciákat.
A burgonya transzformációja esetében a DNS szekvencia előnyösen a 23. számú szekvenciában leírt DNS szekvencia, vagy ennek részei, melyek egy antisense hatás kiváltásához elegendő hosszúságúak.
A növényi sejtekben való transzkripcióhoz való terminációs jelek leírásra kerültek és szabadon felcserélhetők. Például, az Agrobacterium tumefaciens-bő\ származó oktopin szintetáz gén terminációs szekvenciája is felhasználható.
A folyamat (a) lépése szerint megszerkesztett expressziós kazetta növényi sejtbe való transzferálását előnyösen plazmidokat használva valósítjuk meg, különösen olyan plazmidokat használva, melyek az expressziós kazetta növényi genomba való stabil integrálódását teszik lehetővé.
Elméletileg, a fent leírt eljárás az összes növény faj esetében használható, érdeklődésre tartanak számot az egyszikű és a kétszikű növények. A különböző egyszikű és kétszikű növények esetében használt transzformálási technikákat már leírták. Az eljárásokat előnyösen haszonnövények esetében használjuk, különösen keményítőt termelő növények esetében, mint például gabonák (kukorica, búza, árpa, rozs, zab), burgonya, borsó, rizs, kaszava, stb. esetében.
Az idegen gének magasabbrendű növényekbe való bejuttatásának megvalósításához széleskörű klónozó vektorok állnak rendelkezésre, melyek tartalmazzák az E. coli-hoz való replikációs origót és a transzformált bakteriális sejt szelekciójához való marker gént. Ilyen vektorokra példák a pBR322, a pUC sorozat, az m13mp sorozat, a pACYC184, stb. A kívánt szekvencia a vektorba a megfelelő restrikciós helynél juttatható be. A kapott plazmidot E. coli sejtek transzformálására használjuk. A transzformált E. coli sejteket egy megfelelő tápközegben tenyésztjük, összegyűjtjük és lizáljuk. A plazmidot standard technikáknak megfelelően nyerjük ki. A nyert plazmid jellemzéséhez használt analízises módszerként a DNS restrikciós analízist és a szekvencia analízist használjuk általában. Az egyes műveletek után a plazmid DNS hasítható és a kapott DNS fragment más DNS szekvenciákhoz köthető.
Nagy számú technika áll rendelkezésre a DNS növényi gazdasejtbe való bejuttatására. Ezen technikák közé tartoznak a növényi sejtek transzformálása TDNS-sel Agrobacterium tumefaciens-t vagy Agrobacterium rhizogenes-t használva transzformánsként, protoplasztok fúziójával, a DNS injektálásával és elektroporációjával, DNS biolisztikus technikával és más lehetséges technikákkal történő bejuttatásával.
A DNS növényi sejtekbe való injektálása és elektroporációja esetében, nincs specifikus igény az alkalmazott plazmidokkal szemben. Egyszerű plazmidok, mint a pUC származékok is felhasználhatók. Azonban, ha teljes növény regeneráltatása a cél a megfelelő transzformált sejtekből, szükség van egy szelektálható marker gén jelenlétére.
A kívánt gének növényi sejtekbe történő bejuttatásának módszerétől függően, további DNS szekvenciákra lehet szükség. Például, ha a Ti vagy a Ri plazmidot használjuk a növényi sejtek transzformálására legalább a jobb határt, gyakran azonban a Ti és a Ri plazmid T-DNS jobb és bal határát is kapcsolni kell szomszédos régióként a bejuttatandó génekhez.
Ha a transzformációhoz Agrobacteriumot használunk, a bejuttatandó DNS-t speciális plazmidokba kell klónozni, vagy egy köztes vektorba, vagy egy bináris • · vektorba. A köztes vektorok homológ rekombinációval integrálhatók az Agrobacterium Ti vagy Ri plazmidjába azoknak a szekvenciáknak köszönhetően, melyek homológok a T-DNS-ben levő szekvenciákkal. Az említett plazmid tartalmazza a T-DNS transzferálásához szükséges vir régiót. A köztes vektorok nem képesek Agrobacteriumban replikálódni. A közetes vektor Agrobacterium tumefaciens-be transzferálható egy helper plazmid segítségével (konjugáció). A bináris vektorok mind az E. coli-ban mind az Agrobacteriumokban replikálódhatnak. Ezek tartalmaznak egy szelekciós marker gént és egy kötőt vagy polikötőt, melyeket jobb és bal T-DNS határ régiók határolnak. Ezek közvetlenül transzformálhatok Agrobacteriumokba (Holster et al., Mól. Gén. Génét. 163 (1978), 181-187). Az Agrobacteriumok transzformálásához használt plazmidok ezenkívül tartalmaznak még egy szelekciós marker gént a transzformált bektérium szelekciójának lehetővé tétele céljából, például az NPTII gént. A gazdasejtként szolgáló Agrobacteriumnak tartalmaznia kell egy a vir régiót hordozó plazmidot. A vir régió a T-DNS növényi sejtekbe való transzferálásához szükséges. További T-DNS is jelen lehet. Az így transzformált Agrobacteriumot növényi sejtek transzformálására használjuk.
A növényi sejtek transzformálására használt T-DNS alkalmazását széleskörűen vizsgálták és kielégítően le is írták: EP 120516, Hoekema, In: The Binary Plánt Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Chapter V; Fraley et al., Crit. Rév. Plánt. Sci.,4:1-46 és An et al., EMBO J. 4 (1985), 277-287). Néhány bináris vektor már beszerezhető a kereskedelemben is, például a pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc., USA).
A DNS növényi sejtekbe való transzferálásához a növényi explantumokat előnyösen Agrobacterium tumefaciens-sze\ vagy Agrobacterium rhizogenes-sze\ tenyésztjük. A fertőzött növényi anyagból (például levél darabok, törzs szegmentek, gyökerek, valamint protoplasztok, vagy szuszpenzió tenyésztett növényi sejtek is) • · · · · z U .······· teljes növények regeneráltathatók megfelelő tápközegen, mely tartalmazhat antibiotikumokat vagy biocideket a transzformált sejtek szelekciójához. Az így kapott növények a bejuttatott DNS jelenlétére szkrínelhetők.
Ha a bejuttatott DNS egyszer integrálódik a növényi sejt genomjába, általában stabilan ott is marad és megtalálható az eredetileg transzformált sejt utódaiban is. Normális esetben tartalmaz egy szelekciós markért, mely a transzformált sejtnek rezisztenciát biztosít egy biociddel szemben, vagy egy antibiotikummal, például kanamicin, G 418, bleomicin, higromicin, vagy foszfinotricin stb, szemben. A szelektált marker ezért lehetővé kell tegye a transzformált sejt szelekcióját a bejuttatott DNS-t nem tartalmazó sejtekkel szemben.
A transzformált sejtek a sejtek között a szokásos módon fejlődnek (cf. McCormick et al., Plánt Cell Reports 5 (1986), 81-84). Ezek a növények a hagyományos módon szaporíthatok és keresztezhetők ugyanezen transzformált genetikai anyagot vagy más genetikai anyagot tartalmazó növényekkel. A kapott hibrid egyed a megfelelő fenotípusos tulajdonságokkal rendelkezik.
Két vagy több generációt kell felnevelni ahhoz, hogy biztosítsuk, hogy a fenotípusos tulajdonság stabil és örökölhető. Ezenkívül, magot kell gyűjteni ahhoz, hogy biztosítsuk a megfelelő fenotípust vagy más megtartott tulajdonságot.
Egy a fent leírt folyamatok szerint előállított expressziós kazetta bejuttatása a transzformált növényi sejtekben RNS képződéséhez vezet. Ha egy elágazást megszüntető enzimet kódoló DNS szekvenciát a promóterrel sense orientációban kapcsolunk az expressziós kazettában, mRNS szintetizálódik, mely templátként szolgálhat további vagy új elágazást megszüntető enzimek szintéziséhez a növényi sejtekben. Ennek eredményeként ezek a sejtek fokozott elágazást megszüntető enzim aktivitást mutatnak, ami a sejtekben termelt amilopektin elágazási fokának módosulásához vezet. Ezzel a változással, egy olyan keményítőt nyerünk, mely • · · felülmúlja a természetesen előforduló keményítőt egy sokkal koordináltabb térbeli szerkezettel és nagyobb egységességgel. Ez többek között előnyös hatással van a keményítő film képző tulajdonságaira.
Ha egy elágazást megszüntető enzimet kódoló DNS szekvenciát antisense orientációban kapcsolunk a promóterrel, egy antisense RNS szintetizálódik a transzgenikus növényi sejtben, mely gátolja az endogén elágazást megszüntető enzim gének expresszióját. Ennek eredményeként, ezek a sejtek csökkent elágazást megszüntető enzim aktivitással rendelkeznek, ami módosított keményítő képződéséhez vezet. Ezt az antisense technikát használva, lehetőség nyílik olyan növények létrehozására, melyekben az endogén elágazást megszüntető enzim géneket 0-100% között különböző mértékben gátolunk, így lehetővé tesszük olyan növények létrehozását, melyek módosított elégazási fokú amilopektin keményítőt szintetizálnak. Ez egy olyan előnyt képvisel a hagyományos termesztéssel és mutagenezises technikákkal szemben, ami jelentős idő és pénz megtakarítást jelent egy ilyen változat létrehozásában. Az erősen elágazó amilopektin különösen nagy felszínnel rendelkezik és így specifikusan alkalmazható kopolimerként. A nagy elágazási fok ezenkívül az amilopektin jobb vízben való oldékonyságát jelenti. Ez a tulajdonság nagyon előnyös bizonyos technikai alkalmazások esetében. Az elágazást megszüntető enzimeket kódoló, a jelen találmány DNS molekuláinak használatával létrehozott módosított amilopketin termeléshez különösen jól használható a burgonya. Azonban, a jelen találmány alkalmazása nem korlátozódik ezen növény használatára.
A transzgenikus növényekben szintetizált módosított keményítő a növényekből vagy növényi sejtekből hagyományos módszereknek megfelelően izolálható és élelmiszeripari és ipari termékek előállítására használható tisztítás után.
• · · • · ·
Tulajdonságainak köszönhetően, a jelen találmány növényi sejtjeiből és/vagy növényeiből nyerhető keményítő különböző ipari alkalmazásokhoz használható.
Alapjában véve a keményítő két fő kategóriára osztható, nevezetesen a keményítő hidrolízises termékeire és arra, amit natív keményítőnek hívunk. A hidrolízises termékek közé tartoznak lényegében az enzimatikus vagy kémiai folyamatokkal nyert glükóz, valamint a glükózt felépítő blokkok, melyek további folyamatokban használhatók, például fermentációban, vagy további kémiai módosításokhoz. Ebben az összefüggésben fontos lehet, hogy a hidrolízises folyamatot egyszerűen és olcsón lehessen elvégezni. Jelenleg, lényegében amiloglükozidázt használva enzimatikusan végzik. Megfontolandó, hogy a költségek csökkenthetők, a hidrolízishez szükséges enzimek mennyiségének csökkentésével a keményítő szerkezetének módosítása következtében, például a szemcsék felületének növelése követleztében, a jobb emészthetőségnek köszönhetően, kevésbé elágazó vagy térbeli szerkezet következtében, ami a használt enzim hozzáférhetőségét korlátozza.
A natív keményítőnek nevezett rész használata, amit polimer szerkezete következtében alkalmaznak, két nagy területre osztható:
(a) Élelmiszerekben való alkalmazás
A keményítő különböző élelmiszerek klasszikus adalékanyaga, mely élelmiszerekben ez lényegében a vizes adalékok kötőjeként szolgál és/vagy megnövekedett viszkozitást, vagy megnövekdett gélképződést okoz. Fontos jellegzetes tulajdonságok a folyási és szorpciós képesség, a duzzadás és a pasztifikációs hőmérséklet, a viszkozitás és a sűrűsödés, a keményítő oldékonységa, az átlátszóság és a massza állag, a hő, nyírási és sav rezisztencia, a retrogradációs tendencia, filmképzési képesség, • · · • · · • · · · · fagyasztással/olvasztással szembeni rezisztencia, emészthetőség, valamint például szervetlen vagy szerves ionokkal való komplex képzési képesség.
(b) Nem élelmiszerekben való alkalmazás
A másik fő alkalmazási terület a keményítő hatásjavítóként való használata különböző termelési folyamatokban és/vagy technikai termékek adalékaként. A keményítő hatásjavítóként való alkalmazásának fő területe először is a papír és karton ipar. Ezen a területen a keményítőt főként retencióként (a szilárd anyagok visszatartásához), a töltő és finom részecskék írezőjeként, szilárdító anyagként és a dehidrációban használják. Ezenkívül, a keményítő előnyös tulajdonságait - merevség, keménység, szilárdság, tapadás, fényesség, simaság, szakítási erősség, valamint a felületek - hasznosítják.
A papír termelési folyamatban különbséget lehet tenni az alkalmazá négy területe között, nevezetesen felületi kezelés, burkolás, tömeg és “spayezés”.
A felületi kezeléssel kapcsolatban a keményítővel szembeni követelmények közé tartoznak lényegében a fényesség magas foka, a megfelelő viszkozitás, a nagy viszkozitási stabilitás, a jó film képzési tulajdonság, valamint a kis porképzés. Ha burkoló anyagként kerül felhasználásra, a szilárd anyag tartalom, a megfelelő viszkozitás, a nagy kötődési képesség és a nagy pigment affinitás a lényeges. A tömeghez való adalékanyagként a gyors, egységes, veszteségmentes diszperzió, az erős mechanikai stabilitás, a teljes retenció a papír pépben a lényeges tulajdonságok. Ha a keményítőt spayezéshez használják a szilárd anyagok megfelelő tartalma, a nagy viszkozitás valamint a nagy kötődési képesség a lényegesek.
Az alkalmazás egy fő területe például az adhéziós (ragasztó) iparban található, ahol az alkalmazási területeket négy csoportra lehet osztani: a tiszta keményítő ragasztóként, a speciális vegyi anyagokkal készített keményítő • · · · · ragasztóként, a keményítő szintetikus gyanták és polimer diszperziók adalékaként, valamint a keményítő szintetikus ragasztók extendereként való használata. Az összes keményítő alapú ragasztó 90%-át a hullámkarton, a papír zacskók, zsákok, a papír és alumínium alkotóanyagaiként, dobozok előállításában és borítékok, bélyegek stb. nedvesedő ragasztójaként használják.
A hatásjavítóként és adalékanyagként való alkalmazás egyéb területe a textilek és a textil kezelési termékek. A textil iparban a következő négy alkalmazási terület különböztethető meg: a keményítő írező anyagként való használata, azaz a bógáncskiválasztó viselkedés simítására és erősítésére szolgáló adalékként a szövés során aktív nyújtó erők elleni védelemhez, valamint az anyag ellenállás növelésére a szövés során, általában minőségromboló előkezelések (például fehérítés, festés, stb) után a textil feljavításához használt anyagként, a festékek anyagának dúsításához használt anyagként a festék diffúzió megakadályozására és a hosszanti szál adalékaként varrófonalaknál.
Ezenkívül a keményítő felhasználható építőipari anyagok adalékaként is. Egy példa a gipszkarton előállítása, ahol a keményítő híg gipszbe keverve vízzel masszává áll, a gipszlemez felszínére diffundál és így a kartont a lemezhez erősíti. A keményítő egyéb alkalmazási területe a gipszhez és ásványi rostokhoz való keverése. A készre kevert cementben a keményítő a megkötési folyamat lassítására használható.
Ezenkívül a keményítő előnyös olyan eszközök előállítására ami a talaj stabilizálását segíti elő, ami a talaj részecskék ideiglenes védelmére szolgál a vízzel szemben a mesterséges föld áthelyezés esetén. A tudomány mai állásánál keményítőt és polimer emulziókat tartalmazó kombinált termékeket • · · · · • ·· • · · lehet azonos erózió és inkrusztáció csökkentő hatásúnak tartani, mint ezideig használt termékeket, azonban ezek sokkal olcsóbbak.
Ezenkívül a keményítő növényvédőszerekben is használható ezen készítmények specifikus tulajdonságainak módosítása céljából. Például, keményítőket használnak a növényvédő szerek és műtrágyák nedvesedésének javítására, az aktív alkotórészek dozírozott felszabadulására, a folyékony, illő és/vagy szagos aktív alkotórészek mikrokristályokká stabil, deformálható anyagokká való konverziójára, az inkompatibilis készítmények keveréséhez, valamint a csökkent diszintegráció következtében bekövetkező hatás időtartamának meghosszabbítására.
A keményítő másik fontos felhasználási területe a gyógyszerek, a gyógyszeripar és a kozmetikai ipar. A gyógyszeriparban a keményítő tabletták kötőanyagaként használható, vagy a kapszulákban a kötőanyag hígítószereként. Ezenkívül, a keményítő megfelelő diszintegráns a tablettákban, miután lenyelés után folyadékot abszorbeál és rövid idő elteltével megdúzzad annyira, hogy az aktív anyag kiszabadul. Az orvosi folyékony anyagok és porok a keményítő alkalmazásának további területei. A kozmetikumok területén a keményítő használható például a por alakú adalékanyagok, mint például illatosítok vagy szalicilsav hordozójaként is. A keményítő alkalmazásának egy viszonylag széles területe a fogkrémek előállítása.
A keményítő szén és brikett adalékaként való használata szintén elképzelhető. A keményítő hozzáadásával, a szén mennyiségileg agglomerálható és/vagy jó minőségben brikettálható, így megakadályozzuk a brikettek idő előtti szétesését. A grillező szén 4-6% hozzáadott keményítőt tartalmaz a “kalorált” (calorated) szén 0,1-0,5% keményítőt tartalmaz. Ezenkívül, a keményítő kötő ···· · • ·· • · · anyagként is alkalmazható, miután ha a szénhez és briketthez adják, jelentősen csökkenti a toxikus anyagok emisszióját.
Ezenkívül a keményítő derítő anyagként is használható az érc és szén iszap feldolgozásában.
Az alkalmazás másik területe a feldolgozási anyagok adalékaként való használata az öntés során. A különböző öntési folyamatokhoz kötő anyagokkal kevert homokból készített öntödei magokra van szükség. Manapság, a leggyakrabban használt kötő anyag a módosított keményítővel, leggyakrabban duzzadó keményítővel kevert bentonit.
A keményítő hozzáadás célja a folyási rezisztencia növelése és a kötési erősség fokozása. Ezenkívül a dúzzadó keményítők a termelési folyamat több előfeltételének megfelelnek, mint például a hideg vízben való diszpergálhatóság, rehidratálhatóság, jó keverhetőség homokkal és jó vízzel való keverhetőség.
A gumiiparban a keményítő a technikai és optikai minőség javítására használható. Ennek oka a javított felületi fényezés, a ragadás és a megjelenés. Ehhez a célhoz a keményítőt gumi anyagok ragadós gumírozott felületein diszpergáljuk a hideg vulkanizálás előtt. A keményítő felhasználható a gumi préselhetőségének javítása céljából is.
A módosított keményítő másik alkalmazási területe a bőr helyettesítő anyagok előállítása.
A műanyag iparban a következő alkalmazási területek merülnek fel: a keményítőből származó termékek integrációja a feldolgozási folyamatokba (a keményítő csupán egy töltőanyag, nincs közvetlen kötődés a szintetikus polimer és a keményítő között), vagy másik lehetőségként a keményítőből • · · • ···· származó termékek polimerek előállításához való integrációja (a keményítő és a polimer egy stabil kötést hoz létre).
A keményítő tiszta töltőanyagként való használata nem versenghet más anyagok, például a talkum használatával. Más a helyzet, ha a specifikus keményítő tulajdonságok hatékonyakká válnak és a végtermék tulajdonság profilja így egyértelműen megváltozik. Egy példa a keményítő termékek termoplasztikus anyagok, például a polietilén feldolgozásában való használata. így a keményítőt és a szintetikus polimert 1:1 arányban keverjük koexpresszió segítségével egy “master batch” létrehozása céljából, amiből különböző termékeket lehet létrehozni, általános technikák segítségével, granulált polietilént használva. A keményítő polietilén filmekben való integrálása fokozott anyag permeabilitást okozhat az üreges testekben, fokozott víz pára permeabilitást, fokozott antisztatikus viselkedést, fokozott anti-blokkoló viselkedést, valamint fokozott vizes festékekkel való nyomhatóságot.
Másik lehetőség a keményítő poliuretán habokban való használata. A keményítő származékok adaptációjának köszönhetően, valamint a feldolgozási technikák optimalizációjának köszönhetően lehetőség van a szintetikus polimerek és a keményítő hidroxil csoportjai közötti reakciók specifikus szabályozására. Az eredmény olyan poliuretán film, mely a következő tulajdonság profillal rendelkezik a keményítő használatának köszönhetően: a hő expanzió csökkent koeficiense, csökkent zsugorodási viselkedés, javított nyomás/nyúlási viselkedés, fokozott vízgőz permeabilitás a víz befogadási képesség változása nélkül, csökkent gyúlékonyság és repedési sűrűség, az éghető részek nem csökkennek, nincsenek halogenidek, és • · · ·«·* · • · csökkent az öregedés. A még meglevő hátrányok a csökkent nyomási és ütközési erősség.
A filmek termék fejlesztése nem az egyetlen lehetőség. A szilárd műanyag termékek, mint például az edények, tálcák, tálak előállíthatok az 50%-nál nagyobb keményítő tartalom segítségével. Ezenkívül, a keményítő/polimer keverékek azzal az előnnyel rendelkeznek, hogy biológiai úton sokkal könnyebben lebomlanak.
Ezenkívül, kiemelkedő vízkötő képességüknek köszönhetően, a keményítővel oltott polimerek kiemelkedő jelentőségűvé váltak. Ezek olyan termékek, melyek egy keményítő gerinccel rendelkeznek és a szintetikus monomer oldal rácsa van ráoltva a gyökös lánc mechanizmusok elméletének megfelelően. A jelenleg beszerezhető keményítővel oltott polimerek a következőkkel jellemezhetők: fokozott kötődéssel, 1000 g víz/g keményítő visszatartó képességgel nagy viszkozitásnál. Ezen szuper abszorbeálok alkalmazási területe kibővült az útóbbi néhány évben és ezek főként a higénia területén kerültek felhasználásra, például olyan termékek esetében, mint a pelenkák és lepedők, valamint a mezőgazdasági szektorban, például mag pétietekként.
A génsebészetileg módosított új keményítő használatához döntő fontosságú, a szerkezet, a víztartalom, a protein tartalom, a lipid tartalom, a rost tartalom, a hamu/foszfát tartalom, az amilóz/amilopektin arány, a relatív mól tömeg megoszlása, az elágazás foka, a szemcse mérete és formája, valamint a kristályosodás, másrészt pedig a következő jellemzőkből eredő tulajdonságok: folyási és szorpciós viselkedés, a pasztifikációs hőmérséklet, a sűrűsödési képesség, az oldékonyság, a massza szerkezet, az átlátszóság, a hő, nyírás és sav rezisztencia, a retrogradációra való hajlam, a gélképzési képesség, a fagyasz-tással/olvasztással szembeni rezisztencia,
Λ · •·· ··Λ komplex képzési képesség, jód kötés, film képzés, adhéziós erősség, enzim stabilitás, emészthetőség és reaktivitás. Ezenkívül, a viszkozitás különösen fontos.
Ezenkívül, a jelen találmány növényi sejtjeiből és/vagy növényeiből nyerhető módosított keményítő további kémiai módosításnak vethető alá, ami a fent leírt alkalmazási területekhez vagy új alkalmazási területekhez lényeges minőség javulást eredményezhet. Ezek a kémiai módosítások elméletileg ismertek a tudomány e területén képzett szakember számára. Ezek különösen az alábbiak segítségével végrehajtott módosítások:
- savas kezelés
- oxidáció
- észterifikáció (foszfát, nitrát, szulfát, xantát, acetát és cifrát keményítő létrehozása, más szerves savak szintén felhasználhatók az észterifikációhoz)
- keményítő éterek létrehozása (keményítő alkil éter, o-allil éter, hidroxialkil éter, o-karboximetil éter, N-tartalmú keményítő éterek, S-tartalmú keményítő éterek létrehozása)
- elágazó keményítő létrehozása
- keményítővel oltott polimer létrehozása.
A jelen találmány ezenkívül a jelen találmány DNS molekuláival is kapcsolatos, melyeket a vad tpusú növényekhez képest módosított elágazási fokú amilopektin keményítőt szintetizáló növények termelésére használunk.
A jelen találmány egy további célja a találmány DNS molekuláinak, vagy ezen DNS molekulák részeinek, vagy ezen molekulák reverz komplementjeinek használata egy elágazást megszüntető enzim enzimatikus aktivitásával rendelkező proteineket, vagy ilyen proteinek fragmentjét kódoló homológ molekulák növényekből vagy más organizmusokból való azonosítására vagy izolálására. A “homológja” kifejezés meghatározását korábban megadtuk.
·»*· · • * • «· · · • »*
Az 1. ábra a pDBE-Spi plazmidot mutatja
A vékony vonal a pBluescriptSKII(-) plazmid szekvenciájának felel meg. A vastag vonal a Spinacia oleracea elágazást megszüntető enzimjét kódoló cDNS-t képviseli. A cDNS inzertet a plazmid polikötőjének EcoRI és Xhol restrikciós helyei közé ligáltuk. A nyil az elágazást megszüntető enzim kódoló régiójának orientációját jelzi. A cDNS inzert DNS szekvenciáját a 17. számú szekvenciában mutatjuk be.
A 2. ábra a p35S-DBE-Spi plazmidot mutatja
A = A fragment: CaMV 35S promóter, 6909-7437 nukleotid (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294)
B = B fragment: a Spinacia oleracea-bó\ származó, elágazást megszüntető enzimet kódoló cDNS;
a pDBE-Spi plazmidból származó EcoRI/Xhol fragment, körülbelül 3440 bp; a promóterhez viszonyított orientációja: sense
C= C fragment: a pTiACH5 Ti plazmid T-DNS-ének 11748-11939 nukleotidjai (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835-846)
A 3. ábra a Solanum tuberosum-bői származó elágazást megszüntető enzim tisztítását mutatja
O = a Solanum tuberosum gumó szövetének homogenizátumából származó protein kivonat
Durchlauf = a protein kivonat affinitás kromatográfiájának kitöltetlen térfogata immobilizált béta-ciklodextrinen béta-ciklodextrin = az affinitás kromatográfia elúciója oldott béta-ciklodextrinnel 1 mg/ml vagy 10 mg/ml koncentrációban
DBE = Solanum tuberosum-bó\ származó elágazást megszüntető enzim
DE = Solanum tuberosum-bői származó aránytalanító enzim «* * ·«
A 4. ábra a pDBE-Pot plazmidot mutatja
A vékony vonal a pBluescriptSKII(-) plazmid szekvenciájának felel meg. A vastag vonal a Solanum tuberosum elágazást megszüntető enzim egy részét kódoló cDNS-t képviseli. A nyíl az elágazást megszüntető enzim kódoló régiójának orientációját jelzi. A cDNS inzertet a plazmid polikötőjének BamHI és Smal restrikciós helyei közé ligáltuk. A cDNS inzert DNS szekvenciáját a 23. számú szekvenciában mutatjuk be.
Az 5. ábra a p35S-antiDBE-Pot plazmidot mutatja
A = A fragment: CaMV 35S promóter, 6909-7437 nukleotid (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294)
B = B fragment: a Solanum tuberosum-ból származó, elágazást megszüntető enzim egy részét kódoló részleges cDNS szekvencia; a pDBE-Pot plazmidból származó Smal/BamHI fragment, körülbelül 500 bp; a promóterhez viszonyított orientációja: anti-sense
C= C fragment: a pTiACH5 Ti plazmid T-DNS-ének 11748-11939 nukleotidjai (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835-846)
A 6. ábra egy a p35S-DBE-Spi plazmiddal transzformált és a vad típusú burgonya (RE7 sorozat) gumó kivonatból származó elágazást megszüntető enzimre vonatkozó aktivitási gélt mutat.
DBE = elágazást megszüntető enzim
W = vad típusú növény
A számok a vizsgált növény vonalak számát jelzik.
A 7. ábra egy Rapid Visco Analyser által rögzített, burgonyából izolált keményítő vizes oldatainak görbéjét mutatja. Az 1-3 görbék a p35S-DBE-Spi plazmiddal transzformált burgonyából nyert keményítő oldatainak viszkozitását jelzi.
··<· « « · · « · ····
4· *
S - ί • i4« »»
4·· · .
:·*· ··· ···
Összehasonlítás céljából a 4-es görbe a vad típusú keményítő viszkozitási profilját mutatja.
1- es görbe: RE7-34 növény vonal
2- es görbe: RE7-26 növény vonal
3- as görbe: RE7-10 növény vonal
4- es görbe: vad típusú keményítő
A 8. ábra a létrehozott keményítő gélek stabilitását mutatja. A görbék a gél deformálásához szükséges erőt illusztrálják. Az 1-3 erő profilok a p35S-DBESpi plazmiddal transzformált burgonyából nyert keményítőnek felelnek meg. összehasonlításként, a 4-es görbe a vad típusú keményítő erő profilját mutatja:
1- es görbe: RE7-34 növény vonal
2- es görbe: RE7-26 növény vonal
3- as görbe: RE7-10 növény vonal
4- es görbe: vad típusú keményítő
A 9. ábra egy a p35S-antiDBE-Pot plazmiddal transzformált és a vad típusú burgonya (RE500 sorozat) gumó kivonatból származó elágazást megszüntető enzimre vonatkozó aktivitási gélt mutat.
DBE = elágazást megszüntető enzim
W = vad típusú növény
A számok a vizsgált növény vonalak számát jelzik.
A 10. ábra a p35S-antiDBE-Pot plazmiddal transzformált burgonyából származó keményítő szemcse mikroszkopikus fényképét mutatja.
A 11. ábra egy Rapid Visco Analyser által rögzített, burgonyából izolált keményítő vizes oldatainak görbéjét mutatja. Az 1-3 görbék a p35S-antiDBE-Pot plazmiddal transzformált burgonyából nyert keményítő oldatainak
• · · viszkozitását jelzik. Összehasonlítás céljából a 4-es görbe a vad típusú keményítő viszkozitás'! profilját mutatja.
1- es görbe: RE500-47 növény vonal
2- es görbe: RE500-75 növény vonal
3- as görbe: RE500-81 növény vonal
4- es görbe: vad típusú keményítő
A 12. ábra a létrehozott keményítő gélek stabilitását mutatja. A görbék a gél deformálásához szükséges erőt illusztrálják. Az 1-3 erő profilok a p35SantiDBE-Pot plazmiddal transzformált burgonyából nyert keményítőnek felelnek meg. összehasonlításként, a 4-es görbe a vad típusú keményítő erő profilját mutatja:
1- es görbe: RE500-47 növény vonal
2- es görbe: RE500-75 növény vonal
3- as görbe: RE500-81 növény vonal
4- es görbe: vad típusú keményítő
A példák a jelen találmány illusztrálására szolgálnak.
A következő példákban a következő technikákat használjuk:
1. Klónozási technika
Az E. co//'-ban való klónozáshoz a pBluescriptSKII(-) (Stratagene) és a pUC19 plazmidokat használjuk.
A növény transzformáláshoz a gén szerkezeteket a pBinAR vektorba klónozzuk.
• · ·
2, Baktérium törzsek
A pBluescript vektorokhoz a pUC vektorokhoz és a pBinAR szerkezetekhez az E. coli DH5alfa törzset (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, USA) használjuk. Az in vivő kimetszéshez az E. coli XL1-Blu törzset használjuk.
A plazmidok burgonyába való transzformálásához az Agrobacterium tumefaciens C58C1 pGV2260 törzset (Deblaere et al., Nucl. Acids Rés. 13 (1985), 4777-4788) használjuk.
3, Az Agrobacterium tumefaciens transzformálása
A DNS transzferálását Höfgen és Willmitzer (Nucleic Acids Rés. 16 (1988), 9877) módszerét használva közvetlen transzformációval hajtjuk végre. A transzformált Agrobacteriumok plazmid DNS-ét Bimbóim és Doly (Nucleic Acids Rés. 7 (1979), 1513-1523) módszerének megfelelően izoláljuk, majd gél elektroforézises analízisnek vetjük alá a megfelelő restrikció után.
4, Burgonya transzformációja
Burgonya (Solanum tuberosum L. cv. Désirée) steril tenyészet kis leveleit egy szikével megsértjük és 10 ml MS tápközegbe (Murashige and Skook, Physiol. Plánt. 15 (1962), 473) helyezzük, mely 2 % szacharózt és 50 pl szelektíven szaporított Agrobacterium tumefaciens egy éjszakás tenyészetét tartalmazza. Miután a keveréket óvatosan összerázzuk 3-5 percig, tovább inkubáljuk sötétben 2 napig. A kallusz indukcióhoz a leveleket 1,6% glükózt, 5 mg/l naftil ecetsavat, 0,2 mg/l benzil aminopurint, 250 mg/l claforant, 50 mg/l kanamicint és 0,80% Bacto agart tartalmazó MS tápközegre helyezzük. 25 C° hőmérsékleten, 3000 lux mellett tartó 1 hetes inkubálás után a leveleket hajtás indukció céljából 1,6% glükózt, 1,4 mg/l zeatin ribózt, 20 mg/l naftil ecetsavat, 20 mg/lgiberellinsavat, 250 mg/l claforant, 50 mg/l kanamicint és 0,80% Bacto agart tartalmazó MS agarra helyezzük.
• · · ··· ·*· ··· • ····· a a a •· a a·a ·· aaa
5. A DNS fraqmentek radioaktív jelölése
A DNS fragmenteket radioaktív jelöléssel látjuk el a Boehringer (Germany) egy DNS Random Primer Labelling Kit-jét használva a gyártók útmutatásának megfelelően.
6. Northern lenyomat analízis
Standardt technikákat használva RNS-t izolálunk növények levél szövetéből. Agaróz gélen (1,5 % agaróz, 1 x MÉN puffer, 16,6 % formaldehid) 50 pg RNS-t szeparálunk. A gélt rövid ideig vízzel mossuk a gél futtatása után. Az RNS-t 20 x SSC-vel transzferáljuk kapilláris lenyomatolással egy Hybond N nylon membránra (Amersham, UK). Ezután az RNS-t a membránra UV kereszt kötéssel rögzítjük.
A membránt előhibridizáljuk NSEB pufferben 68 C° hőmérsékleten 2 órán keresztül, majd NSEB pufferben hibridizáljuk 68 C° hőmérsékleten egy éjszakán keresztül a radioaktív jelölésű próba jelenlétében.
7. A növény termesztése
A burgonya növényeket üvegházban tenyésztjük a következő körülmények között:
Fény periódus: 16 óra, 25000 lux, 22 C° hőmérséklet
Sötét periódus: 8 óra, 15 C° hőmérséklet
Nedvességtartalom: 60%
8. Az elágazást megszüntető enzim natív gélben való detektálása
Az elágazást megszüntető enzim aktivitás nem-denaturáló gél elektroforézis segítségével történő detektálásához burgonya gumó szövet mintákat tárunk fel 50 mM Tris-HCI (pH 7,6), 2 mM DTT, 2,5 mM EDTA, 10% glicerol és 0,4 mM PMSF elegyében. Az elektroforézist egy MiniProtean II kamrában végezzük el (BioRad) nem denaturáló körülmények között Laemmli módszerének (Natúré 227 (1970), 680685) megfelelően. A 1,5 mm vastag gélek monomer koncentrációja 7,5% (w/v) és a gél 1 % vörös pullulant (Megazyme, Australia) tartalmaz. Protein kivonat azonos mennyiségeit helyezzük fel és szeparáljuk 2 órán keresztül 10 mA/gél értéken.
Ezután az aktivitás géleket 100 mM nátrium acetát (pH 6,0) és 0,1% bétamerkaptoetanol elegyében inkubáljuk 37 C° hőmérsékleten. Az elágazást megszüntető enzim aktivitást a vörös pullulan hidrolízisén keresztül (elszíntelenedés) detektáljuk.
9. Keményítő analízis
A transzgenikus burgonya növények által termelt keményítőt a következő módszerekkel jellemezzük:
a) A foszfát tartalom meghatározása
A burgonya keményítőben némely glükóz egység a C3-as és a C6-os pozícióknál levő szénatomoknál foszforilálható. A glükóz C6 pozíciójánál levő foszforiláltság fokának meghatározásához 100 mg keményítőt hidrolizálunk 1 ml 0,7 M Hcl-ben 95 C° hőmérsékleten 4 órán keresztül (Nielsen et al., Plánt Physiol. 105 (1994), 111-117). 0,7 M KOH-val történő semlegesítés után 50 pl hidrolizátumot vetünk alá fotometriás-enzimatikus tesztnek a glükóz-6-foszfát tartalom meghatározása céljából. A teszt keverék (100 mM imidazol/HCI, 10 mM MgCI2; 0,4 mM NAD; 2 egység glükóz-6-foszfát dehidrogenáz a Leuconostoc mesenteroides-bő\; 30 C° hőmérséklet) abszorpciós változását 334 nm hullámhosszon mérjük.
b) A burgonya növényekből származó amilóz/amilopektin arány meghatározása
A burgonyából a keményítőt standard technikáknak megfelelően határozzuk meg és az amilóz/amilopektin arányt a Hovenkamp-Hermelink et al (Potato Rés. 31 (1988), 241-246) által leírt módszernek megfelelően határozzuk meg.
• · • ·
c) A keményítő vizes oldata viszkozitásának meghatározása
A transzformált burgonya növények által szintetizált keményítő vizes oldata viszkozitásának meghatározása céljából keményítőt izolálunk transzformált növények gumójából. 2 g keményítőt oldunk fel 25 ml H2O-ban és ezt használjuk a Rapid Visco Analyser készülékben (Newport Scientific Pty Ltd., Investment Support Group, Warriewood NSW 2102, Australia) való analízishez. Az analizátort a gyártók útmutatásának megfelelően működtetjük. A keményítő vizes oldata viszkozitásának meghatározásához a keményítő szuszpenziót először 50 C° hőmérsékletről 96 C° hőmérsékletre melegítjük 12 C°/perc sebességgel. Ezt követően, a hőmérsékletet 96 C°-on tartjuk 2,5 percig. Ezután az oldatot 96 C° hőmérsékletről 50 C° hőmérsékletre hűtjük 16,4 C°/perc sebességgel. A teszt teljes ideje alatt mérjük a viszkozitást. Ezen mérések megfelelő eredményeit görbékként ábrázoljuk, mely az idő föggvényében ábrázolja a viszkozitást.
d) A gél stabilitásának meghatározása
A keményítő további jellemezéséhez gél stabilitását mérjük egy TA-XT2 Texture Analyser (Stable Micro System, Unit 105, Blackdown Rural Industries, Haste Hill, Haslemere, Surrey Gu 27 3AY, England) készüléket használva a gyártók útmutatásának megfelelően. A Rapid Visco Analyser (lásd a 9c pontot) készülékből nyert masszát szobahőmérsékleten tároljuk 24 órán keresztül a gél képződés lehetővé tétele céljából. Ezután a gél stabilitást úgy mérjük, hogy egy műanyag próbát (d=10 mm) hagyunk penetrálni a 2 cm vastag gél mintán 0,5 mm/sec sebességgel 7 mm mélységig. A mérés jellegzetes erő profilt eredményez az idő függvényében.
A használt rövidítések
EDTA etilén diamin tetraecetsav
IPTG izopropil béta-D-tiogalakto-piranozid
PAAG poliakrilamid gél
PCR polimeráz lánc reakció
PMSF fenil-metil-szulfonil fluorid
SDS nátrium dodecil szulfát
Felhasznált anyagok és oldatok
A puffer 50 mM nátrium acetát (pH 6,0)
2.5 mM 1,4-ditio-DL-treitol
1.5 mM béta-merkaptoetanol 0,4 mM PMSF nátrium biszulfit, nátrium szulfit és aszkorbinsav nyomnyi mennyisége
B puffer 50 mM MES pH 5,8 NaOH-val
C puffer 250 mM foszfát puffer
250 mM NaCI mM EDTA
7% SDS
25% PEG6000
25% formamid
250 mg/l denaturált hering sperma DNS
H puffer 2 χ SSC χ Denhardt-féle oldat
0,1% SDS mM EDTA mM dinátrium foszfát
250 mg/ml hering sperma DNS 50 mg/ml tRNS x SSC 175,3 g NaCI
88,2 g nátrium citrát
1000 ml-re igazítjuk ddH2O-val pH 7,0 10 N NaOH-val
1, példa
Egy elágazást megszüntető enzim Spinacia oleracea-bó\ való tisztítása és a peptid szekvencia meghatározása
A spenótból származó elágazást megszüntető enzim tisztításához 500 g “középső erétől megfosztott” spenót levelet homogenizálunk 1,5 I B pufferben “homogenizátorban” 1 percen keresztül. A homogenizátumot egy 6 rétegű muszlin ruha szendvicsen átszűrjük. Ha szükséges, a pH értéket 5,8-ra igazítjuk. A homogenizátumot 25000 x g értéken centrifugáljuk 30 percen keresztül. Ezután a proteineket a felülúszóból kicsapatjuk ammónium szulfátos kicsapatással 0 C° hőmérsékleten. Ebből a célból, az ammónium szulfátot folyamatosan adjuk hozzá keverés mellett a felülúszóhoz a telítődési koncentráció 40 %-os koncentrációjának eléréséig. A proteinek kicsapatását keverés mellett további 30 percig folytatjuk. A kicsapatott proteinek centrifugálással (25000 x g, 30 perc) való szeparációja után a kapott felülúszót ammónium szulfáttal keverjük a telítődési koncentráció 50%-os
koncentrációjának eléréséig. A kicsapatást újabb 30 percig folytatjuk. Ezután a keveréket 25000 x g értéken 30 percig centrifugáljuk és a kicsapatott proteineket körülbelül 80 ml B pufferben reszuszpendáljuk. 30000 x g értéken 15 percig tartó centrifugálás után a felülúszót eltávolítjuk és egy B pufferrel ekvilibrált affinitási oszlopra helyezzük. Az affinitási oszlop anyaga expoxy-aktivált szefaróz 6B (Sigma), melyhez béta-ciklodextrint (Ciklo-hepta-amilóz; Sigma) kapcsolunk a Ludwig et al (Plánt Physiol. 74 (1984), 856-861) által leírtaknak megfelelően. Az affinitási oszlopot B pufferrel mossuk, míg az eluátum semmilyen abszorpciót nem mutat 280 nm hullámhosszon. Az elágazást megszüntető enzim elúcióját 1 mg/ml bétaciklodextrinnel végezzük el B pufferben. A frakciókat DNSS teszttel vizsgáljuk az elágazást megszüntető enzim aktivitásra (lásd Ludwig et al., loc. cit.) és összegyűjtjük. A ciklodextrin eltávolítását és a protein oldat koncentrálását Centricon 30 kémcsövekkel (Amicon) hajtjuk végre B pufferrel való többszörös mosással.
A tisztított protein 200 pg mennyiségét BrCN-nel hasítjuk a Matsudaira (“A Practical Guide to Protein and Peptide Purification fór Microsequencing”, Academic Press, Inc., San Diego (1989), p.29) által leírtak szerint. A kapott peptideket SDS poliakrilamid gél elektroforézissel szeparáljuk. A használt gél egy grádiens gél, melyben a poliakrilamid koncentráció 12%-ról 18%-ra nő, állandó, 6 M karbamid koncentráció mellett. A peptideket az SDS gélről egy PVDF membránra visszük félszáraz-elektrolenyomatolással. Az izolált peptidek pepiid szekvenciáját standard technikáknak megfelelően határozzuk meg. A Spinacia oleracea elágazást megszüntető enzimjéből azonosított peptid szekvenciák közül kettő a 13. és a 14.
számú szekvenciákban került leírásra.
• ·
2. példa
Egy spenótból származó elágazást megszüntető enzimet kódoló cDNS izolálása
Az 1. példa szerint nyert spenótból származó elágazást megszüntető enzim peptid szekvenciáját azon oligonukleotid szekvenciák származtatására használjuk, melyek a spenótból származó elágazást megszüntető enzimet kódoló gén DNS szekvenciájának régióit képviselik, ha figyelembe vesszük a genetikai kód degeneráltságát. A származtatott oligonukleotid szekvenciákkal összhangban szintetikus oligonukleotidokat szintetizálunk standard technikák szerint. Ezeket az oligonukleotidokat használjuk a PCR technikával történő amplifikációhoz spenót levelekből származó mRNS-t használva templátként.
Az oligonukleotidok lehető leghatékonyabb kívánt DNS fragmenthez való hibridizációjához a lehető leghosszabb oligonukleotidokat kell használni. Azonban a növekvő hosszúsággal a degeneráltság mértéke is nő, azaz nő a különböző szekvencia kombinációjú oligonukleotidok száma. A 6000-ig terjedő degeneráltsági fok még elfogadható.
A 13. számú szekvenciában leírt peptid szekvenciához a szekvenciát egy 20 bp hosszúságú oligonukleotid próbához származtatjuk. Az oligonukleotid GC tartalma maximálisan 40% és minimálisan 30%. A 14. számú szekvenciában leírt peptid szekvenciához a szekvenciát egy 20 bp hosszúságú oligonukleotid próbához származtatjuk. Az oligonukleotid GC tartalma maximálisan 45% és minimálisan 35%.
Az oligonukleotidok szintéziséhez való szekvencia templátok a következők:
A peptid: NH2-Gln Pro Ile Glu Thr Ile Asn Tyr Val-COOH (13. számú szekvencia)
RNS: 5’ CÁR CCN AUH GAR ACN AUH AAY UAY GUN 3’
A oligo: 3’ TAC GTY GGW TAR CTY TGW TA 5’ (15. számú szekvencia) • * · • ··
B peptid: NH2-Asn Ile Asp Gly Val Glu Gly-COOH (14. számú szekvencia) mRNS: 5’ AAY AUH GAY GGN GUN GAR GGN 3’
B oligo 5’ AAY ATY GAT GGW GTU GAR GG 3’ (16. számú szekvencia)
Az RNS-t spenót levelekből izoláljuk standard technikáknak megfelelően. Ezt használjuk PCR-hoz az A és B oligonukleotidokat használva. Az egyes oligonukleotidok 100 pmol mennyiségeit használjuk reakció keverékenként 52 C° hőmérsékletű anneálási hőmérsékleten és 1,5 mM MgCI2 koncentráció mellett. 30 ciklust hajtunk végre. A PCR körülbelül 500 bp hosszúságú DNS fragmentet eredményez.
Ezt a DNS fragmentet a pUC19 vektorba ligáljuk, melyet a Smal-gyel hasítottuk. A kapott plazmid a pAR1 plazmid. A DNS inzert szekvenciájának egy részét Sanger et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977), 5463-5467) módszerét használva határozzuk meg. A meghatározott szekvencia a 17. számú szekvenciában megadott DNS szekvencia 1920-2216 nukleotidjainak felel meg, a degenerált oligonukleotidokkal bejuttatott hibás párosodások kivételével. Az említett szekvenciából származó aminosav szekvencia 42,2% azonosságot mutat a Klebsiella aerogenes-bő\ származó pulA génnel, mely a pullulanázt kódolja, egy 90 aminosavból álló szakaszon túl.
A spenótból származó elágazást megszüntető enzimet kódoló cDNS molekulák izolálásához egy cDNS könyvtárat szerkesztünk meg a Lambda ΖΑΡ II (Stratagene) vektorban Sonnewald et al., (Planta 189 (1993), 174-181) leírásának megfelelően és a fág fejekbe csomagoljuk. Ezt követően, az XL1-Blue törzs E. coli sejtjeit fertőzzük a cDNS fragmenteket tartalmazó fágokkal és Petri csészékben egy • « · * · ··· ··· táptalajra szélesztjük körülbelül 30000/75 cm2 sűrűségben. Körülbelül 8 órás inkubálás után nitrocellulóz membránokat helyezünk a lizált baktérium rétegre és egy perc elteltével eltávolítjuk. A szűrőt 2 percig 0,2 M NaOH, 1,5 M NaCI elegyében inkubáljuk, majd 2 percig 0,4 M Tris/HCI-ben (pH 7,5) és végül 2 percig 2 x SSC-ben. A szűrőket megszárítjuk UV kereszt kötjük és 42 C° hőmérsékleten 3 órán keresztül inkubáljuk C pufferben a radioaktív jelölésű próba hozzáadása előtt. Próbaként a pAR1 plazmid cDNS inzertjét használjuk. A hibridizációt 42 C° hőmérsékleten hajtjuk végre 12 -16 óra alatt. Ezután a szűrőket 45 C° hőmérsékleten mossuk 15 percig 1 x SSC/0,3% SDS-ben, majd háromszor 15 percig 0,1 x SSC/0,3% SDS-ben, majd autoradiográfiának vetjük alá.
A pozitív fág kiónokat egyediesítjük és standard technikákat használva tovább tisztítjuk. Az in vivő kimetszési módszert használjuk a pozitív fág kiónokból a megfelelő cDNS inzertet tartalmazó kétszálú pBluescript plazmidot tartalmazó E. coli kiónok nyerésére.Az inzertek méret és restrikciós mintázatának vizsgálata után a megfelelő kiónok DNS szekvenciáját meghatározzuk. Több olyan kiónt azonosítunk, melyek a spenótból származó elágazást megszüntető enzimet kódoló inzerteket tartalmaznak, különösen a 17. számú szekvenciában leírt DNS szekvencia 18043067 nukleotidjait magába foglaló cDNS inzerttel rendelkező kiónt. Azonban teljes kiónokat nem nyerünk.
Az elágazást megszüntető enzimet kódoló teljes régiót tartalmazó cDNS molekulák izolálásához spenót levélből származó mRNS-sel rendelkező specifikus cDNS könyvtárat hozunk létre. Ebből a célból, spenót levelekből származó teljes RNS-t izolálunk standard technikáknak megfelelően. A poli(A+) mRNS kinyeréséhez a teljes RNS-t helyezzük egy poli(dT) oszlopra, melyről a poli(A+) mRNS-t eluáljuk.
A poli(A+) mRNS-ből kiindulva cDNS-t hozunk létre Gubler és Hoffmann (Gene 25 (1983), 263-269) módszerének megfelelően egy Xhol oligo d(t)18 primert • · « · » ·*· ·* ··· t · «··· · (» ·* · ··· ·· használva. A cDNS-t Xhol-gyel hasítjuk az EcoRI kötő hozzáadása után és irányított módon egy Lambda Uni-ZAP XR vektorba (Stratagene) ligáljuk, mely vektort EcoRIgyel és Xhol-gyel hasítottunk. Körülbelül 2000000 így létrehozott cDNS könyvtár plakkot szkrínelünk az elágazást megszüntető enzimet kódoló cDNS szekvenciákra. Ebből a célból az XL1-Blue törzs E. coli sejtjeit a cDNS fragmenteket tartalmazó fágokkal fertőzzük és Petri csészékben tápközegre szélesztjük körülbelül 30000/75 cm2 sűrűségben. Körülbelül 8 órás inkubálás után nitrocellulóz membránokat helyezünk a lizált baktérium rétegre, majd 1 perc múlva eltávolítjuk. A szűrőket 2 percig 0,2 M NaOH, 1,5 M NaCl elegyében inkubáljuk, majd 2 percig 0,4 M Tris/HCIben (pH 7,5), majd ezt követően 2 percig 2 x SSC-ben. A szűrőket megszárítjuk UV kereszt kötjük és 42 C° hőmérsékleten 3 órán keresztül inkubáljuk C pufferben a radioaktív jelölésű próba hozzáadása előtt. Próbaként vagy az elágazást megszüntető enzimet kódoló régió csupán részeit tartalmazó fent leírt cDNS inzerteket használjuk, vagy a pAR1 plazmid inzertjét. A 42 C° hőmérsékleten 12 órán át tartó hibridizáció után a szűrőket 45 C° hőmérsékleten mossuk 15 percig 1 x SSC/0,3% SDS-ben majd háromszor 15 percig 0,1 x SSC/0,3% SDS-ben, majd autoradiográfiát végzünk.
A pozitív fág kiónokat egyediesítjük és standard technikákat használva tovább tisztítjuk. Az in vivő kimetszési módszert használjuk a pozitív fág kiónokból a megfelelő cDNS inzertet tartalmazó kétszálú pBluescript plazmidot tartalmazó E. coli kiónok nyerésére. Az inzertek méret és restrikciós mintázatának vizsgálata után a megfelelő kiónok DNS szekvenciáját izoláljuk és a cDNS inzert DNS szekvenciáját meghatározzuk.
««»
3. példa
A pDBE-Spi plazmid cDNS inzertjének szekvencia analízise
A 2. példa szerint nyert E. coli kiónból a pDBE-Spi plazmidot izoláljuk(1. ábra) és cDNS inzertjét standard technikáknak megfelelően meghatározzuk a didezoxi módszert használva (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977), 54635467). Az inzert hosszúsága körülbelül 3437 bp. A nukleotid szekvenciát és a származtatott aminosav szekvenciát a 17. számú szekvenciában mutatjuk be.
4. példa
A p35S-DBE-Spi plazmid megszerkesztése, burgonya növények transzformációja, valamint a szintetizált keményítő jellemzése
A pDBE-Spi plazmidból egy körülbelül 3450 bp hosszúságú DNS fragmentet nyerünk EcoRI/Xhol restrikciós endonukleázzal való emésztéssel, ami a 17. számú szekvenciában bemutatott szekvenciával rendelkezik és a spenót elágazást megszüntető enzim kódoló régióját tartalmazza. Ezt a DNS fragmentet klónozzuk a pBinAR vektorba (Höfgen and Willmitzer Plánt Sci. 66 (1990), 221-230), melyet Smal-gyel hasítottunk. A pBinAR vektor a pBin19 bináris vektor (Bevan, Nucl. Acids Rés. 12 (1984), 8711-8721) származéka.
A pBinAR plazmid megszerkesztését a 12. példában írjuk le.
A kapott plazmidot p35S-DBE-Spi plazmidnak nevezzük és a 2. ábrán írjuk le. A cDNS fragment inzertálása egy olyan expressziós kazettát eredményez, mely az alábbiak (2. ábra) szerinti A, B és C fragmenteket tartalmazza:
Az A fragment (529 bp) a karfiol mozaik vírus (CaMV) 35S promóterét tartalmazza. A fragment magába foglalja a CaMV 6909-7437 nukleotidjait (Franck et al., Cell 21 (1980),285-294).
A B fragment a proteint kódoló régiót tartalmazza, valamint a spenót elágazást megszüntető enzimet kódoló cDNS szomszédos régióit. Ezt egy EcoRI/Xhol fragmentként izoláljuk a pDBE-Spi plazmidból a fent leírtak szerint és a pBinAR plazmidban levő promóterhez sense orientációban fúzionáltatjuk.
A C fragment (192 bp) a pTiACH5 Ti plazmid T-DNS-e 3-as génjének poliadenilációs jelét tartalmazza (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835-846).
A p35S-DBE-Spi plazmid mérete körülbelül 14,2 kb.
A p35S-DBE-Spi vektort burgonya növényi sejtekbe transzferáljuk Agrobacterium tumefaciens által közvetített transzformációval. A transzformált sejtekből intakt növényeket regeneráltatunk.
A spenót elágazást megszüntető enzimjét kódoló mRNS jelenlétének meghatározására szolgáló RNS analízist a sikeresen végrehajtott genetikai módosítás értékelésére lehet használni. Ebből a célból, általában northern lenyomat analízist hajtunk végre. Teljes RNS-t izolálunk növényi szövetből a Logemann et al által leírt (Anal. Biochem. 163 (1987), 16-20) módszernek megfelelően, gél elektroforézissel szeeparáljuk, egy nylon membránra transzferáljuk és egy megfelelő próbához hibridizáltatjuk.
A transzformáció eredményeként a transzgenikus burgonya növények fokozott elágazást megszüntető enzim aktivitást mutatnak (cf 6. ábra).
Az ezen növények által termelt keményítőt ezt követően analizáljuk és jellemezzük. A transzgenikus növények által termelt keményítő viszkozitását és gél stabilitását tekintve különbözik a vad típusú növények által szintetizált keményítőtől.
A viszkozitást egy Rapid Visco Analyser készülékkel határozzuk meg a fent leírt módszernek megfelelően. Az eredményeket a 7. ábrán mutatjuk be. A 7. ábra a 4-es görbén egy tipikus RVA görbét mutat a Désirée változatú burgonya vad típusából izolált keményítő esetében. A transzformált növény vonalak 1-3 görbéi sokkal kisebb - teljesen viszkozitás! maximum mentes állapotot mutat a 96 C° hőmérsékletre való melegítés után, valamint magasabb növekedést az 50 C° hőmérsékletre való hűtés után. A transzgenikus p35S-DBE-Spi növényekből származó keményítő maximális viszkozitása lényegesen csökken a vad típusú növényekből származó keményítőhöz képest. A módosított keményítő végső viszkozitása az ezt követő hűtés után lényegesen magasabb, mint a vad típusú növényekben szintetizált keményítő értékei.
A 8. ábra a transzgenikus növény vonalak keményítőjéből készített gél gél stabilitását mutatja a vad típusú keményítőből készített géléhez viszonyítva. A módosított keményítő gél stabilitása jelentősen eltér. A módosított keményítő géljeinek deformálásához szükséges erő nagyobb, mint a vad típusú keményítőből készített megfelelő gél deformálásához szükséges erő.
A transzgenikus növényekben termelt keményítő foszfát tartalma körülbelül megfelel a vad típusú növényekben termelt keményítő esetén nyert értékeknek (lásd az 1. táblázatot). A mérési hiba körülbelül ±5%.
Az amilóz tartalom Hovenkamp-Hermelink et al (Potato Rés. 31 (1988), 241246) szerint számítható ki. Az amilóz tartalom 5-40%-kal nő (lásd az 1. táblázatot).
1. táblázat
Növények nmol glükóz-6-foszfát/mg keményítő % amilóz
vad típus 9,00 20,4
RE7-10 10,80 21,7
RE7-26 8,23 21,8
RE7-34 8,49 24,3
A RE7-34-es növény vonal mutatja a lég szignifikánsabb eltérést a vad típusú növénytől.
5. példa
A Solanum tuberosum egy elágazást megszüntető enzimjét kódoló genom DNS szekvenciák azonosítása és izolálása
A Solanum tuberosum elágazást megszüntető enzimjét kódoló genom DNS szekvenciák azonosítását és izolálását úgy hajtjuk végre, hogy először egy elágazást megszüntető enzim enzimatikus aktivitásával rendelkező proteineket izolálunk burgonyából, ezen proteinek peptid szekvenciáját meghatározzuk és ezen pepiid szekvenciákból degenerált oligonukleotid szekvenciákat származtatunk, melyeket genom könyvtárak szkrínelésére használunk.
Ez a folyamat részletesen az alábbiakban került leírásra:
(a) Egy Solanum tuberosum-ban levő új elágazást megszüntető enzim azonosítása
Egy Solanum tuberosum-ban levő új elágazást megszüntető enzim azonosítását az alábbiakban leírt ismert módszerekkel hajtjuk végre:
Protein kivonatokat nyerünk Solanum tuberosum gumó szövetéből.
Ebből a célból, 820 g gumó szövetet homogenizálunk 1500 ml A pufferben.
Ezen homogenizátum 50 ml mennyiségét PAAG-ben (lásd a 0 sávot a 3. ábrán) szeparáljuk. A gél 7,5% akrilamidot (pH 7,9) tartalmaz, mely metilén biszakrilamiddal kapcsolódik 1:75 mértékben, valamint 1% amilopektinnel. Az elektroforézishez való puffer rendszer tris/glicint (pH 7,9) tartalmaz. A gél futtatás után a gélt 50 mM tris/citrát (pH 7,0), 2 mM aszkorbinsav elegyében ekvilibráltatjuk 22 C° hőmérsékleten 4 órán keresztül. A gélt Lugol oldattal festjük 15 percen keresztül. A festés eredményeit a 3. ábrán a 0. sávban mutatjuk be. Az elágazást bejuttató enzim (a diszproporcionáló ···· ··· • · ··· ··* (=aránytalanító) enzim elágaztató enzimje) aktivitása eredményeként létrejött vöröses sávon túl megfigyelhető egy erősen kék sáv is. A kék festődés az amilopektin alfa-1,6-glükozidos elágazásainak enzimatikus emésztésének eredménye, ami a vöröses vagy bíbor színt eredményezi.
(b) A Solanum tuberosum-bó\ származó elágazást megszüntető enzim tisztítása és a peptid szekvenciák detektálása
A Solanum tuberosum-bó\ származó elágazást megszüntető enzim tisztítását és a peptid szekvenciák detektálását az alábbi ismert módszereknek megfelelően hajtjuk végre:
A burgonyából származó elágazást megszüntető enzim tisztításához 500 g gumót homogenizálunk 1,5 I B pufferben egy homogenizátorban 1 percen keresztül. A homogenizátumot 6 rétegű muszlin anyagon átszűrjük Ha szükséges, a pH értéket 5,8 értékre állítjuk. A homogenizátumot 25000 x g értéken centrifugáljuk 30 percen keresztül. Ezután a proteineket a felülúszóból kicsapatjuk ammónium szulfátos kicsapatással 0 C° hőmérsékleten. Ebből a célból az ammónium szulfátot folyamatosan adjuk az felülúszóhoz keverés mellett a telítődési koncentráció 40%-os koncentrációjának eléréséig. Amikor a proteinek kicsapódása megkezdődik az elegyet újabb 30 percig keverjük. A kicsapódott proteinek centrifugálással (25000 x g, 30 perc) történő szaparálása után a kapott felülúszót ammónium szulfáttal keverjük a telítődési koncentráció 50%-os koncentrációjának eléréséig. A kicsapatást újabb 30 percig végezzük. Ezután az elegyet 25000 x g értéken centrifugáljuk 30 percig és a kicsapódott proteineket körülbelül 80 ml B pufferben reszuszpendáljuk. 30000 x g értéken 15 percig tartó centrifugálás után a felülúszót eltávolítjuk és egy B pufferrel ekvilibrált affinitás oszlopra helyezzük. Az affinitási oszlop anyaga expoxi aktivált szafaróz 6B (Sigma), melyhez béta-ciklodextrint ···· ···· · • ··· ··· ··· ···. · • - · ··· (ciklohepta-amilóz; Sigma) kötöttünk Ludwig et al (Plánt Physiol. 74 (1984), 856-861) leírásának megfelelően Az affinitási oszlopot a B pufferrel addig mossuk, míg semmilyen abszorpciót nem mérünk 280 nm hullámhosszúságon. A stacioner fázishoz alacsony affinitást mutató protein frakciót béta-ciklodextrin oldatot használva (1 mg/ml A pufferben) eluáljuk, majd ezután leöntjük. A pufferben levő 10 mg/ml béta-ciklodextrin koncentrációnál a burgonya elágazást megszüntető enzim eluál (cf. 3. ábra).
Az eluátum elágazást megszüntető enzimben gazdag frakcióját elektroforézisnek vetjük alá denaturáló PAAG-ben Laemmli (Natúré 227 (1970), 680-685) módszerének megfelelően. A denaturált proteint kivágjuk a gélből és izoláljuk. A peptid szekvenciákat standard technikáknak megfelelően határozzuk meg. A Solanum tuberosum-bő\ származó elágazást megszüntető enzim peptid szekvenciáit az 1. és a 12. számú szekvenciákban mutatjuk be.
(c) A Solanum tuberosum elágazást megszüntető enzimjét kódoló genom DNS szekvenciák azonosítása és izolálása génsebészeti eljárás használatával
A (b) szekcióban leírtak szerint nyert peptid szekvenciákat használjuk olyan oligonukleotid szekvenciák származtatására, melyek a burgonya elágazást megszüntető enzimjét kódoló gének régióit képviselik, ha figyelembe vesszük a genetikai kód degeneráltságát. Standard technikáknak megfelelően szintetikus oligonukleotidokat szintetizálunk a származtatott oligonukleotid szekvenciákkal összhangban. Ezeket a szintetikus oligonukleotidokat használjuk a genom könyvtárak szkrínelésére.
Először egy genom cDNS könyvtárat hozunk létre Liu et al (Plánt Mól. Bioi. 17 (1991), 1139-1154) módszerének megfelelően. Ezt követően, P2392 törzsű E. coli sejteket fertőzünk a genom DNS fragmenteket tartalmazó fágokkal és Petri csészékben tápközegre szélesztjük körülbelül 30000 sejt/75 cm2 sűrűségben. A Petri csészéket 37 C° hőmérsékleten inkubáljuk, addig, míg a fág plakkok megfelelő méretűek nem lesznek (körülbelül 6-8 óra). Ezután a Petri csészéket 4 C° hőmérsékleten tároljuk több órán keresztül. Nitrocellulóz membránokat helyezünk a lizált baktérium rétegre, majd egy perc múlva eltávolítjuk. A szűrőket 2 percig 0,2 M NaOH, 1,5 M NaCl elegyében inkubáljuk, majd 2 percig 0,4 M Tris/HCI-ben (pH 7,5) és végül 2 percig 2 x SSC-ben. A szűrőket megszárítjuk UV kereszt-kötjük és 3 órán keresztül H pufferben inkubáljuk a radioaktív vég jelölésű oligonukleotidok hozzáadása előtt. Hibridizáció után, 12 órán keresztül a szűrőket mossuk kétszer 15 percig 0,2 x SSC/0,1% SDS elegyében, majd autoradiográfiának vetjük alá.
A hibridizáció hőmérsékletét és a szűrők mosását az alábbiak alapján lehet kiszámítani:
T+15 — 16,6 x [Na ] + 0,41 x [% ^ΰοΐιρθη^ιθο^] + 81,5 - 675/hosszúság0|ig0nu|(|eoti(j Az 1. vagy az 5. számú szekvenciákban leírt burgonya elágazást megszüntető enzim peptid szekvenciája felhasználható megfelelő oligonukleotid szekvenciák származtatására. A lehető legmagasabb hibridizációs hőmérséklet eléréséhez - mely megfelelő specifitást biztosít a hibrid képződéshez - a lehető leghosszabb oligonukleotidok használatára van szükség. A növekvő hosszúságggal, azonban nő a degeneráltság foka is, azaz az eltérő szekvencia kombinációval rendelkező oligonukleotidok száma is nő. A 6000-ig terjedő degeneráltsági fok még elfogadható. Ha egy protein esetében több peptid szekvencia is ismert, megfelelő oligonukleotidok származtathatók, kombinálhatok és használhatók a hibridizációhoz való oligonukleotid keverékhez, így a hibridizáció hatékonyságának fokozásához.
Az 1. számú szekvenciában leírt peptid szekvencia egy részéhez egy 20 bázispárból álló oligonukleotid próbához való szekvenciát származtatunk. Az
....« ···· ·*» oligonukleotid degeneráltsági foka 256 a maximálisan 65%-os és minimálisan
40%-os GC tartalom mellett, ami körülbelül 56 C° maximális hibridizációs hőmérsékletet eredményez. Az 5. számú szekvenciában bemutatott pepiid szekvencia egy részéhez egy 20 bázispár hosszúságú oligonukleotid próbához való szekvenciát származtatunk. Az oligonukleotid degeneráltsági foka 384 a maximálisan 55%-os és minimálisan 50%-os GC tartalom mellett, és ez körülbelül 60 C° maximális hibridizációs hőmérsékletet eredményez. Mind a két oligonukleotidot felhasználjuk keverékként a hibridizációhoz 54 C° hőmérsékleten. A szűrőket 45 C° hőmérsékleten mossuk.
A próbák szintéziséhez való szekvencia templát a következő:
1. peptid: NH2-Asp Ser Asp Asp Val Lys Pro Glu Gly-COOH (8-16 aminosavak az 1. számú szekvenciában) mRNS: 5’ GAY GAY GUN AAR CCN GAR GG 3’
1. próba: 3’ CTR CTR CAN TTY GGN CTY CC 5' (19. számú szekvencia)
5. peptid: NH2-lle Gin Val Gly Met Alá Alá -COOH (3-9 aminosavak az 5. számú szekvenciában) mRNS: 5’ AUH CÁR GUN GUN AUG GCN GC 3’
2. próba: 3’ TAD GTY CAI CCI TAC CGI CG 5’ (20. számú szekvencia)
Három szkrínelési ciklusban a használt próbákhoz hibridizálódó DNS inzertet tartalmazó fág kiónokat egyediesítjük, Ily módon körülbelül 40 plakkot azonosítunk 500000 fág plakk szkrínelése során. Ezeket a pozitív fág kiónokat ··»· «
használjuk a spenótból izolált, elágazást megszüntető enzimet kódoló a cDNS szekvenciához (17. számú szekvencia) való hibridizációhoz. Ily módon három fág klón izolálható, melyek a spenótból származó cDNS szekvenciához hibridizálódnak. Az azonosított lambda fág kiónok egyikéből, a ZDepot-ból, standard technikáknak megfelelően DNS-t nyerünk, a DNS inzertet izoláljuk és Sau3A restrikciós endonukleázzal hasítjuk. A kapott alfragmenteket a BamHIgyel hasított pBluescript vektorba ligáljuk. E. coli sejteket transzformálunk a kapott plazmidokkal. A transzformált baktériumokat tápközegre szélesztjük Petri csészében. Annak meghatározásához, hogy melyik baktérium tartalmazza az elágazást megszüntető enzimet kódoló DNS inzertet egy telep hibridizációt hajtunk végre. Ebből a célból egy nitrocellulóz membránt helyezünk a Petri csészében levő szilárd tápközegre. Erre a membránra az E. coli sejt telepek transzferálodnak. A Petri csészét 37 C° hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán keresztül és a membránon levő E. coli sejteket telepekké szaporítjuk. A membránt eltávolítjuk a tápközegről és 5 percig inkubáljuk 10% SDS-ben, 5 percig 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCI elegyében, majd 5 percig 0,5 M Tris/HCI-ben (pH 7,5), majd ezt követően 5 percig 2 x SSCben. A szűrőket megszárítjuk, UV kereszt kötjük és 3 órán keresztül H pufferben inkubáljuk a radioaktív vég jelölésű oligonukleotidok hozzáadása előtt. A hibridizációhoz az 1-es (19. számú szekvencia) és a 2-es (20. számú szekvencia) radioaktív jelölésű próbákat használjuk. Az 54 C° hőmérsékleten 12 órán keresztül végzett hibridizáció után a szűrőket 45 C° hőmérsékleten kétszer mossuk 15 percig 0,2 x SSC/0,1 SDS-ben, majd autoradiográfiának vetjük alá. A használt próbához hibridizálódó telepek baktériumait tenyésztjük és a sejtekből a plazmid DNS-t izoláljuk. Ily módon, a használt oligonukleotidokhoz hibridizálódó inzerteket tartalmazó különböző plazmidokat • · izolálunk. Ezt követően, az izolált plazmidok inzertjeinek DNS szekvenciája egy részét Sanger et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977),5463-5467) módszerének megfelelően meghatározzuk.
6. példa
A Solanum tuberosum-bó\ származó elágazást megszüntető enzimet kódoló cDNS szekvenciák izolálása polimeráz lánc reakciót használva
Az 5. példában nyert részleges genom DNS szekvenciákat az elágazást megszüntető enzimet kódoló spenót cDNS szekvenciához hasonlítjuk. Azt találtuk, hogy az azonosított inzertek közül kettő olyan DNS szekvenciát tartalmaz, melyek a spenót cDNS-ben egymástól körülbelül 500 bázispár távolságra elhelyezkedő két DNS szekvenciával homológok. Ezen szekvenciákból kiindulva két oligonukleotidot szintetizálunk a PCR reakcióhoz. Ezen két oligonukleotid a következő nukleotid szekvenciával rendelkezik:
C oligonukleotid (21. számú szekvencia)
5’ AAGGTACCGG ATCCTCTGCT GATGGCAAGT GGACATTATT 3’
D oligonukleotid (22. számú szekvencia)
5’ TTAAGCCCGG GCGATACGAC AAGGACCATT TGCATTACCA G 3’
A C oligonukleotid az amplifikált DNS fragment egyik végére egy BamHI restrikciós hely bejuttatására szolgál. Ez az oligonukleotid részlegesen homológ a spenót cDNS-sel a 17. számú szekvenciában leírt DNS szekvencia 1082-1110 nukleotidok között. A D oligonukleotid az amplifikálandó DNS fragment másik végére egy Smal restrikciós hely bejuttatására szolgál. Ez az oligonukleotid homológ a spenót cDNS-sel a 17. számú szekvenciában leírt DNS szekvencia 1545-4571 • · · ·· nukleotidok között. Ezeket az oligonukleotidokat használjuk a burgonya gumó cDNS könyvtárból származó DNS fragment amplifikálásához.
Ebből a célból, egy cDNS könyvtárat hozunk létre a burgonya gumó szövetből származó teljes RNS előállításával Logemenn et al (Anal. Biochem. 163 (1987), 1620) módszerét használva. Standard technikákat használva a teljes RNS-ből poliadenilált mRNS-t hozunk létre, majd cDNS szintéziséhez használjuk a Gubler és Hoffmann (Gene 25 (1983), 263) által leírt módszer szerint. A cDNS-t a kereskedelemben beszerezhető EcoRI/Notl adapterekkel ligáljuk, a Lambda ΖΑΡ II (Stratagene) fág DNS EcoRI restrikciós helyére ligáljuk és a fág fejbe zárjuk.
Az így létrehozott cDNS könyvtárból egy körülbelül 500 bázispár hosszúságú DNS fragmentet amplifikálunk PCR-t használva a C és D oligonukleotidokat használva. Ezt a DNS fragmentet a BamHI és Smal restrikciós endonukleázokkal hasítjuk és egy BamHI-gyel és Smal-gyel hasított pBluescript vektorba ligáljuk. A kapott plazmidot pDBE-Pot plazmidnak hívjuk (4. ábra).
Az izolált 500 bázispár hosszúságú fragment szolgál a burgonya elágazást megszüntető enzim teljes kódoló régióját tartalmazó cDNS fragment izolálására a fent leírtak szerint megszerkesztett Lambda ZAP ll-ben levő cDNS könyvtárból hagyományos molekuláris génsebészeti eljárásokat használva.
7. példa
A pDBE-Pot plazmid cDNS inzertjének szekvencia analízise
A 6. példa szerint nyert E. coli kiónból a pDBE-Pot (4. ábra) plazmidot izoláljuk és cDNS inzertjét standard didezoxi módszerrel meghatározzuk (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977), 5463-5467). Az inzert 492 bázispár hosszúságú. Nukleotid szekvenciáját a 23. számú szekvenciában mutatjuk be.
• · · • · · · · · · • · · · · ·
A DNS szekvencia analízise azt mutatja, hogy az 1. számú és a 2. számú szekvenciákban bemutatott peptid szekvenciákat a 23. számú szekvenciában bemutatott DNS szekvencia kódolja két pozícióban található eltéréssel. Az 1. számú szekvencia a 23. számú szekvenciában bemutatott aminosav szekvencia 6-26 aminosavainak felel meg és a 2. számú szekvencia a 23. számú szekvenciában bemutatott aminosav szekvencia 80-99 aminosavainak. Az eltérések adódhatnak abból, hogy a proteint a Désirée változatból izoláltuk, a használt cDNS könyvtárat viszont a Berolina változatból szerkesztettük meg.
8. példa
A p35S-anti-DBE-Pot plazmid megszerkesztése, burgonya növények transzformálása és a szintetizált keményítő jellemzése
A pDBE-Pot plazmidból BamHI-Smal emésztéssel egy körülbelül 500 bázispár hosszúságú DNS fragmentet izolálunk, mely fragment a 23. számú szekvenciában bemutatott szekvenciával rendelkezik és a burgonya elágazást megszüntető enzim kódoló régiójának egy részét tartalmazza. Ezt a DNS fragmentet klónozzuk a BamHI/Smal restrikciós endonukleázokkal hasított pBinAR vektorba (Höfgen and Willmitzer, Plánt Sci. 66 (1990), 221-230). A pBinAR vektor a Bin19 bináris vektor (Bevan, Nucleic Acids rés. 12 (1984), 8711-8721) származéka.
A pBinAR vektort az alábbiak szerint szerkesztjük meg:
A karfiol mozaik vírus 35S promóterének 6909-7437 nukleotidjait tartalmazó 529 bázispár hosszúságú fragmentet (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294) a pDH51 plazmidból egy EcoRI/Kpnl fragmentként izoláljuk (Pietrzak etal., Nucl. Acids Rés. 14, 5857-5868) és a pBin19 plazmid polikötőjének EcoRI és Kpnl restrikciós helyei közé ligáljuk. így kapjuk a pBin19-A plazmidot.
• · ·
A pAGV40 plazmidból (Herrera-Estrella et al., Natúré 303, 209-213) egy 192 bázispár hosszúságú fragmentet izolálunk a Pvull és HindlII restrikciós endonukleázokat használva, ez a fragment tartalmazza a pTiACH5 Ti plazmid TDNS-e 3-as génjének poliadenilációs jelét (Gielen et al., EMBO J. 3, 835846)(11749-11939 nukleotidok). Az Sphl kötők Pvul restrikciós helyhez való hozzáadása után a fragmentet az Sphl és HindlII restrikciós endonukleázokkal hasított pBin19-A plazmidba ligáljuk, ez eredményezi a pBinAR plazmidot.
A kapott plazmidot p35S-anti-DBE-Pot plazmidnak nevezzük és az 5. ábrán mutatjuk be.
A cDNS fragment inzertálása egy olyan expressziós kazettát eredményez, mely az alábbiak szerint az A, B, és C fragmenteket tartalmazza (5. ábra):
Az A fragment (529 bp) a karfiol mozaik vírus (CaMV) 35S promóterét tartalmazza. A fragment a CaMV 6909-7437 nukleotidjait tartalmazza (Franck et al., Cell 21 (1980),285-294).
A B fragment a burgonya elágazást megszüntető enzimet kódoló cDNS proteint kódoló régiójának egy részét tartalmazza. Ezt a részt a pDBE-Pot plazmidból izoláljuk BamHI/Smal fragmentként a fent leírtak szerint, majd a pBinAR plazmidban a promóterhez fúzionáltatjuk anti-sense orientációban.
A C fragment (192 bp) a pTiACHö Ti plazmid T-DNS-se 3-as génjének poliadenilációs jelét tartalmazza (Gielen et al., EMBO J. (1984), 835-846).
A p35S-antiDBS-Pot plazmid mérete körülbelül 11,5 kb.
A p35S-antiDBE-Pot vektort burgonya növényekbe transzferáljuk Agrobacterium tumefaciens által közvetített transzformációval. Intakt növényeket regeneráltatunk a transzformált sejtekből.
• ····· · · ·· · ··· · · ···
Az elágazást megszüntető enzimet kódoló endogén mRNS hiányának megállapítására szolgáló teljes RNS analízis arra használható, hogy megállapítsuk, hogy a növényeket sikeresen módosítottuk-e genetikailag.
A transzformáció eredményeként a transzgenikus burgonya növények csökkent elágazást megszüntető enzim aktivitást mutatnak (cf. 9. ábra).
A vad típusú növényekből származó keményítő szemcsékkel szemben, melyek szabályos kerek formájúak, a transzgenikus növények által termelt keményítő szemcsék durva, repedezett, sőt horzsolt felszínnel rendelkeznek (lásd a 10. ábrát).
A transzgenikus növények által szintetizált keményítő a gélképzés alatti (“paszta képzés”) viszkozitásban, gél stabilitásában és a foszfát tartalomban is eltér még a vad típusú növények által termelt keményítőtől.
A viszkozitást Rapid Visco Analyser segítségével határozzuk meg a fent leírt módszert ahsználva. Az eredményeket a 11. ábrán mutatjuk be. A 11. ábra a 4. görbében egy tipikus RVA görbét mutat a vad típusú növényekből (Désirée változat) izolált keményítő esetében. A transzformált növény vonalak 1-3 görbéi jelentősen csökkent viszkozitási maximumot mutatnak a 96 C° hőmérsékletre való hevítés után és nagyobb viszkozitás növekedést az 50 C° hőmérsékletre való hűtés után azaz magasabb a végső viszkozitás.
A 12. ábra a gátolt növény vonalak keményítőjéből készített gélek gél stabilitását mutatja a vad típusú növényekből származó keményítőből készített gélekhez viszonyítva. A módosított keményítő gél stabilitása jelentősen eltér. A gél deformálásához szükséges erő jelentősen magasabb, mint a vad típusú keményítőből készített megfelelő gél deformálásához szükséges erő.
A transzgenikus növények által szintetizált keményítő foszfát tartalma - az antisense gátlás mértékétől függ ez is - a vad típusú növények által termelt keményítő értékei fölé esik (lásd a 2. táblázatot). A mérés hibája körülbelül ±5%.
• · • · · · · · · • · * · · · ·
Az amilőz tartalmat Hovenkapm-Hermelink et al (Potato Rés. 31 (1988), 241246) módszerének megfelelően számítjuk ki. A transzgenikus növény vonaltól függően, az amilóz tartalom körülbelül azonos, vagy kissé magasabb,, mint a vad típusú keményítő amilóz tartalma (lásd a 2. táblázatot).
2. táblázat
Növények nmol glükóz-6- -foszfát/mg keményítő % amilóz
vad típus 9,00 20,4
RE500-47 14,66 21,7
RE500-81 11,19 19,7
RE500-75 10,42 22,5
• ··
SZEKVENCIA LISTA (1) ÁLTALÁNOS
INFORMÁCIÓ:
(i) FELTALÁLÓ (A)
Forschung (B) (C) (E) (F) (G) (H)
NÉV: Institut fuer Genbiologische
Berlin GmbH
UTCA: Ihnestr. 63
VÁROS: Berlin
ORSZÁG: Németország
IRÁNYÍTÓSZÁM: 14195
TELEFON: +49 30 83000760
TELEFAX: +49 30 83000736 (ii) A TALÁLMÁNY CÍME: Növényekből származó elágazást megszüntető enzimeket kódoló DNS molekulák (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 24 (iv) SZÁMÍTÓGÉPES OLVASÁSI FORMA:
(A) A HORDOZÓ KÖZEG: Floppy lemez (B) SZÁMÍTÓGÉP: IBM PC kompatibilis (C) OPERÁCIÓS RENDSZER: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Verzió #1.30 (EPO) (vi) ELSŐBBSÉGI ADATOK:
(A) AZ ALKALMAZÁS SZÁMA: DE P4447387.7 (B) IKTATÁSI DÁTUM: 22-DEC-1995 (2) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(I) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 21 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nincs (iv) ANTISENSE: nincs (v) A FRAGMENT TÍPUSA: belső (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) ORGANIZMUS: Solanum tuberosum (B) TÖRZS: cv Desirée (C) SZÖVET TÍPUS: gumó • · · · · ·
(xi) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Arg Thr Leu Leu Val Asn Leu Asp Ser Asp Asp Val Lys Pro Glu Gly 1 5 10 15
Gly Asp Asn Leu Gin 20 (2) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(I) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 20 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nincs (iv) ANTISENSE: nincs (v) A FRAGMENT TÍPUSA: belső (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) ORGANIZMUS: Solanum tuberosum (B) TÖRZS: cv Desirée (C) SZÖVET TÍPUS: gumó (xi) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Arg Leu Ser Ser Alá Gly Ile Thr His Val His Leu Leu Pro Thr Tyr 15 10 15
Gin Phe Alá Gly 20 (2) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(I) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 10 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nincs (iv) ANTISENSE: nincs (v) A FRAGMENT TÍPUSA: belső • · · • · · (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) ORGANIZMUS: Solanum tuberosum (B) TÖRZS: cv Desirée (C) SZÖVET TÍPUS: gumó (xi) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gly Ser Glu Val Leu Met His Asp Gly Lys
10 (2) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI :
(I) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 14 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nincs (iv) ANTISENSE: nincs (v) A FRAGMENT TÍPUSA: belső (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) ORGANIZMUS: Solanum tuberosum (B) TÖRZS: cv Desirée (C) SZÖVET TÍPUS: gumó (xi) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Ser Pro Ser Glu Alá Asp Pro Val Glu He Val Gin Leu Lys 15 10 (2) AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(I) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 12 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nincs (iv) ANTISENSE: nincs (v) A FRAGMENT TÍPUSA: belső (vi) EREDETI FORRÁS:
• · (A) ORGANIZMUS: Solanum tuberosum (B) TÖRZS: cv Desirée (C) SZÖVET TÍPUS: gumó (xi) AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Asp Cys Ile Gin Val Gly Met Alá Alá Asn Asp Lys 15 10 (2) A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(I) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 10 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nincs (iv) ANTISENSE: nincs (v) A FRAGMENT TÍPUSA: belső (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) ORGANIZMUS: Solanum tuberosum (B) TÖRZS: cv Desirée (C) SZÖVET TÍPUS: gumó (xi) A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Lys Leu Gin Leu His Pro Val Gin Met Asn
10 (2) A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(I) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 10 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nincs (iv) ANTISENSE: nincs {v) A FRAGMENT TÍPUSA: belső (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) ORGANIZMUS: Solanum tuberosum
6.4 • ·· (B) TÖRZS: cv Desirée (C) SZÖVET TÍPUS: gumó (xi) A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Glu Leu Asp Gly Val Val Trp Ser Alá Glu 15 10 (2) A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(I) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 10 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nincs (iv) ANTISENSE: nincs (v) A FRAGMENT TÍPUSA: belső (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) ORGANIZMUS: Solanum tuberosum (B) TÖRZS: cv Desirée (C) SZÖVET TÍPUS: gumó (xi) A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Ser Leu Leu Asn Ser Leu Ser Thr Glu Lys
10 (2) A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(I) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 11 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nincs (iv) ANTISENSE: nincs (v) A FRAGMENT TÍPUSA: belső (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) ORGANIZMUS: Solanum tuberosum (B) TÖRZS: cv Desirée (C) SZÖVET TÍPUS: gumó • ·«· · • · • · · ··* • · ···· · ·· · ··· (xi) A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Alá Asn Val Glu Arg Met Leu Thr Val Ser Lys 15 10 (2) A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(I) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 15 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nincs (iv) ANTISENSE: nincs (v) A FRAGMENT TÍPUSA: belső (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) ORGANIZMUS: Solanum tuberosum (B) TÖRZS: cv Desirée (C) SZÖVET TÍPUS: gumó (xi) A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Leu Glu Gin Thr Asn Tyr Gly Leu Pro Gin Gin Val Ile Glu Lys 15 10 45 (2) A 11. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(I) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nincs (iv) ANTISENSE: nincs (v) A FRAGMENT TÍPUSA: belső (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) ORGANIZMUS: Solanum tuberosum (B) TÖRZS: cv Desirée (C) SZÖVET TÍPUS: gumó ·«« ··· ··* (xi) A 11. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: Tyr Gly Leu Pro Val Gin Val Phe Glu 1 5 (2) A 12. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(I) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 13 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris.
(ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nincs (iv) ANTISENSE: nincs (v) A FRAGMENT TÍPUSA: belső (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) ORGANIZMUS: Solanum tuberosum (B) TÖRZS: cv Desirée (C) SZÖVET TÍPUS: gumó (xi) A 12. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Arg Thr Leu Leu Val Asn Leu Asn Ser Asp Asp Val Lys 15 10 (2) A 13. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(I) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nincs (iv) ANTISENSE: nincs (v) A FRAGMENT TÍPUSA: belső (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) ORGANIZMUS: Spinacia oleracea (C) SZÖVET TÍPUS: levél (xi) A 13. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
» 1· ·· ·· »»ν· ·*· · • · · • · * · • · ···« «* « · *· · • ··
Gin Pro Ile Glu Thr Ile Asn Tyr Val 1 5 (2) A 14. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(I) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 7 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nincs (iv) ANTISENSE: nincs (v) A FRAGMENT TÍPUSA: belső (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) ORGANIZMUS: Spinacia oleracea (C) SZÖVET TÍPUS: levél (xi) A 14. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Asn Ile Asp Gly Val Glu Gly
5 (2) A 15. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(I) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: más nukleinsav (A) LEÍRÁS: /desc = oligonukleotid (iii) HIPOTETIKUS: van (iv) ANTISENSE: nincs (xi) A 15. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATWGTYTCRA TWGGYTGCAT 20 (2) A 16. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(I) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú • «·· * < · « • · · ·«« · • « ···· V <*· · 4·» * (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: más nukleinsav (A) LEÍRÁS: /desc = oligonukleotid (iii) HIPOTETIKUS: van (iv) ANTISENSE: nincs
...(ix) JELLEMZŐ:
(A) NÉV/KULCS: módosított bázis (B) LOKÁCIÓ: 15 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓK: /mod-bázis = i (xi) A 16. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEIRASA:
AAYATYGATG GWGTGGARGG (2) A 17. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(I) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 3437 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: kétszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA:cDNS - mRNS (iii) HIPOTETIKUS: nincs (iv) ANTISENSE: nincs • · · · (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) ORGANIZMUS: Spinacia oleracea (C) SZÖVET TÍPUS: levél
...(ix) JELLEMZŐ:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) LOKÁCIÓ: 201 3095 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék= elágazást megszüntető enzim (R-Enzim (xi) A 17. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AAAACATTCC GATTAGCGGC AAATAACAAA CCCCAAACAA ACTCTAACCA TGAAATCTCA
TCTTTTTAAC ATCATTTTTC ATCGAAATCT ACGTTCTGTA ACTAATTTTC CCACTTTACA
GCATCATTCT TCATCTGCTC AACTGAATTT TCTGCTTAAA CCGCCATAGC CAAAAACTTC
120
0
AACCTCACAT TATCGCTCTA ATG TCT TCA CTA TAT AAC CCC ATT GCT CTT 230
Met Ser Ser Leu Tyr Asn Pro Ile Alá Leu
10
GCT Alá TCT AGT TTC Phe CAT His 15 CAC His CAT TAT CCT AAT CTT CGT TTT CTA Leu CCC Pro 25 TTT Phe 278
Ser Ser His Tyr Pro Asn 20 Leu Arg Phe
AAT TTC AAT TTT ATT ACC AAA TTA CCC GTT TCT AAT TCC TTT GCT ATT 326
Asn Phe Asn Phe Ile Thr Lys Leu Pro Val Ser Asn Ser Phe Alá Ile
30 35 40
GGG TCT AGT TCT AGA AGC TTC CAT TCA TCG CCA TTG AAG AAG GAT TCT 374
Gly Ser Ser Ser Arg Ser Phe His Ser Ser Pro Leu Lys Lys Asp Ser
45 50 55
TCT TGC TTT TGT TGT TCC ATG GCT GTC GAA GTT GGT TCT GCT TCT TCT 422
Ser Cys Phe Cys Cys Ser Met Alá Val Glu Val Gly Ser Alá Ser Ser
60 65 70
GTT TCT CAG AGT GAA TTG CAA GGA AGT TTG AAT AGT TGT AGA GCG TAT 470
Val Ser Gin Ser Glu Leu Gin Gly Ser Leu Asn Ser Cys Arg Alá Tyr
75 80 85 90
TGG CCT AGC AAG TAT ACA TTT GCC TGG AAT GTT GAT ATT GGT AAT GGT 518
Trp Pro Ser Lys Tyr Thr Phe Alá Trp Asn Val Asp Ile Gly Asn Gly
95 100 105
TCA TAT TAC TTA TTT GCA AGT AAA ACT GCT GCC CTA AAG TTT ACA GAT 566
Ser Tyr Tyr Leu Phe Alá Ser Lys Thr Alá Alá Leu Lys Phe Thr Asp
110 115 120
GCT GGG ATA GAA GGA TAC GAC GTG AAA ATC AAG CTT GAC AAG GAC CAA 614
Alá Gly Ile Glu Gly Tyr Asp Val Lys Ile Lys Leu Asp Lys Asp Gin
125 130 135
GGG GGA TTG CCA GCA AAT GTC ACT GAA AAA TTT CCT CAT ATT AGA GGT 662
Gly Gly Leu Pro Alá Asn Val Thr Glu Lys Phe Pro His Ile Arg Gly
140 145 150
TAC TCG GCC TTT AAA GCT CCA GCC ACA CTG GAT GTT GAT AGT CTG CTG 710
Tyr Ser Alá Phe Lys Alá Pro Alá Thr Leu Asp Val Asp Ser Leu Leu
155 160 165 170
AAG TGT CAA CTT GCA GTT GCT GCT TTC AGT GCT GAC GGG GCT TGC AGA 758
Lys Cys Gin Leu Alá Val Alá Alá Phe Ser Alá Asp Gly Alá Cys Arg
175 180 185
AAT GCT ACT GGT TTG CAG TTG CCT GGC GTT ATT GAT GAG TTG TAT TCA 806
Asn Alá Thr Gly Leu Gin Leu Pro Gly Val Ile Asp Glu Leu Tyr Ser
190 195 200
TAT Tyr GAT Asp GGC CCT CTG GGT GCT GTT TTC TCA GAA AAC ACC ATA Ile TCA Ser CTG Leu 854
Gly 205 Pro Leu Gly Alá Val 210 Phe Ser Glu Asn Thr 215
TAC CTA TGG GCT CCT ACT GCT CAA GCT GTT TCT GCC AGC ATA TTT AAG 902
Tyr Leu Trp Alá Pro Thr Alá Gin Alá Val Ser Alá Ser Ile Phe Lys
220 225 230
GAT CCA TCA GGT GGT GAA CCA TTA CAA ACC GTC CAG CTT ATA GAG TCA 950
Asp Pro Ser Glv Gly Glu Pro Leu Gin Thr Val Gin Leu Ile Glu Ser
235 240 245 250
AAT GGT GTT TGG AGC GCT GTG GGG CCA AGA ACC TGG GAG GGG TGT TAT 998
Asn Gly Val Trp Ser Alá Val Gly Pro Arg Thr Trp Glu Gly Cys Tyr
255 260 265
TAT GTT TAT GAA ATC ACT GTC TAT CAC CAT AGC ACC TTG AGA ATT GAA 1046
Tyr Val Tyr Glu Ile Thr Val Tyr His His Ser Thr Leu Arg Ile Glu
270 275 280
AAA AGC TTT GCT Alá ATT GAT CCA TAT GCC AGA GGG ATT TCA GCT GAT GTA 1094
Lys Ser Phe 285 Ile Asp Pro Tyr 290 Alá Arg Gly Ile Ser 295 Alá Asp Val
AAG CGA ACA TTA TTG GCT GAC TTA AGC TCT GAA ACT CTA AAG CCT GAA 1142
Lys Arg Thr Leu Leu Alá Asp Leu Ser Ser Glu Thr Leu Lys Pro Glu
300 305 310
GGA TGG GAA AAT CTT GCT GAT GAA AAA CCT CAT CTT CTT TCT CCA TCT 1190
Gly Trp Glu Asn Leu Alá Asp Glu Lys Pro His Leu Leu Ser Pro Ser
315 320 325 330
GAC ATC AGT CTC TAT GAG CTG CAT ATA AGA GAT TTC AGT GCT TAT GAC 1238
Asp Ile Ser Leu Tyr Glu Leu His Ile Arg Asp Phe Ser Alá Tyr Asp
335 340 345
CTC ACT GTG CAC CCT GAC CTT CGT GGT GGA TAT CTT GCT TTC ACT TCA 1286
Leu Thr Val His Pro Asp Leu Arg Gly Gly Tyr Leu Alá Phe Thr Ser
350 355 360
CAG GAC TCA GCT GGT GTT AAT CAT TTG GAA AAG TTA TCT GCT GCT GGT 1334
Gin Asp Ser Alá Gly Val Asn His Leu Glu Lys Leu Ser Alá Alá Gly
365 370 375
CTT ACT CAC GTT CAT CTG CTG CCA AGC TTC CAG TTT GCT GAA GTT GAT 1382
Leu Thr His Val His Leu Leu Pro Ser Phe Gin Phe Alá Glu Val Asp
380 385 390
GAT GAC AAA AAG AAG TGG AAA TTT GTT GAT ACT AAG AGG TTT GAA ACA 1430
Asp Asp Lys Lys Lys Trp Lys Phe Val Asp Thr Lys Arg Phe Glu Thr
395 400 405 410
CTA CCA CCT GAT TCA GAA GAG CAA CAA GCT CAA ATA ACT GCC ATC CGA 1478
Leu Pro Pro Asp Ser Glu Glu Gin Gin Alá Gin Ile Thr Alá Ile Arg
415 420 425
GAT GAA GAT GGA TAT AAC TGG GGG TAT AAT CCT GTT TTG TGG GGA ACT 1526
Asp Glu Asp Gly Tyr Asn Trp Gly Tyr Asn Pro Val Leu Trp Gly Thr
430 435 440
CCT AAG GGA AGC TAT GCA ACA GAT CCA AAT GGT CCA TGC CGT ATA ATT 1574
Pro Lys Gly Ser Tyr Alá Thr Asp Pro Asn Gly Pro Cys Arg Ile Ile
445 450 455
GAG TTC AGA AAG ATG GTC CAG GCG CTA AAT CGT ATT GGT CTT CGC GTA 1622
Glu Phe Arg Lys Met Val Gin Alá Leu Asn Arg Ile Gly Leu Arg Val
460 465 470
r 71 • · · · • • • · • · • · · • · ··· · · · • · · · · • · · · · ·
GTT TTG GAT GTT GTT TAT AAC CAT TTA AAT AGC AGT GGG CCC TCC GAT 1670
Val Leu Asp Val Val Tyr Asn His Leu Asn Ser Ser Gly Pro Ser Asp
475 480 485 490
GAT AAT TCT GTC CTG GAC AAG ATT GTT CCA GGT TAC TAC TTA AGA AGA 1718
Asp Asn Ser Val Leu Asp Lys Ile Val Pro Gly Tyr Tyr Leu Arg Arg
495 500 505
GAT AAT GAT GGT GCT ATT GAA AAT AGC ACA TGT GTG AAT GAC ACA GCT 1766
Asp Asn Asp Gly Alá Ile Glu Asn Ser Thr Cys Val Asn Asp Thr Alá
510 515 520
AGC GAG CAT TTT ATG GTT GAA CGC CTG ATT TTG GAT GAT CTA AAA CAT 1814
Ser Glu His Phe Met Val Glu Arg Leu Ile Leu Asp Asp Leu Lys His
525 530 535
TGG GCG GTG AAT TAT AAG GTT GAT GGT TTC AGA TTT GAT CTT ATG GGC 1862
Trp Alá Val Asn Tyr Lys Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Gly
540 545 550
CAC ATA ATG AAA CAT ACG ATG GTG AAA GCG ACA AAT ATG CTC CAA GGC 1910
His Ile Met Lys His Thr Met Val Lys Alá Thr Asn Met Leu Gin Gly
555 560 565 570
CTG TCA AAA AAC ATA GAT GGT GTA GAG GGT TCA AGC ATT TAT TTA TAT 1958
Leu Ser Lys Asn Ile Asp Gly Val Glu Gly Ser Ser Ile Tyr Leu Tyr
575 580 585
GGT GAA GGA TGG GAC TTT GGC GAG GTG GCA AAT AAT GCA CGT GGA GTA 2006
Gly Glu Gly Trp Asp Phe Gly Glu Val Alá Asn Asn Alá Arg Gly Val
590 595 600
AAT GCA TCT CAA CTG AAT CTT GGA GGA ACA GGA ATT GGA AGT TTT AAT 2054
Asn Alá Ser Gin Leu Asn Leu Gly Gly Thr Gly Ile Gly Ser Phe Asn
605 610 615
GAT CGG ATT CGA GAT GCA GTG CTT GGT GGG GGG CCT TTT GGT CCC CCT 2102
Asp Arg Ile Arg Asp Alá Val Leu Gly Gly Gly Pro Phe Gly Pro Pro
620 625 630
CTT CAG CAA GGT TAC GTG ACT GGT TTA TCT TTA CAG CCT AAT GAT CAT 2150
Leu Gin Gin Gly Tyr Val Thr Gly Leu Ser Leu Gin Pro Asn Asp His
635 640 645 650
GAC CAT AGC GGT AAA GCC AAT GCA GAC CGT ATG CTT GCT GTG GCA AAA 2193
Asp His Ser Gly Lys Alá Asn Alá Asp Arg Met Leu Alá Val Alá Lys
655 660 665
GAT CAT ATC CAG GTT GGG ATG GCT GGA AAC TTG AGA GAC TAC ATT CTG 224 6
Asp His Ile Gin Val Gly Met Alá Gly Asn Leu Arg Asp Tyr Ile Leu
670 675 680
ACA AAC TGT GAT GGA AAA CAG GTA AAA GGC TCA GAA GTT TAT ACC TAT 2294
Thr Asn Cys Asp Gly Lys Gin Val Lys Gly Ser Glu Val Tyr Thr Tyr
685 690 695
GGG GGA ACG CCG GTT GGG TAT GCT ATG CAG CCG ATA GAA ACT ATC AAC 2342
Gly Gly Thr Pro Val Gly-Tyr Alá Met Gin Pro Ile Glu Thr Ile Asn
700 705 710
TAT GTC TCA GCT CAT GAC AAC GAA ACT CTT TTC GAT ATT GTC AGT TTG 2390
Tyr Val Ser Alá His Asp Asn Glu Thr Leu Phe Asp Ile Val Ser Leu
715 720 725 730
AAG ACT CCT ACC TAC ATT ACG GTG GAT GAG AGA TGT AGG GTA AAT CAT 2438
Lys Thr Pro Thr Tyr Ile Thr Val Asp Glu Arg Cys Arg Val Asn His
735 740 745 • · · ··· ··· ··· • ···· · · • · ··· ·» · · ·
ΤΤΑ GCT ACG AGT ATT CTA GCA CTT TCC CAG GGA ATA CCC TTT TTC CAT 2486
Leu Alá Thr Ser 750 Ile Leu Alá Leu Ser 755 Gin Gly Ile Pro ' Phe 760 Phe His
GCT GGT GAT GAG TTG CTA CGT TCA AAG TCC CTT GAC CGT GAT TCT TAT 2534
Alá Gly Asp 765 Glu Leu Leu Arg Ser 770 Lys Ser Leu Asp Arg 775 Asp Ser Tyr
AAC TCT GGT GAT TGG TTT AAC AGA TTA GAC TTC AGC TAT AAC TCC AAC 2582
Asn Ser Gly Asp Trp Phe Asn Arg Leu Asp Phe Ser Tyr Asn Ser Asn
780 785 790
AAT Asn 795 TGG Trp GGT Gly GTT Val GGT Gly CTC Leu 800 CCT Pro CCC Pro AAG Lys GAT Asp CAC His 805 AAT Asn GAG Glu AGC Ser AAT Asn TGG Trp 810 2630
CCA TTA ATC AAG AAA AGA TTG GCA AAT CCG TCC TAC AAG CCT GAC AAG 2678
Pro Leu Ile Lys Lys 815 Arg Leu Alá Asn Pro 820 Ser Tyr Lys Pro Asp 825 Lys
AAT CAC ATT ATT GCT GCT GTT GAA AAT TTC ACC AAT TTG TTG CAA ATT 2726
Asn His Ile Ile 830 Alá Alá Val Glu Asn 835 Phe Thr Asn Leu Leu 840 Gin Ile
AGA TAC TCT TCT CCA CTA TTC CGT TTA AGA AGT GCA AAG GAT ATT GAG 2774
Arg Tyr Ser 845 Ser Pro Leu Phe Arg 850 Leu Arg Ser Alá Lys 855 Asp Ile Glu
GAT CGA GTA CGA TTC CAC AAT AAT GTT CCA TCT TGG ATT CCT GGG CTT 2822
Asp Arg 860 Val Arg Phe His Asn 865 Asn Val Pro Ser Trp 870 Ile Pro Gly Leu
ATA GCT ATG AGC ATT GAA GAT GGT CAT GCG GGA GCC CCT GGC TTG TCA 2870
Ile 875 Alá Met Ser Ile Glu 880 Asp Gly His Alá Gly 885 Alá Pro Gly Leu Ser 890
CAG ATA GAT CCC AAG TTC CAG TAC ATT GTT GTA ATA ATC AAT GTT CAG 2918
Gin Ile Asp Pro Lys 895 Phe Gin Tyr Ile Val 900 Val Ile Ile Asn Val 905 Gin
CCT ACT GAA ACC AAA TTT GTT AAC CCA GAT CTG CGA GCT AAA TCC CTA 2966
Pro Thr Glu Thr 910 Lys Phe Val Asn Pro 915 Asp Leu Arg Alá Lys 920 Ser Leu
CAG CTG CAT CCA GTA CAG TCA ACA TCA GGG GAC ACG GTT GTT AAG GAA 3014
Gin Leu His 925 Pro Val Gin Ser Thr 930 Ser Gly Asp Thr Val 935 Val Lys Glu
TCA AAG TAT GAG CCT TCT ACT GGA TGC TTT ACT ATA CCT CCT AAA TCA 3062
Ser Lys Tyr Glu Pro Ser Thr Gly Cys Phe Thr Ile Pro Pro Lys Ser
940 945 950
ACT GCA GTG TTC GTT GAG CCA CGG Thr Alá Val Phe Val Glu Pro Arg : 955 960 CAT GTT TAA His Val * 965 GCTGAAGTTG AAGGGTCTGT 3115
CCAAGACGGC GACCGCATGT GGTTGTCAGT AAGTGGAGTT ACTTTCTGCA TATTACACGG 3175
TTCAATACAA ATAAATAACG TCTGCTACCG CAGCGAGCTG AGGTCTCACA GAATAAGTTA 3235
CAAAAAAGTT AGCAGTTATA TTTCATAAGT TCATAGTTCA GCTGAATAAG AACCACCAAA 3295
ATCTTACGTT GTACTTGTAG CAGTGCTTTT GTCACGCATA AATAATCAGT TGCTTGTTAA 3355
CCATACATCC GATATGAATG AATAATTTTT TTTTTTTTAA ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ 3415
ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑ
3437 • · · ··· · · · ··· • ····« · · · ·· · ··· · · · · · (2) A 18. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(I) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 965 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein
Met 1 Ser (xi) Ser A Leu 18. Tyr 5 SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Asn Pro Ile Alá Leu 10 Alá Ser Ser Phe His 15 His
His Tyr Pro Asn 20 Leu Arg Phe Leu Pro Phe 25 Asn Phe Asn Phe Ile 30 Thr
Lys Leu Pro 35 Val Ser Asn Ser Phe Alá Ile 40 Gly Ser Ser Ser Arg 45 Ser
Phe His 50 Ser Ser Pro Leu Lys 55 Lys Asp Ser Ser Cys 60 Phe Cys Cys Ser
Met 65 Alá Val Glu Val Gly 70 Ser Alá Ser Ser Val Ser 75 Gin Ser Glu Leu 80
Gin Gly Ser Leu Asn 85 Ser Cys Arg Alá Tyr 90 Trp Pro Ser Lys Tyr 95 Thr
Phe Alá Trp Asn 100 Val Asp Ile Gly Asn Gly 105 Ser Tyr Tyr Leu Phe 110 Alá
Ser Lys Thr 115 Alá Alá Leu Lys Phe Thr Asp 120 Alá Gly Ile Glu Gly 125 Tyr
Asp Val 130 Lys Ile Lys Leu Asp 135 Lys Asp Gin Gly Gly 140 Leu Pro Alá Asn
Val 145 Thr Glu Lys Phe Pro 150 His Ile Arg Gly Tyr Ser 155 Alá Phe Lys Alá 160
Pro Alá Thr Leu Asp 165 Val Asp Ser Leu Leu 170 Lys Cys Gin Leu Alá 175 Val
Alá Alá Phe Ser 180 Alá Asp Gly Alá Cys Arg 185 Asn Alá Thr Gly Leu 190 Gin
Leu Pro Gly 195 Val Ile Asp Glu Leu Tyr Ser 200 Tyr Asp Gly Pro Leu 205 Gly
Alá Val 210 Phe Ser Glu Asn Thr 215 Ile Ser Leu Tyr Leu 220 Trp Alá Pro Thr
Alá 225 Gin Alá Val Ser Alá 230 Ser Ile Phe Lys Asp Pro 235 Ser Gly Gly Glu 240
Pro Leu Gin Thr Val 245 Gin Leu Ile Glu Ser 250 Asn Gly Val Trp Ser 255 Alá
Val Gly Pro Arg 260 Thr Trp Glu Gly Cys Tyr 265 Tyr Val Tyr Glu Ile 270 Thr
Val Tyr His 275 His Ser Thr Leu Arg Ile Glu 280 Lys Ser Phe Alá Ile 285 Asp
Pro Tyr 290 Alá Arg Gly Ile Ser 295 Alá Asp Val Lys Arg 300 Thr Leu Leu Alá
Asp 305 Leu Ser Ser Glu Thr 310 Leu Lys Pro Glu Gly Trp 315 Glu Asn Leu Alá 320
• «
Asp Glu Lys Pro His 325 Leu Leu Ser Pro Ser Asp 330 Ile Ser Leu Tyr Glu 335
Leu His Ile Arg Asp Phe Ser Ala Tyr Asp Leu Thr Val His Pro Asp
340 345 350
Leu Arg Gly Gly Tyr Leu Ala Phe Thr Ser Gin Asp Ser Ala Gly Val
355 360 365
Asn His Leu Glu Lys Leu Ser Ala Ala Gly Leu Thr His Val His Leu
370 375 380
Leu Pro Ser Phe Gin Phe Ala Glu Val Asp Asp Asp Lys Lys Lys Trp
385 390 395 400
Lys Phe Val Asp Thr Lys Arg Phe Glu Thr Leu Pro Pro Asp Ser Glu
405 410 415
Glu Gin Gin Ala Gin Ile Thr Ala Ile Arg Asp Glu Asp Gly Tyr Asn
420 425 430
Trp Gly Tyr Asn Pro Val Leu Trp Gly Thr Pro Lys Gly Ser Tyr Ala
435 440 445
Thr Asp Pro Asn Gly Pro Cys Arg Ile Ile Glu Phe Arg Lys Met Val
450 455 460
Gin Ala Leu Asn Arg Ile Gly Leu Arg Val Val Leu Asp Val Val Tyr
465 470 475 480
Asn His Leu Asn Ser Ser Gly Pro Ser Asp Asp Asn Ser Val Leu Asp
485 490 495
Lys Ile Val Pro Gly Tyr Tyr Leu Arg Arg Asp Asn Asp Gly Ala Ile
500 505 510
Glu Asn Ser Thr Cys Val Asn Asp Thr Ala Ser Glu His Phe Met Val
515 520 525
Glu Arg Leu Ile Leu Asp Asp Leu Lys His Trp Ala Val Asn Tyr Lys
530 535 540
Val 545 Asp Gly Phe Arg Phe 550 Asp Leu Met Gly His 555 Ile Met Lys His Thr 560
Met Val Lys Ala Thr 565 Asn Met Leu Gin Gly 570 Leu Ser Lys Asn Ile 575 Asp
Gly Val Glu Gly 580 Ser Ser Ile Tyr Leu 585 Tyr Gly Glu Gly Trp 590 Asp Phe
Gly Glu Val 595 Ala Asn Asn Ala Arg 600 Gly Val Asn Ala Ser 605 Gin Leu Asn
Leu Gly 610 Gly Thr Gly Ile Gly 615 Ser Phe Asn Asp Arg 620 Ile Arg Asp Ala
Val 625 Leu Gly Gly Gly Pro 630 Phe Gly Pro Pro Leu 635 Gin Gin Gly Tyr Val 640
Thr Gly Leu Ser Leu 645 Gin Pro Asn Asp His 650 Asp His Ser Gly Lys 655 Ala
Asn Ala Asp Arg 660 Met Leu Ala Val Ala 665 Lys Asp His Ile Gin 670 Val Gly
Met Ala Gly Asn Leu Arg Asp Tyr Ile Leu Thr Asn Cys Asp Gly Lys 675 680 685
75
Gin Val Lys Gly Ser Glu Val Tyr Thr Tyr Gly Gly Thr Pro Val Gly
690 695 700
Tyr Alá Met Gin Pro Ile Glu Thr Ile Asn Tyr Val Ser Alá His Asp
705 710 715 720
Asn Glu Thr Leu Phe Asp Ile Val Ser Leu Lys Thr Pro Thr Tyr Ile
725 730 735
Thr Val Asp Glu Arg Cys Arg Val Asn His Leu Alá Thr Ser Ile Leu
740 745 750
Alá Leu Ser Gin Gly Ile Pro Phe Phe His Alá Gly Asp Glu Leu Leu
755 760 765
Arg Ser Lys Ser Leu Asp Arg Asp Ser Tyr Asn Ser Gly Asp Trp Phe
770 775 780
Asn Arg Leu Asp Phe Ser Tyr Asn Ser Asn Asn Trp Gly Val Gly Leu
785 790 795 800
Pro Pro Lys Asp His Asn Glu Ser Asn Trp Pro Leu Ile Lys Lys Arg
805 810 815
Leu Alá Asn Pro Ser Tyr Lys Pro Asp Lys Asn His Ile Ile Alá Alá
820 825 830
Val Glu Asn Phe Thr Asn Leu Leu Gin Ile Arg Tyr Ser Ser Pro Leu
835 840 845
Phe Arg Leu Arg Ser Alá Lys Asp Ile Glu Asp Arg Val Arg Phe His
850 855 860
Asn Asn Val Pro Ser Trp Ile Pro Gly Leu Ile Alá Met Ser Ile Glu
865 870 875 880
Asp Gly His Alá Gly Alá Pro Gly Leu Ser Gin Ile Asp Pro Lys Phe
885 890 895
Gin Tyr Xle Val Val Ile Ile Asn Val Gin Pro Thr Glu Thr Lys Phe
900 905 910
Val Asn Pro Asp Leu Arg Alá Lys Ser Leu Gin Leu His Pro Val Gin
915 920 925
Ser Thr Ser Gly Asp Thr Val Val Lys Glu Ser Lys Tyr Glu Pro Ser
930 935 940
Thr Gly Cys Phe Thr Ile Pro Pro Lys Ser Thr Alá Val Phe Val Glu
945 950 955 960
Pro Arg His Val ★
965 (2) A 19. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(I) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: más nukleinsav (A) LEÍRÁS: /desc = oligonukleotid (iii) HIPOTETIKUS: van (iv) ANTISENSE: nincs • r. · · »ν· ·»* · • » · ·* Λ < *· · · · • » « «« * » < ·· ' (xi) A 19. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCYTCNGGYT TNACRTCRTC 20 (2) A 20. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(I) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: más nukleinsav (A) LEÍRÁS: /desc = oligonukleotid (iii) HIPOTETIKUS: van (iv) ANTISENSE: nincs
...(ix) JELLEMZŐ:
(A) NÉV/KULCS: módosított bázis (B) LOKÁCIÓ: 3 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓK: /mód bázis = i
...(ix) JELLEMZŐ:
(A) NÉV/KULCS: módosított bázis (B) LOKÁCIÓ: 9 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓK: /mód bázis = i
...(ix) JELLEMZŐ:
(A) NÉV/KULCS: módosított bázis (B) LOKÁCIÓ: 11 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓK: /mód bázis = i (xi) A 20. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GCGGCCATGC CGACYTGDAT 2 0 (2) A 21. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(I) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 43 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: más nukleinsav (A) LEÍRÁS: /desc = oligonukleotid (iii) HIPOTETIKUS: van (iv) ANTISENSE: nincs
··· ··· (xi) A 21. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AAGGTACCGG ATCCTCTGCT GATGGCAAGT GGACATTATT AGT 43 (2) A 22. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(I) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 41 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: más nukleinsav (A) LEÍRÁS: /desc = oligonukleotid (iii) HIPOTETIKUS: van (iv) ANTISENSE: nincs (xi) A 22. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TTAAGCCCGG GCGATACGAC AAGGACCATT TGCATTACCA G 41 (2) A 23. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(I) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 492 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS - mRNS (iii) HIPOTETIKUS: nincs (iv) ANTISENSE: nincs (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) ORGANIZMUS: Solanum tuberosum (B) TÖRZS: Berolina (F) SZÖVET TÍPUS: gumó
.. .(ix) JELLEMZŐ:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) LOKÁCIÓ: 1..492 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék = elágazást megszüntető enzim (R-enzim)
(xi) A 23. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCT GCT GAT GGC Gly AAG TGG ACA TTA TTA GTT AAT CTT GAT TCT GAT GAT 48
Ser Alá Asp Lys 5 Trp Thr Leu Leu Val 10 Asn Leu Asp Ser Asp Asp 15
GTA AAA CCT GAA GGC TGG GAT AAT CTA CAA GAC GTG AAG CCA AAT CTT 96
Val Lys Pro Glu Gly Trp Asp Asn Leu Gin Asp Val Lys Pro Asn Leu
20 25 30
CTT TCC TTT TCT GAT GTC AGC ATC TAT GAG CTG CAT GTT AGA GAT TTC 144
Leu Ser Phe Ser Asp Val Ser Ile Tyr Glu Leu His Val Arg Asp Phe
35 40 45
ACT GCC AGT GAC CCT ACT GTG TCT CAT GAA TTT CAG GCC GGT TAT CTC 192
Thr Alá Ser Asp Pro Thr Val Ser His Glu Phe Gin Alá Gly Tyr Leu
50 55 60
GCC CCT TCC ACG TCG CAG GCA TCA GCT GGT GTC CAA CAT TTG AAA AGA 240
Alá Pro Ser Thr Ser Gin Alá Ser Alá Gly Val Gin His Leu Lys Arg
65 70 75 80
TTA TCA AGT GCT GGT ATC ACT CAT GTC CAC CTG TGG CCA ACC TAT CAA 288
Leu Ser Ser Alá Gly Ile Thr His Val His Leu Trp Pro Thr Tyr Gin
85 90 95
TTT GCT GGT GTC GAA GAT GAG AAA CAT AAA TGG AAG TAT ACA GAT ATC 336
Phe Alá Gly Val Glu Asp Glu Lys His Lys Trp Lys Tyr Thr Asp Ile
100 105 110
GAG AAA CTC AAC TCT TTT CCA CCA GAT TCT GAG GAG CAG CAG GCT CTT 384
Glu Lys Leu Asn Ser Phe •Pro •Pro Asp Ser Glu Glu Gin Gin Alá Leu
115 120 125
ATC ACA GCC ATC CAA GAT GAA GAT GGC TAT AAT TGG GGG TAT AAT CCT 432
Xle Thr Alá Xle Gin Asp Glu Asp Gly Tyr Asn Trp Gly Tyr Asn Pro
130 135 140
GTT CTC TGG GGA GTT CCA AAG GGA AGC TAT GCT GGT AAT GCA AAT GGT 480
Val Leu Trp Gly Val Pro Lys Gly Ser Tyr Alá Gly Asn Alá Asn Gly
145 150 155 160
CCT TGT CGT ATC 492
Pro Cys Arg Ile
(2) A 24. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI
(I) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 164 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein
(xi) A 24 . SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Ser 1 Alá Asp Gly Lys Trp 5 Thr Leu Leu Val Asn Leu 10 Asp Ser Asp 15 Asp
Val Lys Pro Glu 20 Gly Trp Asp Asn Leu Gin Asp Val 25 Lys Pro 30 Asn Leu
Leu Ser Phe 35 Ser Asp Val Ser Ile Tyr Glu Leu His 40 Val 45 Arg Asp Phe
Thr Alá Ser 50 Asp Pro Thr Val Ser His Glu Phe Gin 55 60 Alá Gly Tyr Leu
Alá 65 Pro Ser Thr Ser Gin 70 Alá Ser Alá Gly Val Gin 75 His Leu Lys Arg 80
Leu Ser Ser Alá Gly Ile 85 Thr His Val His Leu Trp 90 Pro Thr Tyr 95 Gin
Phe Alá Gly Val 100 Glu Asp Glu Lys His Lys Trp Lys 105 Tyr Thr 110 Asp Ile
Glu Lys Leu 115 Asn Ser Phe Pro Pro Asp Ser Glu Glu 120 Gin 125 Gin Alá Leu
Ile Thr Alá 130 Ile Gin Asp Glu Asp Gly Tyr Asn Trp 135 140 Gly Tyr Asn Pro
Val 145 Leu Trp Gly Val Pro 150 Lys Gly Ser Tyr Alá Gly 155 Asn Alá Asn Gly 160
Pro Cys Arg Ile

Claims (22)

1. Egy elágazást megszüntető enzim biológiai aktivitásával rendelkező, vagy ennek egy biológiailag aktív fragmentjét tartalmazó növényi proteint kódoló DNS molekula azzal jellemezve, hogy az alábbi (a) a 18. számú szekvenciában bemutatott aminosav szekvenciával rendelkező proteint kódoló DNS molekulákat;
(b) a 17. számú szekvenciában bemutatott nukleotid szekvenciával rendelkező DNS molekulákat;
(c) a 24. számú szekvenciában bemutatott aminosav szekvenciát tartalmazó proteint kódoló DNS molekulákat;
(d) a 23. számú szekvenciában bemutatott nukleotid szekvenciával rendelkező DNS molekulákat;
(e) a genetikai kód degeneráltsága következtében az (a) , (b), (c) vagy a (d) pontoknak megfelelő DNS molekulák nukleotid szekvenciájától eltérő nukleotid szekvenciával rendelkező
DNS molekulákat; és (f) az (a) , (b) , (c) , (d) vagy (e) pontoknak megfelelő DNS molekulákhoz hibridizáló DNS molekulákat magába foglaló csoportból szelektáljuk.
··· ··· • · • · · ··
- 81
2. Az 1. igénypont szerinti DNS molekula azzal jellemezve, hogy az elágazást megszüntető enzim enzimatikus aktivitásával rendelkező protein az 1. - 14. számú szekvenciákban bemutatott peptid szekvenciák legalább néhányával rendelkezik.
3. Az 1. vagy a 2. igénypont szerinti DNS molekula azzal jellemezve, hogy a protein SDS gélelektroforézis alapján körülbelül 100 ± 10 kD molekulasúllyal rendelkezik.
4. Az 1. - 3. igénypontok bármelyike szerinti DNS molekula azzal jellemezve, hogy a molekula magasabbrendű növényekből származik.
5. A 4. igénypont szerinti DNS molekula azzal jellemezve, hogy a nüvény a Solanaceae családból származik.
6. Az 5. igénypont szerinti DNS molekula azzal jellemezve, hogy a növény a Solanum tuberosum-ot jelenti.
7. A 4. igénypont szerinti DNS molekula azzal jellemezve, hogy a növény a Chenopodiaceae családból származik.
• · · ··« • · ···· «
8. A 7. igénypont szerinti DNS molekula azzal jellemezve, hogy a növény a Spinacia oleracea-t jelenti.
9. Egy vektor azzal jellemezve, hogy az 1. - 8.
igénypontok bármelyike szerinti DNS molekulát tartalmazza.
10. A 9. igénypont szerinti vektor azzal jellemezve, hogy a vektorban a DNS molekula a prokarióta vagy eukarióta sejtekben történő transzkripciót és transzlációt lehetővé tevő szabályozó DNS szekvenciákhoz sense orientációban kapcsolódik.
11. Egy gazdasejt azzal jellemezve, hogy az 1. - 8.
igénypontok bármelyike szerinti DNS molekulával, vagy a 9, vagy a 10. igénypontok bármelyike szerinti vektorral transzformáljuk, vagy mely sejt egy ilyen sejtből származik és az 1. - 8. igénypontok szerinti DNS molekulát vagy a 9. vagy a
10. igénypont szerinti vektort tartalmazza.
12. Növényi protein előállítására szolgáló eljárás azzal jellemezve, hogy a protein egy elágazást megszüntető enzim biológiai aktivitásával rendelkezik, vagy ennek egy aktív fragmentjévei, a 11. igénypont szerinti gazdasejteket megfelelő ··«· * ·» · ··* ·
- 83 körülmények között tenyésztjük és a tenyészetből a proteint kinyerjük.
13. Egy elágazást megszüntető enzim biológiai aktivitásával rendelkező, vagy ennek egy biológiailag aktív fragmentjét tartalmazó protein azzal jellemezve, hogy:
(a) a 12. igénypont szerinti folyamattal kinyerhető; vagy (b) melyet, a burgonyából vagy a spenótból származó proteineket nem számítva az 1. - 8 igénypontok bármelyike szerinti DNS molekula kódol.
14. A 11. igénypont szerinti gazdasejt azzal jellemezve, hogy egy transzgenikus növényi sejtet jelent.
15. Transzgenikus növények azzal jellemezve, hogy a 14.
igénypont szerinti transzgenikus növényi sejteket tartalmaznak.
16. Keményítő azzal jellemezve, hogy a 14. igénypont szerinti növényi sejtekből vagy a 15. igénypont szerinti növényekből kinyerjük.
17. Egy transzgenikus növényi sejt azzal jellemezve, hogy elágazást megszüntető enzim aktivitását a nem-transzformált sejtekéhez képest az elágazást megszüntető enzimet kódoló endogén nukleinsav molekulák transzkripciójának vagy transzlációjának gátlása következtében csökkentjük, mely sejtek (a) egy elágazást megszüntető enzimet kódoló endogén nukleinsav szekvencia transzkriptjéhez való antisense RNS-t kódoló rekombináns nukleinsav molekulát; vagy (b) egy elágazást megszüntető enzimet kódoló endogén nukleinsav szekvencia transzkriptjenek specifikus hasítására képes ribozimot kódoló rekombináns nukleinsav molekulát; vagy (c) egy endogén elágazást megszüntető enzim gén expresszióját koszuppressziós hatással gátló RNS-t kódoló rekombináns nukleinsav molekulát tartalmaz, és az említett csökkenés az említett rekombináns nukleinsav molekul expressziójából adódik.
18. Az 1. - 8. igénypontok bármelyike szerinti DNS molekulát, vagy egy ilyen molekula egy részét tartalmazó, a 17.
igénypont szerinti transzgenikus növényi sejt azzal jellemezve, hogy a DNS molekula vagy annak egy része a növényi sejtekben a *«· ·· < ··· ··♦ · • « · ·«· ··» ··* • * · . · Λ Λ ΛΛ transzkripciót lehetővé tevő szabályozó DNS szekvenciákhoz antisense orientációban kapcsolódik.
19. Transzgenikus növények azzal jellemezve, hogy a 17.
vagy a 18. igénypontok szerinti növényi sejteket tartalmazzák.
20. Keményítő azzal jellemezve, hogy a 17. vagy a 18.
igénypontok szerinti növényi sejtekből, vagy a 19. igénypont szerinti növényekből kinyerhetjük.
21. A 15. vagy 19. igénypont szerinti növények szaporító anyaga azzal jellemezve, hogy a 14. igénypont szerinti vagy a
17. vagy a 18. igénypontok bármelyike szerinti növényi sejteket tartalmaz.
22. A 16. vagy 20. igénypontok szerinti keményítő alkalmazása azzal jellemezve, hogy élelmiszeripari vagy egyéb ipari termékek előállítására használjuk.
HU9800236A 1994-12-22 1995-12-22 Növényekből származó elágazást megszüntető enzimeket kódoló DNS molekulák HUT77470A (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4447387A DE4447387A1 (de) 1994-12-22 1994-12-22 Debranching-Enzyme aus Pflanzen und DNA-Sequenzen kodierend diese Enzyme

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HUT77470A true HUT77470A (hu) 1998-05-28

Family

ID=6537587

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9800236A HUT77470A (hu) 1994-12-22 1995-12-22 Növényekből származó elágazást megszüntető enzimeket kódoló DNS molekulák

Country Status (9)

Country Link
US (3) US6117665A (hu)
EP (1) EP0807179A1 (hu)
JP (1) JPH10510990A (hu)
AU (1) AU714379B2 (hu)
CA (1) CA2208410A1 (hu)
DE (1) DE4447387A1 (hu)
HU (1) HUT77470A (hu)
IL (1) IL116527A0 (hu)
WO (1) WO1996019581A1 (hu)

Families Citing this family (191)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6825342B1 (en) 1995-05-05 2004-11-30 National Starch And Chemical Investment Holding Corporation Plant starch composition
ATE332382T1 (de) 1995-09-19 2006-07-15 Bayer Bioscience Gmbh Pflanzen, die eine modifizierte stärke synthetisieren, verfahren zu ihrer herstellung sowie modifizierte stärke
DE19608918A1 (de) 1996-03-07 1997-09-11 Planttec Biotechnologie Gmbh Nucleinsäuremoleküle, die neue Debranching-Enzyme aus Mais codieren
DE19618125A1 (de) * 1996-05-06 1997-11-13 Planttec Biotechnologie Gmbh Nucleinsäuremoleküle, die neue Debranching-Enzyme aus Kartoffel codieren
AT408996B (de) * 1996-08-01 2002-04-25 Tulln Zuckerforschung Gmbh Faserbehandlungsmittel
CA2284688C (en) * 1997-05-06 2010-02-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Corn pullulanase
GB9716185D0 (en) * 1997-07-31 1997-10-08 Innes John Centre Starch debranching enzymes
GB9718863D0 (en) * 1997-09-06 1997-11-12 Nat Starch Chem Invest Improvements in or relating to stability of plant starches
DE19836098A1 (de) 1998-07-31 2000-02-03 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Pflanzen, die eine modifizierte Stärke synthetisieren, Verfahren zur Herstellung der Pflanzen, ihre Verwendung sowie die modifizierte Stärke
WO2003000854A2 (en) 2001-06-25 2003-01-03 Ses Europe N.V./S.A. Double fructan beets
JP2004345592A (ja) * 2003-05-26 2004-12-09 Nissan Motor Co Ltd 車両の操舵装置
AU2004252186B8 (en) 2003-06-30 2010-06-24 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Wheat with altered branching enzyme activity and starch and starch containing products derived therefrom
CL2007003743A1 (es) * 2006-12-22 2008-07-11 Bayer Cropscience Ag Composicion que comprende fenamidona y un compuesto insecticida; y metodo para controlar de forma curativa o preventiva hongos fitopatogenos de cultivos e insectos.
CL2007003744A1 (es) 2006-12-22 2008-07-11 Bayer Cropscience Ag Composicion que comprende un derivado 2-piridilmetilbenzamida y un compuesto insecticida; y metodo para controlar de forma curativa o preventiva hongos fitopatogenos de cultivos e insectos.
EP2120558B1 (de) 2007-03-12 2016-02-10 Bayer Intellectual Property GmbH 3,4-Disubstituierte Phenoxyphenylamidin-Derivate und deren Verwendung als Fungizide
EP1969930A1 (de) 2007-03-12 2008-09-17 Bayer CropScience AG Phenoxyphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide
EP1969929A1 (de) 2007-03-12 2008-09-17 Bayer CropScience AG Substituierte Phenylamidine und deren Verwendung als Fungizide
JP2010520899A (ja) 2007-03-12 2010-06-17 バイエル・クロツプサイエンス・アクチエンゲゼルシヤフト ジハロフェノキシフェニルアミジン及び殺真菌剤としてのその使用
EP1969931A1 (de) * 2007-03-12 2008-09-17 Bayer CropScience Aktiengesellschaft Fluoalkylphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide
EP1969934A1 (de) 2007-03-12 2008-09-17 Bayer CropScience AG 4-Cycloalkyl-oder 4-arylsubstituierte Phenoxyphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide
US8168567B2 (en) * 2007-04-19 2012-05-01 Bayer Cropscience Ag Thiadiazolyl oxyphenyl amidines and the use thereof as a fungicide
DE102007045956A1 (de) 2007-09-26 2009-04-09 Bayer Cropscience Ag Wirkstoffkombination mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
DE102007045953B4 (de) 2007-09-26 2018-07-05 Bayer Intellectual Property Gmbh Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
DE102007045919B4 (de) 2007-09-26 2018-07-05 Bayer Intellectual Property Gmbh Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
DE102007045920B4 (de) 2007-09-26 2018-07-05 Bayer Intellectual Property Gmbh Synergistische Wirkstoffkombinationen
DE102007045922A1 (de) 2007-09-26 2009-04-02 Bayer Cropscience Ag Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
EP2090168A1 (de) 2008-02-12 2009-08-19 Bayer CropScience AG Methode zur Verbesserung des Pflanzenwachstums
EP2072506A1 (de) 2007-12-21 2009-06-24 Bayer CropScience AG Thiazolyloxyphenylamidine oder Thiadiazolyloxyphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide
EP2168434A1 (de) 2008-08-02 2010-03-31 Bayer CropScience AG Verwendung von Azolen zur Steigerung der Resistenz von Pflanzen oder Pflanzenteilen gegenüber abiotischem Stress
CA2733958A1 (en) 2008-08-14 2010-02-18 Bayer Cropscience Ag Insecticidal 4-phenyl-1h-pyrazoles
DE102008041695A1 (de) 2008-08-29 2010-03-04 Bayer Cropscience Ag Methoden zur Verbesserung des Pflanzenwachstums
EP2201838A1 (de) 2008-12-05 2010-06-30 Bayer CropScience AG Wirkstoff-Nützlings-Kombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
EP2198709A1 (de) 2008-12-19 2010-06-23 Bayer CropScience AG Verfahren zur Bekämpfung resistenter tierischer Schädlinge
EP2223602A1 (de) 2009-02-23 2010-09-01 Bayer CropScience AG Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials genetisch modifizierter Pflanzen
EP2204094A1 (en) 2008-12-29 2010-07-07 Bayer CropScience AG Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants Introduction
EP2381781B1 (de) 2008-12-29 2016-06-08 Bayer Intellectual Property GmbH Verfahren zur verbesserten nutzung des produktionspotentials genetisch modifizierter pflanzen
EP2039772A2 (en) 2009-01-06 2009-03-25 Bayer CropScience AG Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants introduction
EP2039770A2 (en) 2009-01-06 2009-03-25 Bayer CropScience AG Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants
EP2039771A2 (en) 2009-01-06 2009-03-25 Bayer CropScience AG Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants
WO2010081689A2 (en) 2009-01-19 2010-07-22 Bayer Cropscience Ag Cyclic diones and their use as insecticides, acaricides and/or fungicides
EP2227951A1 (de) 2009-01-23 2010-09-15 Bayer CropScience AG Verwendung von Enaminocarbonylverbindungen zur Bekämpfung von durch Insekten übertragenen Viren
CN102300852B (zh) 2009-01-28 2015-04-22 拜尔农科股份公司 杀真菌剂 n-环烷基-n-双环亚甲基-羧酰胺衍生物
AR075126A1 (es) 2009-01-29 2011-03-09 Bayer Cropscience Ag Metodo para el mejor uso del potencial de produccion de plantas transgenicas
EP2218717A1 (en) 2009-02-17 2010-08-18 Bayer CropScience AG Fungicidal N-((HET)Arylethyl)thiocarboxamide derivatives
JP5728735B2 (ja) 2009-02-17 2015-06-03 バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングＢａｙｅｒ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ ＧｍｂＨ 殺菌性ｎ−（フェニルシクロアルキル）カルボキサミド、ｎ−（ベンジルシクロアルキル）カルボキサミド及びチオカルボキサミド誘導体
TW201031331A (en) 2009-02-19 2010-09-01 Bayer Cropscience Ag Pesticide composition comprising a tetrazolyloxime derivative and a fungicide or an insecticide active substance
DE102009001469A1 (de) 2009-03-11 2009-09-24 Bayer Cropscience Ag Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen
DE102009001681A1 (de) 2009-03-20 2010-09-23 Bayer Cropscience Ag Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen
DE102009001728A1 (de) 2009-03-23 2010-09-30 Bayer Cropscience Ag Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen
DE102009001730A1 (de) 2009-03-23 2010-09-30 Bayer Cropscience Ag Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen
DE102009001732A1 (de) 2009-03-23 2010-09-30 Bayer Cropscience Ag Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen
MX2011009916A (es) 2009-03-25 2011-10-06 Bayer Cropscience Ag Combinaciones de principios activos con propiedades insecticidas y acaricidas.
EP2232995A1 (de) 2009-03-25 2010-09-29 Bayer CropScience AG Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen
JP5462354B2 (ja) 2009-03-25 2014-04-02 バイエル・クロップサイエンス・アーゲー 殺虫特性及び殺ダニ特性を有する活性成分組合せ
UA104887C2 (uk) 2009-03-25 2014-03-25 Баєр Кропсаєнс Аг Синергічні комбінації активних речовин
AP3073A (en) 2009-03-25 2014-12-31 Bayer Cropscience Ag Active ingredient combinations with insecticidal and acaricidal properties
WO2010108505A1 (de) 2009-03-25 2010-09-30 Bayer Cropscience Ag Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden eigenschaften
EP2239331A1 (en) 2009-04-07 2010-10-13 Bayer CropScience AG Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants
CN102458125B (zh) 2009-05-06 2015-04-29 拜尔农作物科学股份公司 环戊二酮化合物及其用作杀昆虫剂、杀螨剂和/或杀菌剂的用途
AR076839A1 (es) 2009-05-15 2011-07-13 Bayer Cropscience Ag Derivados fungicidas de pirazol carboxamidas
EP2251331A1 (en) 2009-05-15 2010-11-17 Bayer CropScience AG Fungicide pyrazole carboxamides derivatives
EP2255626A1 (de) 2009-05-27 2010-12-01 Bayer CropScience AG Verwendung von Succinat Dehydrogenase Inhibitoren zur Steigerung der Resistenz von Pflanzen oder Pflanzenteilen gegenüber abiotischem Stress
WO2010139410A2 (de) 2009-06-02 2010-12-09 Bayer Cropscience Ag Verwendung von succinat dehydrogenase inhibitoren zur kontrolle von sclerotinia ssp
BR112012001080A2 (pt) 2009-07-16 2015-09-01 Bayer Cropscience Ag Combinações de substâncias ativas sinérgicas contendo feniltriazóis
WO2011015524A2 (en) 2009-08-03 2011-02-10 Bayer Cropscience Ag Fungicide heterocycles derivatives
EP2292094A1 (en) 2009-09-02 2011-03-09 Bayer CropScience AG Active compound combinations
EP2343280A1 (en) 2009-12-10 2011-07-13 Bayer CropScience AG Fungicide quinoline derivatives
CN102724879B (zh) 2009-12-28 2015-10-21 拜尔农科股份公司 杀真菌剂肟基-四唑衍生物
JP5894928B2 (ja) 2009-12-28 2016-03-30 バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト 殺菌剤ヒドロキシモイル−ヘテロ環誘導体
CN102725282B (zh) 2009-12-28 2015-12-16 拜尔农科股份公司 杀真菌剂肟基-四唑衍生物
EP2525658B1 (de) 2010-01-22 2017-03-01 Bayer Intellectual Property GmbH Akarizide und/oder insektizide wirkstoffkombinationen
AR080443A1 (es) 2010-03-04 2012-04-11 Bayer Cropscience Ag 2-amidobencimidazoles sustituidos con fluruoalquilo
EP2555619A2 (de) 2010-04-06 2013-02-13 Bayer Intellectual Property GmbH Verwendung der 4-phenylbuttersäure und/oder ihrer salze zur steigerung der stresstoleranz in pflanzen
WO2011124553A2 (de) 2010-04-09 2011-10-13 Bayer Cropscience Ag Verwendung von derivaten der (1-cyancyclopropyl)phenylphosphinsäure, deren ester und/oder deren salze zur steigerung der toleranz in pflanzen gegenüber abiotischem stress
BR112012027559A2 (pt) 2010-04-28 2015-09-08 Bayer Cropscience Ag composto, composição fungicida e método para controlar os fungos fitopatogênicos de culturas
WO2011134911A2 (en) 2010-04-28 2011-11-03 Bayer Cropscience Ag Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives
BR112012027558A2 (pt) 2010-04-28 2015-09-15 Bayer Cropscience Ag ''composto da fórmula (i), composição fungicida e método para o controle de fungos fitogênicos de colheitas''
CN102933556B (zh) 2010-06-03 2015-08-26 拜尔农科股份公司 N-[(杂)芳基乙基]吡唑(硫代)羧酰胺及其杂取代的类似物
PL2576517T3 (pl) 2010-06-03 2015-06-30 Bayer Ip Gmbh N-[(het)aryloalkilo)]pirazolo(tio)karboksyamidy i ich analogi heteropodstawione
UA110703C2 (uk) 2010-06-03 2016-02-10 Байєр Кропсайнс Аг Фунгіцидні похідні n-[(тризаміщений силіл)метил]-карбоксаміду
US9593317B2 (en) 2010-06-09 2017-03-14 Bayer Cropscience Nv Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering
US9574201B2 (en) 2010-06-09 2017-02-21 Bayer Cropscience Nv Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering
EP3181550B1 (en) 2010-07-20 2019-11-20 Bayer Intellectual Property GmbH Benzocycloalkenes as antifungal agents
RU2013114710A (ru) 2010-09-03 2014-10-10 Байер Интеллектуэль Проперти Гмбх Замещенные конденсированные пиримидиноны и дигидропиримидиноны
EP2460406A1 (en) 2010-12-01 2012-06-06 Bayer CropScience AG Use of fluopyram for controlling nematodes in nematode resistant crops
EP2618667A2 (en) 2010-09-22 2013-07-31 Bayer Intellectual Property GmbH Use of biological or chemical control agents for controlling insects and nematodes in resistant crops
WO2012045798A1 (en) 2010-10-07 2012-04-12 Bayer Cropscience Ag Fungicide composition comprising a tetrazolyloxime derivative and a thiazolylpiperidine derivative
WO2012052490A1 (en) 2010-10-21 2012-04-26 Bayer Cropscience Ag N-benzyl heterocyclic carboxamides
BR112013009590B8 (pt) 2010-10-21 2019-03-19 Bayer Ip Gmbh composto, composição fungicida e método
UA109460C2 (uk) 2010-11-02 2015-08-25 Байєр Інтелекчуал Проперті Гмбх N-гетарилметилпіразолілкарбоксаміди
CN103369962A (zh) 2010-11-15 2013-10-23 拜耳知识产权有限责任公司 5-卤代吡唑(硫代)甲酰胺
BR112013012080A2 (pt) 2010-11-15 2016-07-19 Bayer Ip Gmbh n-aril pirazol (tio) carboxamidas
WO2012065947A1 (en) 2010-11-15 2012-05-24 Bayer Cropscience Ag 5-halogenopyrazolecarboxamides
EP2460407A1 (de) 2010-12-01 2012-06-06 Bayer CropScience AG Wirkstoffkombinationen umfassend Pyridylethylbenzamide und weitere Wirkstoffe
CN103281900A (zh) 2010-12-01 2013-09-04 拜耳知识产权有限责任公司 氟吡菌酰胺用于防治作物中的线虫以及提高产量的用途
EP2658853A1 (en) 2010-12-29 2013-11-06 Bayer Intellectual Property GmbH Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives
EP2474542A1 (en) 2010-12-29 2012-07-11 Bayer CropScience AG Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives
EP2471363A1 (de) 2010-12-30 2012-07-04 Bayer CropScience AG Verwendung von Aryl-, Heteroaryl- und Benzylsulfonamidocarbonsäuren, -carbonsäureestern, -carbonsäureamiden und -carbonitrilen oder deren Salze zur Steigerung der Stresstoleranz in Pflanzen
EP2494867A1 (de) 2011-03-01 2012-09-05 Bayer CropScience AG Halogen-substituierte Verbindungen in Kombination mit Fungiziden
EP2683239A1 (en) 2011-03-10 2014-01-15 Bayer Intellectual Property GmbH Use of lipochito-oligosaccharide compounds for safeguarding seed safety of treated seeds
US20140005230A1 (en) 2011-03-14 2014-01-02 Juergen Benting Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives
WO2012136581A1 (en) 2011-04-08 2012-10-11 Bayer Cropscience Ag Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives
AR090010A1 (es) 2011-04-15 2014-10-15 Bayer Cropscience Ag 5-(ciclohex-2-en-1-il)-penta-2,4-dienos y 5-(ciclohex-2-en-1-il)-pent-2-en-4-inos sustituidos como principios activos contra el estres abiotico de las plantas, usos y metodos de tratamiento
EP2511255A1 (de) 2011-04-15 2012-10-17 Bayer CropScience AG Substituierte Prop-2-in-1-ol- und Prop-2-en-1-ol-Derivate
AR085585A1 (es) 2011-04-15 2013-10-09 Bayer Cropscience Ag Vinil- y alquinilciclohexanoles sustituidos como principios activos contra estres abiotico de plantas
AR085568A1 (es) 2011-04-15 2013-10-09 Bayer Cropscience Ag 5-(biciclo[4.1.0]hept-3-en-2-il)-penta-2,4-dienos y 5-(biciclo[4.1.0]hept-3-en-2-il)-pent-2-en-4-inos sustituidos como principios activos contra el estres abiotico de las plantas
EA029682B1 (ru) 2011-04-22 2018-04-30 Байер Интеллекчуал Проперти Гмбх Комбинации активных соединений, содержащие производное соединение (тио)карбоксамида и фунгицидное соединение
WO2012168124A1 (en) 2011-06-06 2012-12-13 Bayer Cropscience Nv Methods and means to modify a plant genome at a preselected site
CN103957711A (zh) 2011-07-04 2014-07-30 拜耳知识产权有限责任公司 取代的异喹啉酮、异喹啉二酮、异喹啉三酮和二氢异喹啉酮或其各自的盐作为活性剂对抗植物非生物胁迫的用途
AU2012293636B2 (en) 2011-08-10 2015-12-03 Bayer Intellectual Property Gmbh Active compound combinations comprising specific tetramic acid derivatives
CN103890181A (zh) 2011-08-22 2014-06-25 拜尔作物科学公司 修饰植物基因组的方法和手段
JP2014524455A (ja) 2011-08-22 2014-09-22 バイエル・インテレクチユアル・プロパテイー・ゲー・エム・ベー・ハー 殺真菌性ヒドロキシモイル−テトラゾール誘導体
EP2561759A1 (en) 2011-08-26 2013-02-27 Bayer Cropscience AG Fluoroalkyl-substituted 2-amidobenzimidazoles and their effect on plant growth
BR112014005262A2 (pt) 2011-09-09 2017-04-04 Bayer Ip Gmbh método para aprimorar um vegetal e utilização de um composto de fórmula (i) ou (ii)
US9090600B2 (en) 2011-09-12 2015-07-28 Bayer Intellectual Property Gmbh Fungicidal 4-substituted-3-{phenyl[(heterocyclylmethoxy)imino]methyl}-1,2,4-oxadizol-5(4H)-one derivatives
AR087873A1 (es) 2011-09-16 2014-04-23 Bayer Ip Gmbh Uso de fenilpirazolin-3-carboxilatos para mejorar el rendimiento de las plantas
UA115971C2 (uk) 2011-09-16 2018-01-25 Байєр Інтеллектуал Проперті Гмбх Застосування ацилсульфонамідів для покращення врожайності рослин
EP2755484A1 (en) 2011-09-16 2014-07-23 Bayer Intellectual Property GmbH Use of 5-phenyl- or 5-benzyl-2 isoxazoline-3 carboxylates for improving plant yield
BR112014006940A2 (pt) 2011-09-23 2017-04-04 Bayer Ip Gmbh uso de derivados de ácido 1-fenilpirazol-3-carboxílico 4-substituído como agentes contra estresse abiótico em plantas
PL2764101T3 (pl) 2011-10-04 2017-09-29 Bayer Intellectual Property Gmbh RNAi do kontroli grzybów i lęgniowców poprzez hamowanie genu dehydrogenazy sacharopinowej
WO2013050324A1 (de) 2011-10-06 2013-04-11 Bayer Intellectual Property Gmbh Abiotischen pflanzenstress-reduzierende kombination enthaltend 4- phenylbuttersäure (4-pba) oder eines ihrer salze (komponente (a)) und eine oder mehrere ausgewählte weitere agronomisch wirksame verbindungen (komponente(n) (b)
MX2014005976A (es) 2011-11-21 2014-08-27 Bayer Ip Gmbh Derivados de n-[(silil trisustituido)metil]-carboxamida fungicidas.
CA2857438A1 (en) 2011-11-30 2013-06-06 Bayer Intellectual Property Gmbh Fungicidal n-bicycloalkyl and n-tricycloalkyl (thio)carboxamide derivatives
CA2859467C (en) 2011-12-19 2019-10-01 Bayer Cropscience Ag Use of anthranilic acid diamide derivatives for pest control in transgenic crops
EP2797891B1 (en) 2011-12-29 2015-09-30 Bayer Intellectual Property GmbH Fungicidal 3-[(pyridin-2-ylmethoxyimino)(phenyl)methyl]-2-substituted-1,2,4-oxadiazol-5(2h)-one derivatives
TWI558701B (zh) 2011-12-29 2016-11-21 拜耳知識產權公司 殺真菌之３－［（１，３－噻唑－４－基甲氧基亞胺）（苯基）甲基］－２－經取代之－１，２，４－二唑－５（２ｈ）－酮衍生物
CN104244714B (zh) 2012-02-22 2018-02-06 拜耳农作物科学股份公司 琥珀酸脱氢酶抑制剂(sdhi)用于防治葡萄中的木材病害的用途
JP6093381B2 (ja) 2012-02-27 2017-03-08 バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングＢａｙｅｒ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ ＧｍｂＨ チアゾリルイソオキサゾリンと殺菌剤を含んでいる活性化合物組合せ
WO2013139949A1 (en) 2012-03-23 2013-09-26 Bayer Intellectual Property Gmbh Compositions comprising a strigolactame compound for enhanced plant growth and yield
EP2836489B1 (en) 2012-04-12 2016-06-29 Bayer Cropscience AG N-acyl-2-(cyclo) alkylpyrrolidines and piperidines useful as fungicides
JP2015516396A (ja) 2012-04-20 2015-06-11 バイエル・クロップサイエンス・アーゲーＢａｙｅｒ Ｃｒｏｐｓｃｉｅｎｃｅ Ａｇ Ｎ−シクロアルキル−ｎ−［（三置換シリルフェニル）メチレン］−（チオ）カルボキサミド誘導体
JP6109295B2 (ja) 2012-04-20 2017-04-05 バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト Ｎ−シクロアルキル−ｎ−［（ヘテロシクリルフェニル）メチレン］−（チオ）カルボキサミド誘導体
CA2871008C (en) 2012-04-23 2022-11-22 Bayer Cropscience Nv Targeted genome engineering in plants
EP2662360A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG 5-Halogenopyrazole indanyl carboxamides
US9375005B2 (en) 2012-05-09 2016-06-28 Bayer Cropscience Ag 5-halogenopyrazole indanyl carboxamides
EP2662370A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG 5-Halogenopyrazole benzofuranyl carboxamides
WO2013167545A1 (en) 2012-05-09 2013-11-14 Bayer Cropscience Ag Pyrazole indanyl carboxamides
EP2662364A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG Pyrazole tetrahydronaphthyl carboxamides
EP2662362A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG Pyrazole indanyl carboxamides
EP2662361A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG Pyrazol indanyl carboxamides
EP2662363A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG 5-Halogenopyrazole biphenylcarboxamides
AR091104A1 (es) 2012-05-22 2015-01-14 Bayer Cropscience Ag Combinaciones de compuestos activos que comprenden un derivado lipo-quitooligosacarido y un compuesto nematicida, insecticida o fungicida
AU2013289301A1 (en) 2012-07-11 2015-01-22 Bayer Cropscience Ag Use of fungicidal combinations for increasing the tolerance of a plant towards abiotic stress
AU2013311826A1 (en) 2012-09-05 2015-03-26 Bayer Cropscience Ag Use of substituted 2-amidobenzimidazoles, 2-amidobenzoxazoles and 2-amidobenzothiazoles or salts thereof as active substances against abiotic plant stress
PL2908642T3 (pl) 2012-10-19 2022-06-13 Bayer Cropscience Ag Sposób wzmacniania tolerancji roślin na stres abiotyczny z zastosowaniem pochodnych karboksyamidowych lub tiokarboksyamidowych
AU2013333847B2 (en) 2012-10-19 2017-04-20 Bayer Cropscience Ag Method for treating plants against fungi resistant to fungicides using carboxamide or thiocarboxamide derivatives
CA2888600C (en) 2012-10-19 2021-08-10 Bayer Cropscience Ag Active compound combinations comprising carboxamide derivatives
WO2014060518A1 (en) 2012-10-19 2014-04-24 Bayer Cropscience Ag Method of plant growth promotion using carboxamide derivatives
EP2735231A1 (en) 2012-11-23 2014-05-28 Bayer CropScience AG Active compound combinations
WO2014079957A1 (de) 2012-11-23 2014-05-30 Bayer Cropscience Ag Selektive inhibition der ethylensignaltransduktion
EP2925135A2 (en) 2012-11-30 2015-10-07 Bayer CropScience AG Binary pesticidal and fungicidal mixtures
WO2014083088A2 (en) 2012-11-30 2014-06-05 Bayer Cropscience Ag Binary fungicidal mixtures
US9775349B2 (en) 2012-11-30 2017-10-03 Bayer Cropscience Ag Binary fungicidal or pesticidal mixture
BR112015012055B1 (pt) 2012-11-30 2021-01-12 Bayer Cropscience Ag composição fungicida ternária, seu processo de preparação, método para controlar um ou mais microrganismos nocivos, semente resistente a microrganismos nocivos e seu método de tratamento
BR112015012519A2 (pt) 2012-11-30 2017-07-11 Bayer Cropscience Ag misturas ternárias fungicidas e pesticidas
EP2740720A1 (de) 2012-12-05 2014-06-11 Bayer CropScience AG Substituierte bicyclische- und tricyclische Pent-2-en-4-insäure -Derivate und ihre Verwendung zur Steigerung der Stresstoleranz in Pflanzen
EP2740356A1 (de) 2012-12-05 2014-06-11 Bayer CropScience AG Substituierte (2Z)-5(1-Hydroxycyclohexyl)pent-2-en-4-insäure-Derivate
WO2014086751A1 (de) 2012-12-05 2014-06-12 Bayer Cropscience Ag Verwendung substituierter 1-(arylethinyl)-, 1-(heteroarylethinyl)-, 1-(heterocyclylethinyl)- und 1-(cyloalkenylethinyl)-cyclohexanole als wirkstoffe gegen abiotischen pflanzenstress
WO2014090765A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 Bayer Cropscience Ag Use of 1-[2-fluoro-4-methyl-5-(2,2,2-trifluoroethylsulfinyl)phenyl]-5-amino-3-trifluoromethyl)-1 h-1,2,4 tfia zole for controlling nematodes in nematode-resistant crops
AR093996A1 (es) 2012-12-18 2015-07-01 Bayer Cropscience Ag Combinaciones bactericidas y fungicidas binarias
EP2935218A1 (en) 2012-12-19 2015-10-28 Bayer CropScience AG Difluoromethyl-nicotinic- tetrahydronaphtyl carboxamides
CN105705490A (zh) 2013-03-07 2016-06-22 拜耳作物科学股份公司 杀真菌的3-{苯基[(杂环基甲氧基)亚氨基]甲基}-杂环衍生物
WO2014161821A1 (en) 2013-04-02 2014-10-09 Bayer Cropscience Nv Targeted genome engineering in eukaryotes
JP2016522800A (ja) 2013-04-12 2016-08-04 バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト 新規トリアゾリンチオン誘導体
MX2015014365A (es) 2013-04-12 2015-12-07 Bayer Cropscience Ag Derivados de triazol novedosos.
KR20150144779A (ko) 2013-04-19 2015-12-28 바이엘 크롭사이언스 악티엔게젤샤프트 살충성 또는 농약성 2성분 혼합물
BR112015026235A2 (pt) 2013-04-19 2017-10-10 Bayer Cropscience Ag método para melhorar a utilização do potencial de produção de plantas transgênicas envolvendo a aplicação de um derivado de ftaldiamida
WO2014177514A1 (en) 2013-04-30 2014-11-06 Bayer Cropscience Ag Nematicidal n-substituted phenethylcarboxamides
TW201507722A (zh) 2013-04-30 2015-03-01 Bayer Cropscience Ag 做為殺線蟲劑及殺體內寄生蟲劑的ｎ－（２－鹵素－２－苯乙基）－羧醯胺類
BR112015031235A2 (pt) 2013-06-26 2017-07-25 Bayer Cropscience Ag derivados de n-cicloalquil-n-[(biciclil-fenil)metileno]-(tio)carboxamida
EA201600097A1 (ru) 2013-07-09 2016-06-30 Байер Кропсайенс Акциенгезельшафт Применение выбранных пиридон карбоксамидов или их солей в качестве активных веществ против абиотического стресса растений
WO2015082587A1 (en) 2013-12-05 2015-06-11 Bayer Cropscience Ag N-cycloalkyl-n-{[2-(1-substitutedcycloalkyl)phenyl]methylene}-(thio)carboxamide derivatives
JP6507165B2 (ja) 2013-12-05 2019-04-24 バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト Ｎ−シクロアルキル−ｎ−｛［２−（１−置換シクロアルキル）フェニル］メチレン｝−（チオ）カルボキサミド誘導体
AR101214A1 (es) 2014-07-22 2016-11-30 Bayer Cropscience Ag Ciano-cicloalquilpenta-2,4-dienos, ciano-cicloalquilpent-2-en-4-inas, ciano-heterociclilpenta-2,4-dienos y ciano-heterociclilpent-2-en-4-inas sustituidos como principios activos contra el estrés abiótico de plantas
AR103024A1 (es) 2014-12-18 2017-04-12 Bayer Cropscience Ag Piridoncarboxamidas seleccionadas o sus sales como sustancias activas contra estrés abiótico de las plantas
BR112017022000A2 (pt) 2015-04-13 2018-07-03 Bayer Cropscience Ag derivados de n-cicloalquil-n-(biheterocicliletileno)-(tio)carboxamida.
EP3436575A1 (en) 2015-06-18 2019-02-06 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
WO2018019676A1 (en) 2016-07-29 2018-02-01 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Active compound combinations and methods to protect the propagation material of plants
WO2018054832A1 (en) 2016-09-22 2018-03-29 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Novel triazole derivatives
US20190281828A1 (en) 2016-09-22 2019-09-19 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Novel triazole derivatives
US20190225974A1 (en) 2016-09-23 2019-07-25 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Targeted genome optimization in plants
RU2019115286A (ru) 2016-10-26 2020-11-27 Байер Кропсайенс Акциенгезельшафт Применение ниразифлумида для борьбы с sclerotinia spp при обработке семян
RU2755433C2 (ru) 2016-12-08 2021-09-16 Байер Кропсайенс Акциенгезельшафт Применение инсектицидов для борьбы с проволочниками
WO2018108627A1 (de) 2016-12-12 2018-06-21 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Verwendung substituierter indolinylmethylsulfonamide oder deren salze zur steigerung der stresstoleranz in pflanzen
EP3332645A1 (de) 2016-12-12 2018-06-13 Bayer Cropscience AG Verwendung substituierter pyrimidindione oder jeweils deren salze als wirkstoffe gegen abiotischen pflanzenstress
US11591601B2 (en) 2017-05-05 2023-02-28 The Broad Institute, Inc. Methods for identification and modification of lncRNA associated with target genotypes and phenotypes
WO2019025153A1 (de) 2017-07-31 2019-02-07 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Verwendung von substituierten n-sulfonyl-n'-aryldiaminoalkanen und n-sulfonyl-n'-heteroaryldiaminoalkanen oder deren salzen zur steigerung der stresstoleranz in pflanzen
CA3073848A1 (en) 2017-09-21 2019-03-28 The Broad Institute, Inc. Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
US10968257B2 (en) 2018-04-03 2021-04-06 The Broad Institute, Inc. Target recognition motifs and uses thereof
JP2021525774A (ja) 2018-06-04 2021-09-27 バイエル アクチェンゲゼルシャフトＢａｙｅｒ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 除草活性二環式ベンゾイルピラゾール
US11384344B2 (en) 2018-12-17 2022-07-12 The Broad Institute, Inc. CRISPR-associated transposase systems and methods of use thereof

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4454161A (en) * 1981-02-07 1984-06-12 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Process for the production of branching enzyme, and a method for improving the qualities of food products therewith
US5349123A (en) * 1990-12-21 1994-09-20 Calgene, Inc. Glycogen biosynthetic enzymes in plants
IE913215A1 (en) * 1990-09-13 1992-02-25 Gist Brocades Nv Transgenic plants having a modified carbohydrate content
DE4104782B4 (de) * 1991-02-13 2006-05-11 Bayer Cropscience Gmbh Neue Plasmide, enthaltend DNA-Sequenzen, die Veränderungen der Karbohydratkonzentration und Karbohydratzusammensetzung in Pflanzen hervorrufen, sowie Pflanzen und Pflanzenzellen enthaltend dieses Plasmide
EP0529894A1 (en) * 1991-08-16 1993-03-03 A.E. Staley Manufacturing Company Fragmented, debranched amylopectin starch precipitate as fat replacer
US5331108A (en) * 1992-01-31 1994-07-19 Wisconsin Alumni Research Foundation Mutant maize variety containing the glt1-1 allele
WO1995004826A1 (en) * 1993-08-09 1995-02-16 Institut Für Genbiologische Forschung Berlin Gmbh Debranching enzymes and dna sequences coding them, suitable for changing the degree of branching of amylopectin starch in plants
DE69423361T2 (de) * 1993-10-05 2000-12-07 Miller Brewing Co., Milwaukee Geklonte pullulanase
AU688006B2 (en) * 1994-03-25 1998-03-05 Brunob Ii B.V. Method for producing altered starch from potato plants

Also Published As

Publication number Publication date
JPH10510990A (ja) 1998-10-27
US20030175931A1 (en) 2003-09-18
CA2208410A1 (en) 1996-06-27
US6635454B1 (en) 2003-10-21
IL116527A0 (en) 1996-03-31
EP0807179A1 (en) 1997-11-19
US6716612B2 (en) 2004-04-06
DE4447387A1 (de) 1996-06-27
AU714379B2 (en) 1999-12-23
US6117665A (en) 2000-09-12
AU4433396A (en) 1996-07-10
WO1996019581A1 (en) 1996-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6716612B2 (en) DNA molecules coding for debranching enzymes derived from plants
AU740492C (en) Novel nucleic acid molecules from maize and their use for the production of modified starch
CA2231774C (en) Plants which synthesize a modified starch, process for the production thereof and modified starch
CA2205118C (en) Dna molecules encoding enzymes involved in starch synthesis, vectors, bacteria, transgenic plant cells and plants containing these molecules
AU724164B2 (en) Nucleic acid molecules coding for debranching enzymes from potato
US6162966A (en) Modified starch from plants, plants synthesizing this starch, and processes for its preparation
AU2002314061B2 (en) DNA molecules that code for enzymes involved in starch synthesis, vectors, bacteria, transgenic plant cells and plants containing said molecules
AU725197B2 (en) Nucleic acid molecules encoding soluble starch synthases from maize

Legal Events

Date Code Title Description
DFC4 Cancellation of temporary protection due to refusal