WO1997032985A1 - Nucleinsäuremoleküle, codierend debranching-enzyme aus mais - Google Patents

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WO1997032985A1
WO1997032985A1 PCT/EP1997/001141 EP9701141W WO9732985A1 WO 1997032985 A1 WO1997032985 A1 WO 1997032985A1 EP 9701141 W EP9701141 W EP 9701141W WO 9732985 A1 WO9732985 A1 WO 9732985A1
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starch
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plant
ser
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Jens Kossmann
Lothar Willmitzer
Michael Emmermann
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Planttec Biotechnologie Gmbh Forschung & Entwicklung
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    • C12Y302/01041—Pullulanase (3.2.1.41)

Definitions

  • the present invention relates to nucleic acid molecules which encode proteins from maize with the enzymatic activity of a debranching enzyme (R enzyme). Furthermore, the invention relates to transgenic plants and plant cells in which an amylopectin with an altered degree of branching occurs as a result of the expression of an additional debranching enzyme activity from maize or the inhibition of an endogenous debranching enzyme activity, and which is obtained from said transgenic plant cells and plants ⁇ strength.
  • R enzyme debranching enzyme
  • Starch plays an important role both as a storage material in a large number of plants and as a renewable, industrially usable raw material and is becoming increasingly important.
  • For the industrial use of the starch it is necessary that it corresponds to the requirements of the processing industry in terms of structure, shape and / or other physico-chemical parameters.
  • the polysaccharide starch is made up of chemically uniform basic building blocks, the glucose molecules, but represents a complex mixture of different molecular forms which have differences in the degree of polymerization and the occurrence of branching.
  • amylose starch an essentially unbranched polymer made from ⁇ -1,4-glycosidically linked glucose molecules
  • amylopectin starch a branched polymer in which the branches are formed by the occurrence of additional c ⁇ -1, 6-glycosidic linkages come about.
  • amylopectin In typical plants used for starch production, e.g. Corn or potato, the two forms of starch occur in a ratio of approx. 25 parts amylose to 75 parts amylopectin.
  • amylopectin there is, for example, a further branched polysaccharide, the so-called phytoglycogen, which differs from amylopectin in that it has a higher degree of branching and a different solubility behavior (see, for example, Lee et al., Aren. Biochem. Biophys. 143 (1971), 365-374; Pan and Nelson, Plant Physiol. 74 (1984), 324-328).
  • amylopectin is used to include the phytoglycogen.
  • starch-producing plants are required which, for example, only contain the component amylopectin or only the component amylose. Plants are required for a number of other uses which synthesize forms of amylopectin with different degrees of branching.
  • Such plants can be produced, for example, by breeding or mutagenesis techniques.
  • mutagenesis can produce varieties which only form amylopectin.
  • a genotype was also generated by chemical mutagenesis in a haploid line that does not form amylose (Hovenkamp-Hermelink, Theor. Appl. Genet. 75 (1987), 217-221).
  • WO 92/11376 discloses DNA sequences which code for a branching enzyme (Q enzyme), the ⁇ -1,6 branches introduces in amylopectin starch. With the aid of these DNA sequences, it should be possible to produce transgenic plants in which the amylose / amylopectin ratio of the starch has changed.
  • Q enzyme branching enzyme
  • the pullulanases which in addition to pullulan also use amylopectin as a substrate, come from microorganisms, e.g. Klebsiella, and before plants. In plants, these enzymes are also called R-enzymes.
  • Isoamylases that do not use pullulan, but do use glycogen and amylopectin as substrates, also occur in microorganisms and plants. Isoamylases have been described, for example, in maize (Manners & Rowe, Carbohydr. Res. 9 (1969), 107) and potato (Ishizaki et al., Agric. Biol. Chem. 47 (1983), 771-779).
  • amylo-1, 6-glucosidases have been described in mammals and yeasts and use border dextrins as a substrate.
  • the object of the present invention is therefore to identify further debranching enzymes which may occur in maize or to isolate corresponding nucleic acid molecules which code for these enzymes.
  • the present invention thus relates to nucleic acid molecules which encode proteins with the biological activity of a debranching enzyme from maize, or to a biologically active fragment thereof, such nucleic acid molecules preferably encoding a debranching enzyme from maize which has the functionality described under Seq ID No. 2 indicated amino acid sequence.
  • Such a nucleic acid molecule particularly preferably comprises the one listed under Seq ID no. 1 indicated nucleotide sequence, in particular the coding region, or a corresponding ribonucleotide sequence.
  • the invention also relates to nucleic acid molecules which encode proteins with the biological activity of a debranching enzyme from maize or biologically active fragments thereof and which hybridize with one of the nucleic acid molecules described above.
  • the present invention relates to nucleic acid molecules whose sequences differ from the sequences of the abovementioned nucleic acid molecules due to the degeneration of the genetic code and which encode a protein which has the biological activity of a debranching enzyme from maize.
  • the invention also relates to nucleic acid molecules, the sequence of which is complementary to all or part of the sequence of the above-mentioned nucleic acid molecules.
  • hybridization means hybridization under conventional hybridization conditions, preferably under stringent conditions, as described, for example, in Sambrock et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition (1989). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
  • nucleic acid molecules which hybridize with the nucleic acid molecules according to the invention can originate from any corn plant.
  • Nucleic acid molecules that hybridize with the molecules according to the invention can e.g. can be isolated from genomic or from cDNA libraries.
  • nucleic acid molecules from maize plants can be identified and isolated using the nucleic acid molecules according to the invention or parts of these molecules or the reverse complements of these molecules, e.g. by means of hybridization according to standard methods (see, e.g., Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
  • nucleic acid molecules can be used as the hybridization sample that exactly or essentially the Seq ID No. 1 indicated nucleotide sequence or parts of this sequence.
  • the fragments used as a hybridization sample can also be synthetic fragments which were produced with the aid of the common synthetic techniques and whose sequence essentially corresponds to that of a nucleic acid molecule according to the invention. If genes which hybridize with the nucleic acid sequences according to the invention have been identified and isolated, a determination of the sequence and an analysis of the properties of the proteins encoded by this sequence are necessary.
  • the molecules hybridizing with the nucleic acid molecules according to the invention also include fragments, derivatives and allelic variants of the DNA molecules described above which encode a debranching enzyme from maize or a biologically, ie enzymatically, active fragment thereof. Fragments are understood to mean parts of the nucleic acid molecules that are long enough to encode a polypeptide with the enzymatic activity of a debranching enzyme from maize.
  • the term derivative in this context means that the sequences of these molecules differ from the sequences of the nucleic acid molecules described above at one or more positions and have a high degree of homology to these sequences. Homology means a sequence identity of at least 40%, in particular an identity of at least 60%, preferably over 80% and particularly preferably over 90%. The deviations from the nucleic acid molecules described above may have resulted from deletion, addition, substitution, insertion or recombination.
  • nucleic acid molecules which are homologous to the molecules described above and represent derivatives of these molecules are generally variations of these molecules which represent modifications which have the same biological function. These can be both naturally occurring variations, for example sequences from other organisms, or mutations, wherein these mutations can have occurred naturally or have been introduced by targeted mutagenesis. Furthermore, the variations can be synthetically produced sequences.
  • allelic variants can be both naturally occurring variants and also synthetically produced variants or those produced by recombinant DNA techniques.
  • the proteins encoded by the different variants of the nucleic acid molecules according to the invention have certain common characteristics.
  • These may include, for example, enzyme activity, molecular weight, immunological reactivity, conformity, etc., and physical properties such as, for example, running behavior in gel electrophoresis, chromatographic behavior, sedimentation coefficients, solubility, spectroscopic properties, stability; pH optimum, temperature optimum etc.
  • the enzymatic activity of the debranching enzyme can be detected, for example, by a staining test, as described in WO 95/04826. This is based on the fact that a protein with a starch-modifying activity can be detected if protein extracts, for example from corn kernels, are separated in non-denaturing, amylopectin-containing polyacrylamide gels (PAAG) and the gel, after incubation in a suitable buffer, is subsequently subjected to iodine staining . While unbranched amylos forms a blue complex with iodine, amylopectin gives a reddish-violet color.
  • a staining test as described in WO 95/04826. This is based on the fact that a protein with a starch-modifying activity can be detected if protein extracts, for example from corn kernels, are separated in non-denaturing, amylopectin-containing polyacrylamide gels (PAAG) and the gel, after incubation
  • amylopectin-containing polyacrylamide gels which stain reddish-violet with iodine, there is a color shift in places where debranching activity is localized, which leads to a blue coloration of the gel, since the branches of the violet-coloring amylopectin are broken down by the debranching enzyme become.
  • the debranching enzyme activity can be detected using the DNSS test (see Ludwig et al., Plant Physiol. 74 (1984), 856-861).
  • the nucleic acid molecules according to the invention can be any nucleic acid molecules, in particular DNA or RNA molecules, for example cDNA, genomic DNA, mRNA etc. They can be naturally occurring molecules, or they can be produced by genetic engineering or chemical synthesis methods.
  • the nucleic acid molecules according to the invention encode a hitherto unknown protein from maize with the enzymatic one Activity of a debranching enzyme. So far, only a locus has been described for maize which encodes a protein with debranching enzyme activity (James et al., See above). So far there has been no evidence in the literature that there are other genes in maize that code for debranching enzymes.
  • nucleic acid molecules according to the invention Homology comparisons of the nucleic acid molecules according to the invention with those in James et al. (see above) show that these sequences show no significant homology and would not hybridize with one another.
  • the molecules according to the invention thus encode a new type of corn debranching enzyme. With the help of these molecules it is now possible to intervene in a targeted manner in the starch metabolism of maize and other starch-storing plants and thus to enable the synthesis of a starch modified in its chemical or physical properties.
  • nucleic acid molecules according to the invention in any, preferably starch-storing plants, or by reducing the debranching enzyme activity in maize plants by using the nucleic acid sequences according to the invention, for example by means of antisense, ribozyme or cosuppression effects.
  • the present invention relates to nucleic acid molecules of at least 15 base pairs in length which hybridize specifically with the nucleic acid molecules according to the invention.
  • Hybridizing specifically here means that these molecules hybridize with nucleic acid molecules which encode the new debranching enzymes from maize, but not with nucleic acid molecules which encode other proteins.
  • Hybridizing preferably means hybridizing under stringent conditions (see above).
  • the invention relates to those nucleic acid molecules which hybridize with transcripts of nucleic acid molecules according to the invention and can thereby prevent their translation. These are preferably RNA molecules complementary to the transcripts.
  • the invention relates to vectors, in particular plasmids, cosmids, viruses, bacteriophages and other vectors common in genetic engineering, which contain the nucleic acid molecules according to the invention described above.
  • nucleic acid molecules contained in the vectors are linked to regulatory elements which ensure transcription and translation in prokaryotic or eukaryotic cells.
  • the invention relates to host cells, in particular prokaryotic or eukaryotic cells, which have been transformed with a nucleic acid molecule or a vector described above, and cells which are derived from such host cells and which contain the described nucleic acid molecules or vectors.
  • the host cells can be bacterial or fungal cells, as well as plant or animal cells.
  • the invention also relates to proteins with the biological activity of a debranching enzyme from maize, which are encoded by the nucleic acid molecules according to the invention, or biologically active fragments thereof.
  • the present invention relates to methods for producing a vegetable protein with the biological activity of a debranching enzyme from maize or a biologically active fragment thereof, in which host cells according to the invention are cultivated under suitable conditions and the protein from the culture, i.e. is obtained from the cells and / or the culture medium.
  • nucleic acid molecules By providing the nucleic acid molecules according to the invention, it is now possible to use genetic engineering methods to modify plant cells to have a new or an increased debranching enzyme activity from corn compared to wild-type cells, ie corresponding non-transformed cells.
  • maize cells or plants can be modified such that they have a reduced debranching enzyme activity compared to wild-type cells or plants.
  • the host cells according to the invention are transgenic plant cells which, owing to the presence and expression of an introduced nucleic acid molecule according to the invention, have either a new or an increased debranching enzyme activity compared to non-transformed cells.
  • Such transgenic plant cells differ from non-transformed cells in that the nucleic acid molecule introduced is either heterologous to the transformed cell, i.e. comes from a cell with a different genomic background, or because the nucleic acid molecule introduced, if it is homologous to the transformed plant species, is located in the genome at a location where it does not naturally occur in non-transformed cells.
  • the nucleic acid molecule introduced can either be under the control of its natural promoter or linked to regulatory elements of foreign genes.
  • the invention also relates to transgenic plants which contain the transgenic plant cells described above.
  • the plant which is transformed with the nucleic acid molecules according to the invention and in which a debranching enzyme is synthesized from corn due to the introduction of such a molecule can in principle be any plant. It is preferably a monocotyledon or dicotyledon crop, in particular a starch-storing plant, such as, for example, cereal plants, legumes, potatoes or cassava. Grain plants are understood in particular as monocotyledonous plants belonging to the order Poales, preferably those belonging to the family of the Poaceae. Examples of this are the plants belonging to the genera Avena (oat), Triticum
  • Starch-storing legumes are e.g. some species of the genus Pisum (e.g. Pisum sativum), Vicia (e.g. Vicia faba), Cicer (e.g. Cicer arietinum), Lens
  • Phaseolus e.g. Phaseolus vulgaris and Phaseolus coccineus
  • Phaseolus e.g. Phaseolus vulgaris and Phaseolus coccineus
  • the expression of a new or additional debranching enzyme activity from maize in the transgenic plant cells and plants according to the invention has an influence on the degree of branching of the amylopectin synthesized in the cells and plants.
  • a starch synthesized in these plants therefore has changed physical and / or chemical properties compared to starch from wild-type plants.
  • the invention thus also relates to the starch obtainable from the transgenic plant cells or plants.
  • the invention further relates to propagation material from transgenic plants according to the invention, for example seeds, fruits, cuttings, tubers, rhizomes, etc., this propagation material containing transgenic plant cells described above.
  • the propagation material is preferably the corn kernels.
  • the present invention relates to transgenic plant cells of maize, in which the activity of the debranching enzyme according to the invention is reduced due to the inhibition of transcription or translation of endogenous nucleic acid molecules which code for a debranching enzyme according to the invention.
  • This is preferably achieved in that a nucleic acid molecule according to the invention or a part of it is expressed in the corresponding plant cells in antisense orientation and the described debranching enzyme activity is reduced due to an antisense effect.
  • Another possibility for reducing the debranching enzyme activity in plant cells is the expression of suitable ribozymes which specifically cleave transcripts of the DNA molecules according to the invention.
  • ribozymes with the aid of the DNA molecules according to the invention is familiar to the person skilled in the art. It is also possible to express molecules which have both an antisense and a ribozyme effect in combination. Alternatively, the debranching enzyme activity in the plant cells can also be reduced by a cosupression effect.
  • the method is known to the person skilled in the art and is described, for example, in Jorgensen (Trends Biotechnol. 8 (1990), 340-344), Niebel et al. (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 91-103), Flavell et al. (Curr. Top. Microbiol. Immunol.
  • the invention further relates to transgenic maize plants which contain the transgenic plant cells described above with reduced debranching enzyme activity.
  • the amylopectin strength of the transgenic cells and plants has a different degree of branching due to the reduced debranching enzyme activity compared to starch from untransformed plants.
  • the invention therefore also relates to the modified starch obtainable from the transgenic cells or plants.
  • the invention also relates to propagation material of the transgenic plants described above, in particular seeds, wherein this contains transgenic plant cells described above.
  • Transgenic plant cells which, owing to the expression of a new or additional debranching enzyme activity, form an amylopectin strong with a different degree of branching compared to amylopectin strong synthesized in wild-type plants can be produced, for example, by a process which comprises the following steps:
  • nucleic acid sequence which encodes a protein with the enzymatic activity of a debranching enzyme or a biologically active fragment thereof and is coupled in sense orientation to the 3 • end of the promoter;
  • Transgenic maize plant cells which, owing to the reduction in the debranching enzyme activity described, form an amylopectin starch with a different degree of branching compared to amylopectin synthesized in wild-type plants can, for example, be produced by a process which comprises the following steps: (a) Production of an expression cassette which comprises the following DNA sequences:
  • nucleic acid sequence which encodes a protein with the enzymatic activity of a debranching enzyme or a part of such a protein and which is coupled in antisense orientation to the 3 'end of the promoter;
  • any promoter functional in the plants selected for the transformation can be used for the promoter mentioned under (i).
  • the promoter can be homologous or heterologous with respect to the plant species used.
  • the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus (Odell et al., Nature 313 (1985), 810-812) is suitable, which ensures constitutive expression in all tissues of a plant and that described in WO / 9401571 Promoter construct.
  • Another example are the promoters of the polyubiquitin genes from maize (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18 (1992) 675-689.
  • promoters can also be used which are only determined at a time determined by external influences (see for example WO / 9307279) Promoters of heat-shock proteins which allow simple induction can be of particular interest, and promoters which lead to expression of downstream sequences in a particular tissue of the plant can also be used (see, for example, B. Stockhaus et al., 1989, EMBO J. 8: 2245-2251. ren used, which are active in the starch-storing organs of the plants to be transformed. These are the corn kernels in maize, and the tubers in potatoes. For example, the tuber-specific B33 promoter (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) can be used to overexpress the nucleic acid molecules according to the invention in the potato.
  • Seed-specific promoters have already been described for various plant species. So e.g. the USP promoter from Vicia faba, which ensures seed-specific expression in V. faba and other plants (Fiedler et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Bäumlein et al., Mol Gen. Genet. 225: 459-467 (1991)).
  • promoters of the zein genes ensure a specific expression in the endosperm of the maize kernels (Pedersen et al., Cell 29 (1982), 1015-1026; Quattrocchio et al., Plant Mol. Biol. 15 (1990) , 81-93).
  • nucleic acid sequence mentioned under process step (a) (ii), which encodes a protein with the enzymatic activity of a debranching enzyme from maize is linked to the promoter in se ⁇ se orientation
  • this nucleic acid sequence can be both native or homologous origin as well as foreign or heterologous origin with respect to the plant species to be transformed, ie Both maize plants and any other plants can be transformed with the expression cassette described, preferably the above-mentioned starch-storing plants.
  • the synthesized protein can be localized in any compartment of the plant cell.
  • Vegetable debranching enzymes are usually localized in the plastids and therefore have a signal sequence for translocation into these organelles.
  • the DNA sequence encoding this signal sequence must be removed and the coding region linked to DNA sequences that encode the lo Ensure calibration in the respective compartment.
  • Such sequences are known (see, for example, Braun et al., EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald et al ., Plant J. 1 (1991), 95-106).
  • nucleic acid sequence mentioned under process step (a) (ii), which encodes a protein from maize with the enzymatic activity of a debranching enzyme is linked in an antiseptic orientation to the promoter
  • this is preferably of a nucleic acid sequence of homologous origin with respect to the plant species to be transformed.
  • nucleic acid sequences can also be used which have a high degree of homology to endogenously present debranching enzyme genes, in particular homologies higher than 80%, preferably homologies between 90% and 100% and particularly preferably homologies over 95% .
  • Sequences up to a minimum length of 15 bp can be used. An inhibitory effect is not excluded even when using shorter sequences. Longer sequences between 100 and 500 base pairs are preferably used, and sequences with a length of over 500 base pairs are used in particular for efficient antisense inhibition. As a rule, sequences are used which are shorter than 5000 base pairs, preferably sequences which are shorter than 2500 base pairs.
  • Termination signals for transcription in plant cells are described and can be interchanged with one another as desired.
  • the termination sequence of the octopine synthase gene from Agrobacterium turne faciens can be used.
  • the transfer of the expression cassette constructed according to process step (a) into plant cells is preferably carried out using plasmids, in particular with the aid of plasmids, which ensure stable integration of the expression cassette into the plant genome.
  • the method described above for overexpressing a new corn debranching enzyme can in principle be applied to all plant species. Both monocot and dicot plants are of interest, in particular the starch-storing plants described above.
  • the process described above for reducing the debranching enzyme activity is preferably used on monocotyledonous plants, in particular on maize.
  • an RNA is formed in the transformed plant cells. If the nucleic acid sequence coding for a maize debranching enzyme in the expression cassette is linked to the promoter in the se ⁇ se orientation, an mRNA is synthesized which acts as a template for the synthesis of an additional or new maize debranching enzyme in the plant cells can serve. As a result, these cells have an activity or an increased activity of the corn debranching enzyme, which leads to a change in the degree of branching of the amylopectin formed in the cells. As a result, a strength becomes accessible which is distinguished from the naturally occurring strength by a more orderly spatial structure and an increased uniformity. Among other things, this can have favorable effects on the film-forming properties.
  • transgenic plant cells synthesize an antiseptic RNA which inhibits the expression of endogenous debranching enzyme genes .
  • these cells have a reduced activity of the new debranching enzyme from corn, which leads to the formation of a modified starch.
  • the antiseptic technique it is possible to produce plants in which the expression of an endogenous debranching enzyme gene is inhibited to a different extent in May in a range from 0% to to 100 %.
  • Maize is particularly suitable for the production of modified amylopectin using the nucleic acid molecules according to the invention which encode debranching enzymes.
  • the application of the invention is not restricted to this plant species. Any other plant species can be used for the overexpression.
  • the modified starch synthesized in the transgenic plants can be isolated from the plants or from the plant cells using conventional methods and, after purification, can be used for the production of foods and industrial products.
  • starches according to the invention can be modified by processes known to the person skilled in the art and are suitable in unmodified or modified form for various uses in the food or non-food sector.
  • starch can be divided into two large areas.
  • One area comprises the hydrolysis products of starch, mainly glucose and glucon units, which are obtained by enzymatic or chemical processes. They serve as the starting material for further chemical modifications and processes, such as fermentation.
  • hydrolysis products of starch mainly glucose and glucon units
  • They serve as the starting material for further chemical modifications and processes, such as fermentation.
  • amyloglucosidase amyloglucosidase.
  • a change in the structure of the starch for example an increase in the surface area of the grain, easier digestibility due to a lower degree of branching or a steric structure which limits the accessibility for the enzymes used, could cause this.
  • Starch is a classic additive for many foodstuffs, in which it essentially takes on the function of binding aqueous additives or causes an increase in viscosity or increased gel formation. Important characteristics are the flow and sorption behavior, the swelling and gelatinization temperature, the viscosity and thickening performance, the solubility of the starch, the transparency and paste structure, the heat, shear and acid stability, the tendency to retrogradation, the ability for film formation, freeze / thaw stability, digestibility and the ability to form complexes with eg inorganic or organic ions.
  • the starch can be used as an auxiliary for different manufacturing processes or as an additive in technical products.
  • the starch is used primarily for retardation (retention of solids), the setting of filler and fine particles, as a strengthening agent and for drainage.
  • the cheap Properties of the starch in terms of rigidity, hardness, sound, grip, gloss, smoothness, splitting resistance and surfaces.
  • the requirements for the starch in relation to the surface treatment are essentially a high degree of whiteness, an adapted viscosity, high viscosity stability, good film formation and low dust formation.
  • the solids content, an adapted viscosity, a high binding capacity and high pigment affinity play an important role.
  • a rapid, uniform, loss-free distribution, high mechanical stability and complete restraint in the paper flow are important.
  • an adapted solids content, high viscosity and high binding capacity are also important.
  • starches A large area of use of the starches is in the adhesive industry, where the possible uses are divided into four areas: use as pure starch glue, use with starch glues prepared with special chemicals, use of starch as an additive to synthetic resins and polymer dispersions and the use of starches as extenders for synthetic adhesives.
  • 90% of the starch-based adhesives are used in the fields of corrugated board production, production of paper bags, bags and pouches, production of composite materials for paper and aluminum, production of cardboard and rewetting glue for envelopes, stamps etc. used.
  • starch as a sizing agent, i.e. as an auxiliary for smoothing and strengthening the Velcro behavior to protect against the tensile forces acting during weaving as well as to increase the abrasion resistance during weaving, starch as an agent for textile upgrading, especially after quality-reducing pretreatments such as bleaching, dyeing etc., starch as a thickening agent during production of color pastes to prevent dye diffusion and starch as an additive to chain agents for sewing threads.
  • the fourth area of application is the use of starches as an additive in building materials.
  • One example is the production of plasterboard, in which the starch mixed in the gypsum paste pastes with the water, diffuses to the surface of the plasterboard and binds the cardboard to the plate there.
  • Other areas of application are admixing to plaster and mineral fibers.
  • starch products are used to delay setting.
  • starch Another market for starch is in the manufacture of soil stabilizers that are used to temporarily protect soil particles from water during artificial earthmoving. Combinations of starch and polymer emulsions are, according to today's knowledge, in their erosion and The crust-reducing effect of equating the previously used products is, however, significantly lower in price.
  • starch in crop protection agents to change the specific properties of the preparations.
  • the starch can be used to improve the wetting of crop protection agents and fertilizers, for the metered release of the active substances, for converting liquid, volatile and / or malodorous substances into microcrystalline, stable, moldable substances, for mixing incompatible compounds and for Extension of the duration of action by reducing the decomposition can be used.
  • starch can be used as a binder for tablets or for binder dilution in capsules.
  • the starch can furthermore serve as a tablet disintegrant, since after swallowing it absorbs liquid and swells to such an extent after a short time that the active substance is released.
  • Medical sliding and wound powders are based on starch for qualitative reasons.
  • starches are used, for example, as carriers for powder additives such as fragrances and salicylic acid.
  • a relatively large area of application for the starch is toothpaste.
  • Starch is used as an additive to coal and briquette. Coal can be agglomerated or briquetted with a high-quality additive, which allows the briquettes to disintegrate at an early stage is prevented.
  • the added starch is between 4 and 6% for barbecued coal and between 0.1 and 0.5% for calorized coal. Furthermore, starches are becoming increasingly important as binders, since their addition to coal and briquette can significantly reduce the emission of harmful substances.
  • the starch can also be used as a flocculant in ore and coal sludge processing.
  • Another area of application is as an additive to foundry additives.
  • Various casting processes require cores that are made from binder-mixed sands.
  • Bentonite which is mixed with modified starches, mostly swelling starches, is predominantly used today as a binder.
  • the purpose of the starch addition is to increase the flow resistance and to improve the binding strength.
  • the swelling starches can have other production requirements, such as dispersibility in cold water, rehydration, good miscibility in sand and high water-binding capacity.
  • the starch can be used in the rubber industry to improve the technical and optical quality.
  • the reasons for this are the improvement of the surface gloss, the improvement of the grip and the appearance, for this reason starch is sprinkled on the sticky rubberized surfaces of rubber materials before the cold vulcanization, and the improvement of the printability of the rubber.
  • a further sales opportunity for the modified starches is in the production of leather substitutes.
  • starch secondary products in the processing process (starch is only filler, there is no direct bond between synthetic polymer and starch) or alternatively the integration of starch secondary products in the production of polymers (starch and polymer form a firm bond).
  • starch as a pure filler is not competitive compared to other substances such as talc. The situation is different when the specific starch properties come into play and the property profile of the end products is thereby significantly changed.
  • An example of this is the use of starch products in the processing of thermoplastics, such as polyethylene.
  • the starch and the synthetic polymer are combined by co-expression in a ratio of 1: 1 to form a 'master batch', from which various products are produced using granulated polyethylene using conventional process techniques.
  • starch in polyurethane foams.
  • starch derivatives By adapting the starch derivatives and by optimizing the process, it is possible to control the reaction between synthetic polymers and the hydroxy groups of the starches in a targeted manner.
  • the result is polyurethane films which, through the use of starch, obtain the following property profiles: a reduction in the Coefficients of thermal expansion, reduction in shrinkage behavior, improvement in pressure / stress behavior, increase in water vapor permeability without changing water absorption, reduction in flammability and tear density, no dripping of flammable parts, freedom from halogen and reduced aging.
  • Disadvantages that are currently still present are reduced compressive strength and reduced impact resistance.
  • Solid plastic products such as pots, plates and bowls can also be manufactured with a starch content of over 50%.
  • starch / polymer mixtures can be assessed favorably, since they have a much higher biodegradability.
  • starch graft polymers Because of their extreme water-binding capacity, starch graft polymers have also become extremely important. These are products with a backbone made of starch and a side lattice grafted on according to the principle of the radical chain mechanism of a synthetic monomer.
  • the starch graft polymers available today are characterized by better binding and retention properties of up to 1000 g of water per g of starch with high viscosity.
  • the areas of application for these superabsorbers have expanded considerably in recent years and are in the hygiene area with products of diapers and underlays as well as in the agricultural sector, e.g. seed pilling.
  • Ash / phosphate content, amylose / amylopectin ratio, molar mass distribution, degree of branching, grain size and shape as well as crystallinity on the other hand also the properties that result in the following characteristics: flow and sorption behavior, gelatinization temperature, viscosity, thickening performance, solubility, paste structure and transparency , Heat, shear and acid stability, tendency to retrogradation, gel fertilizer, freeze / thaw stability, complex formation, iodine binding, film formation, adhesive strength, enzyme stability, digestibility and reactivity.
  • modified starches by means of genetic engineering interventions in a transgenic plant can on the one hand change the properties of the starch obtained from the plant in such a way that further modifications by means of chemical or physical processes no longer appear to be necessary.
  • the starches modified by genetic engineering processes can be subjected to further chemical modifications, which leads to further improvements in quality for certain of the fields of application described above.
  • nucleic acid molecules according to the invention can in principle also be used to produce plants. len in which the activity of the debranching enzyme according to the invention is increased or decreased and at the same time the activities of other enzymes involved in starch biosynthesis are changed. All combinations and permutations are conceivable.
  • nucleic acid molecules which encode a protein according to the invention or corresponding antisense constructs can be introduced into plant cells in which the synthesis of endogenous GBSS I, SSS I, II or GBSS II proteins or the su gene is already carried out is inhibited due to an antisense effect or a mutation, or the synthesis of the branching enzyme is inhibited (as described, for example, in WO92 / 14827 or the ae mutant (Shannon and Garwood, in Whistler, BeMiller and Paschall, Starch: Chemistry and Technology, Academic Press, London, 2nd Edition (1984), 25-86)).
  • DNA molecules can be used for the transformation which simultaneously contain several regions coding for the corresponding debranching enzymes in antisense orientation under the control of a suitable promoter, or which encode a corresponding cosuppression RNA or a corresponding ribozyme.
  • each sequence can be under the control of its own promoter, or the sequences can be transcribed as a fusion from a common promoter. The latter alternative will generally be preferable since in this case the synthesis of the corresponding proteins should be inhibited to approximately the same extent.
  • DNA molecules which, in addition to DNA sequences which code for debranching enzymes, contain further DNA sequences which code for other proteins involved in starch synthesis or modification. These can encode an antisense RNA, a corresponding ribozyme or a cosuppression RNA.
  • the sequences can in turn either be connected in series and transcribed by a common promoter or but each with its own promoter. There is no upper limit to the number of antisense fragments transcribed from a promoter in such a DNA molecule. However, the resulting transcript should generally have a length of no more than 20 kb, preferably no more than 5 kb.
  • Coding regions which are located in such DNA molecules in combination with other coding regions behind a suitable promoter can originate from DNA sequences which code for the following proteins: starch-bound (GBSS I and II) and soluble starch synthases (eg SSS I and II), branching enzymes, disproportionation enzymes and starch phosphorylases. This is only an example. The use of other DNA sequences in the context of such a combination is also conceivable. With the help of such constructs it is possible to inhibit the synthesis of several enzymes simultaneously in plant cells which have been transformed with them.
  • the constructs can be introduced into classic mutants which are defective for one or more genes in starch biosynthesis (Shannon and Garwood, see above). These defects can e.g. relate to the following proteins: starch grain-bound (GBSS I and II) and soluble starch synthases (eg SSS I and II), branching enzymes (BE I and II), "debranching” enzymes (see locus), disproportionation fermentation enzymes and starch phosphorylases. Again, this is only an exemplary list.
  • cloning vectors which contain a replication signal for E. coli and a marker gene for the selection of transformed bacterial cells.
  • examples of such vectors are pBR322, pUC series, M13mp series, pACYC184 etc.
  • the desired sequence can be introduced into the vector at a suitable restriction site.
  • the plasmid obtained is used for the transformation of E. coli cells.
  • Transformed E. coli cells are grown in a suitable medium, then harvested and lysed.
  • the plasmid is recovered. Restriction analyzes, gel electrophoresis and other biochemical-molecular biological methods are generally used as the analysis method for characterizing the plasmid DNA obtained.
  • the plasmid DNA can be cleaved and DNA fragments obtained can be linked to other DNA sequences.
  • Each plasmid DNA sequence can be cloned into the same or different plasmids.
  • a variety of techniques are available for introducing DNA into a plant host cell. These techniques include the transformation of plant cells with T-DNA using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes as a transformation agent, the fusion of protoplasts, the injection, the electroporation of DNA, the introduction of DNA using the biolistic method and other possibilities.
  • plasmids When injecting and electroporation of DNA into plant cells, no special requirements are made of the plasmids used. Simple plasmids such as e.g. pUC derivatives can be used. However, if whole plants are to be regenerated from such transformed cells, the presence of a selectable marker gene is necessary.
  • the Ti or Ri plasmid is used for the transformation of the plant cell, at least the right boundary, but often the right and left boundary of the Ti and Ri plasmid T-DNA as the flank region, must be linked to the genes to be introduced .
  • the DNA to be introduced must be cloned into special plasmids, either in an intermediate vector or in a binary vector.
  • the intermediate vectors can owing to sequences homologous to sequences in the T-DNA are integrated into the Ti or Ri plasmid of the agrobacteria by homologous recombination. This also contains the vir region necessary for the transfer of the T-DNA.
  • Intermediate vectors cannot replicate in agrobacteria.
  • the intermediate vector can be transferred to Agrobacterium tumefaciens by means of a helper plasmid (conjugation).
  • Binary vectors can replicate in both E. coli and agrobacteria.
  • the agrobacterium serving as the host cell is said to contain a plasmid which carries a vir region. The vir region is necessary for the transfer of the T-DNA into the plant cell. Additional T-DNA can be present.
  • the agrobacterium transformed in this way is used to transform plant cells.
  • T-DNA for the transformation of plant cells has been intensively investigated and is sufficient in EP 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offset- drukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al. , Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46 and An et al. EMBO J. 4 (1985), 277-287.
  • plant explants can expediently be cultivated with Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes.
  • Whole plants can then be regenerated from the infected plant material (for example leaf pieces, stem segments, roots, but also protoplasts or suspension-cultivated plant cells) in a suitable medium, which can contain antibiotics or biocides for the selection of transformed cells.
  • the plants obtained in this way can then be examined for the presence of the introduced DNA.
  • Other possibilities of introducing foreign DNA using the biolistic method or by protoplast transformation are known (cf. for example Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (HJ Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge).
  • EP 292 435 describes a process by means of which fertile plants can be obtained starting from a slimy, soft (friable) granular corn callus. Shillito et al.
  • the introduced DNA is integrated in the genome of the plant cell, it is generally stable there and is also retained in the progeny of the originally transformed cell. It normally contains a selection marker which shows the transformed plant cells resistance to a biocide or an antibiotic such as kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin or phosphinotricin and others. mediated.
  • the individually chosen marker should therefore allow the selection of transformed cells from cells that lack the inserted DNA.
  • the transformed cells grow within the plant in the usual way (see also McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84).
  • the resulting plants can be grown normally and crossed with plants that have the same transformed genetic makeup or other genetic makeup.
  • the resulting hybrid individuals have the corresponding phenotypic properties. Seeds can be obtained from the plant cells. Two or more generations should be grown to ensure that the phenotypic trait is stably maintained and inherited. Seeds should also be harvested to ensure that the appropriate phenotype or other characteristics have been preserved.
  • the invention further relates to the use of the nucleic acid molecules according to the invention for the production of plants which synthesize an amylopectin strong with a different degree of branching compared to wild-type plants.
  • Another object of the present invention is the use of the nucleic acid molecules according to the invention or parts of these molecules or the reverse complements of these molecules for the identification and isolation of homologous molecules which encode proteins with the enzymatic activity of a de-branching enzyme or fragments of such products teine, from plants or other organisms.
  • homologous molecules which encode proteins with the enzymatic activity of a de-branching enzyme or fragments of such products teine, from plants or other organisms.
  • Protoplast isolation medium (100 ml)
  • Protoplast washing solution 1 like protoplast insulating solution, but without cellulase, pectolyase and BSA Transformation buffer
  • PEG 6000 is added to the above buffer under b) shortly before use of the solution (40% by weight PEG).
  • the solution is filtered through a 0.45 ⁇ m sterile filter.
  • Protoplast culture medium (in mg / 1)
  • the vector pBluescript II SK (Stratagene) was used for cloning in E. coli. 2nd Bacterial strains
  • the E.coli strain DH5 ⁇ (Bethesda Research Laborato ⁇ ries, Gaithersburgh, USA) was used for the Bluescript vector and for the pUSP constructs.
  • the E.coli strain XLl-Blue was used for in vivo excision.
  • the liquid medium is aspirated and the remaining cells are rinsed with 50 ml protoplast washing solution 1 and sucked dry again.
  • 10 ml of protoplast isolation medium are added to 2 g of the harvested cell mass.
  • the resuspended cells and cell aggregates are incubated at 27 ⁇ 2 ° C with gentle shaking (30 to 40 rpm) for 4 to 6 h in the dark.
  • the suspension is sieved through a stainless steel and nylon sieve of 200 or 45 ⁇ m mesh sizes.
  • the combination of a 100 ⁇ m and a 60 ⁇ m sieve enables the cell aggregates to be separated just as well.
  • the protoplast-containing filtrate is assessed microscopically. It usually contains 98-99% protoplasts. The rest are undigested single cells. Protoplast preparations with this degree of purity are used for transformation experiments without additional gradient centrifugation. By centric The protoplasts are sedimented at 100 rpm in the swinging rotor (100 ⁇ g, 3 min). The supernatant is discarded and the protoplasts are resuspended in washing solution 1. The centrifugation is repeated and the protoplasts are then resuspended in the transformation buffer.
  • the protoplasts resuspended in transformation buffer are filled into 50 ml polyahomer tubes with a titer of 0.5-1 x 10 6 protoplasts / ml in 10 ml portions.
  • the DNA used for the transformation is dissolved in Tris-EDTA (TE) buffer. 20 ⁇ g of plasmid DNA are added per ml of protoplast suspension. A plasmid imparting resistance to phosphinetricin is used as the vector (cf., for example, EP 0 513 849).
  • TE Tris-EDTA
  • a plasmid imparting resistance to phosphinetricin is used as the vector (cf., for example, EP 0 513 849).
  • the protoplast suspension is gently shaken to distribute the DNA homogeneously in the solution. Immediately afterwards, 5 ml of PEG solution is added dropwise.
  • the PEG solution is distributed homogeneously. Then another 5 ml of PEG solution are added and the homogeneous mixing is repeated. The protoplasts remain at ⁇ 2 ° C. for 20 min of the PEG solution. The protoplasts are then sedimented by centrifugation for 3 minutes (100 g; 1000 rpm). The supernatant is discarded. The protoplasts are washed by shaking gently in 20 ml of W5 solution and then centrifuged again. Then they are resuspended in 20 ml protoplast culture medium, centrifuged again and resuspended in culture medium.
  • the titer is set to 6 - 8 x 10 5 protoplasts / ml and the protoplasts in 3 ml portions in petri dishes ( ⁇ 60 mm, height 15 mm). activated. The petri dishes sealed with Parafilm are placed in the dark at 25 ⁇ 2 ° C.
  • the protoplasts are cultivated without the addition of fresh medium. As soon as the cells regenerated from the protoplasts have developed into cell aggregates with more than 20-50 cells, 1 ml of fresh protoplast culture medium is added which contains sucrose as an osmoticum (90 g / 1).
  • the cell aggregates formed from protoplasts can be plated on agar media with 100 mg / 1 L-phosphinothricin.
  • N6 medium with the vitamins of the protoplast culture medium, 90 g / 1 sucrose and 1.0 mg / 1 2.4D is just as suitable as an analog medium, for example with the macro and micronutrient salts of the MS medium (Murashige and Skoog (1962), see above).
  • the calli resulting from stably transformed protoplasts can continue to grow unhindered on the selective medium.
  • the transgenic calli can be transferred to fresh selection medium which also contains 100 mg / 1 L-phosphinothricin but which no longer contains auxin.
  • the transgenic corn calli that have integrated the L-phosphinothricin acetyltransferase gene into their genome differentiate first plants on this medium in the presence of L-phosphinothricin.
  • the embryogenic transformed maize tissue is on hormone-free N6-medium (Chu CC. Et al., Sci. Sin. 16 (1975), 659) in the presence of 5xl0 ⁇ 4 M L-Phosphi ⁇ nothricin.
  • Corn embryos that express the Phsphinothricin acetyl transferase gene (PAT gene) sufficiently strongly develop into plants on this medium. Untransformed embryos or those with only very weak PAT activity die. As soon as the leaves of the in vitro plants have reached a length of 4-6 mm, they can be transferred into soil.
  • the plants After washing off agar residues at the roots, the plants are planted in a mixture of clay, sand, vermiculite and uniform earth in a ratio of 3: 1: 1: 1 and more relatively during the first 3 days after transplanting Humidity adapted to earth culture.
  • the cultivation takes place in a climatic chamber with a light period of 14 h approx. 25000 lux at plant height at a day / night temperature of 23 ⁇ 1/17 ⁇ 1 ° C.
  • the adapted plants are cultivated at a humidity of 65 ⁇ 5%.
  • a cDNA library based on polyA + RNA from maize leaves was created in the vector Lambda ZAPII (Stratagene) and packaged in phage heads. E. coli cells of the XLl-Blue strain were then infected with the phages containing the cDNA fragments (1 ⁇ 10 6 pfu) and plated out on medium in petri dishes at a density of approximately 30,000 per 75 cm 2 . After about 8 hours of incubation, nitrocellulose membranes were placed on the lysed bacterial lawn, which were removed after one minute.
  • the filters were placed in 0.2 M NaOH for 2 min; 1.5 M NaCl, then incubated in 0.4 M Tris / HCl pH 7.5 for 2 min and then in 2 x SSC for 2 min. After the DNA had been dried and fixed by UV crosslinking, the filters were incubated in hybridization buffer at 42 ° C. for 3 hours before radioactively labeled sample was added.
  • a potato cDNA encoding a potato debranching enzyme was used as a sample (see Seq ID No. 3). This had previously been isolated with the aid of degenerate oligonucleotides which had been derived from the partial amino acid sequence of a debranching enzyme from potato.
  • Hybridizing phage clones were isolated and further purified using standard procedures. With the aid of the in vivo excision method, E. coli clones were obtained from positive phage clones which contain a double-stranded pBluescript plasmid with the respective cDNA insert. After checking the size and the restriction pattern of the insert, suitable clones were used for plasmid DNA isolated. Such a plasmid isolated, pREM-53, had an insertion of 1195 bp.
  • the nucleotide sequence of the cDNA insertion was determined by standard methods using the dideoxy method (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467). The insertion is 1995 bp long and the nucleotide sequence and the derived amino acid sequence are shown in Seq ID No. 1 specified.
  • the Seq ID No. 1 indicated nucleotide sequence represents a partial cDNA encoding a previously unknown debranching enzyme from maize. With the aid of this sequence it is possible, using conventional methods, to isolate a complete cDNA sequence or a genomic sequence from suitable cDNA or genomic libraries.
  • ORGANISM Zea mays
  • F TISSUE TYPE: leaf tissue
  • GGC ACG AGG TCA AAA CTC CCT CCA GGG TCA GAT TTG CAA CAA GCT GCA 48 Gly Thr Arg Ser Lys Leu Pro Pro Gly Ser Asp Leu Gin Gin Ala Ala 1 5 10 15
  • AAATGATGTT ATAGAGGTAC AAAAGCATTG GAACATTTCT TTATAGAGGT GAACCACCCT 1915
  • MOLECULE TYPE cDNA TO mRNA
  • HYPOTHETICAL NO
  • ANTISENSE NO
  • GAG AAA CTC AAC TCT TTT CCA CCA GAT TCT GAG GAG CAG CAG GCT CTT 384 Glu Lys Leu Asn Ser Phe Pro Pro Asp Ser Glu Glu Gin Gin Ala Leu 675 680 685
  • ATC ACA GCC ATC CAA GAT GAA GAT GGC TAT AAT TGG GGG TAT AAT CCT 432 Ile Thr Ala Ile Gin Asp Glu Asp Gly Tyr Asn Trp Gly Tyr Asn Pro 690 695 700 GTT CTC TGG GGA GTT CCA AAG GGA AGC TAT GCT GGT AAT GCA AAT GGT 480 Val Leu Trp Gly Val Pro Lys Gly Ser Tyr Ala Gly Asn Ala Asn Gly 705 710 715

Abstract

Es werden Nucleinsäuremoleküle beschrieben, die Debranching-Enzyme aus Mais codieren, sowie transgene Pflanzenzellen und Pflanzen, in denen es aufgrund der Expression eines Debranching-Enzyms ausMais oder der Inhibition einer solchen endogenen Debranching-Enzymaktivität zur Synthese eines in seinen Eigenschaften veränderten Amylopektins kommt.

Description

Nucleinsäuremoleküle, codierend Debranching-Enzyme aus Mais
Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäuremoleküle, die Proteine aus Mais mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms (R-Enzyms) codieren. Ferner betrifft die Erfindung transgene Pflanzen und Pflanzenzellen, in denen es aufgrund der Expression einer zusätzlichen Debranching- Enzymaktivität aus Mais oder der Inhibierung einer endogenen Debranching-Enzymaktivität zur Synthese eines Amylopektins mit einem veränderten Verzweigungsgrad kommt, sowie die aus den besagten transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen erhält¬ liche Stärke.
Stärke spielt sowohl als Speicherstoff in einer Vielzahl von Pflanzen als auch als nachwachsender, industriell verwertba¬ rer Rohstoff eine wichtige Rolle und gewinnt zunehmend an Bedeutung. Für die industrielle Verwendung der Stärke ist es erforderlich, daß diese hinsichtlich der Struktur, Form und/oder sonstigen physikalisch-chemischen Parametern den Erfordernissen der verarbeitenden Industrie entspricht . Für den Einsatz in möglichst vielen Einsatzgebieten ist es dar¬ über hinaus erforderlich, eine große StoffVielfalt zu errei¬ chen.
Das Polysaccharid Stärke ist aus chemisch einheitlichen Grundbausteinen, den Glucosemolekülen, aufgebaut, stellt je¬ doch ein komplexes Gemisch aus unterschiedlichen Molekülfor¬ men dar, die Unterschiede hinsichtlich des Polymerisations- grades und des Auftretens von Verzweigungen aufweisen. Man unterscheidet die Amylose-Stärke, ein im wesentlichen unver¬ zweigtes Polymer aus α-1,4-glycosidisch verknüpften Glucose¬ molekülen, von der Amylopektin-Stärke, ein verzweigtes Poly¬ mer, bei dem die Verzweigungen durch das Auftreten von zu- sätzlichen cκ-1, 6-glykosidischen Verknüpfungen zustande kom¬ men.
In typischen für die Stärkeproduktion verwendeten Pflanzen, wie z.B. Mais oder Kartoffel, kommen die beiden Stärkeformen in einem Verhältnis von ca. 25 Teilen Amylose zu 75 Teilen Amylopektin vor. Neben dem Amylopektin kommt beispielsweise beim Mais ein weiteres verzweigtes Polysaccharid, das soge¬ nannte Phytoglycogen, vor, das sich vom Amylopektin durch einen stärkeren Verzweigungsgrad und ein anderes Löslich- keitsverhalten unterscheidet (siehe z.B. Lee et al. , Aren. Biochem. Biophys. 143 (1971), 365-374; Pan und Nelson, Plant Physiol. 74 (1984) , 324-328) . Im Rahmen dieser Anmeldung wird der Begriff Amylopektin so verwendet, daß er das Phyto¬ glycogen umfaßt.
Im Hinblick auf die Einheitlichkeit des Grundstoffes Stärke für seine Anwendung im industriellen Bereich werden Stärke- produzierende Pflanzen benötigt, die beispielsweise nur noch die Komponente Amylopektin oder nur noch die Komponente Amy¬ lose enthalten. Für eine Reihe weiterer Verwendungen werden Pflanzen benötigt, die unterschiedlich stark verzweigte Amy¬ lopektin-Formen synthetisieren.
Derartige Pflanzen können beispielsweise durch Züchtung oder Mutagenesetechniken erzeugt werden. Für bestimmte Pflanzen¬ spezies, z.B. Mais, ist bekannt, daß durch Mutagenese Sorten erzeugt werden können, die nur noch Amylopektin bilden. Für die Kartoffel wurde ebenfalls durch chemische Mutagenese bei einer haploiden Linie ein Genotyp erzeugt, der keine Amylose bildet (Hovenkamp-Hermelink, Theor. Appl. Genet. 75 (1987) , 217-221) .
Aus Visser et al . (Mol. Gen. Genet. 225 (1991) , 289) und der WO 92/11376 ist weiterhin bekannt, daß mittels einer anti- sense-Inhibition des Gens für die Stärkekorn-gebundene Stär- kesynthase in Kartoffel Sorten erzeugt werden können, die weitgehend reine Amylopektinstärke synthetisieren. Ferner sind aus der WO 92/14827 DNA-Sequenzen bekannt, die ein Ver¬ zweigungsenzym codieren (Q-Enzym) , das α-1, 6-Verzweigungen in Amylopektinstärke einführt. Mit Hilfe dieser DNA-Sequen¬ zen sollte es möglich sein, transgene Pflanzen herzustellen, bei denen das Amylose/Amylopektin-Verhältnis der Stärke ver¬ ändert ist.
Für eine weitere gezielte Veränderung des Verzweigungsgrades von in Pflanzen synthetisierter Stärke mit Hilfe gentechni¬ scher Verfahren ist es nach wie vor erforderlich, DNA-Se¬ quenzen zu identifizieren, die Enzyme codieren, die am Stär¬ kemetabolismus, insbesondere der Verzweigung von Stärkemole¬ külen, beteiligt sind.
Neben den Q-Enzymen, die Verzweigungen in Stärkemoleküle einführen, kommen in Pflanzen Enzyme vor, die Verzweigungen auflösen können. Diese Enzyme werden als Debranching-Enzyme bezeichnet und werden entsprechend ihrer Substratspezifität in drei Gruppen eingeteilt:
(a) Die Pullulanasen, die neben Pullulan auch Amylopektin als Substrat nutzen, kommen bei Mikroorganismen, z.B. Klebsiella, und bei Pflanzen vor. In Pflanzen werden diese Enzyme auch als R-Enzyme bezeichnet.
(b) Die Isoamylasen, die nicht Pullulan, wohl aber Glycogen und Amylopektin als Substrat nutzen, kommen ebenfalls bei Mikroorganismen und Pflanzen vor. Isoamylasen wurden beispielsweise bei Mais (Manners & Rowe, Carbohydr. Res. 9 (1969), 107) und Kartoffel (Ishizaki et al. , Agric . Biol. Chem. 47 (1983), 771-779) beschrieben.
(c) Die Amylo-1, 6-Glucosidasen sind bei Säugern und Hefen beschrieben und nutzen Grenzdextrine als Substrat.
In Zuckerrübe konnte von Li et al. (Plant Physiol. 98 (1992) , 1277-1284) neben fünf Endo- und zwei Exoamylasen nur ein Debranching-Enzym vom Pullulanase-Typ nachgewiesen wer¬ den. Dieses Enzym, das eine Größe von ca. 100 kD und ein pH- Optimum von 5,5 aufweist, ist in den Chloroplasten lokali¬ siert. Auch für Spinat wurde ein Debranching-Enzym beschrie¬ ben, das Pullulan als Substrat verwendet. Sowohl das Debranching-Enzym aus Spinat als auch das aus der Zuckerrübe besitzen bei der Reaktion mit Amylopektin als Substrat ver- glichen mit Pullulan als Substrat eine 5-fach geringere Ak¬ tivität (Ludwig et al. , Plant Physiol. 74 (1984) , 856-861; Li et al., Plant Physiol. 98 (1992) , 1277-1284) . Bei der landwirtschaftlich wichtigen stärkespeichernden Kul¬ turpflanze Kartoffel wurde die Aktivität eines Debranching- Enzyms von Hobson et al . (J. Chem. Soc, (1951) , 1451) un¬ tersucht. Es gelang der Nachweis, daß das entsprechende En¬ zym im Gegensatz zum Q-Enzym keine kettenverlängernde Akti¬ vität besitzt, sondern lediglich ot- 1 , 6-glycosidische Bindun¬ gen hydrolysiert. Das Enzym konnte jedoch bisher nicht ge¬ nauer charakterisiert werden.
Im Fall der Kartoffel wurden bereits Verfahren zur Reinigung des Debranching-Enzyms sowie partielle Peptidsequenzen des gereinigten Proteins vorgeschlagen (WO 95/04826) . Für Spinat wurde inzwischen die Reinigung eines Debranching- Enzyms, sowie die Isolierung einer entsprechenden cDNA be¬ schrieben (Renz et al. , Plant Physiol. 108 (1995) , 1342) .
Für die wichtigste Stärke liefernde Pflanze, Mais, wurde bisher in der Literatur lediglich die Existenz eines Debranching-Enzyms beschrieben. Dieses wird aufgrund seiner Substratspezifität in die Gruppe der Isoamylasen eingeordnet (siehe z.B. Hannah et al. , Scientia Horticulturae 55 (1993) , 177-197 oder Garwood (1984) in Starch Chemistry and Technology, Whistler, R.L. , BeMiller, J.N. , Puschall, E.F. (eds.) , Academic Press San Diego, New York, Boston, 25-86) . Die entsprechende Mutante wird als su (sugary) bezeichnet. Das Gen des sugary-Locus wurde kürzlich cloniert (siehe James et al. , Plant Cell 7 (1995), 417-429) . Neben dem sugary-Locus ist bisher in Mais kein anderer Genlocus be¬ kannt, der ein Protein mit Debranching-Enzymaktivität co¬ diert. Es gab bisher auch keinerlei Hinweise, daß andere Debranching-Enzymformen in Mais vorkommen. Will man trans- gene Maispflanzen herstellen, die keinerlei Debranching-En¬ zymaktivität mehr aufweisen, z.B. um eine Veränderung des Verzweigungsgrades der Amylopektinstarke zu erzielen, so ist es erforderlich, alle im Mais vorkommenden Debranching-En- zymformen zu identifizieren und die entsprechenden Gene oder cDNA-Sequenzen zu isolieren.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, weitere möglicherweise bei Mais vorkommende Debranching-En- zyme zu identifizieren bzw. entsprechende Nucleinsäuremole- küle, die diese Enzyme codieren, zu isolieren.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Pa¬ tentansprüchen bezeichneten Ausführungsformen gelöst .
Somit betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremole- küle, die Proteine mit der biologischen Aktivität eines Debranching-Enzyms aus Mais codieren, oder ein biologisch aktives Fragment davon, wobei derartige Nucleinsäuremoleküle vorzugsweise ein Debranching-Enzym aus Mais codieren, das die unter Seq ID No. 2 angegebene Aminosäuresequenz auf¬ weist. Besonders bevorzugt umfaßt ein derartiges Nucleinsäu- remolekül die unter Seq ID No. 1 angegebene Nucleotidse- quenz, insbesondere die codierende Region, oder eine ent¬ sprechende Ribonucleotidsequenz .
Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Nucleinsäuremole¬ küle, die Proteine mit der biologischen Aktivität eines Debranching-Enzyms aus Mais codieren oder biologisch aktive Fragmente davon und die mit einem der oben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle hybridisieren.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremo¬ leküle, deren Sequenzen sich aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von den Sequenzen der obengenannten Nucleinsäuremoleküle unterscheidet, und die ein Protein co¬ dieren, das die biologische Aktivität eines Debranching- Enzyms aus Mais aufweist. Die Erfindung betrifft auch Nucleinsäuremoleküle, deren Se¬ quenz zu der gesamten oder einem Teil der Sequenz der oben¬ genannten Nucleinsäuremoleküle komplementär ist.
Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet im Rahmen dieser Er¬ findung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridi- sierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedin¬ gungen, wie sie beispielsweise in Sambrock et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben sind. Nucleinsäuremoleküle, die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridisieren, können prinzipiell aus jeder beliebigen Maispflanze stammen.
Nucleinsäuremoleküle, die mit den erfindungsgemäßen Molekü¬ len hybridisieren, können z.B. aus genomischen oder aus cDNA-Bibliotheken isoliert werden.
Die Identifizierung und Isolierung derartiger Nucleinsäure¬ moleküle aus Maispflanzen kann dabei unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder Teile dieser Mo¬ leküle bzw. der reversen Komplemente dieser Moleküle erfol¬ gen, z.B. mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe z.B. Sambrook et al. , 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) .
Als Hybridisierungsprobe können z.B. Nucleinsäuremoleküle verwendet werden, die exakt die oder im wesentlichen die un¬ ter Seq ID No. 1 angegebene Nucleotidsequenz oder Teile die¬ ser Sequenz aufweisen. Bei den als Hybridisierungsprobe ver¬ wendeten Fragmenten kann es sich auch um synthetische Frag¬ mente handeln, die mit Hilfe der gängigen Synthesetechniken hergestellt wurden und deren Sequenz im wesentlichen mit der eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls übereinstimmt. Hat man Gene identifiziert und isoliert, die mit den erfin¬ dungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen hybridisieren, ist eine Bestimmung der Sequenz und eine Analyse der Eigenschaften der von dieser Sequenz codierten Proteine erforderlich. Die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridi¬ sierenden Moleküle umfassen auch Fragmente, Derivate und al- lelische Varianten der oben beschriebenen DNA-Moleküle, die ein Debranching-Enzym aus Mais codieren oder ein biologisch, d.h. enzymatisch, aktives Fragment davon. Unter Fragmenten werden dabei Teile der Nucleinsäuremoleküle verstanden, die lang genug sind, um ein Polypeptid mit der enzymatischen Ak¬ tivität eines Debranching-Enzyms aus Mais zu codieren. Der Ausdruck Derivat bedeutet in diesem Zusammenhang, daß die Sequenzen dieser Moleküle sich von den Sequenzen der oben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle an einer oder mehreren Positionen unterscheiden und einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität von mindestens 40 %, insbesondere eine Identität von mindestens 60 %, vorzugsweise über 80 % und besonders bevorzugt über 90 %. Die Abweichungen zu den oben beschriebenen Nucleinsäuremolekülen können dabei durch Dele- tion, Addition, Substitution, Insertion oder Rekombination entstanden sein.
Homologie bedeutet ferner, daß funktionelle und/oder struk¬ turelle Äquivalenz zwischen den betreffenden Nucleinsäuremo¬ lekülen oder den durch sie codierten Proteinen, besteht. Bei den Nucleinsäuremolekülen, die homolog zu den oben beschrie¬ benen Molekülen sind und Derivate dieser Moleküle darstel¬ len, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Mo¬ leküle, die Modifikationen darstellen, die dieselbe biologi¬ sche Funktion ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürli¬ cherweise auftretende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus anderen Organismen, oder um Mutationen, wobei diese Mutationen auf natürliche Weise aufgetreten sein kön¬ nen oder durch gezielte Mutagenese eingeführt wurden. Ferner kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende Varianten handeln, als auch um synthetisch hergestellte oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugte Varianten. Die von den verschiedenen Varianten der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codierten Proteine weisen bestimmte ge¬ meinsame Charakteristika auf. Dazu können z.B. Enzymaktivi¬ tät, Molekulargewicht, immunologische Reaktivität, Konforma¬ tion etc. gehören, sowie physikalische Eigenschaften wie z.B. das Laufverhalten in Gelelektrophoresen, chromatogra¬ phisches Verhalten, Sedimentationskoeffizienten, Löslich¬ keit, spektroskopische Eigenschaften, Stabilität; pH-Opti¬ mum, Temperatur-Optimum etc.
Der Nachweis der enzymatischen Aktivität des Debranching-En¬ zyms kann beispielsweise durch einen Färbetest erfolgen, wie in der WO 95/04826 beschrieben. Dieser beruht darauf, daß sich ein Protein mit einer stärkemodifizierenden Aktivität nachweisen läßt, wenn Proteinextrake, beispielsweise aus Maiskörnern, in nicht-denaturierenden, amylopektinhaltigen Polyacrylamidgelen (PAAG) aufgetrennt werden und das Gel, nach Inkubation in einem geeigneten Puffer, anschließend einer Jodfärbung unterzogen wird. Während unverzweigte Amy¬ lose mit Jod einen blauen Komplex bildet, ergibt Amylopektin eine rötlich-violette Färbung. In amylopektinhaltigen Poly¬ acrylamidgelen, die mit Jod rötlich-violett färben, kommt es an Orten, an denen eine Debranching-Aktivität lokalisiert ist, zu einer Farbverschiebung hin zu einer Blaufärbung des Gels, da die Verzweigungen deε violettfärbenden Amylopektins von dem Debranching-Enzym abgebaut werden.
Alternativ kann der Nachweis der Debranching-Enzymaktivität mit Hilfe des DNSS-Tests (siehe Ludwig et al . , Plant Physiol. 74 (1984) , 856-861) erfolgen.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können beliebige Nucleinsäuremoleküle sein, insbesondere DNA- oder RNA-Mole- küle, beispielsweise cDNA, genomische DNA, mRNA etc. Sie können natürlich vorkommende Moleküle sein, oder durch gen¬ technische oder chemische Syntheseverfahren hergestellte. Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codieren ein bis¬ her unbekanntes neues Protein aus Mais mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms. Bisher war für Mais le¬ diglich ein Locus beschrieben worden der ein Protein mit Debranching-Enzymaktivität codiert (James et al . , s.o.) . In der Literatur gab es bisher keinerlei Hinweise, daß es in Mais weitere Gene gibt, die Debranching-Enzyme codieren. Ho¬ mologievergleiche der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle mit den in James et al . (s.o.) beschriebenen zeigen, daß diese Sequenzen keine signifikante Homologie zeigen und nicht miteinander hybridisieren würden. Somit codieren die erfindungsgemäßen Moleküle einen neuen Typ von Debranching- Enzymen aus Mais. Mit Hilfe dieser Moleküle ist es nun mög¬ lich gezielt in den Stärkemetabolismus von Mais und anderen stärkespeichernden Pflanzen einzugreifen und somit die Syn¬ these einer in ihren chemischen oder physikalischen Eigen¬ schaften modifizierten Stärke zu ermöglichen. Dies kann zum einen durch Überexpression der erfindungsgemäßen Nucleinsäu¬ remoleküle in beliebigen, vorzugsweise stärkespeichernden Pflanzen, erfolgen oder durch Reduktion der Debranching-En¬ zymaktivität in Maispflanzen durch Einsatz der erfindungsge¬ mäßen Nucleinsäuresequenzen, beispielsweise mittels anti- sense-, Ribozym- oder Cosuppressionseffekten.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremole¬ küle von mindestens 15 Basenpaaren Länge, die spezifisch mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridisieren. Spezifisch hybridisieren bedeutet hierbei, daß diese Mole¬ küle mit Nucleinsäuremolekülen hybridisieren, die die neuen Debranching-Enzyme aus Mais codieren, jedoch nicht mit Nucleinsäuremolekülen, die andere Proteine codieren. Hybri¬ disieren bedeutet dabei vorzugsweise Hybridisieren unter stringenten Bedingungen (s.o.) . Insbesondere betrifft die Erfindung solche Nucleinsäuremoleküle, die mit Transkripten von erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridisieren und dadurch deren Translation verhindern können. Dieses sind vorzugsweise zu den Transkripten komplementäre RNA-Moleküle. Weiterhin betrifft die Erfindung Vektoren, insbesondere Plasmide, Cosmide, Viren, Bacteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren, die die oben beschriebenen er¬ findungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in den Vekto¬ ren enthaltenen Nucleinsäuremoleküle verknüpft mit regulato¬ rischen Elementen, die die Transkription und Translation in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen gewährleisten.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Wirtszellen, insbesondere prokaryontische oder eukaryonti- sche Zellen, die mit einem oben beschriebenen Nucleinsäure- molekül oder einem Vektor transformiert wurden, und Zellen, die von derartigen Wirtszellen abstammen und die beschriebe¬ nen Nucleinsäuremoleküle oder Vektoren enthalten. Die Wirts¬ zellen können Bakterien- oder Pilzzellen, sowie pflanzliche oder tierische Zellen sein.
Die Erfindung betrifft auch Proteine mit der biologischen Aktivität eines Debranching-Enzyms aus Mais, die durch die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codiert werden, oder biologisch aktive Fragmente davon.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Her¬ stellung eines pflanzlichen Proteins mit der biologischen Aktivität eines Debranching-Enzyms aus Mais oder eines bio¬ logisch aktiven Fragmentes davon, bei dem erfindungsgemäße Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden und das Protein aus der Kultur, d.h. aus den Zellen und/oder dem Kulturmedium gewonnen wird.
Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nucleinsäure¬ moleküle besteht nun die Möglichkeit, pflanzliche Zellen mittels gentechnischer Methoden dahingehend zu verändern, daß sie eine neue oder eine gesteigerte Debranching-Enzymak¬ tivität aus Mais aufweisen im Vergleich zu Wildtypzellen, d.h. entsprechenden nicht transformierten Zellen. Insbeson¬ dere können Maiszellen bzw. -pflanzen dahingehend verändert werden, daß sie im Vergleich zu Wildtyp-Zellen oder -pflan¬ zen eine verringerte Debranching-Enzymaktivitat aufweisen.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich daher bei den erfindungsgemäßen Wirtszellen um transgene pflanzli¬ che Zellen, die aufgrund der Gegenwart und Expression eines eingeführten erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls im Ver¬ gleich zu nichttransformierten Zellen entweder eine neue oder eine gesteigerte Debranching-Enzymaktivität aufweisen. Solche transgenen Pflanzenzellen unterscheiden sich von nicht-transformierten Zellen dadurch, daß das eingeführte Nucleinsäuremolekül entweder heterolog zu der transformier¬ ten Zelle ist, d.h. aus einer Zelle mit einem anderen geno¬ mischen Hintergrund stammt, oder dadurch daß das eingeführte Nucleinsäuremolekül, wenn es homolog zur transformierten Pflanzenspezies ist, im Genom an einem Ort lokalisiert ist, an dem es in nicht-transformierten Zellen natürlicherweise nicht vorkommt. Dabei kann das eingeführte Nucleinsäuremole¬ kül entweder unter der Kontrolle seines natürlichen Promo¬ tors stehen oder mit regulatorischen Elementen fremder Gene verknüpft sein.
Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls transgene Pflanzen, die die oben beschriebenen transgenen Pflanzenzellen enthal¬ ten.
Bei der Pflanze, die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäure¬ molekülen transformiert ist, und in der aufgrund der Einfüh¬ rung eines solchen Moleküls ein Debranching-Enzym aus Mais synthetisiert wird, kann es sich im Prinzip um jede belie¬ bige Pflanze handeln. Vorzugsweise ist es eine monokotyle oder dikotyle Nutzpflanze, insbesondere eine stärkespei¬ chernde Pflanze, wie z.B. Getreidepflanzen, Leguminosen, Kartoffeln oder Maniok. Unter Getreidepflanzen werden insbesondere monokotyle Pflan¬ zen verstanden, die zur Ordnung Poales, bevorzugt solche, die zur Familie der Poaceae gehören. Beispiele hierfür sind die Pflanzen, die zu den Gattungen Avena (Hafer) , Triticum
(Weizen) , Seeale (Roggen) , Hordeum (Gerste) , Oryza (Reis) , Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorghum (Hirse) , Zea (Mais) etc. gehören, wobei Pflanzen der Spezies Zea mays (Mais) be¬ sonders bevorzugt sind. Stärkespeichernde Leguminosen sind z.B. manche Arten der Gattung Pisum (z.B. Pisum sativum) , Vicia (z.B. Vicia faba) , Cicer (z.B. Cicer arietinum) , Lens
(z.B. Lens culinaris) , Phaseolus (z.B. Phaseolus vulgaris und Phaseolus coccineus) , etc.
Die Expression einer neuen oder zusätzlichen Debranching-En¬ zymaktivität aus Mais in den erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen hat einen Einfluß auf den Ver¬ zweigungsgrad des in den Zellen und Pflanzen synthetisierten Amylopektins. Daher besitzt eine in diesen Pflanzen synthe¬ tisierte Stärke veränderte physikalische und/oder chemische Eigenschaften im Vergleich zu Stärke aus Wildtyp-Pflanzen. Somit betrifft die Erfindung auch die aus den transgenen Pflanzenzellen oder Pflanzen erhältliche Stärke.
Gegenstand der Erfindung ist ferner Vermehrungsmaterial von erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen, beispielsweise Samen, Früchte, Stecklinge, Knollen, Wurzelstöcke etc., wobei die¬ ses Vermehrungsmaterial oben beschriebene transgene Pflan¬ zenzellen enthält. Im Fall von Maispflanzen handelt es sich bei dem Vermehrungsmaterial vorzugsweise um die Maiskörner.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung transgene Pflan¬ zenzellen von Mais, bei denen die Aktivität des erfindungs- gemäßen Debranching-Enzyms verringert ist aufgrund der Inhi¬ bition der Transkription oder Translation von endogenen Nucleinsäuremolekülen, die ein erfindungsgemäßes Debranching-Enzym codieren. Dies wird vorzugsweise dadurch erreicht, daß ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül oder ein Teil davon in den entsprechenden Pflanzenzellen in anti- sense-Orientierung exprimiert wird und es aufgrund eines antisense-Effektes zur Verringerung der beschriebenen Debranching-Enzymaktivitat kommt . Eine weitere Möglichkeit zur Verringerung der Debranching-Enzymaktivitat in pflanzli¬ chen Zellen besteht in der Expression von geeigneten Ribozy- men, die spezifisch Transkripte der erfindungsgemäßen DNA- Moleküle spalten. Die Herstellung derartiger Ribozyme mit Hilfe der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle ist dem Fachmann geläufig. Möglich ist auch die Expression von Molekülen, die sowohl einen antisense- als auch einen Ribozymeffekt in Kom¬ bination ausüben. Alternativ kann die Verringerung der Debranching-Enzymaktivitat in den Pflanzenzellen auch durch einen Cosupressionseffekt erfolgen. Das Verfahren ist dem Fachmann bekannt und ist beispielsweise beschrieben in Jorgensen (Trends Biotechnol . 8 (1990) , 340-344) , Niebel et al. (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995) , 91-103) , Flavell et al. (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995) , 43-46) , Palaqui und Vaucheret (Plant. Mol. Biol. 29 (1995) , 149-159) , Vaucheret et al . (Mol. Gen. Genet. 248 (1995) , 311-317) , de Borne et al. (Mol. Gen. Genet. 243 (1994) , 613- 621) und anderen Quellen.
Die Erfindung betrifft ferner transgene Maispflanzen, die die oben beschriebenen transgenen Pflanzenzellen mit verrin¬ gerter Debranching-Enzymaktivitat enthalten.
Die Amylopektinstarke der transgenen Zellen und Pflanzen weist aufgrund der verringerten Debranching-Enzymaktivitat einen veränderten Verzweigungsgrad auf im Vergleich zu Stärke aus nichttransformierten Pflanzen. Gegenstand der Er¬ findung ist daher ebenfalls die aus den transgenen Zellen oder Pflanzen erhältliche modifizierte Stärke.
Die Erfindung betrifft auch Vermehrungsmaterial der vorste¬ hend beschriebenen transgenen Pflanzen, insbesondere Samen, wobei dieses vorstehend beschriebene transgene Pflanzenzel¬ len enthält .
Transgene Pflanzenzellen, die aufgrund der Expression einer neuen oder zusätzlichen Debranching-Enzymaktivitat eine Amy¬ lopektinstarke mit einem veränderten Verzweigungsgrad bilden im Vergleich zu in Wildtyp-Pflanzen synthetisierter Amylo¬ pektinstarke, können beispielsweise durch ein Verfahren her¬ gestellt werden, das folgende Schritte umfaßt:
(a) Herstellung einer Expressionskassette, die folgende DNA- Sequenzen umfaßt:
(i) einen Promotor, der die Transkription in pflanzli¬ chen Zellen gewährleistet;
(ii) mindestens eine erfindungsgemäße Nucleinsäurese- quenz, die ein Protein mit der enzymatischen Akti¬ vität eines Debranching-Enzyms codiert oder ein biologisch aktives Fragment davon und in sense- Orientierung an das 3 • -Ende des Promotors gekop¬ pelt ist; und
(iii) gegebenenfalls ein Termmationssignal für die Ter¬ mination der Transkription und die Addition eines poly-A-Schwanzes an daε entstehende Transkript, das an das 3 ' -Ende der codierenden Region gekop¬ pelt ist; und
(b) Transformation pflanzlicher Zellen mit der in Schritt
(a) hergestellten Expressionskassette.
Transgene Maispflanzenzellen, die aufgrund der Verringerung der beschriebenen Debranching-Enzymaktivitat eine Amylopek¬ tinstarke mit einem im Vergleich zu in Wildtyp-Pflanzen syn¬ thetisierter Amylopektinstarke veränderten Verzweigungsgrad bilden, können beispielsweise durch ein Verfahren herge¬ stellt werden, das folgende Schritte umfaßt: (a) Herstellung einer Expressionskassette, die folgende DNA- Sequenzen umfaßt :
(i) einen Promotor, der die Transkription in pflanzli¬ chen Zellen gewährleistet;
(ii) mindestens eine erfindungsgemäße Nucleinsäurese- quenz, die ein Protein mit der enzymatischen Akti¬ vität eines Debranching-Enzyms codiert oder einen Teil eines solchen Proteins und die in antisense- Orientierung an das 3 ' -Ende des Promotors gekop¬ pelt ist; und
(iii) gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Ter¬ mination der Transkription und die Addition eines poly-A-Schwanzes an das entstehende Transkript, das an das 3 ' -Ende der codierenden Region gekop¬ pelt ist; und
(b) Transformation pflanzlicher Zellen mit der in Schritt
(a) hergestellten Expressionskassette.
Für den unter (i) genannten Promotor kommt im Prinzip jeder in den für die Transformation gewählten Pflanzen funktionale Promotor in Betracht. Der Promotor kann homolog oder hetero- log in bezug auf die verwendete Pflanzenspezies sein. Ge¬ eignet ist beispielsweise der 35S-Promotor des Cauliflower- Mosaik-Virus (Odell et al., Nature 313 (1985) , 810-812) , der eine konstitutive Expression in allen Geweben einer Pflanze gewährleistet und das in der WO/9401571 beschriebene Promo- torkonstrukt . Ein anderes Beispiel sind die Promotoren der Polyubiquitingene aus Mais (Christensen et al . , Plant Mol. Biol. 18 (1992) 675-689. Es können jedoch auch Promotoren verwendet werden, die nur zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt (siehe beispielsweise WO/9307279) . Von besonderem Interesse können hierbei Promotoren von heat- shock-Proteinen sein, die eine einfache Induktion erlauben. Ferner können die Promotoren verwendet werden, die in einem bestimmten Gewebe der Pflanze zu einer Expression nachge¬ schalteter Sequenzen führen (siehe z. B. Stockhaus et al . , EMBO J. 8 (1989) , 2245-2251) . Präferentiell werden Promoto- ren eingesetzt, die in den stärkespeichernden Organen der zu transformierenden Pflanzen aktiv sind. Dies sind beim Mais die Maiskörner, während es bei der Kartoffel die Knollen sind. Zur Überexpression der erfindungsgemäßen Nucleinsäure¬ moleküle in der Kartoffel kann beispielsweise der knollen¬ spezifische B33-Promotor (Rocha-Sosa et al. , EMBO J. 8 (1989) , 23-29) verwendet werden.
Samenspezifische Promotoren sind bereits für verschiedene Pflanzenspezies beschrieben worden. So z.B. der USP-Promotor aus Vicia faba, der eine samenspezifische Expression in V. faba und anderen Pflanzen gewährleistet (Fiedler et al. , Plant Mol. Biol. 22 (1993) , 669-679; Bäumlein et al. , Mol Gen. Genet. 225 (1991) , 459-467) . In Mais gewährleisten bei¬ spielsweise Promotoren der Zein-Gene eine spezifische Ex¬ pression im Endosperm der Maiskörner (Pedersen et al . , Cell 29 (1982) , 1015-1026; Quattrocchio et al. , Plant Mol. Biol. 15 (1990) , 81-93) .
In dem Fall, daß die unter Verfahrensschritt (a) (ii) ge¬ nannte, Nucleinsäuresequenz, die ein Protein mit der enzyma¬ tischen Aktivität eines Debranching-Enzyms aus Mais codiert, in seπse-Orientierung mit dem Promotor verknüpft ist, kann diese Nucleinsäuresequenz sowohl nativen bzw. homologen Ur¬ sprungs als auch fremden bzw. heterologen Ursprungs in bezug auf die zu transformierende Pflanzenspezies sein, d.h. es können sowohl Maispflanzen als auch beliebige andere Pflan¬ zen mit der beschriebenen Expressionskassette transformiert werden, vorzugsweise die obengenannten stärkespeichernden Pflanzen.
Es besteht grundsätzlich die Möglichkeit, daß das syntheti¬ sierte Protein in jedem beliebigen Kompartiment der pflanz¬ lichen Zelle lokalisiert sein kann. Pflanzliche Debranching- Enzyme sind in der Regel in den Piastiden lokalisiert und besitzen daher eine Signalsequenz für die Translokation in diese Organellen. Um die Lokalisation in einem anderen Kom¬ partiment der Zelle zu erreichen, muß die DNA-Sequenz, die diese Signalsequenz codiert, entfernt werden und die codie¬ rende Region mit DNA-Sequenzen verknüpft werden, die die Lo- kalisierung in dem jeweiligen Kompartiment gewährleisten. Derartige Sequenzen sind bekannt (Siehe beispielsweise Braun et al., EMBO J. 11 (1992) , 3219-3227; Wolter et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85 (1988) , 846-850; Sonnewald et al. , Plant J. 1 (1991) , 95-106) .
In dem Fall, daß die unter Verfahrensschritt (a) (ii) ge¬ nannte Nucleinsäuresequenz, die ein Protein aus Mais mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms codiert, in aπtiseπse-Orientierung mit dem Promotor verknüpft ist, han¬ delt es sich bei dieser vorzugsweise um eine Nucleinsäurese¬ quenz homologen Ursprungs in bezug auf die zu transformie¬ rende Pflanzenspezies. Es können jedoch auch Nucleinsäurese- quenzen verwendet werden, die einen hohen Grad an Homologie zu endogen vorhandenen Debranching-Enzym-Genen haben, insbe¬ sondere Homologien höher als 80 %, vorzugsweise Homologien zwischen 90 % und 100 % und besonders bevorzugt Homologien über 95 %.
Es können Sequenzen bis zu einer Mindestlänge von 15 bp ver¬ wendet werden. Eine inhibierende Wirkung ist aber auch bei der Verwendung kürzerer Sequenzen nicht ausgeschlossen. Be¬ vorzugt werden längere Sequenzen zwischen 100 und 500 Basen¬ paaren verwendet, für eine effiziente antisense-Inhibition werden insbesondere Sequenzen mit einer Länge über 500 Ba¬ senpaaren verwendet. In der Regel werden Sequenzen verwen¬ det, die kürzer als 5000 Basenpaare sind, bevorzugt Sequen¬ zen, die kürzer als 2500 Basenpaare sind.
Terminationssignale für die Transkription in pflanzlichen Zellen sind beschrieben und sind beliebig gegeneinander aus¬ tauschbar. Verwendet werden kann beispielsweise die Termina- tionssequenz des Octopinsynthase-Gens aus Agrobacterium turne faciens .
Der Transfer der gemäß Verfahrensschritt (a) konstruierten Expressionskassette in pflanzliche Zellen erfolgt vorzugs¬ weise unter Verwendung von Plasmiden, insbesondere mit Hilfe von Plasmiden, die eine stabile Integration der Expressions- kassette in das pflanzliche Genom gewährleisten. Das oben beschriebene Verfahren zur Überexpression eines neuen Debranching-Enzyms aus Mais kann prinzipiell auf alle Pflanzenspezies angewendet werde. Von Interesse sind sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen, insbesondere die oben beschriebenen stärkespeichernden Pflanzen. Das oben be¬ schriebene Verfahren zur Reduktion der Debranching-Enzymak¬ tivitat wird bevorzugt auf monokotyledone Pflanzen, insbe¬ sondere auf Mais angewandt.
Infolge der Einführung einer gemäß den beschriebenen Verfah¬ ren konstruierten Expressionskassette kommt es in den trans¬ formierten Pflanzenzellen zur Bildung einer RNA. Ist die ein Debranching-Enzym aus Mais codierende Nucleinsäuresequenz in der Expressionskassette in seπse-Orientierung mit dem Promo¬ tor verknüpft, kommt es zur Synthese einer mRNA, die als Ma¬ trize für die Synthese eines zusätzlichen oder neuen Debranching-Enzyms aus Mais in den pflanzlichen Zellen die¬ nen kann. Als Folge davon weisen diese Zellen eine Aktivität bzw. eine erhöhte Aktivität des Debranching-Enzyms aus Mais auf, was zu einer Veränderung des Verzweigungsgrades des in den Zellen gebildeten Amylopektins führt. Dadurch wird eine Stärke zugänglich, die sich gegenüber der natürlich vorkom¬ menden Stärke durch eine stärker geordnete Raumstruktur so¬ wie eine gesteigerte Einheitlichkeit auszeichnet. Dies kann unter anderem günstige Auswirkungen auf die Filmbildungs- eigenschaften haben.
Ist die ein Debranching-Enzym aus Mais codierende Nuclein¬ säuresequenz dagegen in antisense-Orientierung mit dem Pro¬ motor verknüpft, so kommt es in transgenen Pflanzenzellen zur Synthese einer aπtiseπse-RNA, die die Expression von en¬ dogenen Debranching-Enzym-Genen inhibiert. Als Folge weisen diese Zellen eine reduzierte Aktivität des neuen Debranching-Enzyms aus Mais auf, was zur Bildung einer modi¬ fizierten Stärke führt. Mit Hilfe der aπtiseπse-Technik ist es möglich Pflanzen herzustellen, bei denen die Expression eines endogenen Debranching-Enzym-Gens in Maiε in unter¬ schiedlichem Maße inhibiert ist in einem Bereich von 0 % bis zu 100 %. Dies ermöglicht insbesondere die Herstellung von Maispflanzen, die Amylopektinstarke mit verschiedensten Va¬ riationen im Verzweigungsgrad synthetisieren. Dies stellt einen Vorteil gegenüber herkömmlichen Züchtungs- und Mutage- neseverfahren dar, bei denen die Bereitstellung einer derar¬ tigen Vielfalt nur mit erheblichem Zeit- und Kostenaufwand möglich ist. Stark verzweigtes Amylopektin hat eine beson¬ ders große Oberfläche und eignet sich dadurch als Copolymer in besonderem Maße. Ein starker Verzweigungsgrad führt außerdem zu einer Verbesserung der Wasserlöslichkeit des Amylopektins. Diese Eigenschaft ist für bestimmte technische Anwendungen sehr vorteilhaft .
Besonders geeignet für die Produktion von verändertem Amylo¬ pektin unter Ausnutzung der erfindungsgemäßen Nucleinsäure¬ moleküle die Debranching-Enzyme codieren ist Mais. Die An¬ wendung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Pflanzen¬ spezies beschränkt. Für die Überexpression kann jede belie¬ bige andere Pflanzenspezies verwendet werden.
Die in den transgenen Pflanzen synthetisierte modifizierte Stärke kann mittels gängiger Methoden aus den Pflanzen oder aus den Pflanzenzellen isoliert und nach der Reinigung zur Herstellung von Nahrungsmitteln und industriellen Produkten verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Stärken können nach dem Fachmann be¬ kannten Verfahren modifiziert werden und eignen sich in un- modifizierter oder modifizierter Form für verschiedene Ver¬ wendungen im Nahrungsmittel- oder Nicht-Nahrungsmittelbe¬ reich.
Grundsätzlich läßt sich die Einsatzmöglichkeit der Stärke in zwei große Bereiche unterteilen. Der eine Bereich umfaßt die Hydrolyseprodukte der Stärke, hauptsächlich Glucose und Glu- canbausteine, die über enzymatische oder chemische Verfahren erhalten werden. Sie dienen als Ausgangsstoff für weitere chemische Modifikationen und Prozesse, wie Fermentation. Für eine Reduktion der Kosten kann hierbei die Einfachheit und kostengünstige Ausführung eines Hydrolyseverfahrens von Be- deutung sein. Gegenwärtig verläuft es im wesentlichen enzy¬ matisch unter Verwendung von Amyloglucosidase. Vorstellbar wäre eine Kosteneinsparung durch einen geringeren Einsatz von Enzymen. Eine Strukturveränderung der Stärke, z.B. Ober¬ flächenvergrößerung des Korns, leichtere Verdaulichkeit durch geringeren Verzweigungsgrad oder eine sterische Struk¬ tur, die die Zugänglichkeit für die eingesetzten Enzyme be¬ grenzt, könnte dies bewirken.
Der andere Bereich, in dem die Stärke wegen ihrer polymeren Struktur als sogenannte native Stärke verwendet wird, glie¬ dert sich in zwei weitere Einsatzgebiete:
1. Nahrungsmittelindustrie
Stärke ist ein klassischer Zusatzstoff für viele Nah¬ rungsmittel, bei denen sie im wesentlichen die Funktion des Bindens von wäßrigen Zusatzstoffen übernimmt bzw. eine Erhöhung der Viskosität oder aber eine erhöhte Gelbildung hervorruft. Wichtige Eigenschaftsmerkmale sind das Fließ- und Sorptionsverhalten, die Quell- und Verkleisterungstemperatur, die Viskosität und Dickungs- leistung, die Löslichkeit der Stärke, die Transparenz und Kleisterstruktur, die Hitze-, Scher- und Säuresta¬ bilität, die Neigung zur Retrogradation, die Fähigkeit zur Filmbildung, die Gefrier/Taustabilität, die Verdau¬ lichkeit sowie die Fähigkeit zur Komplexbildung mit z.B. anorganischen oder organischen Ionen.
2. Nicht-Nahrungmittelindustrie
In diesem großen Bereich kann die Stärke als Hilfsstoff für unterschiedliche Herstellungsprozesse bzw. als Zu¬ satzstoff in technischen Produkten eingesetzt. Bei der Verwendung der Stärke als Hilfsstoff ist hier insbeson¬ dere die Papier- und Pappeindustrie zu nennen. Die Stärke dient dabei in erster Linie zur Retardation (Zu¬ rückhaltung von Feststoffen) , der Abbindung von Füll¬ stoff- und Feinstoffteilchen, als Festigungsstoff und zur Entwässerung. Darüber hinaus werden die günstigen Eigenschaften der Stärke in bezug auf die Steifigkeit, die Härte, den Klang, den Griff, den Glanz, die Glätte, die Spaltfestigkeit sowie die Oberflächen ausgenutzt.
2.1 Papier- und Pappeindustrie
Innerhalb des Papierherstellungsprozesses sind vier An¬ wendungsbereiche, nämlich Oberfläche, Strich, Masse und Sprühen, zu unterscheiden.
Die Anforderungen an die Stärke in bezug auf die Ober¬ flächenbehandlung sind im wesentlichen ein hoher Weiße¬ grad, eine angepaßte Viskosität, eine hohe Viskositäts- stabilität, eine gute Filmbildung sowie eine geringe Staubbildung. Bei der Verwendung im Strich spielt der Feststoffgehalt, eine angepaßte Viskosität, ein hohes Bindevermögen sowie eine hohe Pigmentaffinität eine wichtige Rolle. Als Zusatz zur Masse ist eine rasche, gleichmäßige, verlustfreie Verteilung, eine hohe mecha¬ nische Stabilität und eine vollständige Zurückhaltung im Papierfließ von Bedeutung. Beim Einsatz der Stärke im Sprühbereich sind ebenfalls ein angepaßter Fest¬ stoffgehalt, hohe Viskosität sowie ein hohes Bindever¬ mögen von Bedeutung.
2.2 Klebstoffindustrie
Ein großer Einsatzbereich der Stärken besteht in der Klebstoffindustrie, wo man die Einsatzmöglichkeiten in vier Teilbereiche gliedert : die Verwendung als reinem Stärkeleim, die Verwendung bei mit speziellen Chemika¬ lien aufbereiteten Stärkeleimen, die Verwendung von Stärke als Zusatz zu synthetischen Harzen und Polymer¬ dispersionen sowie die Verwendung von Stärken als Streckmittel für synthetische Klebstoffe. 90 % der Klebstoffe auf Stärkebasis werden in den Bereichen Wellpappenherstellung, Herstellung von Papiersäcken, Beuteln und Tüten, Herstellung von Verbundmaterialien für Papier und Aluminium, Herstellung von Kartonagen und Wiederbefeuchtungsleim für Briefumschläge, Brief¬ marken usw. eingesetzt.
2.3 Textil- und Textilpflegemittelindustrie
Ein großes Einsatzfeld für die Stärken als Hilfmittel und Zusatzstoff ist der Bereich Herstellung von Tex¬ tilien und Textilpflegemitteln. Innerhalb der Textilin¬ dustrie sind die folgenden vier Einsatzbereiche zu un¬ terscheiden: Der Einsatz der Stärke als Schlichtmittel, d.h. als Hilfstoff zur Glättung und Stärkung des Klett- verhaltens zum Schutz gegen die beim Weben angreifenden Zugkräfte sowie zur Erhöhung der Abriebfestigkeit beim Weben, Stärke als Mittel zur Textilaufrüstung vor allem nach qualitätsverschlechternden Vorbehandlungen, wie Bleichen, Färben usw., Stärke als Verdickungsmittel bei der Herstellung von Farbpasten zur Verhinderung von Farbstoffdiffusionen sowie Stärke als Zusatz zu Ket- tungsmitteln für Nähgarne.
2.4 Baustoffindustrie
Der vierte Einsatzbereich ist die Verwendung der Stär¬ ken als Zusatz bei Baustoffen. Ein Beispiel ist die Herstellung von Gipskartonplatten, bei der die im Gips¬ brei vermischte Stärke mit dem Wasser verkleistert, an die Oberfläche der Gipsplatte diffundiert und dort den Karton an die Platte bindet. Weitere Einsatzbereiche sind die Beimischung zu Putz- und Mineralfasern. Bei Transportbeton werden Stärkeprodukte zur Verzögerung der Abbindung eingesetzt.
2.5 Bodenstabilisation
Ein weiterer Markt für die Stärke bietet sich bei der Herstellung von Mitteln zur Bodenstabilisation an, die bei künstlichen Erdbewegungen zum temporären Schutz der Bodenpartikel gegenüber Wasser eingesetzt werden. Kom¬ binationsprodukte aus der Stärke und Polymeremulsionen sind nach heutiger Kenntnis in ihrer Erosions- und ver- krustungsmindernden Wirkung den bisher eingesetzten Produkten gleichzusetzen, liegen preislich aber deut¬ lich unter diesen.
2.6 Einsatz bei Pflanzenschutz- und Düngemitteln
Ein Einsatzbereich liegt bei der Verwendung der Stärke in Pflanzenschutzmitteln zur Veränderung der spezifi¬ schen Eigenschaften der Präparate . So kann die Stärke zur Verbesserung der Benetzung von Pflanzenschutz- und Düngemitteln, zur dosierten Freigabe der Wirkstoffe, zur Umwandlung flüssiger, flüchtiger und/oder übelrie¬ chender Wirkstoffe in mikrokristalline, stabile, form¬ bare Substanzen, zur Mischung inkompatibler Verbindun¬ gen und zur Verlängerung der Wirkdauer durch Verminde¬ rung der Zersetzung eingesetzt werden.
2.7 Pharmaka, Medizin und Kosmetikindustrie
Ein weiteres Einsatzgebiet besteht im Bereich der Phar¬ maka, Medizin und Kosmetikindustrie. In der pharmazeu¬ tischen Industrie kann die Stärke als Bindemittel für Tabletten oder zur Bindemittelverdünnung in Kapseln eingesetzt werden. Weiterhin kann die Stärke als Ta- blettensprengmittel dienen, da sie nach dem Schlucken Flüssigkeit absorbieren und nach kurzer Zeit soweit quellen, daß der Wirkstoff freigesetzt wird. Medizini¬ sche Gleit- und Wundpuder basieren aus qualitativen Gründen auf Stärke. Im Bereich der Kosmetik werden Stärken beispielsweise als Träger von Puderzusatzstof- fen, wie Düften und Salicylsäure eingesetzt. Ein rela¬ tiv großer Anwendungsbereich für die Stärke liegt bei Zahnpasta.
2.8 Stärkezusatz zu Kohlen und Briketts
Einen Einsatzbereich bietet die Stärke als Zusatzstoff zu Kohle und Brikett. Kohle kann mit einem Stärkezusatz quantitativ hochwertig agglomeriert bzw. brikettiert werden, wodurch ein frühzeitiges Zerfallen der Briketts verhindert wird. Der Stärkezusatz liegt bei Grillkohle zwischen 4 und 6 %, bei kalorierter Kohle zwischen 0,1 und 0,5 %. Des weiteren gewinnen Stärken als Bindemit¬ tel an Bedeutung, da durch ihren Zusatz zu Kohle und Brikett der Ausstoß schädlicher Stoffe deutlich vermin¬ dert werden kann.
2.9 Erz- und Kohleschlammaufbereitung
Die Stärke kann ferner bei der Erz- und Kohleschlamm¬ aufbereitung als Flockungsmittel eingesetzt werden.
2.10 Gießereihilfsstoff
Ein weiterer Einsatzbereich besteht als Zusatz zu Gießereihilfsstoffen. Bei verschiedenen Gußverfahren werden Kerne benötigt, die aus Bindemittel-versetzten Sänden hergestellt werden. Als Bindemittel wird heute überwiegend Bentonit eingesetzt, das mit modifizierten Stärken, meist Quellstärken, versetzt ist. Zweck des Stärkezusatzes ist die Erhöhung der Fließfe¬ stigkeit sowie die Verbesserung der Bindefestigkeit. Darüber hinaus können die Quellstärken weitere produk¬ tionstechnische Anforderungen, wie im kalten Wasser dispergierbar, rehydratisierbar, gut in Sand mischbar und hohes Wasserbindungsvermögen, aufweisen.
2.11 Einsatz in der Kautschukindustrie
In der Kautschukindustrie kann die Stärke zur Verbesse¬ rung der technischen und optischen Qualität eingesetzt werden. Gründe sind dabei die Verbesserung des Oberflä¬ chenglanzes, die Verbesserung des Griffs und des Ausse¬ hens, dafür wird Stärke vor der Kaltvulkanisation auf die klebrigen gummierten Flächen von Kautschukstoffen gestreut, sowie die Verbesserung der Bedruckbarkeit des Kautschuks . 2.12 Herstellung von Lederersatzstoffen
Eine weitere Absatzmöglichkeit der modifizierten Stär¬ ken besteht bei der Herstellung von Lederersatzstoffen.
2.13 Stärke in synthetischen Polymeren
Auf dem Kunststoffsektor zeichnen sich folgende Ein¬ satzgebiete ab: die Einbindung von Stärkefolgeprodukten in den Verarbeitungsprozess (Stärke ist nur Füllstoff, es besteht keine direkte Bindung zwischen synthetischem Polymer und Stärke) oder alternativ die Einbindung von Stärkefolgeprodukten in die Herstellung von Polymeren (Stärke und Polymer gehen eine feste Bindung ein) .
Die Verwendung der Stärke als reinem Füllstoff ist vergli¬ chen mit den anderen Stoffen wie Talkum nicht wettbewerbsfä¬ hig. Anders sieht es aus, wenn die spezifischen Stärkeeigen¬ schaften zum Tragen kommen und hierdurch das Eigen¬ schaftsprofil der Endprodukte deutlich verändert wird. Ein Beispiel hierfür ist die Anwendung von Stärkeprodukten bei der Verarbeitung von Thermoplasten, wie Polyäthylen. Hierbei werden die Stärke und das synthetische Polymer durch Koex- pression im Verhältnis von 1 : 1 zu einem 'master batch' kombiniert, aus dem mit granuliertem Polyäthylen unter An¬ wendung herkömmlicher Verfahrenstechniken diverse Produkte hergestellt werden. Durch die Einbindung von Stärke in Poly¬ äthylenfolien kann eine erhöhte Stoffdurchlässigkeit bei Hohlkörpern, eine verbesserte Wasserdampfdurchlässigkeit, ein verbessertes Antistatikverhalten, ein verbessertes Anti- blockverhalten sowie eine verbesserte Bedruckbarkeit mit wäßrigen Farben erreicht werden.
Eine andere Möglichkeit ist die Anwendung der Stärke in Po¬ lyurethanschäumen. Mit der Adaption der Stärkederivate sowie durch die verfahrenstechnische Optimierung ist es möglich, die Reaktion zwischen synthetischen Polymeren und den Hydro¬ xygruppen der Stärken gezielt zu steuern. Das Ergebnis sind Polyurethanfolien, die durch die Anwendung von Stärke fol¬ gende Eigenschaftsprofile erhalten: eine Verringerung des Wärmeausdehnungskoeffizienten, Verringerung des Schrumpfver¬ haltens, Verbesserung des Druck/Spannungsverhaltens, Zunahme der Wasserdampfdurchlässigkeit ohne Veränderung der Wasser¬ aufnahme, Verringerung der Entflammbarkeit und der Aufri߬ dichte, kein Abtropfen brennbarer Teile, Halogenfreiheit und verminderte Alterung. Nachteile, die gegenwärtig noch vor¬ handen sind, sind verringerte Druckfestigkeit sowie eine verringerte Schlagfestigkeit.
Die Produktentwicklung beschränkt sich inzwischen nicht mehr nur auf Folien. Auch feste Kunststoffprodukte, wie Töpfe, Platten und Schalen, sind mit einem Stärkegehalt von über 50 % herzustellen. Des weiteren sind Stärke/ Polymermischungen günstig zu beurteilen, da sie eine sehr viel höhere biologi¬ sche Abbaubarkeit aufweisen.
Außerordentliche Bedeutung haben weiterhin auf Grund ihres extremen Wasserbindungsvermögen Stärkepfropfpolymerisate ge¬ wonnen. Dies sind Produkte mit einem Rückgrat aus Stärke und einer nach dem Prinzip des Radikalkettenmechanismus auf¬ gepfropften Seitengitters eines synthetischen Monomers. Die heute verfügbaren Stärkepfropfpolymerisate zeichnen sich durch ein besseres Binde- und Rückhaltevermögen von bis zu 1000 g Wasser pro g Stärke bei hoher Viskosität aus. Die An¬ wendungsbereiche für diese Superabsorber haben sich in den letzten Jahren stark ausgeweitet und liegen im Hygienebe¬ reich mit Produkten Windeln und Unterlagen sowie im land¬ wirtschaftlichen Sektor, z.B. bei Saatgutpillierungen.
Entscheidend für den Einsatz der neuen, gentechnisch verän¬ derten Stärken sind zum einen die Struktur, Wassergehalt, Proteingehalt, Lipidgehalt, Fasergehalt,
Asche/Phosphatgehalt, Amylose/Amylopektinverhältnis, Molmas¬ senverteilung, Verzweigungsgrad, Korngröße und -form sowie Kristallinität, zum anderen auch die Eigenschaften, die in folgende Merkmale münden: Fließ- und Sorptionsverhalten, Verkleisterungstemperatur, Viskosität, Dickungsleistung, Löslichkeit, Kleisterstruktur und -transparenz, Hitze-, Scher- und Säurestabilität, Retrogradationsneigung, Gelbil- düng, Gefrier/Taustabilität, Komplexbildung, Jodbindung, Filmbildung, Klebekraft, Enzymstabilität, Verdaulichkeit und Reaktivität.
Die Erzeugung modifizierter Stärken mittels gentechnischer Eingriffe in einer transgenen Pflanze kann zum einen die Eigenschaften der aus der Pflanze gewonnenen Stärke dahinge¬ hend verändern, daß weitere Modifikationen mittels chemi¬ scher oder physikalischer Verfahren nicht mehr notwendig er¬ scheinen. Zum anderen können die durch gentechnische Verfah¬ ren veränderte Stärken weiteren chemischen Modifikationen unterworfen werden, was zu weiteren Verbesserungen der Qua¬ lität für bestimmte der oben beschriebenen Einsatzgebiete führt. Diese chemischen Modifikationen sind grundsätzlich bekannt. Insbesondere handelt es sich dabei um Modifikatio¬ nen durch
- Hitzebehandlung,
- Säurebehandlung,
- Oxidation und
- Veresterungen,
welche zur Entstehung von Phosphat-, Nitrat-, Sulfat-, Xanthat-, Acetat- und Citratstärken führen. Weitere organi¬ sche Säuren können ebenfalls zur Veresterung eingesetzt wer¬ den:
- Erzeugung von Stärkeethern Stärke-Alkylether, O-Allylether, Hydroxylalkylether, O-Carboxylmethylether, N-haltige Stärkeether, P-haltige Stärkeether, S-haltige Stärkeether
- Erzeugung von vernetzten Stärken
- Erzeugung von Stärke-Pfropf-Polymerisaten
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können prinzipi¬ ell ferner auch dazu verwendet werden, Pflanzen herzustel- len, bei denen die Aktivität des erfindungsgemäßen Debranching-Enzyms erhöht oder verringert ist und gleichzei¬ tig die Aktivitäten anderer, an der Stärkebiosynthese betei¬ ligter Enzyme verändert sind. Dabei sind alle Kombinationen und Permutationen denkbar. Beispielsweise können Nucleinsäu¬ remoleküle, die ein erfindungsgemäßes Protein codieren oder entsprechende antisense-Konstrukte, in Pflanzenzellen einge¬ bracht werden, bei denen bereits die Synthese endogener GBSS I-, SSS I-, II- oder GBSS II-Proteine oder des su-Gens auf¬ grund eines antisense-Effektes oder einer Mutation inhibiert ist oder die Synthese des Verzweigungsenzyms inhibiert ist (wie z.B. beschrieben in W092/14827 oder der ae-Mutante (Shannon und Garwood, in Whistler, BeMiller und Paschall, Starch: Chemistry and Technology, Academic Press, London, 2nd Edition (1984) , 25-86)) .
Soll die Inhibierung der Synthese mehrerer Debranching- Enzyme in transformierten Pflanzen erreicht werden, so kön¬ nen DNA-Moleküle zur Transformation verwendet werden, die gleichzeitig mehrere, die entsprechenden Debranching-Enzyme codierenden Regionen in antisense-Orientierung unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors enthalten, oder die eine entsprechende Cosuppressions-RNA oder ein entsprechen¬ des Ribozym codieren. Hierbei kann alternativ jede Sequenz unter der Kontrolle eines eigenen Promotors stehen, oder die Sequenzen können als Fusion von einem gemeinsamen Promotor transkribiert werden. Letztere Alternative wird in der Regel vorzuziehen sein, da in diesem Fall die Synthese der ent¬ sprechenden Proteine in etwa gleichem Maße inhibiert werden sollte.
Weiterhin ist die Konstruktion von DNA-Molekülen möglich, die neben DNA-Sequenzen, die Debranching-Enzyme codieren, weitere DNA-Sequenzen enthalten, die andere an der Stärke¬ synthese oder -modifikation beteiligte Proteine codieren. Diese können eine antisense-RNA, ein entsprechendes Ribozym oder eine Cosuppressions-RNA codieren. Die Sequenzen können hierbei wiederum entweder hintereinandergeschaltet sein und von einem gemeinsamen Promotor transkribiert werden oder aber jeweils von einem eigenen Promotor. Eine obere Grenze für die Anzahl der in einem derartigen DNA-Molekül von einem Promotor aus transkribierten antisense-Fragmente gibt es nicht. Das entstehende Transkript sollte aber in der Regel eine Länge von nicht mehr als 20 kb, vorzugsweise von nicht mehr als 5 kb haben.
Codierende Regionen, die in derartigen DNA-Molekülen in Kom¬ bination mit anderen codierenden Regionen hinter einem ge¬ eigneten Promotor lokalisiert sind, können aus DNA-Sequenzen stammen, die folgende Proteine codieren: Stärkekorn-gebun¬ dene (GBSS I und II) und lösliche Stärkesynthasen (z.B. SSS I und II) , Verzweigungsenzyme, Disproportionierungsenzyme und Stärkephosphorylasen. Dies ist nur eine beispielhafte Aufzählung. Auch die Verwendung anderer DNA-Sequenzen im Rahmen einer derartigen Kombination ist denkbar. Mit Hilfe derartiger Konstrukte ist es möglich, in Pflanzen¬ zellen, die mit diesen transformiert wurde, die Synthese mehrerer Enzyme gleichzeitig zu inhibieren.
Weiterhin können die Konstrukte in klassische Mutanten ein¬ gebracht werden, die für ein oder mehrere Gene der Stärke- biosynthese defekt sind (Shannon und Garwood, siehe oben) . Diese Defekte können sich z.B. auf folgende Proteine bezie¬ hen: Stärkekorn-gebundene (GBSS I und II) und lösliche Stär¬ kesynthasen (z.B. SSS I und II) , Verzweigungsenzyme (BE I und II) , "Debranching" -Enzyme (su-Locus) , Disproportionie¬ rungsenzyme und Stärkephosphorylasen. Dies ist wiederum nur eine beispielhafte Aufzählung.
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen stehen eine große Anzahl von Clonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E.coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen ent¬ halten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC- Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw.. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation von E.coli-Zellen verwendet. Transformierte E.coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wieder¬ gewonnen. Als Analysemethode zur Charakterisierung der ge¬ wonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsana¬ lysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-molekular¬ biologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid- DNA-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden clo- niert werden.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Tranεformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzen¬ zellen werden an sich keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z.B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus der¬ artig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert wer¬ den, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig.
Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzen¬ zelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z.B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begren¬ zung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführen¬ den Genen verbunden werden.
Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Plasmide cloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können auf¬ grund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plas¬ mid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Re- gion. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der interme¬ diäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation) . Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selek- tionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al. Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187) . Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzli¬ che T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.
Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflan¬ zenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offset- drukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al. , Crit. Rev. Plant. Sei., 4, 1-46 und An et al. EMBO J. 4 (1985) , 277-287 beschrieben worden.
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflan- zen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert wer¬ den. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z.B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Sus- pensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Se¬ lektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen kön¬ nen dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden. Andere Möglichkeiten der Einführung fremder DNA un¬ ter Verwendung des biolistischen Verfahrens oder durch Pro- toplastentransformation sind bekannt (vgl. z.B. Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi¬ Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds . ) , Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge) .
Während die Transformation dikotyler Pflanzen über Ti-Plas- mid-Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens wohl etabliert ist, weisen neuere Arbeiten darauf hin, daß auch monokotyle Pflanzen der Transformation mittels Agrobac¬ terium basierender Vektoren sehr wohl zugänglich sind (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993) , 491-506; Hiei et al. , Plant J. 6 (1994) , 271-282, Deng et al . , Science in China 33 (1990) , 28-34; Wilmink et al, Plant Cell Reports 11 (1992) , 76-80; May et al. , Bio/Technology 13 (1995) , 486-492; Conner und Domisse; Int. J. Plant Sei. 153 (1992) , 550-555; Ritchie et al., Transgenic Res. 2 (1993) , 252-265) .
Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes (Wan und Lemaux, Plant Physiol. 104 (1994) , 37-48; Vasil et al., Bio/Technology 11 (1993) , 1553-1558; Ritala et al., Plant Mol. Biol. 24 (1994), 317-325; Spencer et al. , Theor. Appl . Genet. 79 (1990) , 625-631) , die Protoplasten- transformation, die Elektroporation von partiell permeabili- εierten Zellen, die Einbringung von DNA mittels Glasfasern. Spezifisch die Transformation von Mais wird in der Literatur verschiedentlich beschrieben (vgl. z.B. WO95/06128, EP 0 513 849; EP 0 465 875; Fromm et al . , Biotechnology 8 (1990) , 833-844; Gordon-Kamm et al. , Plant Cell 2 (1990), 603-618; Koziel et al . , Biotechnology 11 (1993) , 194-200) . In EP 292 435 wird ein Verfahren beschrieben, mit Hilfe des¬ sen, ausgehend von einem schleimlosen, weichen (friable) granulösen Mais-Kallus, fertile Pflanzen erhalten werden können. Shillito et al . (Bio/Technology 7 (1989) , 581) haben in diesem Zusammenhang beobachtet, daß es ferner für die Re- generierbarkeit zu fertilen Pflanzen notwendig ist, von Kal- lus-Suspensionskulturen auszugehen, aus denen eine sich tei¬ lende Protoplastenkultur, mit der Fähigkeit zu Pflanzen zu regenerieren, herstellbar ist. Nach einer in vitro Kultivie- rungszeit von 7 bis 8 Monaten erhalten Shillito et al . Pflanzen mit lebensfähigen Nachkommen, die jedoch Abnormali- täten in der Morphologie und der Reproduktivität aufweisen. Prioli und Söndahl (Bio/Technology 7 (1989) , 589) beschrei¬ ben die Regeneration und die Gewinnung fertiler Pflanzen aus Mais-Protoplasten der Cateto Mais-Inzuchtlinie Cat 100-1. Die Autoren vermuten, daß die Protoplasten-Regeneration zu fertilen Pflanzen abhängig ist von einer Anzahl verschiede¬ ner Faktoren, wie z.B. von Genotyp, vom physiologischen Zu¬ stand der Donor-Zellen und von den Kultivierungsbedingungen. Auch die erfolgreiche Transformation anderer Getreidearten wurde bereits beschrieben, z.B. für Gerste (Wan und Lemaux, s.o.; Ritala et al. , s.o.) und für Weizen (Nehra et al. , Plant J. 5 (1994) , 285-297) .
Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektions- marker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz ge¬ genüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin u.a. ver¬ mittelt. Der individuelle gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten.
Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al . , Plant Cell Reports 5 (1986) , 81-84) . Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypisehen Eigenschaften. Von den Pflanzenzellen können Samen gewonnen werden. Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der erfindungs¬ gemäßen Nucleinsäuremoleküle zur Herstellung von Pflanzen, die eine Amylopektinstarke mit einem veränderten Verzwei¬ gungsgrad im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen synthetisieren.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder Teile dieser Moleküle bzw. der reversen Komplemente dieser Moleküle zur Identifizierung und Isolierung homologer Mole¬ küle, die Proteine mit der enzymatischen Aktivität eines De¬ branching-Enzyms codieren oder Fragmente derartiger Pro¬ teine, aus Pflanzen oder anderen Organismen. Für die Defini¬ tion des Begriffs "Homologie" siehe oben.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Verwendete Medien und Lösungen
Protoplastenisolierungsmedium (100 ml)
Cellulase Onozuka R S (Meiji Seika, Japan) 800 mg Pectolyase Y 23 40 mg
KN03 200 mg
KH2P04 136 mg K2HP04 47 mg
CaCl2 2H20 147 mg
MgS04 7H20 250 mg Bovine serum albumin (BSA) 20 mg
Glucose 4000 mg
Fructose 4000 mg
Saccharose 1000 mg pH 5,8
Osmolarität 660 mosm.
Protoplastenwaschlösung 1: wie Protoplastenisolierlösung, aber ohne Cellulase, Pectolyase und BSA Transformationspuffer
a) Glucose 0,5 M
MES 0,1 %
MgCl2 6H20 25 mM pH 5,8 auf 600 mosm. einstellen
b) PEG 6000-Lösung
Glucose 0,5 M
MgCl2 6H20 100 mM
Hepes 20 mM
PH 6,5
Dem obigen Puffer unter b) wird PEG 6000 kurz vor Gebrauch der Lösung zugesetzt (40 Gew.-% PEG) . Die Lösung wird durch ein 0,45 μm Sterilfilter filtriert.
W5 Lösung
CaCl2 125 mM
NaCl 150 mM
KCl 5 mM
Glucose 50 mM
Protoplasten-Kulturmedium (Angaben in mg/1)
KN03 3000
(NH4)2S04 500
MgS04 7H20 350
KH2P04 400
CaCl2 2H20 300
Fe-EDTA und Spurenelemente wie im Murashige-Skoog-Medium
(Physiol. Plant 15 (1962) , 473) . m-Inosit 100
Thiamin HCI 1,0
Nicotinsäureamid 0,5
Pyridoxin HCI 0,5
Glycin 2,0
Glucuronsäure 750
Galacturonsäure 750
Galactose 500
Maltose 500
Glucose 36.000
Fructose 36.000
Saccharose 30.000
Asparagin 500
Glutamin 100
Prolin 300
Caseinhydrolysat 500
2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2, 4-D) 0,5 pH 5,8
Osmolarität 600 mosm.
20 x SSC 175,3 g NaCl
88,2 g Natrium-Citrat ad 1000 ml mit ddH20 pH 7, 0 mit 10 N NaOH
In den Beispielen werden die folgenden Methoden verwendet
Clonierungsverfahren
Zur Clonierung in E.coli wurde der Vektor pBluescript II SK (Stratagene) verwendet. 2 . Bakterienstämme
Für den Bluescript-Vektor und für die pUSP-Konstrukte wurde der E.coli-Stamm DH5α (Bethesda Research Laborato¬ ries, Gaithersburgh, USA) verwendet. Für die in vivo excision wurde der E.coli-Stamm XLl-Blue verwendet.
3. Transformation von Mais
(a) Herstellung von Protoplasten der Zellinie DSM 6009
Protoplastenisolierung
2 - 4 Tage, vorzugsweise 3 Tage nach dem letzten Me¬ diumswechsel einer Protoplastensuspensionskultur wird das Flüssigmedium abgesaugt und die zurückblei¬ benden Zellen mit 50 ml Protoplastenwaschlösung 1 gespült und nochmals trockengesaugt. Zu jeweils 2 g der geernteten Zellmasse wird 10 ml Protoplasteniso- lierungsmedium gegeben. Die resuspendierten Zellen und Zellaggregate werden bei 27 ± 2° C unter leich¬ tem Schütteln (30 bis 40 rpm) 4 bis 6 h im Dunkeln inkubiert .
Protoplastenreinigung
Sobald die Freisetzung von mindestens 1 Mio. Proto¬ plasten/ml erfolgt ist (mikroskopische Beobachtung) , wird die Suspension durch ein Edelstahl- und Nylon¬ sieb von 200 bzw. 45 μm Maschenwerte gesiebt. Die Kombination eines 100 μm und eines 60 μm Siebs er¬ möglicht die Abtrennung der Zellaggregate genauso gut. Das protoplastenhaltige Filtrat wird mikrosko¬ pisch beurteilt. Üblicherweise enthält es 98 - 99 % Protoplasten. Der Rest sind unverdaute Einzelzellen. Protoplastenpräparationen mit diesem Reinheitsgrad werden ohne zusätzliche Gradientenzentrifugation für Transformationsexperimente verwendet. Durch Zentri- fugation (100 UpM im Aufschwingrotor (100 x g, 3 min) werden die Protoplasten sedimentiert . Der Über¬ stand wird verworfen und die Protoplasten in Wasch¬ lösung 1 resuspendiert. Die Zentrifugation wird wie¬ derholt und die Protoplasten danach im Transformati¬ onspuffer resuspendiert.
(b) Protoplastentransformation
Die in Tranformationspuffer resuspendierten Proto¬ plasten werden bei einem Titer von 0,5 - 1 x lo6 Protoplasten/ml in 10 ml Portionen in 50 ml Poly- aHomer-Röhrchen eingefüllt. Die zur Transformation verwendete DNA wird in Tris-EDTA (TE) Puffer gelöst. Pro ml Protoplastensuspension werden 20 μg Plasmid- DNA zugegeben. Als Vektor wird dabei ein Phosphino- tricinresistenz vermittelndes Plasmid verwendet (vgl. z.B. EP 0 513 849) . Nach der DNA-Zugabe wird die Protoplastensuspension vorsichtig geschüttelt, um die DNA homogen in der Lösung zu verteilen. So¬ fort danach wird tropfenweise 5 ml PEG-Lösung zuge¬ tropft .
Durch vorsichtiges Schwenken der Röhrchen wird die PEG-Lösung homogen verteilt. Danach werden nochmals 5 ml PEG-Lösung zugegeben und das homogene Durchmi¬ schen wiederholt. Die Protoplasten verbleiben 20 min der PEG-Lösung bei ± 2° C. Danach werden die Proto¬ plasten durch 3-minütiges Zentrifugieren (100 g; 1000 Upm) sedimentiert. Der Überstand wird verwor¬ fen. Die Protoplasten werden durch vorsichtiges Schütteln in 20 ml W5-Lösung gewaεchen und danach erneut zentrifugiert . Danach werden sie in 20 ml Protoplastenkulturmedium resuspendiert, nochmals zentrifugiert und erneut in Kulturmedium resuspen¬ diert. Der Titer wird auf 6 - 8 x 105 Protopla¬ sten/ml eingestellt und die Protoplasten in 3 ml Portionen in Petrischalen (Φ 60 mm, Höhe 15 mm) kul- tiviert. Die mit Parafilm versiegelten Petrischalen werden bei 25 ± 2° C im Dunkeln aufgestellt.
(c) Protoplastenkultur
Während der ersten 2 - 3 Wochen nach der Protopla- stenisolierung und -transformation werden die Proto¬ plasten ohne Zugabe von frischem Medium kultiviert. Sobald sich die aus den Protoplasten regenerierten Zellen zu Zellaggregaten mit mehr als 20 - 50 Zellen entwickelt haben, wird 1 ml frisches Protoplasten- kulturmedium zugegeben, das als Osmoticum Saccharose (90 g/1) enthält.
(d) Selektion transformierter Maiszellen und Pflanzenre¬ generation
3 - 10 Tage nach der Zugabe von frischem Medium kön¬ nen die aus Protoplasten entstandenen Zellaggregate auf Agar-Medien mit 100 mg/1 L-Phosphinothricin plattiert werden. N6-Medium mit den Vitaminen des Protoplastenkulturmediums, 90 g/1 Saccharose und 1,0 mg/1 2,4D ist ebenso geeignet wie ein analoges Me¬ dium beispielsweise mit den Makro- und Mikronährsal¬ zen des MS-Mediums (Murashige und Skoog (1962) , siehe oben) .
Auf dem Selektivmedium können die aus stabil trans¬ formierten Protoplasten hervorgegangenen Kalli unge¬ hindert weiterwachsen. Nach 3 - 5 Wochen, vorzugs¬ weise 4 Wochen können die transgenen Kalli auf fri¬ sches Selektionsmedium transferiert werden, welches ebenfalls 100 mg/1 L-Phosphinothricin enthält, das aber kein Auxin mehr enthält . Innerhalb von 3 - 5 Wochen differenzieren ca. 50 % der transgenen Mais- kalli, die das L-Phosphinothricinacetyltransferase- Gen in ihr Genom integriert haben, auf diesem Medium in Gegenwart von L-Phosphinothricin erste Pflanzen. (e) Aufzucht transgener Regeneratpflanzen
Das embryogene transformierte Maisgewebe wird auf hormonfreiem N6-Medium (Chu CC. et al., Sei. Sin. 16 (1975) , 659) in Gegenwart von 5xl0~4 M L-Phosphi¬ nothricin kultiviert. Auf diesem Medium entwickeln sich Maisembryonen, die das Phsphinothricinacetyl- transferase-Gen (PAT-Gen) hinreichend stark expri- mieren, zu Pflanzen. Nicht transformierte Embryonen oder solche mit nur sehr schwacher PAT-Aktivität sterben ab. Sobald die Blätter der in vitro-Pflanzen eine Länge von 4 - 6 mm erreicht haben, können diese in Erde transferiert werden. Nach Abwaschen von Agarresten an den Wurzeln werden die Pflanzen in ein Gemisch von Lehm, Sand, Vermiculit und Einheitserde im Verhältnis 3:1:1:1 gepflanzt und während der er¬ sten 3 Tage nach dem Verpflanzen bei 90 - 100 % re¬ lativer Luftfeuchte an die Erdkultur adaptiert. Die Anzucht erfolgt in einer Klimakammer mit 14 h Licht- periode ca. 25000 Lux in Pflanzenhöhe bei einer Tag/Nachttemperatur von 23 ± 1/17 ± 1° C. Die adap¬ tierten Pflanzen werden bei einer Luftfeuchte von 65 ± 5 % kultiviert.
4. Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten
Die radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten wurde mit Hilfe eines DNA-Random Primer Labelling Kits der Firma Boehringer (Deutschland) nach den Angaben des Herstel¬ lers durchgeführt. Beispiel 1
Clonierung einer cDNA, die ein neues Debranching-Enzym aus
Zea mays codiert
Zur Isolierung von cDNA-Molekülen, die ein Debranching-Enzym aus Mais codieren, wurde eine cDNA-Bibliothek ausgehend von polyA+-RNA aus Maisblättern in dem Vektor Lambda ZAPII (Stratagene) erstellt und in Phagenköpfe verpackt. E. coli- Zellen des Stammes XLl-Blue wurden anschließend mit den die cDNA-Fragmente enthaltenden Phagen infiziert (1 x 106 pfu) und auf Medium in Petrischalen in einer Dichte von ca. 30.000 pro 75 cm2 ausplattiert. Nach ca. 8 stündiger Inkuba¬ tion wurden Nitrozellulosemembranen auf den lysierten Bakte¬ rienrasen aufgelegt, die nach einer Minute abgenommen wur¬ den. Die Filter wurden für 2 min in 0,2 M NaOH; 1,5 M NaCl, dann für 2 min in 0,4 M Tris/HCl pH 7,5 und anschließend für 2 min in 2 x SSC inkubiert. Nach Trocknung und Fixierung der DNA durch UV-Crosslinking wurden die Filter 3 h lang in Hy- bridisierungspuffer bei 42°C inkubiert, bevor radioaktiv markierte Probe zugesetzt wurde.
Als Probe wurde eine cDNA aus Kartoffel verwendet, die ein Debranching-Enzym aus Kartoffel codiert (siehe Seq ID No. 3) . Diese war zuvor mit Hilfe degenerierter Oligonucleotide isoliert worden, die von der partiellen Aminosäuresequenz eines Debranching-Enzyms aus Kartoffel abgeleitet worden wa¬ ren.
Die Hybridisierung wurde bei 48°C durchgeführt in 2 x SSC, 10 x Dehnhardts-Lösung; 50 mM Na2HP04, pH 7,2; 0,2 % SDS; 5 mM EDTA und 250 μg/ml denaturierte Heringssperma-DNA. Hybridisierende Phagenclone wurden unter Anwendung von Standardverfahren vereinzelt und weiter gereinigt . Mit Hilfe der in-vivo-excision Methode wurden von positiven Phagenclo- nen E. coli-Clone gewonnen, die ein doppelsträngiges pBluescript-Plasmid mit der jeweiligen cDNA-Insertion ent¬ halten. Nach Überprüfung der Größe und des Restriktionsmu¬ sters der Insertion wurde von geeigneten Clonen Plasmid-DNA isoliert. Ein derart isoliertes Plasmid, pREM-53, besaß eine Insertion von 1195 bp.
Beispiel 2
Sequenzanalyse der cDNA-Insertion des Plasmids pREM-53
Bei dem entsprechend Beispiel 1 isolierten Plasmids pREM-53 wurde die Nucleotidsequenz der cDNA-Insertion durch Standardverfahren mittels der Didesoxymethode (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) , 5463-5467) be¬ stimmt. Die Insertion ist 1995 bp lang und die Nucleotidse¬ quenz sowie die abgeleitete Aminosäuresequenz ist in Seq ID No. 1 angegeben.
Homologievergleiche ergaben, daß es sich bei dem codierten Protein um ein neues Debranching-Enzym aus Mais handelt.
Die unter Seq ID No. 1 angegebene Nucleotidsequenz repräsen¬ tiert eine partielle cDNA, die ein bisher unbekanntes Debranching-Enzym aus Mais codiert. Mit Hilfe dieser Sequenz ist es möglich mittels konventioneller Methoden eine voll¬ ständige cDNA-Sequenz oder eine genomische Sequenz aus ge¬ eigneten cDNA- oder genomischen Bibliotheken zu isolieren.
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN: (i) ANMELDER:
(A) NAME: PlantTec Biotechnologie GmbH Forschung & Entwicklung
(B) STRASSE: Hermannswerder 14
(C) ORT: Potsdam
(E) LAND: Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: 14473
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Nucleinsaeuremolekuele, codierend Debranching-Enzyme aus Mais
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 4
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1993 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu mRNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Zea mays (F) GEWEBETYP: Blattgewebe
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE:1..1675
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
GGC ACG AGG TCA AAA CTC CCT CCA GGG TCA GAT TTG CAA CAA GCT GCA 48 Gly Thr Arg Ser Lys Leu Pro Pro Gly Ser Asp Leu Gin Gin Ala Ala 1 5 10 15
ATT GTG GCT ATT CAG GAA GAG GAC CCT TAT AAT TGG GGG TAT AAC CCT 96 Ile Val Ala Ile Gin Glu Glu Asp Pro Tyr Asn Trp Gly Tyr Asn Pro 20 25 30
GTG GTT TGG GGC GTT CCA AAA GGA AGC TAT GCA AGT AAC CCA GAT GGT 144 Val Val Trp Gly Val Pro Lys Gly Ser Tyr Ala Ser Asn Pro Asp Gly 35 40 45
CCA AGT CGT ATC ATT GAG TAC CGG CTG ATG GTG CAG GCC TTG AAT CGC 192 Pro Ser Arg Ile Ile Glu Tyr Arg Leu Met Val Gin Ala Leu Asn Arg 50 55 60
TTA GGT CTT CGA GTT GTC ATG GAT GTT GTA TAC AAT CAT CTA TAC TCA 240 Leu Gly Leu Arg Val Val Met Asp Val Val Tyr Asn His Leu Tyr Ser 65 70 75 80
AGT GGC CCT TTT GCC ATC ACT TCC GTG CTT GAC AAG ATT GTA CCT GGA 288 Ser Gly Pro Phe Ala Ile Thr Ser Val Leu Asp Lys Ile Val Pro Gly 85 90 95
TAC TAC CTC AGA AGG GAC TCT AAT GGT CAG ACT GAG AAC AGC GCG GCT 336 Tyr Tyr Leu Arg Arg Asp Ser Asn Gly Gin Thr Glu Asn Ser Ala Ala 100 105 110
GTG AAC AAT ACA GCA AGT GAG CAT TTC ATG GTT GAT AGA TTA ATC GTG 384 Val Asn Asn Thr Ala Ser Glu His Phe Met Val Asp Arg Leu Ile Val 115 120 125
GAT GAC CTT CTG AAT TGG GCA GTA AAT TAC AAA GTT GAC GGG TTC AGA 432 Asp Asp Leu Leu Asn Trp Ala Val Asn Tyr Lys Val Asp Gly Phe Arg 130 135 140
TTT GAT CTA ATG GGA CAT ATC ATG AAA AAG ACA ATG ATT AGA GCA AAA 480 Phe Asp Leu Met Gly His Ile Met Lys Lys Thr Met Ile Arg Ala Lys 145 150 155 160
TCG GCT CTT CAA AGC CTT ACA ATT GAT GAA CAT GGA GTA GAT GGT TCA 528 Ser Ala Leu Gin Ser Leu Thr Ile Asp Glu His Gly Val Asp Gly Ser 165 170 175
AAG ATA TAC TTG TAT GGT GAA GGA TGG AAC TTC GGT GAA GTT GCG GAA 576 Lys Ile Tyr Leu Tyr Gly Glu Gly Trp Asn Phe Gly Glu Val Ala Glu 180 185 190
AAT CAA CGT GGG ATA AAT GGA TCC CAG CTA AAT ATG AGT GGC ACT GGG 624 Asn Gin Arg Gly Ile Asn Gly Ser Gin Leu Asn Met Ser Gly Thr Gly 195 200 205
ATT GGT AGT TTC AAC GAT AGA ATC CGT GAT GCT ATA AAT GGT GGC AGT 672 Ile Gly Ser Phe Asn Asp Arg Ile Arg Asp Ala Ile Asn Gly Gly Ser 210 215 220
CCG TTT GGG AAT CCA CTG CAA CAA GGT TTC TCT ACT GGA TTG TTC TTA 720 Pro Phe Gly Asn Pro Leu Gin Gin Gly Phe Ser Thr Gly Leu Phe Leu 225 230 235 240 GAG CCA AAT GGA TTT TAT CAG GGC AAT GAA ACA GAG ACA AGG CTC ACG 768 Glu Pro Asn Gly Phe Tyr Gin Gly Asn Glu Thr Glu Thr Arg Leu Thr 245 250 255
CTT GCT ACA TAC GCT GAC CAT ATA CAG ATT GGA TTA GCT GGC AAT TTG 816 Leu Ala Thr Tyr Ala Asp His Ile Gin Ile Gly Leu Ala Gly Asn Leu 260 265 270
AAG GAC TAT GTA GTT ATA TCT CAT ACT GGA GAA GCT AGA AAA GGA TCT 864 Lys Asp Tyr Val Val Ile Ser His Thr Gly Glu Ala Arg Lys Gly Ser 275 280 285
GAA ATT CGC ACC TTC GAT GGC TCA CCA GTT GGC TAT GCT TCA TCC CCT 912 Glu Ile Arg Thr Phe Asp Gly Ser Pro Val Gly Tyr Ala Ser Ser Pro 290 295 300
ATA GAA ACA ATA AAC TAC GCC TCT GCT CAT GAC AAT GAA ACA CTA TTT 960 Ile Glu Thr Ile Asn Tyr Ala Ser Ala His Asp Asn Glu Thr Leu Phe 305 310 315 320
GAT ATT ATT AGT CTA AAG ACT CCG ATG GAC CTC TCA ATT GAC GAG CGA 1008 Asp Ile Ile Ser Leu Lys Thr Pro Met Asp Leu Ser Ile Asp Glu Arg 325 330 335
TGC AGG ATA AAT CAT TTG TCC ACA AGC ATG ATT GCA TTA TCC CAG GGA 1056 Cys Arg Ile Asn His Leu Ser Thr Ser Met Ile Ala Leu Ser Gin Gly 340 345 350
ATA CCA TTT TTT CAT GCT GGT GAT GAG ATA CTA CGA TCT AAG TCG CTT 1104 Ile Pro Phe Phe His Ala Gly Asp Glu Ile Leu Arg Ser Lys Ser Leu 355 360 365
GAT CGA GAT TCA TAT GAC TCT GGT GAT TGG TTT AAC AAG ATT GAT TTT 1152 Asp Arg Asp Ser Tyr Asp Ser Gly Asp Trp Phe Asn Lys Ile Asp Phe 370 375 380
ACC TAT GAA ACA AAC AAT TGG GGT GTT GGG CTT CCA CCA AGA GAA AAG 1200 Thr Tyr Glu Thr Asn Asn Trp Gly Val Gly Leu Pro Pro Arg Glu Lys 385 390 395 400
AAC GAA GGG AGC TGG CCT TTG ATG AAG CCA AGA TTG GAG AAC CCG TCG 1248 Asn Glu Gly Ser Trp Pro Leu Met Lys Pro Arg Leu Glu Asn Pro Ser 405 410 415
TTC AAA CCT GCA AAA CAT GAC ATT ATT GCT GCC TTA GAC AAA TTT ATT 1296 Phe Lys Pro Ala Lys His Asp Ile Ile Ala Ala Leu Asp Lys Phe Ile 420 425 430
GAT ATC CTC AAG ATC AGA TAC TCA TCA CCT CTC TTT CGC CTA ACT ACA 1344 Asp Ile Leu Lys Ile Arg Tyr Ser Ser Pro Leu Phe Arg Leu Thr Thr 435 440 445
GCA AGT GAT ATT GTG CAA AGG GTT CAC TTT CAC AAC ACA GGG CCC TCC 1392 Ala Ser Asp Ile Val Gin Arg Val His Phe His Asn Thr Gly Pro Ser 450 455 460
TTG GTT CCA GGA GTT ATT GTC ATG AGC ATC GAA GAT GCA CGA AAT GAT 1440 Leu Val Pro Gly Val Ile Val Met Ser Ile Glu Asp Ala Arg Asn Asp 465 470 475 480
AGG CAT GAT ATG GCC CAG ATA GAT GAA ACA TTC TCT TGT GTC GTT ACA 1488 Arg His Asp Met Ala Gin Ile Asp Glu Thr Phe Ser Cys Val Val Thr 485 490 495
GTC TTC AAT GTA TGT CCG TAC GAA GTG TCT ATA GAA ATC CCT GAT CTT 1536 Val Phe Asn Val Cys Pro Tyr Glu Val Ser Ile Glu Ile Pro Asp Leu 500 505 510
GCA TCA CTG CGG CTT CAG TTG CAT CCA GTG CAG GTG AAT TCA TCG GAT 1584 Ala Ser Leu Arg Leu Gin Leu His Pro Val Gin Val Asn Ser Ser Asp 515 520 525
GCG TTA GCC AGG CAG TCT GCG TAC GAC ACC GCC ACA GGT CGA TTC ACC 1632 Ala Leu Ala Arg Gin Ser Ala Tyr Asp Thr Ala Thr Gly Arg Phe Thr 530 535 540
GTG CCG AAA AGG ACA GCA GCA GTG TTC GTG GAA CCC AGG TGC T 1675
Val Pro Lys Arg Thr Ala Ala Val Phe Val Glu Pro Arg Cys 545 550 555
GATGGATGCC TTTCGCTAGC GAGCAAGTGC ATTCGGCATC CAAGTCGAAG CAAACGAATG 1735
AAATAAGAGA AGGCCATCGA ATAAAACGAA GTATATAAAT AGATTGAATA AGACGTTGCC 1795
CAAGTTGCCA AGGCACGCTT TGCCATATGT ATGCGTTGAA AAATAAATAA ATAAATAAAT 1855
AAATGATGTT ATAGAGGTAC AAAAGCATTG GAACATTTCT TTATAGAGGT GAACCACCCT 1915
ATTTTCCAGT TTCCATGTGT GAATTGTGAT TAGCATATGT ATGGAATAAT AATATAAATT 1975
AATTTTATGC AAAAAAAA 1993
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 558 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
Gly Thr Arg Ser Lys Leu Pro Pro Gly Ser Asp Leu Gin Gin Ala Ala 1 5 10 15
Ile Val Ala Ile Gin Glu Glu Asp Pro Tyr Asn Trp Gly Tyr Asn Pro 20 25 30 Val Val Trp Gly Val Pro Lys Gly Ser Tyr Ala Ser Asn Pro Asp Gly 35 40 45
Pro Ser Arg Ile Ile Glu Tyr Arg Leu Met Val Gin Ala Leu Asn Arg 50 55 60
Leu Gly Leu Arg Val Val Met Asp Val Val Tyr Asn His Leu Tyr Ser 65 70 75 80
Ser Gly Pro Phe Ala Ile Thr Ser Val Leu Asp Lys Ile Val Pro Gly 85 90 95
Tyr Tyr Leu Arg Arg Asp Ser Asn Gly Gin Thr Glu Asn Ser Ala Ala 100 105 110
Val Asn Asn Thr Ala Ser Glu His Phe Met Val Asp Arg Leu Ile Val 115 120 125
Asp Asp Leu Leu Asn Trp Ala Val Asn Tyr Lys Val Asp Gly Phe Arg
130 135 140
Phe Asp Leu Met Gly His Ile Met Lys Lys Thr Met Ile Arg Ala Lys 145 150 155 160
Ser Ala Leu Gin Ser Leu Thr Ile Asp Glu His Gly Val Asp Gly Ser 165 170 175
Lys Ile Tyr Leu Tyr Gly Glu Gly Trp Asn Phe Gly Glu Val Ala Glu 180 185 190
Asn Gin Arg Gly Ile Asn Gly Ser Gin Leu Asn Met Ser Gly Thr Gly 195 200 205
Ile Gly Ser Phe Asn Asp Arg Ile Arg Asp Ala Ile Asn Gly Gly Ser 210 215 220
Pro Phe Gly Asn Pro Leu Gin Gin Gly Phe Ser Thr Gly Leu Phe Leu 225 230 235 240
Glu Pro Asn Gly Phe Tyr Gin Gly Asn Glu Thr Glu Thr Arg Leu Thr 245 250 255
Leu Ala Thr Tyr Ala Asp His Ile Gin Ile Gly Leu Ala Gly Asn Leu 260 265 270
Lys Asp Tyr Val Val Ile Ser His Thr Gly Glu Ala Arg Lys Gly Ser 275 280 285
Glu Ile Arg Thr Phe Asp Gly Ser Pro Val Gly Tyr Ala Ser Ser Pro 290 295 300
Ile Glu Thr Ile Asn Tyr Ala Ser Ala His Asp Asn Glu Thr Leu Phe 305 310 315 320 Asp Ile Ile Ser Leu Lys Thr Pro Met Asp Leu Ser Ile Asp Glu Arg 325 330 335
Cys Arg Ile Asn His Leu Ser Thr Ser Met Ile Ala Leu Ser Gin Gly 340 345 350
Ile Pro Phe Phe His Ala Gly Asp Glu Ile Leu Arg Ser Lys Ser Leu 355 360 365
Asp Arg Asp Ser Tyr Asp Ser Gly Asp Trp Phe Asn Lys Ile Asp Phe 370 375 380
Thr Tyr Glu Thr Asn Asn Trp Gly Val Gly Leu Pro Pro Arg Glu Lys 385 390 395 400
Asn Glu Gly Ser Trp Pro Leu Met Lys Pro Arg Leu Glu Asn Pro Ser 405 410 415
Phe Lys Pro Ala Lys His Asp Ile Ile Ala Ala Leu Asp Lys Phe Ile 420 425 430
Asp Ile Leu Lys Ile Arg Tyr Ser Ser Pro Leu Phe Arg Leu Thr Thr 435 440 445
Ala Ser Asp Ile Val Gin Arg Val His Phe His Asn Thr Gly Pro Ser 450 455 460
Leu Val Pro Gly Val Ile Val Met Ser Ile Glu Asp Ala Arg Asn Asp 465 470 475 480
Arg His Asp Met Ala Gin Ile Asp Glu Thr Phe Ser Cys Val Val Thr 485 490 495
Val Phe Asn Val Cys Pro Tyr Glu Val Ser Ile Glu Ile Pro Asp Leu 500 505 510
Ala Ser Leu Arg Leu Gin Leu His Pro Val Gin Val Asn Ser Ser Asp 515 520 525
Ala Leu Ala Arg Gin Ser Ala Tyr Asp Thr Ala Thr Gly Arg Phe Thr 530 535 540
Val Pro Lys Arg Thr Ala Ala Val Phe Val Glu Pro Arg Cys 545 550 555
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 492 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA ZU mRNA (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iv) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS : Solanum tuberosum
(B) STAMM: Berolina (F) GEWEBETYP: tuber
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE:1..492
(D) SONSTIGE ANGABEN: /product= "Debranching enzyme (R-enzyme) "
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
TCT GCT GAT GGC AAG TGG ACA TTA TTA GTT AAT CTT GAT TCT GAT GAT 48 Ser Ala Asp Gly Lys Trp Thr Leu Leu Val Asn Leu Asp Ser Asp Asp 560 565 570
GTA AAA CCT GAA GGC TGG GAT AAT CTA CAA GAC GTG AAG CCA AAT CTT 96 Val Lys Pro Glu Gly Trp Asp Asn Leu Gin Asp Val Lys Pro Asn Leu 575 580 585 590
CTT TCC TTT TCT GAT GTC AGC ATC TAT GAG CTG CAT GTT AGA GAT TTC 144 Leu Ser Phe Ser Asp Val Ser Ile Tyr Glu Leu His Val Arg Asp Phe 595 600 605
ACT GCC AGT GAC CCT ACT GTG TCT CAT GAA TTT CAG GCC GGT TAT CTC 192 Thr Ala Ser Asp Pro Thr Val Ser His Glu Phe Gin Ala Gly Tyr Leu 610 615 620
GCC CCT TCC ACG TCG CAG GCA TCA GCT GGT GTC CAA CAT TTG AAA AGA 240 Ala Pro Ser Thr Ser Gin Ala Ser Ala Gly Val Gin His Leu Lys Arg 625 630 635
TTA TCA AGT GCT GGT ATC ACT CAT GTC CAC CTG TGG CCA ACC TAT CAA 288 Leu Ser Ser Ala Gly Ile Thr His Val His Leu Trp Pro Thr Tyr Gin 640 645 650
TTT GCT GGT GTC GAA GAT GAG AAA CAT AAA TGG AAG TAT ACA GAT ATC 336 Phe Ala Gly Val Glu Asp Glu Lys His Lys Trp Lys Tyr Thr Asp Ile 655 660 665 670
GAG AAA CTC AAC TCT TTT CCA CCA GAT TCT GAG GAG CAG CAG GCT CTT 384 Glu Lys Leu Asn Ser Phe Pro Pro Asp Ser Glu Glu Gin Gin Ala Leu 675 680 685
ATC ACA GCC ATC CAA GAT GAA GAT GGC TAT AAT TGG GGG TAT AAT CCT 432 Ile Thr Ala Ile Gin Asp Glu Asp Gly Tyr Asn Trp Gly Tyr Asn Pro 690 695 700 GTT CTC TGG GGA GTT CCA AAG GGA AGC TAT GCT GGT AAT GCA AAT GGT 480 Val Leu Trp Gly Val Pro Lys Gly Ser Tyr Ala Gly Asn Ala Asn Gly 705 710 715
CCT TGT CGT ATC 492
Pro Cys Arg Ile 720
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 164 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
Ser Ala Asp Gly Lys Trp Thr Leu Leu Val Asn Leu Asp Ser Asp Asp
1 5 10 15
Val Lys Pro Glu Gly Trp Asp Asn Leu Gin Asp Val Lys Pro Asn Leu 20 25 30
Leu Ser Phe Ser Asp Val Ser Ile Tyr Glu Leu His Val Arg Asp Phe 35 40 45
Thr Ala Ser Asp Pro Thr Val Ser His Glu Phe Gin Ala Gly Tyr Leu 50 55 60
Ala Pro Ser Thr Ser Gin Ala Ser Ala Gly Val Gin His Leu Lys Arg 65 70 75 80
Leu Ser Ser Ala Gly Ile Thr His Val His Leu Trp Pro Thr Tyr Gin 85 90 95
Phe Ala Gly Val Glu Asp Glu Lys His Lys Trp Lys Tyr Thr Asp Ile 100 105 110
Glu Lys Leu Asn Ser Phe Pro Pro Asp Ser Glu Glu Gin Gin Ala Leu 115 120 125
Ile Thr Ala Ile Gin Asp Glu Asp Gly Tyr Asn Trp Gly Tyr Asn Pro 130 135 140
Val Leu Trp Gly Val Pro Lys Gly Ser Tyr Ala Gly Asn Ala Asn Gly 145 150 155 160
Pro Cys Arg Ile

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Nucleinsäuremolekül, das ein Protein aus Zea mays mit der biologischen Aktivität eines Debranching-Enzyms co¬ diert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus :
(a) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die unter SeqlD No. 2 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt;
(b) Nucleinsäuremolekülen, die die unter Seq ID No. 1 angegebene Nucleotidsequenz enthalten;
(c) Nucleinsäuremolekülen, die mit einem Nucleinsäuremo¬ lekül nach (a) oder (b) hybridisieren; und
(d) Nucleinsäuremolekülen, deren Nucleotidsequenz auf¬ grund der Degeneration des genetischen Codes von der Nucleotidsequenz eines Nucleinsäuremoleküls nach
(a) , (b) oder (c) abweicht.
2. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das ein cDNA-Mole- kül ist .
3. Nucleinsäuremolekül von mindestens 15 bp Länge, das spe¬ zifisch mit einem Strang eines Nucleinsäuremoleküls nach Anspruch 1 oder 2 hybridisiert.
4. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 3, das spezifisch mit einem Transkript eines Nucleinsäuremoleküls nach An¬ spruch 1 oder 2 hybridisiert und dadurch dessen Transla¬ tion verhindert .
5. Vektor enthaltend ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2.
6. Vektor nach Anspruch 5, wobei das Nucleinsäuremolekül in sense-Orientierung mit regulatorischen Elementen ver¬ knüpft ist, die die Transkription und Translation in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen ermögli¬ chen.
7. Wirtszelle, die mit einem Nucleinsäuremolekül nach An¬ spruch 1 oder 2 oder mit einem Vektor nach Anspruch 5 oder 6 transformiert ist, oder von einer solchen Zelle abstammt .
8. Verfahren zur Herstellung eines Proteins aus Zea mays mit der biologischen Aktivität eines Debranching-Enzyms, bei dem Wirtszellen nach Anspruch 7 unter geeigneten Be¬ dingungen kultiviert werden und das synthetisierte Pro¬ tein aus der Kultur gewonnen wird.
9. Protein aus Zea mays mit der biologischen Aktivität eines Debranching-Enzyms, das codiert wird von einem Nucleinεäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2.
10. Transgene Pflanzenzelle, die mit einem Nucleinsäuremole¬ kül nach Anspruch 1 oder 2 oder einem Vektor nach An¬ spruch 5 oder 6 transformiert ist, wobei das Nucleinsäu¬ remolekül, das das Protein mit der biologischen Aktivi¬ tät eines Debranching-Enzyms aus Mais codiert, unter der der Kontrolle regulatorischer Elemente steht, die die Transkription einer translatierbaren mRNA in pflanzli¬ chen Zellen erlauben.
11. Transgene Pflanze enthaltend transgene Pflanzenzellen nach Anspruch 10.
12. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 11, die eine stär¬ kespeichernde Pflanze ist.
13. Transgene Pflanze nach Anspruch 12, die eine Getreide¬ pflanze ist.
14. Transgene Pflanze nach Anspruch 13, die eine Maispflanze ist .
15. Stärke erhältlich aus Pflanzenzellen nach Anspruch 10 oder aus Pflanzen nach einem der Ansprüche 11 bis 14.
16. Transgene Pflanzenzelle, bei der die Aktivität eines Debranching-Enzyms, das durch ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2 codiert wird, reduziert ist im Vergleich zu nichttransformierten Zellen aufgrund der Inhibition der Transkription oder Translation von endo¬ genen Nucleinsäuremolekülen, die ein Debranching-Enzym codieren, wobei die Inhibition der Transkription erreicht wird durch
(a) die Expression eines Nucleinsäuremoleküls nach Anspruch 1 oder 2 oder eines Teils eines solchen Nucleinsäuremoleküls, wobei das Nucleinsäuremolekül oder der Teil davon in antisense-Orientierung mit regulatorischen Elementen verknüpft ist, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten;
(b) die Expression eines Ribozyms, das spezifisch Transkripte von Nucleinsäuremolekülen nach Anspruch 1 oder 2 spaltet; und/oder
(c) die Expresεion einer Cosuppressions-RNA, die zur Inhibition der Expression endogener Gene führt, die ein erfindungsgemäßes Protein codieren.
17. Transgene Pflanzen enthaltend Pflanzenzellen nach An¬ spruch 16.
18. Transgene Pflanze nach Anspruch 17, die eine Maispflanze ist.
19. Stärke erhältlich aus Pflanzenzellen nach Anspruch 16 oder aus Pflanzen nach Anspruch 17 oder 18.
20. Vermehrungsmaterial von Pflanzen nach einem der Ansprü¬ che 11 bis 14 oder nach Anspruch 17 oder 18 enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 10 oder nach Anspruch 16.
21. Verwendung der Stärke nach Anspruch 15 oder 19 zur Her¬ stellung von Lebensmitteln oder industriellen Produkten.
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