DE4447387A1 - Debranching-Enzyme aus Pflanzen und DNA-Sequenzen kodierend diese Enzyme - Google Patents

Debranching-Enzyme aus Pflanzen und DNA-Sequenzen kodierend diese Enzyme

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Proteine aus Pflanzen mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms (R-Enzyms) und DNA-Sequenzen, die für diese Enzyme kodieren. Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur Veränderung des Verzweigungsgrades von in Pflanzen synthetisierten Amylopektins und Phytoglykogens, Pflanzen und Pflanzenzellen, in denen es aufgrund der Expression einer zusätzlichen Debranching-Enzymaktivität oder der Inhibierung einer endogenen Debranching-Enzymaktivität zur Synthese eines Amylopektins und/oder Phytoglykogens mit einem veränderten Verzweigungsgrad kommt, sowie die aus den besagten Pflanzenzellen und Pflanzen erhältliche Stärke.
Stärke spielt sowohl als Speicherstoff in einer Vielzahl von Pflanzen als auch als nachwachsender, industriell verwertbarer Rohstoff eine wichtige Rolle und gewinnt zunehmend an Bedeutung. Für die industrielle Verwendung der Stärke ist es erforderlich, daß diese hinsichtlich der Struktur, Form und/oder sonstigen physikalisch-chemischen Parametern den Erfordernissen der verarbeitenden Industrie entspricht. Für den Einsatz in möglichst vielen Einsatzgebieten ist es darüberhinaus erforderlich, eine große Stoffvielfalt zu erreichen.
Das Polysaccharid Stärke ist aus chemisch einheitlichen Grundbausteinen, den Glukosemolekülen, aufgebaut, stellt jedoch ein komplexes Gemisch aus unterschiedlichen Molekülformen dar, die Unterschiede hinsichtlich des Polymerisationsgrades und des Auftretens von Verzweigungen aufweisen. Man unterscheidet die Amylose-Stärke, ein im wesentlichen unverzweigtes Polymer aus α-1,4-glykosidisch verknüpften Glukosemolekülen, von der Amylopektin-Stär­ ke, ein verzweigtes Polymer, bei dem die Verzweigungen durch das Auftreten von zusätzlichen α-1,6-glykosidischen Verknüpfungen zustande kommen. In typischen für die Stärkeproduktion verwendeten Pflanzen, wie z. B. Mais oder Kartoffel, kommen die beiden Stärkeformen in einem Verhältnis von ca. 25 Teilen Amylose zu 75 Teilen Amylopektin vor.
Neben dem Amylopektin kommt beispielsweise beim Mais ein weiteres verzweigtes Polysaccharid, das sogenannte Phytoglykogen, vor, das sich vom Amylopektin durch einen stärkeren Verzweigungsgrad und ein anderes Löslichkeitsverhalten unterscheidet (siehe z. B. Lee et al., 1971, Arch. Biochem. Biophys. 143: 365-374; Pan und Nelson, 1984, Plant Physiol. 74: 324-328). Im Rahmen dieser Anmeldung wird der Begriff Amylopektin so verwendet, daß er das Phytoglykogen umfaßt.
Im Hinblick auf die Einheitlichkeit des Grundstoffes Stärke für seine Anwendung im industriellen Bereich werden Stärke-produzierende Pflanzen benötigt, die beispielsweise nur noch die Komponente Amylopektin oder nur noch die Komponente Amylose enthalten. Für eine Reihe weiterer Verwendungen werden Pflanzen benötigt, die unterschiedlich stark verzweigte Amylopektin-Formen synthetisieren.
Derartige Pflanzen können beispielsweise durch Züchtung oder Mutagenesetechniken erzeugt werden. Für bestimmte Pflanzenspezies, z. B. Mais, ist bekannt, daß durch Mutagenese Sorten erzeugt werden können, die nur noch Amylopektin bilden. Für die Kartoffel wurde ebenfalls durch chemische Mutagenese bei einer haploiden Linie ein Genotyp erzeugt, der keine Amylose bildet (Hovenkamp-Hermelink, 1987, Theor. Appl. Genet. 75: 217-221). Haploide Linien, bzw. die daraus entwickelten homozygoten diploiden oder tetraploiden Linien, sind landwirtschaftlich aber nicht einsetzbar. Für die landwirtschaftlich interessanten tetraploiden Linien, sind jedoch die Mutagenesetechniken nicht anwendbar, da wegen des Vorliegens von vier verschiedenen Erbgutkopien eine Inaktivierung aller Kopien eines Gens technisch nicht realisierbar ist. Bei der Kartoffel ist man daher auf andere Techniken angewiesen, z. B. auf die gezielte gentechnische Veränderung von Pflanzen.
So ist beispielsweise aus Visser et al. (1991, Mol. Gen. Genet. 225: 289) und der WO 92/11376 bekannt, daß mittels einer anti-sense-Inhibition des Gens für die Stärkekorn-gebundene Stärkesynthase in Kartoffel Sorten erzeugt werden können, die weitgehend reine Amylopektinstärke synthetisieren.
Weiterhin sind aus der WO 92/14827 DNA-Sequenzen bekannt, die für ein Verzweigungsenzym kodieren (Q-Enzym), das α-1,6-Verzweigungen in Amylopektinstärke einführt. Mit Hilfe dieser DNA-Sequenzen ist es möglich, transgene Pflanzen herzustellen, bei denen das Amylose/Amylopektin-Verhältnis verändert ist.
Für eine weitere gezielte Veränderung des Verzweigungsgrades von in Pflanzen synthetisierter Stärke mit Hilfe gentechnischer Verfahren ist es erforderlich, DNA-Sequenzen zu identifizieren, die für Enzyme kodieren, die am Stärkemetabolismus, insbesondere der Verzweigung von Stärkemolekülen, beteiligt sind.
Neben den Q-Enzymen, die Verzweigungen in Stärkemoleküle einführen, kommen in Pflanzen Enzyme vor, die Verzweigungen auflösen können. Diese Enzyme werden als Debranching/Enzyme bezeichnet und werden entsprechend ihrer Substratspezifität in drei Gruppen eingeteilt:
Die Pullulanasen, die neben Pullulan auch Amylopektin als Substrat nutzen, kommen bei Mikroorganismen, z. B. Klebsiella, und bei Pflanzen vor. In Pflanzen werden diese Enzyme auch als R-Enzyme bezeichnet.
Die Isoamylasen, die nicht Pullulan, wohl aber Glykogen und Amylopektin als Substrat nutzen, kommen ebenfalls bei Mikroorganismen und Pflanzen vor. Isoamylasen wurden beispielsweise bei Mais (Manners & Rowe, 1969, Carbohydr. Res. 9: 107) und Kartoffel (Ishizaki et al., 1983, Agric. Biol. Chem. 47: 771-779) beschrieben.
Die Amylo-1,6-Glukosidasen sind bei Säugern und Hefen beschrieben und nutzen Grenzdextrine als Substrat.
In Zuckerrübe konnte von Li et al. (1992, Plant Physiol. 98: 1277-1284) neben fünf Endo- und zwei Exoamylasen nur ein Debranching-Enzym vom Pullulanase-Typ nachgewiesen werden. Dieses Enzym, das eine Größe von ca. 100 kd und ein pH-Optimum von 5,5 aufweist, ist in den Chloroplasten lokalisiert. Auch für Spinat wurde ein Debranching-Enzym beschrieben, das Pullulan als Substrat verwendet. Sowohl das Debranching-Enzym aus Spinat als auch das aus der Zuckerrübe besitzen bei der Reaktion mit Amylopektin als Substrat verglichen mit Pullulan als Substrat eine 5fach geringere Aktivität (Ludwig et al., 1984, Plant Physiol. 74: 856-861; Li et al., 1992, Plant Physiol. 98: 1277-1284).
Bei der landwirtschaftlich wichtigen stärkespeichernden Kulturpflanze Kartoffel wurde die Aktivität eines Debranching-Enzyms 1951 von Hobson et al. (1951, J. Chem. Soc. 1451) untersucht. Es gelang der Nachweis, daß das entsprechende Enzym im Gegensatz zum Q-Enzym keine kettenverlängernde Aktivität besitzt, sondern lediglich α-1,6-glykosidische Bindungen hydrolysiert. Das Enzym konnte jedoch bisher nicht genauer charakterisiert werden.
Im Fall der Kartoffel wurden bereits Verfahren zur Reinigung des Debranching-Enzyms sowie partielle Peptidsequenzen des gereinigten Proteins vorgeschlagen (Deutsche Patentanmeldung P 43 27 165.0 und PCT/EP 94/026239). Prinzipiell ist es mit Hilfe bekannter Peptidsequenzen möglich unter Verwendung degenerierter Oligonukleotidsonden, DNA-Sequenzen zu identifizieren, die für die jeweiligen Proteine kodieren. In der Praxis ergibt sich jedoch häufig das Problem, daß der Degeneriertheitsgrad der Sonden zu hoch ist oder die Sonden zu kurz sind, um spezifisch Sequenzen zu identifizieren, die für das gesuchte Protein kodieren. Trotz der Kenntnis der vorgeschlagenen Peptidsequenzen des Debranching-Enzyms aus Kartoffel ist es bisher nicht gelungen, mit Hilfe der Hybridisierung gegen degenerierte Oligonukleotide oder mit Hilfe anderer molekularbiologischer oder immunologischer Verfahren, wie sie in der Anmeldung P 43 27 165.0 bereits vorgeschlagen wurden, DNA-Sequenzen zu isolieren, die für pflanzliche Debranching-Enzyme kodieren.
Auch im Fall des Spinats, für den die Reinigung des Debranching-Enzyms bereits 1984 von Ludwig et al. (Plant Physiol. 74: 856-861) beschrieben wurde, gelang bisher weder die Bestimmung von Peptidsequenzen noch die Identifizierung von DNA-Sequenzen, die für das besagte Protein kodieren.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, DNA-Sequenzen bereitzustellen, die für pflanzliche Debranching-Enzyme kodieren.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Pflanzen, die eine Amylopektinstärke mit einem gesteigerten oder reduziertem Verzweigungsgrad synthetisieren, sowie Verfahren zu deren Herstellung bereitzustellen.
Es werden nun die Identifikation und die Isolierung von DNA-Sequenzen, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität von Debranching-Enzymen kodieren, insbesondere von DNA-Sequenzen aus Solanum tuberosum und Spinacia oleracea, beschrieben. Ferner werden transgene Pflanzen, die aufgrund der zusätzlichen Expression eines Debranching-Enzyms bzw. der Inhibition der Expression endogener Gene, die für Debranching-Enzyme kodieren, eine Stärke mit einem veränderten Verzweigungsgrad synthetisieren, sowie Verfahren zur Herstellung derartiger transgener Pflanzen beschrieben.
Die obengenannten Aufgaben werden erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß a) zunächst Proteine mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms bis zur Homogenität aufgereinigt werden,
  • b) von den gereinigten Proteinen Peptidsequenzen durch Proteinsequenzierung ermittelt werden,
  • c) diese Peptidsequenzen zur Klonierung von cDNA-Sequenzen aus einer cDNA-Bibliothek genutzt werden und/oder
  • d) diese Peptidsequenzen zur Klonierung von genomischen DNA-Sequenzen aus einer genomischen Bibliothek mit Hilfe molekularbiologischer Methoden verwendet werden und schließlich
  • e) die isolierten DNA-Sequenzen, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms kodieren, beispielsweise mit Hilfe von Plasmiden in pflanzliche Zellen eingebracht werden und aus den erhaltenen Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden.
In den Ausführungsbeispielen werden exemplarisch anhand der Kartoffel (Solanum tuberosum) und des Spinats (Spinacea oleracea) die Isolierung und Charakterisierung von DNA-Sequenzen, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms kodieren, sowie im Fall der Kartoffel transgene Pflanzen, die ein zusätzliches Debranching-Enzym exprimieren oder bei denen die Expression endogener Debranching-Enzym-Gene aufgrund eines anti­ sense-Effektes inhibiert ist, beschrieben.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher DNA-Sequenzen aus Pflanzen, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität von Debranching-Enzymen kodieren, insbesondere DNA-Sequenzen, die für Debranching-Enzyme kodieren, die aus Proteinextrakten aus Pflanzen isolierbar sind durch:
  • a) fraktionierte Ammoniumsulfatfällung und
  • b) anschließender Affinitätschromatographie an β-Cyclodextrin.
Die Erfindung betrifft insbesondere DNA-Sequenzen, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität von Debranching-Enzymen kodieren, aus höheren Pflanzen, vorzugsweise aus Pflanzen der Familie der Solanaceae oder der Familie der Chenopodiaceae, und besonders bevorzugt DNA-Sequenzen aus Solanum tuberosum und Spinacia oleracea.
Gegenstand der Erfindung sind insbesondere DNA-Sequenzen, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität von Debranching-Enzymen kodieren, wobei diese Proteine mindestens eine oder mehrere der unter Seq ID No. 1 bis Seq ID No. 14 angegebenen Peptidsequenzen aufweisen, sowie DNA-Sequenzen, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität von Debranching-Enzymen kodieren, wobei diese Proteine die unter Seq ID No. 17 oder die unter Seq ID No. 22 angegebenen Aminosäuresequenzen oder Teile davon aufweisen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind DNA-Sequenzen aus Pflanzen, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität von Debranching-Enzymen kodieren und die im wesentlichen die unter Seq ID No. 17 oder die unter Seq ID No. 22 angegebene DNA-Sequenz aufweisen, insbesondere DNA-Sequenzen, die einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen, d. h. eine Homologie von mindestens 60%, vorzugsweise zwischen 70 und 95% und insbesondere eine Homologie von mehr als 95%. Die Erfindung betrifft daher ebenfalls Derivate der unter Seq ID No. 17 und Seq ID No. 22 dargestellten DNA-Sequenzen, die an einer oder mehreren Positionen von den besagten DNA-Sequenzen abweichen, insbesondere Derivate, die durch Insertion, Deletion, Rekombination oder Substitution erhalten wurden und die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität von Debranching-Enzymen kodieren.
Bei den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen handelt es sich in allen Fällen vorzugsweise um isolierte und gereinigte DNA-Sequenzen.
Gegenstand der Erfindung sind ferner im wesentlichen reine Proteine aus Pflanzen mit der enzymatischen Aktivität von Debranching-Enzymen, insbesondere solche aus höheren Pflanzen, vorzugsweise aus Pflanzen der Familie der Solanaceae oder der Chenopodiaceae, und besonders bevorzugt aus Solanum tuberosum oder Spinacia oleracea. Gegenstand der Erfindung sind ferner im wesentlichen reine Debranching-Enzyme aus Pflanzen, die eine oder mehrere der unter Seq ID No. 1 bis Seq ID No. 14 angegebenen Peptidsequenzen aufweisen und ein Molekulargewicht zwischen 50 kd und 150 kd besitzen, vorzugsweise zwischen 70 kd und 130 kd und besonders bevorzugt zwischen 90 kd und 110 kd, wobei die Bestimmung des Molekulargewichtes mittels SDS-Gelelektrophorese erfolgt.
Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Proteine mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms, die im wesentlichen die unter Seq ID No. 22 dargestellte Aminosäuresequenz oder im wesentlichen die unter Seq ID No. 17 dargestellte Aminosäuresequenz aufweisen. Die Erfindung betrifft daher auch Proteine, die Aminosäuresequenzen aufweisen, die mit denen in Seq ID No. 17 bzw. Seq ID No. 22 dargestellten Aminosäuresequenzen im wesentlichen identisch sind und von diesen an einer oder mehreren Positionen abweichen, wobei es sich bei den Abweichungen vorzugsweise um konservative Aminosäureaustausche handelt und das Protein die enzymatische Aktivität eines Debranching-Enzyms besitzt. Insbesondere betrifft die Erfindung Debranching-Enzyme aus Pflanzen, deren Aminosäuresequenz zu der in Seq ID No. 17 oder zu der in Seq ID No. 22 angegebenen Aminosäuresequenz eine hohe Homologie aufweist, insbesondere eine Homologie von mindestens 70%, vorzugsweise von über 80%, besonders bevorzugt von über 90% und insbesondere eine Homologie von über 99%.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung im wesentlichen reine Proteine aus Solanum tuberosum mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms, die aus einem Proteinextrakt aus Kartoffelknollen isolierbar sind durch fraktionierte Ammoniumsulfatfällung und anschließende Affinitätschromatographie an einer β-Cyclodextrinsäule, insbesondere Proteine, die mindestens eine der unter Seq ID No. 1 bis Seq ID No. 12 angegebenen Peptidsequenzen aufweisen, und vorzugsweise Proteine, die ein Molekulargewicht von 100 ± 50 kd in einer SDS-Gelelektrophorese aufweisen.
Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen besteht nun die Möglichkeit, Pflanzen auf gentechnischem Wege dahingehend zu verändern, daß sie eine Amylopektinstärke mit einem reduziertem oder gesteigertem Verzweigungsgrad synthetisieren.
Die Erfindung betrifft daher ebenfalls Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, die eine Amylopektinstärke mit einem im Vergleich zu in Wildtyppflanzen synthetisierter Amylopektinstärke reduzierten Verzweigungsgrad bilden, dadurch gekennzeichnet, daß sie folgende Schritte umfassen:
  • a) Herstellung einer Expressionskassette, die folgende DNA-Sequenzen umfaßt:
  • i) einen in pflanzlichen Zellen funktionalen Promotor, der die Transkription einer nachfolgenden DNA-Sequenz gewährleistet,
  • ii) mindestens eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms kodiert und in sense-Orientierung an das 3′-Ende des Promotors gekoppelt ist, und
  • iii) gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Termination der Transkription und die Addition eines poly-A-Schwanzes an das entstehende Transkript, das an das 3′-Ende der kodierenden Region gekoppelt ist,
  • b) Transformation pflanzlicher Zellen mit der in Schritt a) hergestellten Expressionskassette und
  • c) Regeneration ganzer, intakter Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen,
sowie Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, die eine Amylopektinstärke mit einem im Vergleich zu in Wildtyppflanzen synthetisierter Amylopektinstärke erhöhten Verzweigungsgrad bilden, dadurch gekennzeichnet, daß sie folgende Schritte umfassen:
  • a) Herstellung einer Expressionskassette, die folgende DNA-Sequenzen umfaßt:
  • i) einen in pflanzlichen Zellen funktionalen Promotor, der die Transkription einer nachfolgenden DNA-Sequenz gewährleistet,
  • ii) mindestens eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms kodiert und in anti­ sense-Orientierung an das 3′-Ende des Promotors gekoppelt ist, und
  • iii) gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Termination der Transkription und die Addition eines poly-A-Schwanzes an das entstehende Transkript, das an das 3′-Ende der kodierenden Region gekoppelt ist,
  • b) Transformation pflanzlicher Zellen mit der in Schritt a) hergestellten Expressionskassette und
  • c) Regeneration ganzer, intakter Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.
Für den unter i) genannten Promotor kommt im Prinzip jeder in Pflanzen funktionale Promotor in Betracht. Der Promotor kann homolog oder heterolog in bezug auf die verwendete Pflanzenspezies sein. Geeignet ist beispielsweise der 35S-Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (Odell et al., 1985, Nature 313: 810-812), der eine konstitutive Expression in allen Geweben einer Pflanze gewährleistet und das in der WO/9401571 beschriebene Promotorkonstrukt. Es können jedoch auch Promotoren verwendet werden, die nur zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt (siehe beispielsweise WO/9307279) oder in einem bestimmten Gewebe der Pflanze zu einer Expression nachgeschalteter Sequenzen führen (siehe z. B. Stockhaus et al., 1989, EMBO J. 8: 2245-2251). Präferentiell werden Promotoren eingesetzt, die in den stärkespeichernden Organen der zu transformierenden Pflanzen aktiv sind. Dies sind beim Mais die Maiskörner, während es bei der Kartoffel die Knollen sind. Zur Transformation der Kartoffel kann insbesondere, aber nicht ausschließlich, der knollenspezifische B33-Promotor (Rocha-Sosa et al., 1989, EMBO J. 8: 23-29) verwendet werden.
In dem Fall, daß die unter Verfahrensschritt a) ii genannte, DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms kodiert, in sense-Orientierung mit dem Promotor verknüpft ist, kann diese DNA-Sequenz sowohl nativen bzw. homologen Ursprungs als auch fremden bzw. heterologen Ursprungs in bezug auf die zu transformierende Pflanzenspezies sein. Es können sowohl Sequenzen prokaryontischen Ursprungs als auch solche eukaryontischen Ursprungs verwendet werden. Bevorzugt werden pflanzliche DNA-Sequenzen verwendet, insbesondere DNA-Sequenzen von Pflanzen aus der Familie der Solanaceae und von Pflanzen aus der Familie der Chenopodiaceae, vorzugsweise DNA-Sequenzen aus Solanum tuberosum und aus Spinacia oleracea. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform sieht die Verwendung von DNA-Sequenzen vor, die für Debranching-Enzyme kodieren, die mindestens eine der unter Seq ID No. 1 bis Seq ID No. 14 und Seq ID No. 22 angegebenen Peptidsequenzen aufweisen, insbesondere von DNA-Sequenzen, die für Proteine mit der unter Seq ID No. 17 dargestellten Aminosäuresequenz kodieren, sowie von DNA-Sequenzen die die unter Seq ID No. 17 oder unter Seq ID No. 22 angegebene Nukleotidabfolge aufweisen, oder von DNA-Sequenzen, die im wesentlichen mit diesen Sequenzen übereinstimmen und für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms kodieren.
Es besteht grundsätzlich die Möglichkeit, daß das synthetisierte Protein in jedem beliebigen Kompartiment der pflanzlichen Zelle lokalisiert sein kann. Pflanzliche Debranching-Enzyme sind in der Regel in den Plastiden lokalisiert und besitzen daher eine Signalsequenz für die Translokation in diese Organellen. Im Fall der unter Seq ID No. 17 dargestellten Aminosäuresequenz besteht die Signalsequenz aus den 64 N-terminalen Aminosäuren. Um die Lokalisation in einem anderen Kompartiment der Zelle zu erreichen, muß die DNA-Sequenz, die für diese Signalsequenz kodiert, entfernt werden und die kodierende Region mit DNA-Sequenzen verknüpft werden, die die Lokalisierung in dem jeweiligen Kompartiment gewährleisten. Derartige Sequenzen sind bekannt (Siehe beispielsweise Braun et al., 1992, EMBO J. 11: 3219-3227; Wolter et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 846-850; Sonnewald et al., 1991, Plant J. 1: 95-106).
In dem Fall, daß die unter Verfahrensschritt a) ii genannte DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms kodiert, in anti-sense-Orientierung mit dem Promotor verknüpft ist, handelt es sich bei dieser vorzugsweise um eine DNA-Sequenz homologen Ursprungs in bezug auf die zu transformierende Pflanzenspezies. Es können jedoch auch DNA-Sequenzen verwendet werden, die einen hohen Grad an Homologie zu endogen vorhandenen Debranching-Enzym-Genen haben, insbesondere Homologien höher als 80%, vorzugsweise Homologien zwischen 90% und 100% und besonders bevorzugt Homologien über 95%.
Es können Sequenzen bis zu einer Mindestlänge von 15 bp verwendet werden. Eine inhibierende Wirkung ist aber auch bei der Verwendung kürzerer Sequenzen nicht ausgeschlossen. Bevorzugt werden längere Sequenzen zwischen 100 und 500 Basenpaaren verwendet, für eine effiziente anti-sense-Inhibition werden insbesondere Sequenzen mit einer Länge über 500 Basenpaaren verwendet. In der Regel werden Sequenzen verwendet, die kürzer als 5000 Basenpaare sind, bevorzugt Sequenzen, die kürzer als 2500 Basenpaare sind.
Im Fall der Transformation von Kartoffeln handelt es sich bei der besagten DNA-Sequenz vorzugsweise um die unter Seq ID No. 22 dargestellte DNA-Sequenz oder um Teile davon, die lang genug sind, um einen anti-sense-Effekt auszuüben.
Terminationssignale für die Transkription in pflanzlichen Zellen sind beschrieben und sind beliebig gegeneinander austauschbar. Verwendet werden kann beispielsweise die Terminationssequenz des Octopinsynthase-Gens aus Agrobacterium tumefaciens (siehe z. B. Gielen et al., 1989, EMBO J. 8: 23-29).
Der Transfer der gemäß Verfahrensschritt a) konstruierten Expressionskassette in pflanzliche Zellen erfolgt vorzugsweise unter Verwendung von Plasmiden. Derartige Plasmide enthaltend eine Expressionskassette bestehend aus einem in pflanzlichen Zellen aktiven Promotor, einer DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms kodiert, und gegebenenfalls einem Terminationssignal sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Vorzugsweise erfolgt der Transfer der Expressionskassette in pflanzliche Zellen mit Hilfe von Plasmiden, die eine stabile Integration der Expressionskassette in das pflanzliche Genom gewährleisten.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann prinzipiell auf alle Pflanzenspezies angewendet werde. Von Interesse sind sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen. Für verschiedene monokotyle und dikotyle Pflanzenspezies sind bereits Transformationstechniken beschrieben worden. Bevorzugt werden die Verfahren auf Nutzpflanzen, insbesondere Stärke-produzierende Pflanzen, wie z. B. Mais, Weizen, Gerste, Kartoffel, Erbse, Reis etc. angewandt.
Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls die durch die Verfahren erhältlichen transgenen Pflanzenzellen und transgenen Pflanzen, die aufgrund der zusätzlichen Expression eines Debranching-Enzyms bzw. der Inhibierung der Expression endogener Debranching-Enzym-Gene, eine reduzierte bzw. eine gesteigerte Verzweigung der synthetisierten Amylopektin-Stärke oder des Phytoglykogens aufweisen.
Die besagten trangenen Pflanzenzellen bzw. transgenen Pflanzen sind dadurch gekennzeichnet, daß sie ein rekombinantes DNA-Molekül, vorzugsweise stabil in das Genom integriert, enthalten, das eine gemäß Verfahrensschritt a) konstruierte Expressionskassette umfaßt, bei der eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms kodiert, in sense- oder anti­ sense-Orientierung an einen Promotor geknüpft ist.
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E.coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation von E.coli-Zellen verwendet. Transformierte E.coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium kultiviert, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird nach Standardmethoden wiedergewonnen. Als Analysemethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen und Sequenzanalysen eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid DNA gespalten werden und resultierende DNA-Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden an sich keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z. B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig.
Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden.
Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al. (1978) Mol. Gen. Genet. 163: 181-187). Die zur Transformation der Agrobakterien verwendeten Plasmide enthalten weiterhin ein Selektionsmarkergen, beispielsweise das NPT II-Gen, das die Selektion transformierter Bakterien erlaubt. Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerÿ Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46 und An et al. (1985) EMBO J. 4: 277-287 beschrieben worden. Binäre Vektoren sind bereits z. T. kommerziell erhältlich, z. B. pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc., USA).
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden.
Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin u. a. vermittelt. Der individuelle gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten.
Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84). Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.
Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.
Infolge der Einführung einer gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren konstruierten Expressionskassette kommt es in den transformierten Pflanzenzellen zur Bildung einer RNA. Ist die für ein Debranching-Enzym kodierende DNA-Sequenz in der Expressionskassette in sense-Orientierung mit dem Promotor verknüpft, kommt es zur Synthese einer mRNA, die als Matrize für die Synthese eines zusätzlichen oder neuen Debranching-Enzyms in den pflanzlichen Zellen führen kann. Als Folge davon weisen diese Zellen eine erhöhte Aktivität des Debranching-Enzyms auf, was zu einer Reduktion des Verzweigungsgrades des in den Zellen gebildeten Amylopektins führt. Dadurch wird eine Stärke zugänglich, die sich gegenüber der natürlich vorkommenden Stärke durch eine stärker geordnete Raumstruktur sowie eine gesteigerte Einheitlichkeit auszeichnet. Dies hat unter anderem günstige Auswirkungen auf die Filmbildungseigenschaften.
Ist die für ein Debranching-Enzym kodierende DNA-Sequenz dagegen in anti­ sense-Orientierung mit dem Promotor verknüpft, so kommt es in transgenen Pflanzenzellen zur Synthese einer anti-sense-RNA, die die Expression von endogenen Debranching-Enzym-Genen inhibiert. Als Folge weisen diese Zellen eine reduzierte Aktivität des Debranching-Enzyms auf, was zur Bildung einer stark verzweigten Stärke führt. Mit Hilfe der anti-sense-Technik ist es möglich Pflanzen herzustellen, bei denen die Expression endogener Debranching-Enzym-Gene in unterschiedlichem Maße inhibiert ist in einem Bereich von 0% bis zu 100%. Dies ermöglicht insbesondere die Herstellung von Pflanzen, die Amylopektinstärke mit den verschiedensten Verzweigungsgraden synthetisieren. Dies stellt einen Vorteil gegenüber herkömmlichen Züchtungs- und Mutageneseverfahren dar, bei denen die Bereitstellung einer derartigen Vielfalt nur mit erheblichem Zeit- und Kostenaufwand möglich ist. Stark verzweigtes Amylopektin hat eine besonders große Oberfläche und eignet sich dadurch als Kopolymer in besonderem Maße. Ein starker Verzweigungsgrad führt außerdem zu einer Verbesserung der Wasserlöslichkeit des Amylopektins. Diese Eigenschaft ist für bestimmte technische Anwendungen sehr vorteilhaft. Besonders geeignet für die Produktion von stark verzweigtem Amylopektin unter Ausnutzung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen des Debranching-Enzyms ist die Kartoffel. Die Anwendung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Pflanzenspezies beschränkt.
Die in den transgenen Pflanzen synthetisierte modifizierte Stärke kann mittels gängiger Methoden aus den Pflanzen oder aus den Pflanzenzellen isoliert und nach der Reinigung zur Herstellung von Nahrungsmitteln und industriellen Produkten verwendet werden.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls die aus den besagten transgenen Pflanzen, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, erhältliche Stärke, die dadurch gekennzeichnet ist, daß die in dieser Stärke vorhandene Amylopektinstärke im Vergleich zu in nicht-transformierten Pflanzen synthetisierter Amylopektinstärke einen gesteigerten oder reduzierten Verzweigungsgrad aufweist. Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung der besagten Stärke zur Herstellung von Lebensmitteln und industriellen Produkten.
Einen Gegenstand der Erfindung stellen ebenfalls Vektoren, insbesondere Plasmide, Cosmide, Viren, Bacteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren, dar, die eine oder mehrere der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen enthalten.
Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen zur Herstellung rekombinanter DNA-Moleküle, die zur Transformation pro- oder eukaryontischer Zellen, insbesondere pflanzlicher Zellen, geeignet sind und die Expression der besagten DNA-Sequenzen in den transformierten Zellen gewährleisten, sowie die Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen zur Herstellung von Pflanzen, die eine Amylopektinstärke mit einem gesteigerten oder reduzierten Verzweigungsgrad im Vergleich zu Wildtyppflanzen synthetisieren.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder Teile dieser DNA-Sequenzen bzw. der reversen Komplemente dieser Sequenzen zur Identifizierung und Isolierung homologer Sequenzen, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms kodieren oder für Teile derartiger Proteine, aus Pflanzen oder anderen Organismen. Homologie bedeutet in diesem Zusammenhang eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise über 80% und insbesondere über 95%.
Homologie bedeutet ferner, daß funktionelle und/oder strukturelle Äquivalenz zwischen den betreffenden DNA-Sequenzen oder Aminosäuresequenzen besteht. Bei den Sequenzen, die homolog zu den erfindungsgemäßen Sequenzen sind und von der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz bzw. Aminosäuresequenz an einer oder mehreren Positionen abweichen, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Sequenz, die Modifikationen darstellen, die dieselbe Funktion ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftretende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus anderen Organismen, oder um Mutationen, wobei diese Mutationen auf natürliche Weise aufgetreten sein können oder durch gezielte Mutagenese eingeführt wurden. Ferner kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Die von den verschiedenen Varianten der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz kodierten Proteine weisen bestimmte gemeinsame Charakteristika auf. Dazu können z. B. Enzymaktivität, immunologische Reaktivität, Komformation etc. gehören, sowie physikalische Eigenschaften wie z. B. das Laufverhalten in Gelelektrophoresen, chromatographisches Verhalten, Sedimentations­ koeffizienten, Löslichkeit, spektroskopische Eigenschaften, Stabilität etc.
Um verwandte DNA-Sequenzen zu bestimmen, müssen zunächst Genbanken des jeweils zu untersuchenden Organismus angelegt werden, die repräsentativ für den Gehalt der Gene des Organismus oder für die Expression von Genen in dem Organismus oder einem bestimmten Gewebe des Organismus sind. Erstere sind genomische, letztere sind cDNA-Banken. Die Identifizierung und Isolierung verwandter Sequenzen erfolgt dabei mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY).
Als Hybridisierungsprobe können DNA-Moleküle verwendet werden, die exakt die oder im wesentlichen die unter Seq ID No. 17 oder unter Seq ID No. 22 angegebenen DNA-Sequenzen oder Teilen dieser Sequenzen aufweisen. Bei den als Hybridisierungsprobe verwendeten DNA-Fragmente kann es sich auch um synthetische DNA-Fragmente handeln, die mit Hilfe der gängigen DNA-Synthesetechniken hergestellt wurden und im wesentlichen mit den erfindungsgemäßen Sequenzen übereinstimmen. Hat man Gene identifiziert und isoliert, die mit den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen hybridisieren, ist eine Bestimmung der Sequenz und eine Analyse der Eigenschaften der von dieser Sequenz kodierten Proteine erforderlich.
Gegenstand der Erfindung sind daher auch DNA-Sequenzen aus Pflanzen, die homolog zu den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen sind, mit diesen hybridisieren und die für ein Protein kodieren, das die enzymatische Aktivität eines Debranching-Enzyms besitzt. Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet in diesem Zusammenhang eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY) beschrieben sind.
Der Nachweis der enzymatischen Aktivität des Debranching-Enzyms kann wie in Ausführungsbeispiel 5 beschrieben durch einen Färbetest erfolgen. Dieser beruht darauf, daß sich ein Protein mit einer stärkemodifizierenden Aktivität nachweisen läßt, wenn Proteinextrakte, beispielsweise aus Kartoffelknollen, in nicht-denaturierenden, amylopektinhaltigen Polyacrylamidgelen (PAAG) aufgetrennt werden und das Gel, nach Inkubation in einem geeigneten Puffer, anschließend einer Jodfärbung unterzogen wird. Während unverzweigte Amylose mit Jod einen blauen Komplex bildet, ergibt Amylopektin eine rötlich-violette Färbung. In amylopektinhaltigen Polyacrylamidgelen, die mit Jod rötlich-violett färben, kommt es an Orten, an denen eine Debranching-Aktivität lokalisiert ist, zu einer Farbverschiebung hin zu einer Blaufärbung des Gels, da die Verzweigungen des violettfärbenden Amylopektins von dem Debranching-Enzym abgebaut werden.
Alternativ kann der Nachweis der Debranching-Enzymaktivität mit Hilfe des DNSS-Tests (siehe Ludwig et al., 1984, Plant Physiol. 74: 856-861) erfolgen.
Verwendete Abkürzungen
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
IPTG Isopropyl β-D-Thiogalacto-Pyranosid
PAAG Polyacrylamidgel
PCR Polymerase Chain Reaction
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
SDS Natriumdodecylsulfat
Verwendete Medien und Lösungen
Puffer A
50 mM Natriumacetat pH 6,0
 2,5 mM 1,4-Dithio-DL-threitol
 1,5 mM β-Mercaptoethanol
 0,4 mM PMSF
Spuren von Natriumbisulfit, Natriumsulfit und Ascorbinsäure
Puffer B
50 mM MES
pH 5,8 mit NaOH
Puffer C
250 mM Phosphatpuffer
250 mM NaCl
  1 mM EDTA
  7% SDS
 25% PEG6000
 25% Formamid
250 mg/l denaturierte Heringssperma-DNA
Puffer H
  2×SSC
 10× Denhardts Lösung
 0,1% SDS
  5 mM EDTA
 50 mM Dinatriumphosphat
250 µg/ml Heringssperma-DNA
 50 µg/ml tRNA
20×SSC
175.3 g NaCl
 88.2 g Natrium-Citrat
ad 1000 ml mit ddH₂O
pH 7,0 mit 10 N NaOH
Beschreibung der Abbildungen
Fig. 1 zeigt das Plasmid pDBE-Spi.
Die fein gezogene Linie entspricht der Sequenz von pBluescriptSKII(-). Die starke Linie repräsentiert die cDNA, die für das Debranching-Enzym aus Spinacia oleracea kodiert. Die cDNA-Insertion ist zwischen die EcoR I- und Xho I-Schnittstellen des Polylinkers des Plasmids ligiert. Der Pfeil gibt die Orientierung der kodierenden Region für das Debranching-Enzym an. Die DNA-Sequenz der cDNA-Insertion ist unter Seq ID No. 17 angegeben.
Fig. 2 zeigt das Plasmid p35S-DBE-Spi.
Dabei bedeuten:
A = Fragment A: CaMV 35S-Promotor, nt 6909-7437 (Franck et al. (1980) Cell 21: 285-294)
B = Fragment B: cDNA aus Spinacia oleracea kodierend für das Debranching-Enzym;
EcoR I/Xho I-Fragment aus pDBE-Spi, ca. 3440 bp
Orientierung zum Promotor: sense
C = Fragment C: nt 11 748-11 939 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3: 835-846)
Fig. 3 zeigt die Aufreinigung des Debranching-Enzyms aus Solanum tuberosum.
Dabei bedeuten:
0 = Proteinextrakt eines Homogenats von Knollengewebe aus Solanum tuberosum
Durchlauf = Durchlauf einer Affinitätschromatographie des Proteinextraktes an immobilisiertem β-Cyclodextrin
β-Cyclodextrin = Elution der Affinitätschromatographie mit gelöstem β-Cyclodextrin in der Konzentration 1 mg/ml bzw. 10 mg/ml
DBE = Debranching-Enzym aus Solanum tuberosum
DE = Disproportionierendes Enzym aus Solanum tuberosum
Fig. 4 zeigt das Plasmid pDBE-Pot.
Die fein gezogene Linie entspricht der Sequenz von pBluescriptSKII(-). Die starke Linie repräsentiert die partielle cDNA-Sequenz, die für einen Teil des Debranching-Enzyms aus Solanum tuberosum kodiert. Der Pfeil gibt die Orientierung der kodierenden Region für das Debranching-Enzym an. Die cDNA-Insertion ist zwischen die BamH I- und Sma II-Schnittstellen des Polylinkers des Plasmids ligiert. Die DNA-Sequenz der cDNA-Insertion ist unter Seq ID No. 22 angegeben.
Fig. 5 zeigt das Plasmid p35S-antiDBE-Pot.
Dabei bedeuten:
A = Fragment A: CaMV 35S-Promotor, nt 6909-7437 (Franck et al. (1980) Cell 21: 285-294)
B = Fragment B: partielle cDNA-Sequenz aus Solanum tuberosum kodierend für einen Teil des Debranching-Enzyms;
Sma I/BamH I-Fragment aus pDBE-Pot, ca. 500 bp
Orientierung zum Promotor: anti-sense
C = Fragment C: nt 11 748-11 939 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3: 835-846)
Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele erläutern den Gegenstand der Erfindung ohne ihn einzuschränken, wobei die Identifizierung und Reinigung von Debranching-Enzymen aus Kartoffel (Solanum tuberosum) und Spinat (Spinacia oleracea), sowie die Isolierung von DNA-Sequenzen, die für die besagten Debranching-Enzyme kodieren, beschrieben werden. Ferner wird die Konstruktion binärer Plasmide und die Transformation von Pflanzen mit diesen Plasmiden beschrieben.
In analoger Verfahrensweise können Debranching-Enzyme und diese kodierende DNA-Sequenzen aus anderen Pflanzen isoliert werden und andere Nutzpflanzen wie z. B. Mais oder Weizen transformiert werden.
In den folgenden Ausführungsbeispielen wurden folgende Standardtechniken angewendet:
1. Klonierungsverfahren
Zur Klonierung in E.coli wurden die Vektoren pBluescriptSKII(-) (Stratagene) und pUC19 verwendet.
Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären Vektor pBinAR kloniert.
2. Bakterienstämme
Für die Bluescript-Vektoren, die pUC-Vektoren und für die pBinAR-Konstrukte wurde der E.coli-Stamm DH5α (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburgh, USA) verwendet. Für die in vivo-excision wurde der E.coli-Stamm XL1-Blue verwendet.
Die Transformation der Plasmide in die Kartoffelpflanzen wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes C58C1 pGV2260 durchgeführt (Deblaere et al., 1985, Nucl. Acids Res. 13: 4777 : 4788).
3. Transformation von Agrobacterium tumefaciens
Der Transfer der DNA erfolgte durch direkte Transformation nach der Methode von Höfgen & Willmitzer (1988, Nucleic Acids Res. 16: 9877). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim & Doly (1979, Nucleic Acids Res. 7: 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch analysiert.
4. Transformation von Kartoffeln
Zehn kleine mit dem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel-Sterilkultur (Solanum tuberosum L.cv. Desiree) wurden in 10 ml MS-Medium (Murashige & Skoog (1962) Physiol. Plant. 15: 473) mit 2% Saccharose gelegt, welches 50 ml einer unter Selektion gewachsenen Agrobacterium tuinefaciens-Übernachtkultur enthielt. Nach 3-5 minütigem, leichtem Schütteln erfolgte eine weitere Inkubation für 2 Tage im Dunkeln. Daraufhin wurden die Blätter zur Kallusinduktion auf MS-Medium mit 1,6% Glukose, 5 mg/l Naphthylessigsäure, 0,2 mg/l Benzylaminopurin, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin, und 0,80% Bacto Agar gelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurden die Blätter zur Sproßinduktion auf MS-Medium mit 1,6% Glukose, 1,4 mg/l Zeatinribose, 20 mg/l Naphthylessigsäure, 20 mg/l Giberellinsäure, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin, und 0.80% Bacto Agar gelegt.
5. Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten
Die radiokative Markierung von DNA-Fragmenten wurde mit Hilfe eines DNA-Random Primer Labelling Kits der Firma Boehringer (Deutschland) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt.
6. Northern Blot-Analyse
RNA wurde nach Standardprotokollen aus Blattgewebe von Pflanzen isoliert. 50 µg der RNA wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt (1,5% Agarose, 1×MEN-Puffer, 16,6% Formaldehyd). Das Gel wurde nach dem Gellauf kurz in Wasser gewaschen. Die RNA wurde mit 20×SSC mittels Kapillarblot auf eine Nylonmembran vom Typ Hybond N (Amersham, UK) transferiert. Die RNA wurde anschließend durch UV-Crosslinking auf der Membran fixiert.
Die Membran wurde in NSEB-Puffer für 2 h bei 68°C prähybridisiert und anschließend in NSEB-Puffer über Nacht bei 68°C in Gegenwart der radioaktiv markierten Probe hybridisiert.
7. Pflanzenhaltung
Kartoffelpflanzen wurden im Gewächshaus unter folgenden Bedingungen gehalten:
Lichtperiode: 22 h bei 25000 Lux und 22°C
Dunkelperiode: 8 h bei 15°C
Luftfeuchte: 60%
Ausführungsbeispiel 1 Reinigung eines Debranching-Enzyms aus Spinacia oleracea und Bestimmung von Peptidsequenzen
Zur Reinigung eines Debranching-Enzyms aus Spinat wurden 500 g Spinatblätter, aus denen die Mittelrippen entfernt worden waren, in 1,5 l Puffer B in einem "Warring blendor" für 1 min homogenisiert. Das Homogenat wurde anschließend durch 6 Lagen Mull gepreßt. Falls erforderlich wurde der pH-Wert auf einen Wert von 5,8 eingestellt. Das Homogenat wurde 30 min bei 25 000×g zentrifugiert. Anschließend wurden aus dem Überstand Proteine durch Ammoniumsulfat-Fäl­ lung, die bei 0°C durchgeführt wurde, präzipitiert. Dazu wurde dem Überstand unter ständigem Rühren kontinuierlich Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 40% der Sättigungskonzentration zugesetzt. Die einsetzende Präzipitation von Proteinen wurde unter Rühren für 30 min fortgesetzt. Nach Abtrennen der präzipitierten Proteine durch 30 minütige Zentrifugation bei 25 000×g wurde der resultierende Überstand wiederum mit Ammoniumsulfat versetzt bis zu einer Konzentration von 50% der Sättigungskonzentration. Die Präzipitation wurde wiederum für 30 min fortgesetzt. Anschließend wurde für 30 min bei 25 000×g zentrifugiert und die präzipitierten Proteine in ca. 80 ml Puffer B resuspendiert. Nach 15 minütiger Zentrifugation bei 30 000×g wurde der Überstand abgenommen und auf eine mit Puffer B äquilibrierte Affinitätssäule aufgetragen. Bei dem Material der Affinitätssäule handelte es sich um epoxy­ aktivierte Sepharose 6B (Sigma), an die wie in Ludwig et al. (1984, Plant Physiol. 74: 856-861) beschrieben β-Cyclodextrin (Cycloheptaamylose; Sigma) gekoppelt worden war. Die Affinitätssäule wurde mit Puffer B gewaschen bis das Eluat keine Absorption bei 280 nm aufwies. Die Elution des Debranching-Enzyms erfolgte mit Hilfe von 1 mg/ml β-Cyclodextrin in Puffer B. Mit Hilfe des DNSS-Tests (siehe Ludwig et al., 1984, Plant Physiol. 74: 856-861) wurden Fraktionen mit Debranching-Enzymaktivität bestimmt und vereinigt. Das Entfernen des Cyclodextrins sowie das Einengen der Proteinlösung erfolgten mit Hilfe von Centricon 30-Tubes (Amicon), wobei mehrfach mit Puffer B gewaschen wurde.
Mit 200 µg des gereinigten Proteins wurde eine BrCN-Spaltung durchgeführt wie beschrieben in Matsudaira (1989, "A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing", Academic Press, Inc., San Diego: Seite 29). Die resultierenden Peptide wurden mittels einer SDS-Polyacrylamidgel-Elek­ trophorese aufgetrennt. Bei dem verwendeten Gel handelte es sich um ein Gradientengel, bei dem die Polyacrylamidkonzentration von 12% auf 18% zunahm bei einer gleichbleibenden Konzentration von 6 M Harnstoff. Die Peptide wurden durch Semi-Dry-Electroblotting aus dem SDS-Gel auf eine PVDF-Membran transferiert. Nach Standardverfahren wurden Peptidsequenzen der isolierten Peptide bestimmt. Zwei der identifizierten Peptidsequenzen des Debranching-Enzyms aus Spinacia oleracea sind unter Seq ID No. 13 und Seq ID No. 14 dargestellt.
Ausführungsbeispiel 2 Isolierung einer für Debranching-Enzym aus Spinat kodierenden cDNA
Die entsprechend Ausführungsbeispiel 1 gewonnenen Peptidsequenzen des Debranching-Enzyms aus Spinat wurden zur Ableitung von Oligonukleotidsequenzen verwendet, die unter Berücksichtigung der Degeneriertheit des genetischen Codes Auszüge der DNA-Sequenz des für Debranching-Enzym aus Spinat kodierenden Gens wiedergeben. Entsprechend den abgeleiteten Oligonukleotidsequenzen wurden synthetische Oligonukleotide nach Standardverfahren synthetisiert. Diese wurden für eine Amplifikation mittels PCR unter Verwendung von mRNA aus Spinatblättern verwendet.
Um eine möglichst effiziente Hybridisierung der Oligonukleotide an das gewünschte DNA-Fragment zu gewährleisten, sollen möglichst lange Oligonukleotide verwendet werden. Mit zunehmender Länge steigt jedoch der Degeneriertheitsgrad, d. h. die Anzahl von Oligonukleotiden mit unterschiedlichen Sequenzkombinationen. Degeneriertheitsgrade von bis zu 6000 können akzeptiert werden.
Für die in Seq ID No. 13 angegebene Peptidsequenz wurde die Sequenz für eine Oligonukleotidsonde mit einer Länge von 20 bp abgeleitet. Das Oligonukleotid hat einen GC-Gehalt von maximal 40% und minimal 30%. Für die in Seq ID No. 14 angegebene Peptidsequenz wurde die Sequenz für eine Oligonukleotidsonde mit einer Länge von 20 bp abgeleitet. Das Oligonukleotid hat einen GC-Gehalt von maximal 45% und minimal 35%.
Die Sequenzvorlagen für die Synthese der Oligonukleotide lauten:
Aus Spinatblättern wurde Gesamt-RNA nach Standardverfahren isoliert. Diese wurde für eine PCR unter Verwendung der Oligonukleotide A und B eingesetzt. Es wurden dabei jeweils 100 pmol der Oligonukleotide pro Reaktionsansatz eingesetzt bei einer Annealing-Temperatur von 52°C und einer MgCl₂-Konzentration von 1.5 mM. Es wurden 30 Zyklen durchgeführt.
Durch die PCR wurde ein DNA-Fragment von ca. 500 bp erhalten. Dieses DNA-Fragment wurde in den mit Sma I geschnittenen Vektor pUC19 ligiert. Das resultierende Plasmid wurde pAR1 genannt. Ein Teil der Sequenz der DNA-Insertion wurde mittels der Methode von Sanger et al. (1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467). bestimmt. Die ermittelte Sequenz entspricht bis auf die durch die degenerierten Oligonukleotide eingeführten Mismatche den Nukleotiden 1920 bis 2216 der unter Seq ID No. 17 dargestellten DNA-Sequenz. Die von dieser Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz wies über einen Bereich von 90 Aminosäuren eine Identität von 42,2% zu dem pulA-Gen aus Klebsiella aerogenes auf, das für eine Pullulanase kodiert.
Zur Isolierung von cDNA-Molekülen, die das Debranching-Enzym aus Spinat kodieren, wurde zunächst wie in Sonnewald et al. (1993, Planta 189: 174-181) beschrieben cDNA-Bibliothek in dem Vektor Lambda ZAP II (Stratagene) erstellt und in Phagenköpfe verpackt. E. coli-Zellen des Stammes XL1-Blue wurden anschließend mit den die cDNA-Fragmente enthaltenden Phagen infiziert und auf Medium in Petrischalen in einer Dichte von ca. 30 000 pro 75 cm² ausplattiert. Nach ca. 8 stündiger Inkubation wurden Nitrozellulosemembranen auf den lysierten Bakterienrasen aufgelegt, die nach einer Minute abgenommen wurden. Die Filter wurden für 2 min in 0,2 M NaOH; 1,5 M NaCl, dann für 2 min in 0,4 M Tris/HCl pH 7,5 und anschließend für 2 min in 2×SSC inkubiert. Nach Trocknung und Fixierung durch UV-Crosslinking wurden die Filter 3 h lang in Puffer C bei 42°C inkubiert, bevor radioaktiv markierte Probe zugesetzt wurden. Als Probe wurde die cDNA-Insertion des Plasmids pAR1 verwendet. Die Hybridisierung erfolgte für 12 bis 16 h bei 42°C. Die Filter wurden anschließend bei 45°C 1×15 min in 1×SSC/0,3% SDS und 3×15 min in 0,1×SSC/0,3% SDS gewaschen und autoradiographiert.
Positive Phagenklone wurden unter Anwendung von Standardverfahren vereinzelt und weiter gereinigt. Mit Hilfe der in-vivo-excision-Methode wurden von positiven Phagenklonen E. coli-Klone gewonnen, die ein doppelsträngiges pBluescript-Plasmid mit der jeweiligen cDNA-Insertion enthalten. Nach Überprüfung der Größe und des Restriktionsmusters der Insertionen wurde von geeigneten Klonen die DNA-Sequenz bestimmt.
Es wurden mehrere Klone identifiziert, die Insertionen enthalten, die für das Debranching-Enzym aus Spinat kodieren, insbesondere ein Klon, der eine cDNA-Insertion aufwies, die die Nukleotide 1804 bis 3067 der in Seq ID No. 17 dargestellten DNA-Sequenz umfaßte. Es wurden jedoch keine vollständigen Klone erhalten.
Um cDNA-Moleküle zu isolieren- die die vollständige kodierende Region für das Debranching-Enzym umfassen, wurde eine gerichtete cDNA-Bibliothek mit mRNA aus Spinatblättern angelegt.
Dazu wurde zunächst Gesamt-RNA aus Spinatblättern nach Standardverfahren isoliert. Die Gesamt-RNA wurde zur Gewinnung von poly(A⁺)-mRNA auf eine poly(dT)-Säule aufgetragen, von der poly(A⁺)-mRNA eluiert wurde.
Ausgehend von der poly(A⁺)-mRNA wurde nach der Methode von Gubler und Hoffmann (1983, Gene 25: 263-269) unter Verwendung eines Xho I-Oligo d(t)₁₈-Primers cDNA hergestellt. Diese wurde nach EcoR I-Linkeraddition mit Xho I nachgeschnitten und orientiert in einen mit EcoR I und Xho I geschnittenen Lambda Uni-ZAP XR-Vektor (Stratagene) ligiert.
Ca. 2 000 000 Plaques einer derart konstruierten cDNA-Bibliothek wurden nach cDNA-Sequenzen durchgemustert, die für das Debranching-Enzym kodieren. Dazu wurden E. coli-Zellen des Stammes XL1-Blue mit den die cDNA-Fragmente enthaltenden Phagen infiziert und auf Medium in Petrischalen in einer Dichte von ca. 30 000 pro 75 cm² ausplattiert. Nach ca. 8 stündiger Inkubation wurden Nitrozellulosemembranen auf den lysierten Bakterienrasen aufgelegt, die nach einer Minute abgenommen wurden. Die Filter wurden für 2 min in 0,2 M NaOH; 1,5 M NaCl, dann für 2 min in 0,4 M Tris/HCl pH 7,5 und anschließend für 2 min in 2×SSC inkubiert. Nach Trocknung und Fixierung durch UV-Crosslinking wurden die Filter 3 h lang in Puffer C bei 42°C inkubiert, bevor radioaktiv markierte Probe zugesetzt wurde. Als Probe wurden wahlweise die oben beschriebenen cDNA-Insertionen, die nur Teile der kodierenden Region für das Debranching-Enzym enthielten, oder die Insertion des Plasmids pAR1 verwendet. Nach 12 stündiger Hybridisierung bei 42°C wurden die Filter bei 45°C 1×15 min in 1×SSC/0,3% SDS und 3×15 min in 0,1×SSC/0,3% SDS gewaschen und autoradiographiert.
Positive Phagenklone wurden unter Anwendung von Standardverfahren vereinzelt und weiter gereinigt. Mit Hilfe der in-vivo-excision-Methode wurden von positiven Phagenklonen E. coli-Klone gewonnen, die ein doppelsträngiges pBluescript-Plasmid mit der jeweiligen cDNA-Insertion enthalten. Nach Überprüfung der Größe und des Restriktionsmusters der Insertionen wurde von geeigneten Klonen Plasmid-DNA isoliert und die DNA-Sequenz der cDNA-Insertion bestimmt.
Ausführungsbeispiel 3 Sequenzanalyse der cDNA-Insertion des Plasmids pDBE-Spi
Aus einem entsprechend Ausführungsbeispiel 2 erhaltenen E. coli-Klon wurde das Plasmid pDBE-Spi (Fig. 1) isoliert und seine cDNA-Insertion durch Standardverfahren mittels der Didesoxymethode (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467) bestimmt. Die Insertion ist 3437 bp lang. Die Nukleotidsequenz ist unter Seq ID No. 17 angegeben.
Ausführungsbeispiel 4 Konstruktion des Plasmids p35S-DBE-Spi und Einführung des Plasmids in das Genom von Kartoffelpflanzen
Aus dem Plasmid pDBE-Spi wurde durch EcoR I/Xho I-Verdau ein ca. 3450 bp langes DNA-Fragment isoliert, das die unter Seq. ID No. 17 angegebene Sequenz aufweist und die kodierende Region für das Debranching-Enzym aus Spinat enthält. Dieses DNA-Fragment wurde in den mit Sma I geschnittenen Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, 1990, Plant Sci. 66: 221-230) kloniert. Der Vektor pBinAR ist ein Derivat des binären Vektors pBin19 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721).
Die Konstruktion des Plasmids pBinAR ist in Ausführungsbeispiel 12 beschrieben. Das resultierende Plasmid wurde p35S-DBE-Spi genannt und ist in Fig. 2 dargestellt.
Durch die Insertion des cDNA-Fragmentes entsteht eine Expressionskassette, die folgendermaßen aus den Fragmenten A, B und C aufgebaut ist (Fig. 2):
Das Fragment A (529 bp) enthält den 35S-Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (CaMV). Das Fragment umfaßt die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV (Franck et al. (1980) Cell 21: 285-294).
Das Fragment B umfaßt die proteinkodierende Region sowie flankierende Bereiche der für Debranching-Enzym aus Spinat kodierenden cDNA. Dieses wurde wie oben beschrieben als EcoR I/Xho I-Fragment aus pDBE-Spi isoliert und in sense-Orientierung an den Promotor in pBinAR fusioniert.
Fragment C (192 bp) enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., 1984, EMBO J. 3: 835-846).
Die Größe des Plasmids p35S-DBE-Spi beträgt ca. 14,2 kb.
Der Vektor p35S-DBE-Spi wurde mittels Agrobacterium tumefaciens vermittelter Transformation in Kartoffelpflanzenzellen transferiert. Intakte Pflanzen wurden aus den transformierten Zellen regeneriert.
Die Überprüfung des Erfolges der genetischen Veränderung kann durch Analyse der Gesamt-RNA hinsichtlich des Auftretens einer mRNA, die für das Debranching-Enzym aus Spinat kodiert, erfolgen. Dazu wird in der Regel eine Northern-Blot-Analyse durchgeführt. Hierfür wird aus pflanzlichem Gewebe Gesamt-RNA, wie beschrieben in Logemann et al. (1987, Anal. Biochem. 163: 16-20), isoliert, geleleketrophoretisch aufgetrennt, auf eine Nylonmembran übertragen und mit einer geeigneten Probe hybridisiert.
Ausführungsbeispiel 5 Identifizierung und Isolierung von genomischen DNA-Sequenzen, die ein Debranching-Enzym von Solanum tuberosum kodieren
Die Identifizierung und Isolierung von genomischen DNA-Sequenzen, die ein Debranching-Enzym von Solanum tuberosum kodieren, erfolgte in der Weise, daß zunächst Proteine mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms aus Kartoffeln isoliert wurden, von diesen Proteinen Peptidsequenzen bestimmt wurden und von diesen Peptidsequenzen degenerierte Oligonukleotidsequenzen abgeleitet wurden, die für die Durchmusterung genomischer Bibiotheken verwendet wurden. Dies wird im folgenden ausführlich beschrieben.
a) Identifizierung eines neuen Debranching-Enzyms in Solanum tuberosum
Die Identifizierung eines neuen Debranching-Enzyms in Solanum tuberosum erfolgte gemäß bekannter Methoden wie im folgenden beschrieben: Von Pflanzen der Spezies Solanum tuberosum wurden Proteinextrakte aus Knollengewebe gewonnen. Hierzu wurden 820 g Knollengewebe in 1500 ml Puffer A homogenisiert. Von dem Homogenat wurden 50 µl in einem PAAG aufgetrennt (siehe Spur 0 in Fig. 3). Das Gel enthielt 7,5% Acrylamid pH 8,6, das mit Methylenbisacrylamid bis zu einem Grad von 1: 75 vernetzt wurde, sowie 1% Amylopektin. Das Puffersystem für die Elektrophorese enthielt Tris/Glycin pH 8,9. Nach dem Gellauf wurde das Gel in 50 mM Tris/Citrat pH 7,0; 2 mM Ascorbinsäure bei 22°C für 4 h äquilibriert. Die Färbung des Gels erfolgte mit Lugol′scher Lösung für 15 min. Das Ergebnis der Färbung ist in Fig. 3 Spur 0 gezeigt. Neben einer rötlichen Bande, die auf Aktivität eines Verzweigungen einführenden Enzyms (Branching-Enzym bzw. disproportionierendes Enzym) zurückgeht, ist eine stark blau gefärbte Bande zu erkennen. Die Blaufärbung kommt durch den enzymatischen Abbau von α-1,6-glykosidischen Verzweigungen des Amylopektins zustande die für dessen rötliche bzw. violette Farbe verantwortlich sind.
b) Reinigung eines Debranching-Enzyms aus Solanum tuberosum und Bestimmung von Peptidsequenzen
Die Reinigung eines Debranching-Enzyms aus Solanum tuberosum und die Bestimmung von Peptidsequenzen erfolgte gemäß bekannter Methoden wie im folgenden beschrieben:
Einem nach Abschnitt a) gewonnenen Proteinextrakt aus Knollengewebe von Kartoffel wurde bei 4°C unter Rühren kontinuierlich Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 40% der Sättigungskonzentration zugesetzt. Die hierbei einsetzende partielle Präzipitation von Proteinen wurde unter Rühren für zwei Stunden fortgesetzt. Anschließend wurden präzipitierte Proteine durch Zentrifugation abgetrennt und anschließend weiter fraktioniert.
Nach Auflösen des Präzipitats in 20 ml Puffer A und 12stündiger Dialyse gegen bidestilliertes Wasser wurde die Proteinlösung einer Chromatographie unterzogen. Auf eine Sepharose 6B-Säule, an die P-Cyclodextrin gekoppelt worden war, wurden pro 30 ml Bettvolumen 500 mg Protein aus der fraktionierten Ammoniumsulfatfällung aufgetragen. Anschließend wurde mit Puffer A gewaschen, bis das Eluat keine Absorption bei 280 nm aufweist. Dann wurde mit einer β-Cyclodextrin-Lösung (1 mg/ml in Puffer A) eine Proteinfraktion mit geringer Affinität zur stationären Phase eluiert, die verworfen wurde. Bei einer β-Cyclodextrin-Konzentration von 10 mg/ml in Puffer A wurde das Debranching-Enzym von Kartoffel eluiert (vgl. Fig. 3).
Die an Debranching-Enzym hoch angereicherte Fraktion des Eluats wurde einer Elektrophorese in einem denaturierenden PAAG entsprechend der Vorschrift von Laemmli (1970, Nature 227: 680-685) unterzogen. Das denaturierte Protein wurde aus dem Gel ausgeschnitten und isoliert. Nach Standardverfahren wurden Peptidsequenzen bestimmt. Peptidsequenzen des Debranching-Enzyms aus Solanum tuberosum sind in Seq ID No. 1 bis Seq ID No. 12 wiedergegeben.
c) Identifizierung und Isolierung von genomischen DNA-Sequenzen, die ein Debranching-Enzym von Solanum tuberosum kodieren, mit Hilfe molekulargenetischer Methoden
Die entsprechend Abschnitt b) gewonnenen Peptidsequenzen wurden zur Ableitung von Oligonukleotidsequenzen verwendet, die unter Berücksichtigung der Degeneriertheit des genetischen Codes Auszüge der DNA-Sequenz des für Debranching-Enzym aus Kartoffel kodierenden Gens wiedergeben. Entsprechend den abgeleiteten Oligonukleotidsequenzen wurden synthetische Oligonukleotide nach Standardverfahren synthetisiert. Diese wurden zur Durchmusterung von genomischen Bibliotheken eingesetzt.
Zunächst wurde eine genomische DNA-Bibliothek nach Liu et al. (1991, Plant Mol. Biol. 17: 1139-1154) erstellt. E. coli-Zellen des Stammes P 2392 wurden anschließend mit den die genomischen DNA-Fragmente enthaltenden Phagen infiziert und auf Medium in Petrischalen in einer Dichte von ca. 30 000 pro 75 cm² ausplattiert. Die Petrischalen wurden bei 37°C inkubiert bis die Phagenplaques eine geeignete Größe erreicht haben (ca. 6-8 h). Anschließend wurden die Petrischalen für mehrere Stunden bei 4°C gelagert. Danach wurden Nitrozellulosemembranen auf den lysierten Bakterienrasen aufgelegt, die nach einer Minute abgenommen wurden. Die Filter wurden für 2 min in 0,2 M NaOH; 1,5 M NaCl, dann für 2 min in 0,4 M Tris/HCl pH 7,5 und anschließend für 2 min in 2×SSC inkubiert. Nach Trocknung und Fixierung durch UV-Crosslinking wurden die Filter 3 h lang in Puffer H inkubiert, bevor radioaktiv endmarkierte Oligonukleotide zugesetzt wurden. Nach 12 stündiger Hybridisierung wurden die Filter in 2×15 min in 0,2×SSC/0,1% SDS gewaschen und autoradiographiert.
Die Temperatur für Hybridisierung und Waschen der Filter berechnet sich wie folgt:
T+15 = 16,6×[Na⁺] + 0,41×[%GC Oligonukleotid] + 81,5 - 675/Länge Oligonukleotid
Aus den in Seq ID No. 1 bzw. Seq ID No. 5 dargestellten Peptidsequenzen des Debranching-Enzyms aus Kartoffel lassen sich geeignete Oligonukleotidsequenzen ableiten. Um eine möglichst hohe Hybridisierungstemperatur zu erhalten, die eine ausreichende Spezifität der Hybridbildung gewährleistet, sollen möglichst lange Oligonukleotide verwendet werden. Mit zunehmender Länge steigt jedoch der Degeneriertheitsgrad, d. h. die Anzahl von Oligonukleotiden mit unterschiedlichen Sequenzkombinationen. Degeneriertheitsgrade von bis zu 6.000 können akzeptiert werden. Sind von einem Protein mehrere Peptidsequenzen bekannt, können entsprechend Oligonukleotide abgeleitet und gemeinsam in einem Oligonukleotidgemisch zur Hybridbildung eingesetzt werden. Dies kann die Effizienz der Hybridbildung steigern.
Für einen Teil der in Seq ID No. 1 angegebenen Peptidsequenz wurde die Sequenz für eine Oligonukleotidsonde mit einer Länge von 20 bp abgeleitet. Das Oligonukleotid hat einen Degeneriertheitsgrad von 256 bei einem GC-Gehalt von maximal 65% und minimal 40%. Dadurch ergibt sich eine maximale Hybridisierungstemperatur von ca. 56°C. Für einen Teil der in Seq ID No. 5 angegebenen Peptidsequenz wurde die Sequenz für eine Oligonukleotidsonde mit einer Länge von 20 bp abgeleitet. Das Oligonukleotid hat einen Degeneriertheitsgrad von 384 bei einem GC-Gehalt von maximal 55% und minimal 50%. Die sich daraus ergebende Hybridisierungstemperatur beträgt 60°C. Beide Oligonukleotide wurden als Gemisch bei einer Temperatur von 54°C zur Hybridisierung eingesetzt. Das Waschen der Filter erfolgte bei einer Temperatur von 45°C.
Die Sequenzvorlage für die Synthese der Sonden lautet:
In drei Sondierungszyklen wurden Phagenklone, die eine DNA-Insertion enthalten, die mit den verwendeten Sonden hybridisiert, vereinzelt. Auf diese Weise wurden bei der Durchmusterung von ca. 500 000 Phagenplaques ca. 40 Plaques identifiziert. Diese positiven Phagenklone wurden anschließend zur Hybridisierung gegen die aus Spinat isolierte cDNA-Sequenz (Seq ID No. 17), die für ein Debranching-Enzym kodiert, verwendet. Dabei konnten 3 Phagenklone isoliert werden, die auch mit der cDNA-Sequenz aus Spinat hybridisieren. Von einem der identifizierten Lambda-Phagenklone, λDEpot, wurde nach Standardverfahren DNA gewonnen, die DNA-Insertion isoliert und diese mit der Restriktionsendonuklease Sau 3A geschnitten. Die entstehenden Subfragmente wurden in einen mit BamH I geschnittenen pBluescript-Vektor ligiert. Mit den resultierenden Plasmiden wurden E. coli-Zellen transformiert. Transformierte Bakterien wurden auf Medium in Petrischalen ausplattiert. Um zu bestimmen, welche Bakterien DNA-Insertionen enthalten, die für Debranching-Enzym kodieren, wurde eine Koloniehybridisierung durchgeführt. Hierzu wurde eine Nitrozellulosemembran auf in einer Petrischale befindliches Festmedium gelegt. Auf diese Membran wurden Zellen von E. coli-Kolonien übertragen. Die Petrischale wurde über Nacht bei 37°C inkubiert, wobei die E. coli-Zellen auf der Membran zu Kolonien heranwuchsen. Die Membran wurde von dem Medium abgenommen 5 min in 10% SDS, 5 min in 0,5 M NaOH; 1,5 M NaCl, dann für 5 min in 0,5 M Tris/HCl pH 7,5 und anschließend für 5 min in 2×SSC inkubiert. Nach Trocknung und Fixierung durch UV-Crosslinking wurden die Filter 3 h lang in Puffer H inkubiert, bevor radioaktiv endmarkierte Oligonukleotide zugesetzt wurden. Zur Hybridisierung wurden die radioaktiv markierten Sonden 1 (Seq ID No. 18) und 2 (Seq ID No. 19) eingesetzt. Nach 12 stündiger Hybridisierung bei 54°C wurden die Filter bei 45°C 2×15 min in 0,2×SSC/0,1% SDS gewaschen und autoradiographiert. Bakterien von Kolonien, die mit der verwendeten Sonde hybridisierten, wurden kultiviert, und es wurde aus den Zellen Plasmid-DNA isoliert. Es wurden auf diese Weise verschiedene Plasmide isoliert, die Insertionen enthielte, die mit den verwendeten Oligonukleotiden hybridisierten. Anschließend wurde nach der Methode von Sanger et al. (1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467) partiell die DNA-Sequenz der Insertionen der isolierten Plasmide bestimmt.
Ausführungsbeispiel 6 Isolierung von cDNA-Sequenzen, die ein Debranching-Enzym aus Solanum tuberosum kodieren mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion
Die aus Ausführungsbeispiel 5 erhaltenen partiellen genomischen DNA-Sequenzen wurden mit der DNA-Sequenz der für Debranching-Enzym kodierenden cDNA aus Spinat verglichen. Hierbei ergab sich, das zwei der identifizierten Insertionen DNA-Sequenzen umfaßten, die homolog zu zwei DNA-Sequenzen sind, die in der Spinat-cDNA ca. 500 bp voneinander entfernt liegen. Ausgehend von diesen Sequenzen wurden zur Durchführung einer PCR-Reaktion daher zwei Oligonukleotide synthetisiert. Die beiden Oligonukleotide besaßen folgende Nukleotidsequenzen:
Durch das Oligonukleotid C wird an einem Ende des amplifizierten DNA-Fragmentes eine BamH I-Schnittstelle eingeführt. Dieses Oligonukleotid besitzt partielle Homologie zu der cDNA aus Spinat im Bereich der Nukleotide 1082 bis 1110 der unter Seq ID No. 17 dargestellten DNA-Sequenz. Durch das Oligonukleotid D wird am anderen Ende des zu amplifizierenden Fragmentes eine Sma I-Schnittstelle eingeführt. Dieses Oligonukleotid besitzt Homologie zu der cDNA aus Spinat im Bereich der Nukleotide 1545 bis 1571 der unter Seq ID No. 17 dargestellten DNA-Sequenz. Diese Oligonukleotide wurden für die Amplifikation eines DNA-Fragmentes aus einer Kartoffelknollen-cDNA-Bibliothek verwendet.
Dafür wurde zunächst eine cDNA-Bibliothek erstellt, indem aus Knollengewebe von Kartoffel Gesamt-RNA nach Logemann et al. (1987, Anal. Biochem. 163: 16-20) präpariert wurde. Von der Gesamt-RNA wurde nach Standardverfahren polyadenylierte mRNA präpariert, die nach dem von Gubler & Hoffmann (1983, Gene 25: 263) beschriebenen Verfahren zur Synthese von cDNA eingesetzt wurde. Die cDNA wurde mit kommerziell erhältlichen EcoR I/Not I-Adaptern ligiert, anschließend in die EcoR I-Schnittstelle der DNA des Phagen Lamda ZAP II (Stratagene) ligiert und in Phageköpfe verpackt.
Aus einer derart konstruierten cDNA-Bibliothek, wurde ein ca. 500 bp langes DNA-Fragment mit Hilfe der PCR-Technik unter Verwendung der Oligonukleotide C und D amplifiziert. Dieses DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsendonukleasen BamH I und Sma I geschnitten und in einen mit BamH I und Sma I geschnittenen pBluescript-Vektor ligiert. Das resultierende Plasmid wurde pDBE-Pot genannt (Fig. 4).
Mit Hilfe des isolierten 500 bp-Fragmentes werden mittels gängiger molekularbiologischer Methoden aus einer, wie oben beschrieben konstruierten, cDNA-Bibliothek in Lamda ZAP II cDNA-Fragmente isoliert, die die gesamte kodierende Region für das Debranching-Enzym aus Kartoffel umfassen.
Ausführungsbeispiel 7 Sequenzanalyse der cDNA-Insertion des Plasmids pDBE-Pot
Aus einem entsprechend Ausführungsbeispiel 6 erhaltenen E. coli-Klon wurde das Plasmid pDBE-Pot (Fig. 4) isoliert und seine cDNA-Insertion durch Standardverfahren mittels der Didesoxymethode (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467) bestimmt. Die Insertion ist 492 bp lang. Die Nukleotidsequenz ist unter Seq ID No. 22 angegeben.
Die Analyse der DNA-Sequenz ergab, daß die unter Seq ID No. 1 und unter Seq ID No. 2 angegebenen Peptidsequenzen durch die unter Seq ID No. 22 angegebenen DNA-Sequenz kodiert werden, wobei jeweils an zwei Positionen Abweichungen auftreten. Seq ID No. 1 entspricht den Aminosäuren 6 bis 26 der unter Seq ID No. 22 angegebenen Aminosäuresequenz und Seq ID No. 2 entspricht den Aminosäuren 80 bis 99 der unter Seq ID No. 22 angegebenen Aminosäuresequenz. Die Abweichungen lassen sich dadurch erklären, daß das Protein aus Kartoffeln der Varietät Desiree isoliert wurden, die verwendete cDNA-Bibliothek jedoch aus mRNA von Kartoffeln der Varietät Berolina hergestellt wurde.
Ausführungsbeispiel 8 Konstruktion des Plasmids p35S-antiDBE-Pot und Einführung des Plasmids in das Genom von Kartoffelpflanzen
Aus dem Plasmid pDBE-Pot wurde durch BamH I/Sma I-Verdau ein ca. 500 bp langes DNA-Fragment isoliert, das die unter Seq ID No. 22 angegebene Sequenz aufweist und einen Teil der kodierenden Region für das Debranching-Enzym aus Kartoffel enthält. Dieses DNA-Fragment wurde in den mit BamH I/Sma I geschnittenen Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer (1990) Plant Sci. 66: 221-230) kloniert. Der Vektor pBinAR ist ein Derivat des binären Vektors Bin19 (Bevan (1984) Nucleic Acids Res. 12: 8711-8721).
pBinAR wurde folgendermaßen konstruiert:
Ein 529 bp langes Fragment, das die Nukleotide 6909-7437 des 35S-Promotor des Cauliflowermosaic-Virus umfaßt (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294), wurde als EcoR I/Kpn I-Fragment aus dem Plasmid pDH51 (Pietrzak et al., Nucl. Acids Res. 14: 5857-5868) isoliert und zwischen die EcoR I- und die Kpn I-Schnittstellen des Polylinkers von pBin19 ligiert. Dabei entstand das Plasmid pBin19-A.
Aus dem Plasmid pAGV40 (Herrera-Estrella et al., Nature 303: 209-213) wurde mit Hilfe der Restriktionsendonukleasen Pvu II und Hind III ein 192 bp langes Fragment isoliert, das das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3: 835-846) umfaßt (Nukleotide 11 749-11 939). Nach Addition von Sph I-Linkern an die Pvu I-Schnittstelle wurde das Fragment zwischen die Sph I- und Hind III-Schnittstellen pBin19-A ligiert. Dabei entstand pBinAR.
Das resultierende Plasmid wurde p35S-antiDBE-Pot genannt und ist in Fig. 5 dargestellt.
Durch die Insertion des cDNA-Fragmentes entsteht eine Expressionskassette, die folgendermaßen aus den Fragmenten A, B und C aufgebaut ist (Fig. 5):
Das Fragment A (529 bp) enthält den 35S-Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (CaMV). Das Fragment umfaßt die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV (Franck et al. (1980) Cell 21: 285-294).
Das Fragment B umfaßt einen Teil der proteinkodierenden Region der für Debranching-Enzym aus Kartoffel kodierenden cDNA. Dieser wurde wie oben beschrieben als BamH I/Sma I-Fragment aus pDBE-Pot isoliert und in anti-sense Orientierung an den Promotor in pBinAR fusioniert.
Fragment C (192 bp) enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3: 835-846).
Die Größe des Plasmids p35S-antiDBE-Pot beträgt ca. 11,5 kb.
Der Vektor p35S-antiDBE-Pot wurde mittels Agrobacterium tumefaciens vermittelter Transformation in Kartoffelpflanzenzellen transferiert. Intakte Pflanzen wurden aus den transformierten Zellen regeneriert.
Die Überprüfung des Erfolges der genetischen Veränderung der Pflanzen ist durch Analyse der Gesamt-RNA bezüglich des Verschwindens der endogenen mRNA, die für das Debranching-Enzym kodiert, möglich.

Claims (38)

1. Isolierte und im wesentlichen reine DNA-Sequenzen aus Pflanzen, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität von Debranching-Enzymen kodieren.
2. Isolierte und gereinigte DNA-Sequenzen, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität von Debranching-Enzymen kodieren, die aus Proteinextrakten aus Pflanzen isolierbar sind durch
  • a) fraktionierte Ammoniumsulfatfällung und
  • b) anschließende Affinitätschromatographie an einer β-Cyclodextrinsäule.
3. DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus höheren Pflanzen stammen.
4. DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Pflanzen der Familie der Solanaceae stammen.
5. DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Solanum tuberosum stammen.
6. DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Pflanzen der Familie der Chenopodiaceae stammen.
7. DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Spinacia oleracea stammen.
8. DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie im wesentlichen homolog zu der unter Seq ID No. 22 angegebenen DNA-Sequenz sind.
9. DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie im wesentlichen homolog zu der unter Seq ID No. 17 angegebenen DNA-Sequenz sind.
10. DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie die unter Seq ID No. 22 angegebene DNA-Sequenz besitzen oder Derivate dieser DNA-Sequenz, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von diesen Sequenzen ableitbar sind und die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität einem Debranching-Enzyms kodieren.
11. DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie die unter Seq ID No. 17 angegebene DNA-Sequenz besitzen oder Derivate dieser Sequenzen, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von diesen Sequenzen ableitbar sind und die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms kodieren.
12. DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie für Proteine mit der enzymatischen Aktivität von Debranching-Enzymen kodieren, wobei diese Proteine mindestens eine der unter Seq ID No. 1 bis Seq ID No. 14 angegebenen Peptidsequenzen aufweisen.
13. DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie für Proteine mit der enzymatischen Aktivität von Debranching-Enzymen kodieren, wobei diese Proteine die unter Seq ID No. 17 angegebene Aminosäuresequenz oder eine Aminosäuresequenz, die mit der unter Seq ID No. 17 angegebenen im wesentlichen identisch ist, aufweisen.
14. DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie für Proteine mit der enzymatischen Aktivität von Debranching-Enzymen kodieren, wobei diese Proteine die unter Seq ID No. 22 angegebene Aminosäuresequenz oder eine Aminosäuresequenz, die mit der unter Seq ID No. 22 angegebenen im wesentlichen identisch ist, aufweisen.
15. Isolierte und gereinigte DNA-Sequenzen, die mit DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 10 hybridisieren und die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms kodieren.
16. Isolierte und gereinigte DNA-Sequenzen, die mit DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 11 hybridisieren und die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms kodieren.
17. Ein im wesentlichen reines pflanzliches Protein, das die enzymatische Aktivität eins Debranching-Enzyms aufweist.
18. Ein Protein gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Solanum tuberosum stammt.
19. Ein Protein gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Spinacia oleracea stammt.
20. Ein Protein gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es
  • a) mindestens eine der unter Seq ID No. 1 bis Seq ID No. 14 angegebenen Peptidsequenzen aufweist;
  • b) in einer SDS-Gelelektrophorese ein Molekulargewicht zwischen 100 ± 50 kd aufweist.
21. Ein Protein gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es die unter Seq ID No. 17 dargestellte Aminosäuresequenz oder eine im wesentlichen identische Aminosäuresequenz aufweist.
22. Ein Protein gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es die unter Seq ID No. 22 dargestellte Aminosäuresequenz oder eine im wesentlichen identische Aminosäuresequenz aufweist.
23. Ein im wesentlichen reines Protein aus Solanum tuberosum mit der enzymatische Aktivität eines Debranching-Enzyms isolierbar aus einem Proteinextrakt aus Kartoffelknollen durch fraktionierte Ammoniumsulfatfällung und anschließende Affinitätschromatographie an einer β-Cyclodextrinsäule.
24. Ein Protein gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine der unter Seq ID No. 1 bis Seq ID No. 14 und Seq ID No. 22 angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist.
25. Ein Protein gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer SDS-Gelelektrophorese ein Molekulargewicht von 100 ± 50 kda besitzt.
26. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, die eine Amylopektinstärke mit einem im Vergleich zu in Wildtyppflanzen synthetisierter Amylopektinstärke reduzierten Verzweigungsgrad bilden, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Schritte umfaßt:
  • a) Herstellung einer Expressionskassette, die folgende DNA-Sequenzen umfaßt:
  • i) einen in pflanzlichen zollen funktionalen Promotor, der die Transkription einer nachfolgenden DNA-Sequenz gewährleistet,
  • ii) mindestens eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms kodiert und in sense-Orientierung an das 3′-Ende des Promotors gekoppelt ist, und
  • iii) gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Termination der Transkription und die Addition eines poly-A-Schwanzes an das entstehende Transkript, das an das 3′-Ende der kodierenden Region gekoppelt ist,
  • b) Transformation pflanzlicher Zellen mit der in Schritt a) hergestellten Expressionskassette und
  • c) Regeneration ganzer, intakter Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen,
27. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, die eine Amylopektinstärke mit einem im Vergleich zu in Wildtyppflanzen synthetisierter Amylopektinstärke erhöhten Verzweigungsgrad bilden, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Schritte umfaßt:
  • a) Herstellung einer Expressionskassette, die folgende DNA-Sequenzen umfaßt:
  • i) einen in pflanzlichen Zellen funktionalen Promotor, der die Transkription einer nachfolgenden DNA-Sequenz gewährleistet,
  • ii) mindestens eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms kodiert und in anti­ sense-Orientierung an das 3′-Ende des Promotors gekoppelt ist, und
  • iii) gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Termination der Transkription und die Addition eines poly-A-Schwanzes an das entstehende Transkript, das an das 3′-Ende der kodierenden Region gekoppelt ist,
  • b) Transformation pflanzlicher Zellen mit der in Schritt a) hergestellten Expressionskassette und
  • c) Regeneration ganzer, intakter Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.
28. Verfahren gemäß Anspruch 26 oder Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die unter ii) genannte DNA-Sequenz für ein Protein mit mindestens einer der unter Seq ID No. 1 bis Seq ID No. 14, Seq ID No. 17 und Seq ID No. 22 dargestellten Aminosäuresequenzen kodiert.
29. Verfahren gemäß Anspruch 26 oder Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die unter ii) genannte DNA-Sequenz die unter Seq ID No. 17 oder die unter Seq ID No. 22 dargestellte DNA-Sequenz aufweist.
30. Plasmide oder Bakteriophagen enthaltend DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1 bis 16.
31. Transgene Pflanzen, die Amylopektinstärke synthetisieren, die im Vergleich zu in nicht-transformierten Pflanzen synthetisierter Amylopektinstärke einen gesteigerten Verzweigungsgrad besitzt, erhältlich durch eines der Verfahren gemäß Anspruch 27 bis 29.
32. Transgene Pflanzen, die Amylopektinstärke synthetisieren, die im Vergleich zu in nicht-transformierten Pflanzen synthetisierter Amylopektinstärke einen reduzierten Verzweigungsgrad besitzt, erhältlich durch eines der Verfahren gemäß Anspruch 26, 28 oder Anspruch 29.
33. Pflanzen gemäß den Ansprüchen 31 und 32 dadurch gekennzeichnet, daß es sich um die Nutzpflanzen Kartoffel, Mais, Reis, Weizen, Erbse handelt.
34. Amylopektinstärke mit modifiziertem Verzweigungsgrad isolierbar aus Pflanzen gemäß den Ansprüchen 31 bis 33.
35. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 10 und 11 zur Identifizierung und Isolierung homologer Sequenzen, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms kodieren, aus Pflanzen oder anderen Organismen.
36. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1 bis 16 zur Herstellung rekombinanter DNA-Moleküle, die zur Transformation pflanzlicher Zellen geeignet sind und die die Expression der besagten DNA-Sequenzen in pflanzlichen Zellen gewährleisten.
37. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1 bis 16 zur Herstellung von Pflanzen, die Amylopektin-Stärke synthetisieren mit einem im Vergleich zu in Wildtyppflanzen synthetisierter Amylopektinstärke gesteigerten oder reduzierten Verzweigungsgrad.
38. Verwendung von Amylopektinstärke gemäß Anspruch 34 zur Herstellung von Lebensmitteln und industriellen Produkten.
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