DE19608918A1 - Nucleinsäuremoleküle, die neue Debranching-Enzyme aus Mais codieren - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäuremoleküle, die neue Proteine aus Mais mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms (R-Enzyms) codieren. Ferner betrifft die Erfindung transgene Pflanzen und Pflanzenzellen, in denen es aufgrund der Expression einer zusätzlichen Debranching- Enzymaktivität aus Mais oder der Inhibierung einer endogenen Debranching-Enzymaktivität zur Synthese eines Amylopektins mit einem veränderten Verzweigungsgrad kommt, sowie die aus den besagten transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen erhält­ liche Stärke.

Stärke spielt sowohl als Speicherstoff in einer Vielzahl von Pflanzen als auch als nachwachsender, industriell verwertba­ rer Rohstoff eine wichtige Rolle und gewinnt zunehmend an Bedeutung. Für die industrielle Verwendung der Stärke ist es erforderlich, daß diese hinsichtlich der Struktur, Form und/oder sonstigen physikalisch-chemischen Parametern den Erfordernissen der verarbeitenden Industrie entspricht. Für den Einsatz in möglichst vielen Einsatzgebieten ist es dar­ über hinaus erforderlich, eine große Stoffvielfalt zu errei­ chen.

Das Polysaccharid Stärke ist aus chemisch einheitlichen Grundbausteinen, den Glucosemolekülen, aufgebaut, stellt je­ doch ein komplexes Gemisch aus unterschiedlichen Molekülfor­ men dar, die Unterschiede hinsichtlich des Polymerisations­ grades und des Auftretens von Verzweigungen aufweisen. Man unterscheidet die Amylose-Stärke, ein im wesentlichen unver­ zweigtes Polymer aus α-1,4-glycosidisch verknüpften Glucose­ molekülen, von der Amylopektin-Stärke, ein verzweigtes Poly­ mer, bei dem die Verzweigungen durch das Auftreten von zu­ sätzlichen α-1,6-glykosidischen Verknüpfungen zustande kom­ men.

In typischen für die Stärkeproduktion verwendeten Pflanzen, wie z. B. Mais oder Kartoffel, kommen die beiden Stärkeformen in einem Verhältnis von ca. 25 Teilen Amylose zu 75 Teilen Amylopektin vor. Neben dem Amylopektin kommt beispielsweise beim Mais ein weiteres verzweigtes Polysaccharid, das soge­ nannte Phytoglycogen, vor, das sich vom Amylopektin durch einen stärkeren Verzweigungsgrad und ein anderes Löslich­ keitsverhalten unterscheidet (siehe z. B. Lee et al., Arch. Biochem. Biophys. 143 (1971), 365-374; Pan und Nelson, Plant Physiol. 74 (1984), 324-328). Im Rahmen dieser Anmeldung wird der Begriff Amylopektin so verwendet, daß er das Phyto­ glycogen umfaßt.

Im Hinblick auf die Einheitlichkeit des Grundstoffes Stärke für seine Anwendung im industriellen Bereich werden Stärke­ produzierende Pflanzen benötigt, die beispielsweise nur noch die Komponente Amylopektin oder nur noch die Komponente Amy­ lose enthalten. Für eine Reihe weiterer Verwendungen werden Pflanzen benötigt, die unterschiedlich stark verzweigte Amy­ lopektin-Formen synthetisieren.

Derartige Pflanzen können beispielsweise durch Züchtung oder Mutagenesetechniken erzeugt werden. Für bestimmte Pflanzen­ spezies, z. B. Mais, ist bekannt, daß durch Mutagenese Sorten erzeugt werden können, die nur noch Amylopektin bilden. Für die Kartoffel wurde ebenfalls durch chemische Mutagenese bei einer haploiden Linie ein Genotyp erzeugt, der keine Amylose bildet (Hovenkamp-Hermelink, Theor. Appl. Genet. 75 (1987), 217-221).

Aus Visser et al. (Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 289) und der WO 92/11376 ist weiterhin bekannt, daß mittels einer anti­ sense-Inhibition des Gens für die Stärkekorn-gebundene Stär­ kesynthase in Kartoffel Sorten erzeugt werden können, die weitgehend reine Amylopektinstärke synthetisieren. Ferner sind aus der WO 92/14827 DNA-Sequenzen bekannt, die ein Ver­ zweigungsenzym codieren (Q-Enzym), das α-1,6-Verzweigungen in Amylopektinstärke einführt. Mit Hilfe dieser DNA-Sequen­ zen sollte es möglich sein, transgene Pflanzen herzustellen, bei denen das Amylose/Amylopektin-Verhältnis der Stärke ver­ ändert ist.

Für eine weitere gezielte Veränderung des Verzweigungsgrades von in Pflanzen synthetisierter Stärke mit Hilfe gentechni­ scher Verfahren ist es nach wie vor erforderlich, DNA-Se­ quenzen zu identifizieren, die Enzyme codieren, die am Stär­ kemetabolismus, insbesondere der Verzweigung von Stärkemole­ külen, beteiligt sind.

Neben den Q-Enzymen, die Verzweigungen in Stärkemoleküle einführen, kommen in Pflanzen Enzyme vor, die Verzweigungen auflösen können. Diese Enzyme werden als Debranching-Enzyme bezeichnet und werden entsprechend ihrer Substratspezifität in drei Gruppen eingeteilt:

• (a) Die Pullulanasen, die neben Pullulan auch Amylopektin als Substrat nutzen, kommen bei Mikroorganismen, z. B. Klebsiella, und bei Pflanzen vor. In Pflanzen werden diese Enzyme auch als R-Enzyme bezeichnet.
• (b) Die Isoamylasen, die nicht Pullulan, wohl aber Glycogen und Amylopektin als Substrat nutzen, kommen ebenfalls bei Mikroorganismen und Pflanzen vor. Isoamylasen wurden beispielsweise bei Mais (Manners & Rowe, Carbohydr. Res. 9 (1969), 107) und Kartoffel (Ishizaki et al., Agric. Biol. Chem. 47 (1983), 771-779) beschrieben.
• (c) Die Amylo-1,6-Glucosidasen sind bei Säugern und Hefen beschrieben und nutzen Grenzdextrine als Substrat.

In Zuckerrübe konnte von Li et al. (Plant Physiol. 98 (1992), 1277-1284) neben fünf Endo- und zwei Exoamylasen nur ein Debranching-Enzym vom Pullulanase-Typ nachgewiesen wer­ den. Dieses Enzym, das eine Größe von ca. 100 kD und ein pH- Optimum von 5,5 aufweist, ist in den Chloroplasten lokali­ siert. Auch für Spinat wurde ein Debranching-Enzym beschrie­ ben, das Pullulan als Substrat verwendet. Sowohl das Debranching-Enzym aus Spinat als auch das aus der Zuckerrübe besitzen bei der Reaktion mit Amylopektin als Substrat ver­ glichen mit Pullulan als Substrat eine 5-fach geringere Ak­ tivität (Ludwig et al., Plant Physiol. 74 (1984), 856-861; Li et al., Plant Physiol. 98 (1992), 1277-1284).

Bei der landwirtschaftlich wichtigen stärkespeichernden Kul­ turpflanze Kartoffel wurde die Aktivität eines Debranching- Enzyms von Hobson et al. (J. Chem. Soc., (1951), 1451) un­ tersucht. Es gelang der Nachweis, daß das entsprechende En­ zym im Gegensatz zum Q-Enzym keine kettenverlängernde Akti­ vität besitzt, sondern lediglich α-1,6-glycosidische Bindun­ gen hydrolysiert. Das Enzym konnte jedoch bisher nicht ge­ nauer charakterisiert werden.

Im Fall der Kartoffel wurden bereits Verfahren zur Reinigung des Debranching-Enzyms sowie partielle Peptidsequenzen des gereinigten Proteins vorgeschlagen (WO 95/04826).

Für Spinat wurde inzwischen die Reinigung eines Debranching- Enzyms, sowie die Isolierung einer entsprechenden cDNA be­ schrieben (Renz et al., Plant Physiol. 108 (1995), 1342).

Für die wichtigste Stärke liefernde Pflanze, Mais, wurde bisher in der Literatur lediglich die Existenz eines Debranching-Enzyms beschrieben. Dieses wird aufgrund seiner Substratspezifität in die Gruppe der Isoamylasen eingeordnet (siehe z. B. Hannah et al., Scientia Horticulturae 55 (1993), 177-197 oder Garwood (1984) in Starch Chemistry and Technology, Whistler, R.L., BeMiller, J.N., Puschall, E.F. (eds.), Academic Press San Diego, New York, Boston, 25-86). Die entsprechende Mutante wird als su (sugary) bezeichnet. Das Gen des sugary-Locus wurde kürzlich cloniert (siehe James et al., Plant Cell 7 (1995), 417-429). Neben dem sugary-Locus ist bisher in Mais kein anderer Genlocus be­ kannt, der ein Protein mit Debranching-Enzymaktivität co­ diert. Es gab bisher auch keinerlei Hinweise, daß andere Debranching-Enzymformen in Mais vorkommen. Will man trans­ gene Maispflanzen herstellen, die keinerlei Debranching-En­ zymaktivität mehr aufweisen, z. B. um eine Veränderung des Verzweigungsgrades der Amylopektinstärke zu erzielen, so ist es erforderlich, alle im Mais vorkommenden Debranching-En­ zymformen zu identifizieren und die entsprechenden Gene oder cDNA-Sequenzen zu isolieren.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, weitere möglicherweise bei Mais vorkommende Debranching-En­ zyme zu identifizieren bzw. entsprechende Nucleinsäuremole­ küle, die diese Enzyme codieren, zu isolieren.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Pa­ tentansprüchen bezeichneten Ausführungsformen gelöst.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremole­ küle, die Proteine mit der biologischen Aktivität eines Debranching-Enzyms codieren, oder ein biologisch aktives Fragment davon, wobei diese Nucleinsäuremoleküle aus Mais stammen.

Ein derartiges Nucleinsäuremolekül codiert vorzugsweise für ein Debranching-Enzym aus Mais, das die unter Seq ID No. 2 angegebene Aminosäuresequenz aufweist. Besonders bevorzugt umfaßt ein derartiges Nucleinsäuremolekül die unter Seq ID No. 1 angegebene Nucleotidsequenz insbesondere die codie­ rende Region.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremo­ leküle, deren Sequenzen sich aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von den Sequenzen der obengenannten Nucleinsäuremoleküle unterscheidet, und die ein Protein aus Mais codieren, das die biologische Aktivität eines Debranching-Enzyms aufweist.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Nucleinsäuremole­ küle, die Proteine mit der biologischen Aktivität eines Debranching-Enzyms aus Mais codieren oder biologisch aktive Fragmente davon und die mit einem der oben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle hybridisieren.

Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet im Rahmen dieser Er­ findung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridi­ sierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedin­ gungen, wie sie beispielsweise in Sambrock et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben sind. Nucleinsäuremoleküle, die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridisieren, können prinzipiell aus jeder beliebigen Maispflanze stammen.

Nucleinsäuremoleküle, die mit den erfindungsgemäßen Molekü­ len hybridisieren, können z. B. aus genomischen oder aus cDNA-Bibliotheken isoliert werden.

Die Identifizierung und Isolierung derartiger Nucleinsäure­ moleküle aus Maispflanzen kann dabei unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder Teile dieser Mo­ leküle bzw. der reversen Komplemente dieser Moleküle erfol­ gen, z. B. mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Als Hybridisierungsprobe können z. B. Nucleinsäuremoleküle verwendet werden, die exakt die oder im wesentlichen die un­ ter Seq ID No. 1 angegebene Nucleotidsequenz oder Teile die­ ser Sequenz aufweisen. Bei den als Hybridisierungsprobe ver­ wendeten Fragmenten kann es sich auch um synthetische Frag­ mente handeln, die mit Hilfe der gängigen Synthesetechniken hergestellt wurden und deren Sequenz im wesentlichen mit der eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls übereinstimmt. Hat man Gene identifiziert und isoliert, die mit den erfin­ dungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen hybridisieren, ist eine Bestimmung der Sequenz und eine Analyse der Eigenschaften der von dieser Sequenz codierten Proteine erforderlich.

Die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridi­ sierenden Moleküle umfassen auch Fragmente, Derivate und al­ lelische Varianten der oben beschriebenen DNA-Moleküle, die ein Debranching-Enzym aus Mais codieren oder ein biologisch, d. h. enzymatisch, aktives Fragment davon. Unter Fragmenten werden dabei Teile der Nucleinsäuremoleküle verstanden, die lang genug sind, um ein Polypeptid mit der enzymatischen Ak­ tivität eines Debranching-Enzyms zu codieren. Der Ausdruck Derivat bedeutet in diesem Zusammenhang, daß die Sequenzen dieser Moleküle sich von den Sequenzen der oben beschriebe­ nen Nucleinsäuremoleküle an einer oder mehreren Positionen unterscheiden und einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenz­ identität von mindestens 40%, insbesondere eine Identität von mindestens 60%, vorzugsweise über 80% und besonders bevorzugt über 90%. Die Abweichungen zu den oben beschrie­ benen Nucleinsäuremolekülen können dabei durch Deletion, Ad­ dition, Substitution, Insertion oder Rekombination entstan­ den sein.

Homologie bedeutet ferner, daß funktionelle und/oder struk­ turelle Äquivalenz zwischen den betreffenden Nucleinsäuremo­ lekülen oder den durch sie codierten Proteinen, besteht. Bei den Nucleinsäuremolekülen, die homolog zu den oben beschrie­ benen Molekülen sind und Derivate dieser Moleküle darstel­ len, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Mo­ leküle, die Modifikationen darstellen, die dieselbe biologi­ sche Funktion ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürli­ cherweise auftretende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus anderen Organismen, oder um Mutationen, wobei diese Mutationen auf natürliche Weise aufgetreten sein kön­ nen oder durch gezielte Mutagenese eingeführt wurden. Ferner kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende Varianten handeln, als auch um synthetisch hergestellte oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugte Varianten.

Die von den verschiedenen Varianten der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codierten Proteine weisen bestimmte ge­ meinsame Charakteristika auf. Dazu können z. B. Enzymaktivi­ tät, Molekulargewicht, immunologische Reaktivität, Konforma­ tion etc. gehören, sowie physikalische Eigenschaften wie z. B. das Laufverhalten in Gelelektrophoresen, chromatogra­ phisches Verhalten, Sedimentationskoeffizienten, Löslich­ keit, spektroskopische Eigenschaften, Stabilität; pH-Opti­ mum, Temperatur-Optimum etc.

Der Nachweis der enzymatischen Aktivität des Debranching-En­ zyms kann beispielsweise durch einen Färbetest erfolgen, wie in der WO 95/04826 beschrieben. Dieser beruht darauf, daß sich ein Protein mit einer stärkemodifizierenden Aktivität nachweisen läßt, wenn Proteinextrake, beispielsweise aus Kartoffelknollen, in nicht-denaturierenden, amylopektinhal­ tigen Polyacrylamidgelen (PAAG) aufgetrennt werden und das Gel, nach Inkubation in einem geeigneten Puffer, an­ schließend einer Jodfärbung unterzogen wird. Während unver­ zweigte Amylose mit Jod einen blauen Komplex bildet, ergibt Amylopektin eine rötlich-violette Färbung. In amylopektin­ haltigen Polyacrylamidgelen, die mit Jod rötlich-violett färben, kommt es an Orten, an denen eine Debranching-Aktivi­ tät lokalisiert ist, zu einer Farbverschiebung hin zu einer Blaufärbung des Gels, da die Verzweigungen des violettfär­ benden Amylopektins von dem Debranching-Enzym abgebaut wer­ den.

Alternativ kann der Nachweis der Debranching-Enzymaktivität mit Hilfe des DNSS-Tests (siehe Ludwig et al., Plant Physiol. 74 (1984), 856-861) erfolgen.

Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können beliebige Nucleinsäuremoleküle sein, insbesondere DNA- oder RNA-Mole­ küle handeln, beispielsweise cDNA, genomische DNA, mRNA etc. Sie können natürlich vorkommende Moleküle sein, oder durch gentechnische oder chemische Syntheseverfahren hergestellte.

Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codieren ein bis­ her unbekanntes neues Protein aus Mais mit der enzymatischen Aktivität einem Debranching-Enzyms. Bisher war für Mais le­ diglich ein Locus beschrieben worden der ein Protein mit Debranching-Enzymaktivität codiert (James et al., s. o.). In der Literatur gab es bisher keinerlei Hinweise, daß es in Mais weitere Gene gibt, die Debranching-Enzyme codieren. Ho­ mologievergleiche der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle mit den in James et al. (s. o.) beschriebenen zeigen, daß diese Sequenzen keine signifikante Homologie zeigen und nicht miteinander hybridisieren würden. Somit codieren die erfindungsgemäßen Moleküle einen neuen Typ von Debranching- Enzymen aus Mais. Mit Hilfe dieser Moleküle ist es nun mög­ lich gezielt in den Stärkemetabolismus von Mais und anderen stärkespeichernden Pflanzen einzugreifen und somit die Syn­ these einer in ihren chemischen oder physikalischen Eigen­ schaften modifizierten Stärke zu ermöglichen. Dies kann zum einen durch Überexpression der erfindungsgemäßen Nucleinsäu­ remoleküle in beliebigen, vorzugsweise stärkespeichernden Pflanzen, erfolgen oder durch Reduktion der Debranching-En­ zymaktivität in Maispflanzen durch Einsatz der erfindungsge­ mäßen Nucleinsäuresequenzen, beispielsweise mittels anti­ sense- oder Ribozymeffekte.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremole­ küle von mindestens 15 Basenpaaren Länge, die spezifisch mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridisieren. Spezifisch hybridisieren bedeutet hierbei, daß diese Mole­ küle mit Nucleinsäuremolekülen hybridisieren, die die neuen Debranching-Enzyme aus Mais codieren, jedoch nicht mit Nucleinsäuremolekülen, die andere Proteine codieren. Hybri­ disieren bedeutet dabei vorzugsweise Hybridisieren unter stringenten Bedingungen (s. o.). Insbesondere betrifft die Erfindung solche Nucleinsäuremoleküle, die mit Transkripten von erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridisieren und dadurch deren Translation verhindern können.

Weiterhin betrifft die Erfindung Vektoren, insbesondere Plasmide, Cosmide, Viren, Bacteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren, die die oben beschriebenen er­ findungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle enthalten.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in den Vekto­ ren enthaltenen Nucleinsäuremoleküle verknüpft mit regulato­ rischen Elementen, die die Transkription und Translation in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen gewährleisten.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Wirtszellen, insbesondere prokaryontische oder eukaryonti­ sche Zellen, die mit einem oben beschriebenen Nucleinsäure­ molekül oder einem Vektor transformiert wurden, und Zellen, die von derartigen Wirtszellen abstammen und die beschriebe­ nen Nucleinsäuremoleküle oder Vektoren enthalten. Die Wirts­ zellen können Bakterien- oder Pilzzellen, sowie pflanzliche oder tierische Zellen sein.

Die Erfindung betrifft auch Proteine mit der biologischen Aktivität eines Debranching-Enzyms aus Mais, die durch die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codiert werden, oder biologisch aktive Fragmente davon.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Her­ stellung eines pflanzlichen Proteins mit der biologischen Aktivität eines Debranching-Enzyms oder eines biologisch ak­ tiven Fragmentes davon, bei dem erfindungsgemäße Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden und das Pro­ tein aus der Kultur, d. h. aus den Zellen und/oder dem Kul­ turmedium gewonnen wird.

Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nucleinsäure­ moleküle besteht nun die Möglichkeit, pflanzliche Zellen mittels gentechnischer Methoden dahingehend zu verändern, daß sie eine neue oder eine gesteigerte Debranching-Enzymak­ tivität aus Mais aufweisen im Vergleich zu Wildtypzellen oder dahingehend, daß sie im Vergleich zu Wildtyp-Zellen eine verringerte Debranching-Enzymaktivität aufweisen.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich daher bei den erfindungsgemäßen Wirtszellen um transgene pflanzli­ che Zellen, die aufgrund der Gegenwart und Expression eines zusätzlich eingeführten erfindungsgemäßen Nucleinsäuremole­ küls im Vergleich zu nichttransformierten Zellen entweder eine neue oder eine gesteigerte Debranching-Enzymaktivität aufweisen. Solche transgenen Pflanzenzellen unterscheiden sich von nicht-transformierten Zellen dadurch, daß das ein­ geführte Nucleinsäuremolekül entweder heterolog zu der transformierten Zelle ist, d. h. aus einer Zelle mit einem anderen genomischen Hintergrund stammt, oder dadurch daß das eingeführte Nucleinsäuremolekül, wenn es homolog zur trans­ formierten Pflanzenspezies ist, im Genom an einem Ort loka­ lisiert ist, an dem es in nicht-transformierten Zellen na­ türlicherweise nicht vorkommt. Dabei kann das eingeführte Nucleinsäuremolekül entweder unter der Kontrolle seines na­ türlichen Promotors stehen oder mit regulatorischen Elemen­ ten fremder Gene verknüpft sein.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls transgene Pflanzen, die die oben beschriebenen transgenen Pflanzenzellen enthal­ ten.

Bei der Pflanze, die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäure­ molekülen transformiert ist, und in der aufgrund der Einfüh­ rung eines solchen Moleküls ein Debranching-Enzym aus Mais synthetisiert wird, kann es sich im Prinzip um jede belie­ bige Pflanze handeln. Vorzugsweise ist es eine monokotyle oder dikotyle Nutzpflanze, insbesondere eine stärkespei­ chernde Pflanze, wie z. B. Getreidepflanzen, Leguminosen, Kartoffeln oder Maniok.

Unter Getreidepflanzen werden insbesondere monokotyle Pflan­ zen verstanden, die zur Ordnung Poales, bevorzugt solche, die zur Familie der Poaceae gehören. Beispiele hierfür sind die Pflanzen, die zu den Gattungen Avena (Hafer), Triticum (Weizen), Secale (Roggen), Hordeum (Gerste), Oryza (Reis), Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorghum (Hirse), Zea (Mais) etc. gehören, wobei Pflanzen der Spezies Zea mays (Mais) be­ sonders bevorzugt sind. Stärkespeichernde Leguminosen sind z. B. manche Arten der Gattung Pisum (z. B. Pisum sativum), Vicia (z. B. Vicia faba), Cicer (z. B. Cicer arietinum), Lens (z. B. Lens culinaris), Phaseolus (z. B. Phaseolus vulgaris und Phaseolus coccineus), etc.

Die Expression einer neuen oder zusätzlichen Debranching-En­ zymaktivität aus Mais in den erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen hat einen Einfluß auf den Ver­ zweigungsgrad des in den Zellen und Pflanzen synthetisierten Amylopektins. Daher besitzt eine in diesen Pflanzen synthe­ tisierte Stärke veränderte physikalische und/oder chemische Eigenschaften im Vergleich zu Stärke aus Wildtyp-Pflanzen. Somit betrifft die Erfindung auch die aus den transgenen Pflanzenzellen oder Pflanzen erhältliche Stärke.

Gegenstand der Erfindung ist ferner Vermehrungsmaterial von erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen, beispielsweise Samen, Früchte, Stecklinge, Knollen, Wurzelstöcke etc., wobei die­ ses Vermehrungsmaterial oben beschriebene transgene Pflan­ zenzellen enthält. Im Fall von Maispflanzen handelt es sich bei dem Vermehrungsmaterial vorzugsweise um die Maiskörner.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung transgene Pflan­ zenzellen von Mais, bei denen die Aktivität des erfindungs­ gemäßen Debranching-Enzyms verringert ist aufgrund der Inhi­ bition der Transkription oder Translation von endogenen Nucleinsäuremolekülen, die ein derartiges neues Debranching- Enzym codieren. Dies wird vorzugsweise dadurch erreicht, daß ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül oder ein Teil da­ von in den entsprechenden Pflanzenzellen in antisense-Orien­ tierung exprimiert wird und es aufgrund eines antisense-Ef­ fektes zur Verringerung der beschriebenen Debranching-En­ zymaktivität kommt. Eine weitere Möglichkeit zur Verringe­ rung der Debranching-Enzymaktivität in pflanzlichen Zellen besteht in der Expression von geeigneten Ribozymen, die spe­ zifisch Transkripte der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle spal­ ten. Die Herstellung derartiger Ribozyme mit Hilfe der er­ findungsgemäßen DNA-Moleküle ist dem Fachmann geläufig. Mög­ lich ist auch die Expression von Molekülen, die sowohl einen antisense- als auch einen Ribozymeffekt in Kombination aus­ üben. Alternativ kann die Verringerung der Debranching-En­ zymaktivität in den Pflanzenzellen auch durch einen Co­ supressionseffekt erfolgen.

Die Erfindung betrifft ferner transgene Maispflanzen, die die oben beschriebenen transgenen Pflanzenzellen mit verrin­ gerter Debranching-Enzymaktivität enthalten.

Die Amylopektinstärke der transgenen Zellen und Pflanzen weist aufgrund der verringerten Debranching-Enzymaktivität einen veränderten Verzweigungsgrad auf im Vergleich zu Stärke aus nichttransformierten Pflanzen. Gegenstand der Er­ findung ist daher ebenfalls die aus den transgenen Zellen oder Pflanzen erhältliche modifizierte Stärke.

Die Erfindung betrifft auch Vermehrungsmaterial der vorste­ hend beschriebenen transgenen Pflanzen, insbesondere Samen, wobei diese vorstehend beschriebene transgene Pflanzenzellen enthalten.

Transgene Pflanzenzellen, die aufgrund der Expression einer neuen oder zusätzlichen Debranching-Enzymaktivität eine Amy­ lopektinstärke mit einem veränderten Verzweigungsgrad bilden im Vergleich zu in Wildtyp-Pflanzen synthetisierter Amylo­ pektinstärke, können beispielsweise durch ein Verfahren her­ gestellt werden, das folgende Schritte umfaßt:

• (a) Herstellung einer Expressionskassette, die folgende DNA- Sequenzen umfaßt:
  • (i) einen Promotor, der die Transkription in pflanzli­ chen Zellen gewährleistet;
  • (ii) mindestens eine erfindungsgemäße Nucleinsäurese­ quenz, die ein Protein mit der enzymatischen Akti­ vität eines Debranching-Enzyms codiert oder ein biologisch aktives Fragment davon und in sense- Orientierung an das 3′-Ende des Promotors gekop­ pelt ist; und
  • (iii) gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Ter­ mination der Transkription und die Addition eines poly-A-Schwanzes an das entstehende Transkript, das an das 3′-Ende der codierenden Region gekop­ pelt ist; und
• (b) Transformation pflanzlicher Zellen mit der in Schritt (a) hergestellten Expressionskassette.

Transgene Maispflanzenzellen, die aufgrund der Verringerung der beschriebenen Debranching-Enzymaktivität eine Amylopek­ tinstärke mit einem im Vergleich zu in Wildtyp-Pflanzen syn­ thetisierter Amylopektinstärke veränderten Verzweigungsgrad bilden, können beispielsweise durch ein Verfahren herge­ stellt werden, das folgende Schritte umfaßt:

• (a) Herstellung einer Expressionskassette, die folgende DNA- Sequenzen umfaßt:
  • (i) einen Promotor, der die Transkription in pflanzli­ chen Zellen gewährleistet;
  • (ii) mindestens eine erfindungsgemäße Nucleinsäurese­ quenz, die ein Protein mit der enzymatischen Akti­ vität eines Debranching-Enzyms codiert oder einen Teil eines solchen Proteins und die in antisense- Orientierung an das 3′-Ende des Promotors gekop­ pelt ist; und
  • (iii) gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Ter­ mination der Transkription und die Addition eines poly-A-Schwanzes an das entstehende Transkript, das an das 3′-Ende der codierenden Region gekop­ pelt ist; und
• (b) Transformation pflanzlicher Zellen mit der in Schritt (a) hergestellten Expressionskassette.

Für den unter (i) genannten Promotor kommt im Prinzip jeder in den für die Transformation gewählten Pflanzen funktionale Promotor in Betracht. Der Promotor kann homolog oder hetero­ log in bezug auf die verwendete Pflanzenspezies sein. Ge­ eignet ist beispielsweise der 35S-Promotor des Cauliflower- Mosaik-Virus (Odell et al., Nature 313 (1985), 810-812), der eine konstitutive Expression in allen Geweben einer Pflanze gewährleistet und das in der WO/9401571 beschriebene Promo­ torkonstrukt. Ein anderes Beispiel sind die Promotoren der Polyubiquitingene aus Mais (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18 (1992) 675-689. Es können jedoch auch Promotoren verwendet werden, die nur zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt (siehe beispielsweise WO/9307279).

Von besonderem Interesse können hierbei Promotoren von heat­ shock-Proteinen sein, die eine einfache Induktion erlauben. Ferner können die Promotoren verwendet werden, die in einem bestimmten Gewebe der Pflanze zu einer Expression nachge­ schalteter Sequenzen führen (siehe z. B. Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2245-2251). Präferentiell werden Promoto­ ren eingesetzt, die in den stärkespeichernden Organen der zu transformierenden Pflanzen aktiv sind. Dies sind beim Mais die Maiskörner, während es bei der Kartoffel die Knollen sind. Zur Überexpression der erfindungsgemäßen Nucleinsäure­ moleküle in der Kartoffel kann beispielsweise der knollen­ spezifische B33-Promotor (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) verwendet werden.

Samenspezifische Promotoren sind bereits für verschiedene Pflanzenspezies beschrieben worden. So z. B. der USP-Promotor aus Vicia faba, der eine samenspezifische Expression in V. faba und anderen Pflanzen gewährleistet (Fiedler et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Bäumlein et al., Mol Gen. Genet. 225 (1991), 459-467). In Mais gewährleisten bei­ spielsweise Promotoren der Zein-Gene eine spezifische Ex­ pression im Endosperm der Maiskörner (Pedersen et al., Cell 29 (1982), 1015-1026; Quattrocchio et al., Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93).

In dem Fall, daß die unter Verfahrensschritt (a) (ii) ge­ nannte, Nucleinsäuresequenz, die ein Protein mit der enzyma­ tischen Aktivität eines Debranching-Enzyms aus Mais codiert, in sense-Orientierung mit dem Promotor verknüpft ist, kann diese Nucleinsäuresequenz sowohl nativen bzw. homologen Ur­ sprungs als auch fremden bzw. heterologen Ursprungs in bezug auf die zu transformierende Pflanzenspezies sein, d. h. es können sowohl Maispflanzen als auch beliebige andere Pflan­ zen mit der beschriebenen Expressionskassette transformiert werden, vorzugsweise die obengenannten stärkespeichernden Pflanzen.

Es besteht grundsätzlich die Möglichkeit, daß das syntheti­ sierte Protein in jedem beliebigen Kompartiment der pflanz­ lichen Zelle lokalisiert sein kann. Pflanzliche Debranching- Enzyme sind in der Regel in den Plastiden lokalisiert und besitzen daher eine Signalsequenz für die Translokation in diese Organellen. Um die Lokalisation in einem anderen Kom­ partiment der Zelle zu erreichen, muß die DNA-Sequenz, die diese Signalsequenz codiert, entfernt werden und die codie­ rende Region mit DNA-Sequenzen verknüpft werden, die die Lo­ kalisierung in dem jeweiligen Kompartiment gewährleisten. Derartige Sequenzen sind bekannt (Siehe beispielsweise Braun et al., EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald et al., Plant J. 1 (1991) , 95-106).

In dem Fall, daß die unter Verfahrensschritt (a) (ii) ge­ nannte Nucleinsäuresequenz, die ein Protein aus Mais mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms codiert, in antisense-Orientierung mit dem Promotor verknüpft ist, han­ delt es sich bei dieser vorzugsweise um eine Nucleinsäurese­ quenz homologen Ursprungs in bezug auf die zu transformie­ rende Pflanzenspezies. Es können jedoch auch Nucleinsäurese­ quenzen verwendet werden, die einen hohen Grad an Homologie zu endogen vorhandenen Debranching-Enzym-Genen haben, insbe­ sondere Homologien höher als 80%, vorzugsweise Homologien zwischen 90% und 100% und besonders bevorzugt Homologien über 95%.

Es können Sequenzen bis zu einer Mindestlänge von 15 bp ver­ wendet werden. Eine inhibierende Wirkung ist aber auch bei der Verwendung kürzerer Sequenzen nicht ausgeschlossen. Be­ vorzugt werden längere Sequenzen zwischen 100 und 500 Basen­ paaren verwendet, für eine effiziente antisense-Inhibition werden insbesondere Sequenzen mit einer Länge über 500 Ba­ senpaaren verwendet. In der Regel werden Sequenzen verwen­ det, die kürzer als 5000 Basenpaare sind, bevorzugt Sequen­ zen, die kürzer als 2500 Basenpaare sind.

Terminationssignale für die Transkription in pflanzlichen Zellen sind beschrieben und sind beliebig gegeneinander aus­ tauschbar. Verwendet werden kann beispielsweise die Termina­ tionssequenz des Octopinsynthase-Gens aus Agrobacterium tumefaciens.

Der Transfer der gemäß Verfahrensschritt (a) konstruierten Expressionskassette in pflanzliche Zellen erfolgt vorzugs­ weise unter Verwendung von Plasmiden, insbesondere mit Hilfe von Plasmiden, die eine stabile Integration der Expressions­ kassette in das pflanzliche Genom gewährleisten.

Das oben beschriebene Verfahren zur Überexpression eines neuen Debranching-Enzyms aus Mais kann prinzipiell auf alle Pflanzenspezies angewendet werde. Von Interesse sind sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen, insbesondere die oben beschriebenen stärkespeichernden Pflanzen. Das oben be­ schriebene Verfahren zur Reduktion der Debranching-Enzymak­ tivität wird bevorzugt auf monokotyledone Pflanzen, insbe­ sondere auf Mais angewandt.

Infolge der Einführung einer gemäß den beschriebenen Verfah­ ren konstruierten Expressionskassette kommt es in den trans­ formierten Pflanzenzellen zur Bildung einer RNA. Ist die ein Debranching-Enzym aus Mais codierende Nucleinsäuresequenz in der Expressionskassette in sense-Orientierung mit dem Promo­ tor verknüpft, kommt es zur Synthese einer mRNA, die als Ma­ trize für die Synthese eines zusätzlichen oder neuen Debranching-Enzyms aus Mais in den pflanzlichen Zellen die­ nen kann. Als Folge davon weisen diese Zellen eine Aktivität bzw. eine erhöhte Aktivität des Debranching-Enzyms aus Mais auf, was zu einer Veränderung des Verzweigungsgrades des in den Zellen gebildeten Amylopektins führt. Dadurch wird eine Stärke zugänglich, die sich gegenüber der natürlich vorkom­ menden Stärke durch eine stärker geordnete Raumstruktur so­ wie eine gesteigerte Einheitlichkeit auszeichnet. Dies kann unter anderem günstige Auswirkungen auf die Filmbildungs­ eigenschaften haben.

Ist die ein Debranching-Enzym aus Mais codierende Nuclein­ säuresequenz dagegen in antisense-Orientierung mit dem Pro­ motor verknüpft, so kommt es in transgenen Pflanzenzellen zur Synthese einer antisense-RNA, die die Expression von en­ dogenen Debranching-Enzym-Genen inhibiert. Als Folge weisen diese Zellen eine reduzierte Aktivität des neuen Debranching-Enzyms aus Mais auf, was zur Bildung einer modi­ fizierten Stärke führt. Mit Hilfe der antisense-Technik ist es möglich Pflanzen herzustellen, bei denen die Expression eines endogenen Debranching-Enzym-Gens in Mais in unter­ schiedlichem Maße inhibiert ist in einem Bereich von 0% bis zu 100%. Dies ermöglicht insbesondere die Herstellung von Maispflanzen, die Amylopektinstärke mit verschiedensten Va­ riationen im Verzweigungsgrad synthetisieren. Dies stellt einen Vorteil gegenüber herkömmlichen Züchtungs- und Mutage­ neseverfahren dar, bei denen die Bereitstellung einer derar­ tigen Vielfalt nur mit erheblichem Zeit- und Kostenaufwand möglich ist. Stark verzweigtes Amylopektin hat eine beson­ ders große Oberfläche und eignet sich dadurch als Copolymer in besonderem Maße. Ein starker Verzweigungsgrad führt außerdem zu einer Verbesserung der Wasserlöslichkeit des Amylopektins. Diese Eigenschaft ist für bestimmte technische Anwendungen sehr vorteilhaft.

Besonders geeignet für die Produktion von verändertem Amylo­ pektin unter Ausnutzung der erfindungsgemäßen Nucleinsäure­ moleküle die Debranching-Enzyme codieren ist Mais. Die An­ wendung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Pflanzen­ spezies beschränkt. Für die Überexpression kann jede belie­ bige andere Pflanzenspezies verwendet werden.

Die in den transgenen Pflanzen synthetisierte modifizierte Stärke kann mittels gängiger Methoden aus den Pflanzen oder aus den Pflanzenzellen isoliert und nach der Reinigung zur Herstellung von Nahrungsmitteln und industriellen Produkten verwendet werden.

Die erfindungsgemäßen Stärken können nach dem Fachmann be­ kannten Verfahren modifiziert werden und eignen sich in un­ modifizierter oder modifizierter Form für verschiedene Ver­ wendungen im Nahrungsmittel- oder Nicht-Nahrungsmittelbe­ reich.

Grundsätzlich läßt sich die Einsatzmöglichkeit der Stärke in zwei große Bereiche unterteilen. Der eine Bereich umfaßt die Hydrolyseprodukte der Stärke, hauptsächlich Glucose und Glu­ canbausteine, die über enzymatische oder chemische Verfahren erhalten werden. Sie dienen als Ausgangsstoff für weitere chemische Modifikationen und Prozesse, wie Fermentation. Für eine Reduktion der Kosten kann hierbei die Einfachheit und kostengünstige Ausführung eines Hydrolyseverfahrens von Be­ deutung sein. Gegenwärtig verläuft es im wesentlichen enzy­ matisch unter Verwendung von Amyloglucosidase. Vorstellbar wäre eine Kosteneinsparung durch einen geringeren Einsatz von Enzymen. Eine Strukturveränderung der Stärke, z. B. Ober­ flächenvergrößerung des Korns, leichtere Verdaulichkeit durch geringeren Verzweigungsgrad oder eine sterische Struk­ tur, die die Zugänglichkeit für die eingesetzten Enzyme be­ grenzt, könnte dies bewirken.

Der andere Bereich, in dem die Stärke wegen ihrer polymeren Struktur als sogenannte native Stärke verwendet wird, glie­ dert sich in zwei weitere Einsatzgebiete:

1. Nahrungsmittelindustrie

Stärke ist ein klassischer Zusatzstoff für viele Nah­ rungsmittel, bei denen sie im wesentlichen die Funktion des Bindens von wäßrigen Zusatzstoffen übernimmt bzw. eine Erhöhung der Viskosität oder aber eine erhöhte Gelbildung hervorruft. Wichtige Eigenschaftsmerkmale sind das Fließ- und Sorptionsverhalten, die Quell- und Verkleisterungstemperatur, die Viskosität und Dickungs­ leistung, die Löslichkeit der Stärke, die Transparenz und Kleisterstruktur, die Hitze-, Scher- und Säuresta­ bilität, die Neigung zur Retrogradation, die Fähigkeit zur Filmbildung, die Gefrier/Taustabilität, die Verdau­ lichkeit sowie die Fähigkeit zur Komplexbildung mit z. B. anorganischen oder organischen Ionen.

2. Nicht-Nahrungsmittelindustrie

In diesem großen Bereich kann die Stärke als Hilfsstoff für unterschiedliche Herstellungsprozesse bzw. als Zu­ satzstoff in technischen Produkten eingesetzt. Bei der Verwendung der Stärke als Hilfsstoff ist hier insbeson­ dere die Papier- und Pappeindustrie zu nennen. Die Stärke dient dabei in erster Linie zur Retardation (Zu­ rückhaltung von Feststoffen), der Abbindung von Füll­ stoff- und Feinstoffteilchen, als Festigungsstoff und zur Entwässerung. Darüber hinaus werden die günstigen Eigenschaften der Stärke in bezug auf die Steifigkeit, die Härte, den Klang, den Griff, den Glanz, die Glätte, die Spaltfestigkeit sowie die Oberflächen ausgenutzt.

2.1 Papier- und Pappeindustrie

Innerhalb des Papierherstellungsprozesses sind vier An­ wendungsbereiche, nämlich Oberfläche, Strich, Masse und Sprühen, zu unterscheiden. Die Anforderungen an die Stärke in bezug auf die Ober­ flächenbehandlung sind im wesentlichen ein hoher Weiße­ grad, eine angepaßte Viskosität, eine hohe Viskositäts­ stabilität, eine gute Filmbildung sowie eine geringe Staubbildung. Bei der Verwendung im Strich spielt der Feststoffgehalt, eine angepaßte Viskosität, ein hohes Bindevermögen sowie eine hohe Pigmentaffinität eine wichtige Rolle. Als Zusatz zur Masse ist eine rasche, gleichmäßige, verlustfreie Verteilung, eine hohe mecha­ nische Stabilität und eine vollständige Zurückhaltung im Papierfließ von Bedeutung. Beim Einsatz der Stärke im Sprühbereich sind ebenfalls ein angepaßter Fest­ stoffgehalt, hohe Viskosität sowie ein hohes Bindever­ mögen von Bedeutung.

2. 2 Klebstoffindustrie

Ein großer Einsatzbereich der Stärken besteht in der Klebstoffindustrie, wo man die Einsatzmöglichkeiten in vier Teilbereiche gliedert: die Verwendung als reinem Stärkeleim, die Verwendung bei mit speziellen Chemika­ lien aufbereiteten Stärkeleimen, die Verwendung von Stärke als Zusatz zu synthetischen Harzen und Polymer­ dispersionen sowie die Verwendung von Stärken als Streckmittel für synthetische Klebstoffe. 90% der Klebstoffe auf Stärkebasis werden in den Bereichen Wellpappenherstellung, Herstellung von Papiersäcken, Beuteln und Tüten, Herstellung von Verbundmaterialien für Papier und Aluminium, Herstellung von Kartonagen und Wiederbefeuchtungsleim für Briefumschläge, Brief­ marken usw. eingesetzt.

2.3 Textil- und Textilpflegemittelindustrie

Ein großes Einsatzfeld für die Stärken als Hilfmittel und Zusatzstoff ist der Bereich Herstellung von Tex­ tilien und Textilpflegemitteln. Innerhalb der Textilin­ dustrie sind die folgenden vier Einsatzbereiche zu un­ terscheiden: Der Einsatz der Stärke als Schlichtmittel, d. h. als Hilfstoff zur Glättung und Stärkung des Klett­ verhaltens zum Schutz gegen die beim Weben angreifenden Zugkräfte sowie zur Erhöhung der Abriebfestigkeit beim Weben, Stärke als Mittel zur Textilaufrüstung vor allem nach quaiitätsverschlechternden Vorbehandlungen, wie Bleichen, Färben usw., Stärke als Verdickungsmittel bei der Herstellung von Farbpasten zur Verhinderung von Farbstoffdiffusionen sowie Stärke als Zusatz zu Ket­ tungsmitteln für Nähgarne.

2.4 Baustoffindustrie

Der vierte Einsatzbereich ist die Verwendung der Stär­ ken als Zusatz bei Baustoffen. Ein Beispiel ist die Herstellung von Gipskartonplatten, bei der die im Gips­ brei vermischte Stärke mit dem Wasser verkleistert, an die Oberfläche der Gipsplatte diffundiert und dort den Karton an die Platte bindet. Weitere Einsatzbereiche sind die Beimischung zu Putz- und Mineralfasern. Bei Transportbeton werden Stärkeprodukte zur Verzögerung der Abbindung eingesetzt.

2.5 Bodenstabilisation

Ein weiterer Markt für die Stärke bietet sich bei der Herstellung von Mitteln zur Bodenstabilisation an, die bei künstlichen Erdbewegungen zum temporären Schutz der Bodenpartikel gegenüber Wasser eingesetzt werden. Kom­ binationsprodukte aus der Stärke und Polymeremulsionen sind nach heutiger Kenntnis in ihrer Erosions- und ver­ krustungsmindernden Wirkung den bisher eingesetzten Produkten gleichzusetzen, liegen preislich aber deut­ lich unter diesen.

2.6 Einsatz bei Pflanzenschutz- und Düngemitteln

Ein Einsatzbereich liegt bei der Verwendung der Stärke in Pflanzenschutzmitteln zur Veränderung der spezifi­ schen Eigenschaften der Präparate. So kann die Stärke zur Verbesserung der Benetzung von Pflanzenschutz- und Düngemitteln, zur dosierten Freigabe der Wirkstoffe, zur Umwandlung flüssiger, flüchtiger und/oder übelrie­ chender Wirkstoffe in mikrokristalline, stabile, form­ bare Substanzen, zur Mischung inkompatibler Verbindun­ gen und zur Verlängerung der Wirkdauer durch Verminde­ rung der Zersetzung eingesetzt werden.

2.7 Pharmaka, Medizin und Kosmetikindustrie

Ein weiteres Einsatzgebiet besteht im Bereich der Phar­ maka, Medizin und Kosmetikindustrie. In der pharmazeu­ tischen Industrie kann die Stärke als Bindemittel für Tabletten oder zur Bindemittelverdünnung in Kapseln eingesetzt werden. Weiterhin kann die Stärke als Ta­ blettensprengmittel dienen, da sie nach dem Schlucken Flüssigkeit absorbieren und nach kurzer Zeit soweit quellen, daß der Wirkstoff freigesetzt wird. Medizini­ sche Gleit- und Wundpuder basieren aus qualitativen Gründen auf Stärke. Im Bereich der Kosmetik werden Stärken beispielsweise als Träger von Puderzusatzstof­ fen, wie Düften und Salicylsäure eingesetzt. Ein rela­ tiv großer Anwendungsbereich für die Stärke liegt bei Zahnpasta.

2.8 Stärkezusatz zu Kohlen und Briketts

Einen Einsatzbereich bietet die Stärke als Zusatzstoff zu Kohle und Brikett. Kohle kann mit einem Stärkezusatz quantitativ hochwertig agglomeriert bzw. brikettiert werden, wodurch ein frühzeitiges Zerfallen der Briketts verhindert wird. Der Stärkezusatz liegt bei Grillkohle zwischen 4 und 6%, bei kalorierter Kohle zwischen 0,1 und 0,5%. Des weiteren gewinnen Stärken als Bindemit­ tel an Bedeutung, da durch ihren Zusatz zu Kohle und Brikett der Ausstoß schädlicher Stoffe deutlich vermin­ dert werden kann.

2.9 Erz- und Kohleschlammaufbereitung

Die Stärke kann ferner bei der Erz- und Kohleschlamm­ aufbereitung als Flockungsmittel eingesetzt werden.

2.10 Gießereihilfsstoff

Ein weiterer Einsatzbereich besteht als Zusatz zu Gießereihilfsstoffen. Bei verschiedenen Gußverfahren werden Kerne benötigt, die aus Bindemittel-versetzten Sänden hergestellt werden. Als Bindemittel wird heute überwiegend Bentonit eingesetzt, das mit modifizierten Stärken, meist Quellstärken, versetzt ist.

Zweck des Stärkezusatzes ist die Erhöhung der Fließfe­ stigkeit sowie die Verbesserung der Bindefestigkeit. Darüber hinaus können die Quellstärken weitere produk­ tionstechnische Anforderungen, wie im kalten Wasser dispergierbar, rehydratisierbar, gut in Sand mischbar und hohes Wasserbindungsvermögen, aufweisen.

2.11 Einsatz in der Kautschukindustrie

In der Kautschukindustrie kann die Stärke zur Verbesse­ rung der technischen und optischen Qualität eingesetzt werden. Gründe sind dabei die Verbesserung des Oberflä­ chenglanzes, die Verbesserung des Griffs und des Ausse­ hens, dafür wird Stärke vor der Kaltvulkanisation auf die klebrigen gummierten Flächen von Kautschukstoffen gestreut, sowie die Verbesserung der Bedruckbarkeit des Kautschuks.

2.12 Herstellung von Lederersatzstoffen

Eine weitere Absatzmöglichkeit der modifizierten Stär­ ken besteht bei der Herstellung von Lederersatzstoffen.

2.13 Stärke in synthetischen Polymeren

Auf dem Kunststoffsektor zeichnen sich folgende Ein­ satzgebiete ab: die Einbindung von Stärkefolgeprodukten in den Verarbeitungsprozeß (Stärke ist nur Füllstoff, es besteht keine direkte Bindung zwischen synthetischem Polymer und Stärke) oder alternativ die Einbindung von Stärkefolgeprodukten in die Herstellung von Polymeren (Stärke und Polymer gehen eine feste Bindung ein).

Die Verwendung der Stärke als reinem Füllstoff ist vergli­ chen mit den anderen Stoffen wie Talkum nicht wettbewerbsfä­ hig. Anders sieht es aus, wenn die spezifischen Stärkeeigen­ schaften zum Tragen kommen und hierdurch das Eigen­ schaftsprofil der Endprodukte deutlich verändert wird. Ein Beispiel hierfür ist die Anwendung von Stärkeprodukten bei der Verarbeitung von Thermoplasten, wie Polyäthylen. Hierbei werden die Stärke und das synthetische Polymer durch Koex­ pression im Verhältnis von 1 : 1 zu einem ′master batch′ kombiniert, aus dem mit granuliertem Polyäthylen unter An­ wendung herkömmlicher Verfahrenstechniken diverse Produkte hergestellt werden. Durch die Einbindung von Stärke in Poly­ äthylenfolien kann eine erhöhte Stoffdurchlässigkeit bei Hohlkörpern, eine verbesserte Wasserdampfdurchlässigkeit, ein verbessertes Antistatikverhalten, ein verbessertes Anti­ blockverhalten sowie eine verbesserte Bedruckbarkeit mit wäßrigen Farben erreicht werden.

Eine andere Möglichkeit ist die Anwendung der Stärke in Po­ lyurethanschäumen. Mit der Adaption der Stärkederivate sowie durch die verfahrenstechnische Optimierung ist es möglich, die Reaktion zwischen synthetischen Polymeren und den Hydro­ xygruppen der Stärken gezielt zu steuern. Das Ergebnis sind Polyurethanfolien, die durch die Anwendung von Stärke fol­ gende Eigenschaftsprofile erhalten: eine Verringerung des Wärmeausdehnungskoeffizienten, Verringerung des Schrumpfver­ haltens, Verbesserung des Druck/Spannungsverhaltens, Zunahme der Wasserdampfdurchlässigkeit ohne Veränderung der Wasser­ aufnahme, Verringerung der Entflammbarkeit und der Aufriß­ dichte, kein Abtropfen brennbarer Teile, Halogenfreiheit und verminderte Alterung. Nachteile, die gegenwärtig noch vor­ handen sind, sind verringerte Druckfestigkeit sowie eine verringerte Schlagfestigkeit.

Die Produktentwicklung beschränkt sich inzwischen nicht mehr nur auf Folien. Auch feste Kunststoffprodukte, wie Töpfe, Platten und Schalen, sind mit einem Stärkegehalt von über 50% herzustellen. Des weiteren sind Stärke/ Polymermischungen günstig zu beurteilen, da sie eine sehr viel höhere biologi­ sche Abbaubarkeit aufweisen.

Außerordentliche Bedeutung haben weiterhin auf Grund ihres extremen Wasserbindungsvermögen Stärkepfropfpolymerisate ge­ wonnen. Dies sind Produkte mit einem Rückgrat aus Stärke und einer nach dem Prinzip des Radikalkettenmechanismus auf­ gepfropften Seitengitters eines synthetischen Monomers. Die heute verfügbaren Stärkepfropfpolymerisate zeichnen sich durch ein besseres Binde- und Rückhaltevermögen von bis zu 1000 g Wasser pro g Stärke bei hoher Viskosität aus. Die An­ wendungsbereiche für diese Superabsorber haben sich in den letzten Jahren stark ausgeweitet und liegen im Hygienebe­ reich mit Produkten Windeln und Unterlagen sowie im land­ wirtschaftlichen Sektor, z. B. bei Saatgutpillierungen.

Entscheidend für den Einsatz der neuen, gentechnisch verän­ derten Stärken sind zum einen die Struktur, Wassergehalt, Proteingehalt, Lipidgehalt, Fasergehalt, Asche/Phosphatgehalt, Amylose/Amylopektinverhältnis, Molmas­ senverteilung, Verzweigungsgrad, Korngröße und -form sowie Kristallinität, zum anderen auch die Eigenschaften, die in folgende Merkmale münden: Fließ- und Sorptionsverhalten, Verkleisterungstemperatur, Viskosität, Dickungsleistung, Löslichkeit, Kleisterstruktur und -transparenz, Hitze-, Scher- und Säurestabilität, Retrogradationsneigung, Gelbil­ dung, Gefrier/Taustabilität, Komplexbildung, Jodbindung, Filmbildung, Klebekraft, Enzymstabilität, Verdaulichkeit und Reaktivität.

Die Erzeugung modifizierter Stärken mittels gentechnischer Eingriffe in einer transgenen Pflanze kann zum einen die Eigenschaften der aus der Pflanze gewonnenen Stärke dahinge­ hend verändern, daß weitere Modifikationen mittels chemi­ scher oder physikalischer Verfahren nicht mehr notwendig er­ scheinen. Zum anderen können die durch gentechnische Verfah­ ren veränderte Stärken weiteren chemischen Modifikationen unterworfen werden, was zu weiteren Verbesserungen der Qua­ lität für bestimmte der oben beschriebenen Einsatzgebiete führt. Diese chemischen Modifikationen sind grundsätzlich bekannt. Insbesondere handelt es sich dabei um Modifikatio­ nen durch

• - Hitzebehandlung,
• - Säurebehandlung,
• - Oxidation und
• - Veresterungen,

welche zur Entstehung von Phosphat-, Nitrat-, Sulfat-, Xanthat-, Acetat- und Citratstärken führen. Weitere organi­ sche Säuren können ebenfalls zur Veresterung eingesetzt wer­ den:

• - Erzeugung von Stärkeethern Stärke-Alkylether, O-Allylether, Hydroxylalkylether, O-Carboxylmethylether, N-haltige Stärkeether, P-haltige Stärkeether, S-haltige Stärkeether
• - Erzeugung von vernetzten Stärken
• - Erzeugung von Stärke-Pfropf-Polymerisaten.

Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können prinzipi­ ell ferner auch dazu verwendet werden, Pflanzen herzustel­ len, bei denen die Aktivität des erfindungsgemäßen Debranching-Enzyms erhöht oder verringert ist und gleichzei­ tig die Aktivitäten anderer, an der Stärkebiosynthese betei­ ligter Enzyme verändert sind. Dabei sind alle Kombinationen und Permutationen denkbar. Beispielsweise können Nucleinsäu­ remoleküle, die für ein erfindungsgemäßes Protein codieren oder entsprechende antisense-Konstrukte, in Pflanzenzellen eingebracht werden, bei denen bereits die Synthese endogener GBSS I-, SSS I-, II- oder GBSS II-Proteine oder des su-Gens aufgrund eines antisense-Effektes oder einer Mutation inhi­ biert ist oder die Synthese des Verzweigungsenzyms inhibiert ist (wie z. B. beschrieben in WO92/14827 oder der ae-Mutante (Shannon und Garwood, in Whistler, BeMiller und Paschall, Starch: Chemistry and Technology, Academic Press, London, 2nd Edition (1984), 25-86).)

Soll die Inhibierung der Synthese mehrerer Debranching- Enzyme in transformierten Pflanzen erreicht werden, so kön­ nen DNA-Moleküle zur Transformation verwendet werden, die gleichzeitig mehrere, die entsprechenden Debranching-Enzyme codierenden Regionen in antisense-Orientierung unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors enthalten. Hierbei kann alternativ jede Sequenz unter der Kontrolle eines eigenen Promotors stehen, oder die Sequenzen können als Fusion von einem gemeinsamen Promotor transkribiert werden. Letztere Alternative wird in der Regel vorzuziehen sein, da in diesem Fall die Synthese der entsprechenden Proteine in etwa glei­ chem Maße inhibiert werden sollte.

Weiterhin ist die Konstruktion von DNA-Molekülen möglich, bei denen neben DNA-Sequenzen, die Debranching-Enzyme codie­ ren, weitere DNA-Sequenzen, die andere Proteine, die an der Stärkesynthese oder -modifikation beteiligt sind, in anti­ sense-Orientierung an einem geeigneten Promotor gekoppelt sind. Die Sequenzen können hierbei wiederum hintereinander­ geschaltet sein und von einem gemeinsamen Promotor transkri­ biert werden. Für die Länge der einzelnen codierenden Regio­ nen, die in einem derartigen Konstrukt verwendet werden, gilt das, was oben bereits für die Herstellung von anti­ sense-Konstrukten ausgeführt wurde. Eine obere Grenze für die Anzahl der in einem derartigen DNA-Molekül von einem Promotor aus transkribierten antisense-Fragmente gibt es nicht. Das entstehende Transkript sollte aber in der Regel eine Länge von nicht mehr als 20 kb, vorzugsweise von nicht mehr als 5 kb haben.

Codierende Regionen, die in derartigen DNA-Molekülen in Kom­ bination mit anderen codierenden Regionen in antisense- Orientierung hinter einem geeigneten Promotor lokalisiert sind, können aus DNA-Sequenzen stammen, die für folgende Proteine codieren: Stärkekorn-gebundene (GBSS I und II) und lösliche Stärkesynthasen (z. B. SSS I und II), Verzweigungs­ enzyme, Disproportionierungsenzyme und Stärkephosphorylasen. Dies ist nur eine beispielhafte Aufzählung. Auch die Verwen­ dung anderer DNA-Sequenzen im Rahmen einer derartigen Kombi­ nation ist denkbar.

Mit Hilfe derartiger Konstrukte ist es möglich, in Pflanzen­ zellen, die mit diesen transformiert wurde, die Synthese mehrerer Enzyme gleichzeitig zu inhibieren.

Weiterhin können die Konstrukte in klassische Mutanten ein­ gebracht werden, die für ein oder mehrere Gene der Stärke­ biosynthese defekt sind (Shannon und Garwood, siehe oben). Diese Defekte können sich z. B. auf folgende Proteine bezie­ hen: Stärkekorn-gebundene (GBSS I und II) und lösliche Stär­ kesynthasen (z. B. SSS I und II), Verzweigungsenzyme (BE I und II), "Debranching"-Enzyme (su-Locus), Disproportionie­ rungsenzyme und Stärkephosphorylasen. Dies ist wiederum nur eine beispielhafte Aufzählung.

Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen stehen eine große Anzahl von Clonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E.coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen ent­ halten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC- Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw . . Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation von E.coli-Zellen verwendet. Transformierte E.coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wieder­ gewonnen. Als Analysemethode zur Charakterisierung der ge­ wonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsana­ lysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-molekular­ biologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid- DNA-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden clo­ niert werden.

Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten.

Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzen­ zellen werden an sich keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z. B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus der­ artig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert wer­ den, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig.

Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzen­ zelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begren­ zung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführen­ den Genen verbunden werden.

Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Plasmide cloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können auf­ grund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plas­ mid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Re­ gion. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der interme­ diäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selek­ tionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al. Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzli­ che T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.

Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflan­ zenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offset­ drukkerÿ Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46 und An et al. EMBO J. 4 (1985), 277-287 beschrieben worden.

Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflan­ zen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert wer­ den. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Sus­ pensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Se­ lektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen kön­ nen dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden. Andere Möglichkeiten der Einführung fremder DNA un­ ter Verwendung des biolistischen Verfahrens oder durch Pro­ toplastentransformation sind bekannt (vgl. z. B. Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi- Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge).

Während die Transformation dikotyler Pflanzen über Ti-Plas­ mid-Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens wohl etabliert ist, weisen neuere Arbeiten darauf hin, daß auch monokotyle Pflanzen der Transformation mittels Agrobac­ terium basierender Vektoren sehr wohl zugänglich sind (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6 (1994), 271-282, Deng et al., Science in China 33 (1990), 28-34; Wilmink et al, Plant Cell Reports 11 (1992), 76-80; May et al., Bio/Technology 13 (1995), 486-492; Conner und Domisse; Int. J. Plant Sci. 153 (1992), 550-555; Ritchie et al., Transgenic Res. 2 (1993), 252-265).

Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes (Wan und Lemaux, Plant Physiol. 104 (1994), 37-48; Vasil et al., Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558; Ritala et al., Plant Mol. Biol. 24 (1994), 317-325; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79 (1990), 625-631), die Protoplasten­ transformation, die Elektroporation von partiell permeabili­ sierten Zellen, die Einbringung von DNA mittels Glasfasern.

Spezifisch die Transformation von Mais wird in der Literatur verschiedentlich beschrieben (vgl. z. B. WO95/06128, EP 0 513 849; EP 0 465 875; Fromm et al., Biotechnology 8 (1990), 833-844; Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2 (1990), 603-618; Koziel et al., Biotechnology 11 (1993), 194-200). In EP 292 435 wird ein Verfahren beschrieben, mit Hilfe des­ sen, ausgehend von einem schleimlosen, weichen (friable) granulösen Mais-Kallus, fertile Pflanzen erhalten werden können; Shillito et al. (Bio/Technology 7 (1989), 581) haben in diesem Zusammenhang beobachtet, daß es ferner für die Re­ generierbarkeit zu fertilen Pflanzen notwendig ist, von Kal­ lus-Suspensionskulturen auszugehen, aus denen eine sich tei­ lende Protoplastenkultur, mit der Fähigkeit zu Pflanzen zu regenerieren, herstellbar ist. Nach einer in vitro Kultivie­ rungszeit von 7 bis 8 Monaten erhalten Shillito et al. Pflanzen mit lebensfähigen Nachkommen, die jedoch Abnormali­ täten in der Morphologie und der Reproduktivität aufweisen.

Prioli und Söndahl (Bio/Technology 7 (1989), 589) beschrei­ ben die Regeneration und die Gewinnung fertiler Pflanzen aus Mais-Protoplasten der Cateto Mais-Inzuchtlinie Cat 100-1. Die Autoren vermuten, daß die Protoplasten-Regeneration zu fertilen Pflanzen abhängig ist von einer Anzahl verschiede­ ner Faktoren, wie z. B. von Genotyp, vom physiologischen Zu­ stand der Donor-Zellen und von den Kultivierungsbedingungen. Auch die erfolgreiche Transformation anderer Getreidearten wurde bereits beschrieben, z. B. für Gerste (Wan und Lemaux, s. o.; Ritala et al., s. o..) und für Weizen (Nehra et al., Plant J. 5 (1994) , 285-297).

Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektions­ marker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz ge­ genüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin u. a. ver­ mittelt. Der individuelle gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten.

Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften. Von den Pflanzenzellen können Samen gewonnen werden.

Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.

Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der erfindungs­ gemäßen Nucleinsäuremoleküle zur Herstellung von Pflanzen, die eine Amylopektinstärke mit einem veränderten Verzwei­ gungsgrad im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen synthetisieren.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder Teile dieser Moleküle bzw. der reversen Komplemente dieser Moleküle zur Identifizierung und Isolierung homologer Mole­ küle, die Proteine mit der enzymatischen Aktivität eines De­ branching-Enzyms codieren oder Fragmente derartiger Pro­ teine, aus Pflanzen oder anderen Organismen. Für die Defini­ tion des Begriffs "Homologie" siehe oben.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Verwendete Medien und Lösungen
Protoplastenisolierungsmedium (100 ml)
Cellulase Onozuka R S (Meÿi Seika, Japan)|800 mg
Pectolyase Y 23	40 mg
KNO₃	200 mg
KH₂PO₄	136 mg
K₂HPO₄	47 mg
CaCl₂ 2H₂O	147 mg
MgSO₄ 7H₂O	250 mg
Bovine serum albumin (BSA)	20 mg
Glucose	4000 mg
Fructose	4000 mg
Saccharose	1000 mg
pH	5,8
Osmolarität	660 mosm.

Protoplastenwaschlösung 1: wie Protoplastenisolierlösung, aber ohne Cellulase, Pectolyase und BSA.

Transformationspuffer

a) Glucose: 0,5 M
MES: 0,1%
MgCl₂ 6H₂O: 25 mM
pH: 5,8
auf 600 mosm. einstellen

b) PEG 6000-Lösung
Glucose: 0,5 M
MgCl₂ 6H₂O 100 mM
Hepes: 20 mM
pH: 6,5

Dem obigen Puffer unter b) wird PEG 6000 kurz vor Gebrauch der Lösung zugesetzt (40 Gew.-% PEG). Die Lösung wird durch ein 0,45 µm Sterilfilter filtriert.

WS Lösung
CaCl₂: 125 mM
NaCl: 150 mM
KCl: 5 mM
Glucose: 50 mM

Protoplasten-Kulturmedium (Angaben in mg/l)
KNO₃: 3000
(NH₄)₂SO₄:  500
MgSO₄7H₂O:  350
KH₂PO₄:  400
CaCl₂2H₂O:  300

Fe-EDTA und Spurenelemente wie im Murashige-Skoog-Medium (Physiol. Plant 15 (1962), 473).

m-Inosit
100
Thiamin HCl	1,0
Nicotinsäureamid	0,5
Pyridoxin HCl	0,5
Glycin	2,0
Glucuronsäure	750
Galacturonsäure	750
Galactose	500
Maltose	500
Glucose	36 000
Fructose	36 000
Saccharose	30 000
Asparagin	500
Glutamin	100
Prolin	300
Caseinhydrolysat	500
2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D)	0,5
pH	5,8
Osmolarität	600 mosm.

20 × SSC
175,3 g NaCl
 88,2 g Natrium-Citrat
ad 1000 ml mit ddH₂O
pH 7,0 mit 10 N NaOH

In den Beispielen werden die folgenden Methoden verwendet:

1. Clonierungsverfahren

Zur Clonierung in E.coli wurde der Vektor pBluescript II SK (Stratagene) verwendet.

2. Bakterienstämme

Für den Bluescript-Vektor und für die pUSP-Konstrukte wurde der E.coli-Stamm DH5α (Bethesda Research Laborato­ ries, Gaithersburgh, USA) verwendet. Für die in vivo excision wurde der E.coli-Stamm XL1-Blue verwendet.

3. Transformation von Mais (a) Herstellung von Protoplasten der Zellinie DSM 6009 Protoplastenisolierung

2-4 Tage, vorzugsweise 3 Tage nach dem letzten Me­ diumswechsel einer Protoplastensuspensionskultur wird das Flüssigmedium abgesaugt und die zurückblei­ benden Zellen mit 50 ml Protoplastenwaschlösung 1 gespült und nochmals trockengesaugt. Zu jeweils 2 g der geernteten Zellmasse wird 10 ml Protoplasteniso­ lierungsmedium gegeben. Die resuspendierten Zellen und Zellaggregate werden bei 27 ± 2°C unter leich­ tem Schütteln (30 bis 40 rpm) 4 bis 6 h im Dunkeln inkubiert.

Protoplastenreinigung

Sobald die Freisetzung von mindestens 1 Mio. Proto­ plasten/ml erfolgt ist (mikroskopische Beobachtung), wird die Suspension durch ein Edelstahl und Nylon­ sieb von 200 bzw. 45 µm Maschenwerte gesiebt. Die Kombination eines 100 µm und eines 60 µm Siebs er­ möglicht die Abtrennung der Zellaggregate genauso gut. Das protoplastenhaltige Filtrat wird mikrosko­ pisch beurteilt. Üblicherweise enthält es 98-99% Protoplasten. Der Rest sind unverdaute Einzelzellen. Protoplastenpräparationen mit diesem Reinheitsgrad werden ohne zusätzliche Gradientenzentrifugation für Transformationsexperimente verwendet. Durch Zentri­ fugation (100 UpM im Aufschwingrotor (100 × g, 3 min) werden die Protoplasten sedimentiert. Der Über­ stand wird verworfen und die Protoplasten in Wasch­ lösung 1 resuspendiert. Die Zentrifugation wird wie­ derholt und die Protoplasten danach im Transformati­ onspuffer resuspendiert.

(b) Protoplastentransformation

Die in Transformationspuffer resuspendierten Proto­ plasten werden bei einem Titer von 0,5 - 1 × 10⁶ Protoplasten/ml in 10 ml Portionen in 50 ml Poly­ allomer-Röhrchen eingefüllt. Die zur Transformation verwendete DNA wird in Tris-EDTA (TE) Puffer gelöst. Pro ml Protoplastensuspension werden 20 µg Plasmid- DNA zugegeben. Als Vektor wird dabei ein Phosphino­ tricinresistenz vermittelndes Plasmid verwendet (vgl. z. B. EP 0 513 849). Nach der DNA-Zugabe wird die Protoplastensuspension vorsichtig geschüttelt, um die DNA homogen in der Lösung zu verteilen. So­ fort danach wird tropfenweise 5 ml PEG-Lösung zuge­ tropft.

Durch vorsichtiges Schwenken der Röhrchen wird die PEG-Lösung homogen verteilt. Danach werden nochmals 5 ml PEG-Lösung zugegeben und das homogene Durchmi­ schen wiederholt. Die Protoplasten verbleiben 20 min der PEG-Lösung bei ± 2°C. Danach werden die Proto­ plasten durch 3-minütiges Zentrifugieren (100 g; 1000 Upm) sedimentiert. Der Überstand wird verwor­ fen. Die Protoplasten werden durch vorsichtiges Schütteln in 20 ml WS-Lösung gewaschen und danach erneut zentrifugiert. Danach werden sie in 20 ml Protoplastenkulturmedium resuspendiert, nochmals zentrifugiert und erneut in Kulturmedium resuspen­ diert. Der Titer wird auf 6 - 8 × 10⁵ Protopla­ sten/ml eingestellt und die Protoplasten in 3 ml Portionen in Petrischalen (¢ 60 mm, Höhe 15 mm) kul­ tiviert. Die mit Parafilm versiegelten Petrischalen werden bei 25 ± 2°C im Dunkeln aufgestellt.

(c) Protoplastenkultur

Während der ersten 2-3 Wochen nach der Protopla­ stenisolierung und -transformation werden die Proto­ plasten ohne Zugabe von frischem Medium kultiviert. Sobald sich die aus den Protoplasten regenerierten Zellen zu Zellaggregaten mit mehr als 20-50 Zellen entwickelt haben, wird 1 ml frisches Protoplasten­ kulturmedium zugegeben, das als Osmoticum Saccharose (90 g/l) enthält.

(d) Selektion transformierter Maiszellen und Pflanzenre­ generation

3-10 Tage nach der Zugabe von frischem Medium kön­ nen die aus Protoplasten entstandenen Zellaggregate auf Agar-Medien mit 100 mg/l L-Phosphinothricin plattiert werden. N6-Medium mit den Vitaminen des Protoplastenkulturmediums, 90 g/l Saccharose und 1,0 mg/l 2,4D ist ebenso geeignet wie ein analoges Me­ dium beispielsweise mit den Makro- und Mikronährsal­ zen des MS-Mediums (Murashige und Skoog (1962), siehe oben).

Auf dem Selektivmedium können die aus stabil trans­ formierten Protoplasten hervorgegangenen Kalli unge­ hindert weiterwachsen. Nach 3 - 5 Wochen, vorzugs­ weise 4 Wochen können die transgenen Kalli auf fri­ sches Selektionsmedium transferiert werden, welches ebenfalls 100 mg/l L-Phosphinothricin enthält, das aber kein Auxin mehr enthält. Innerhalb von 3-5 Wochen differenzieren ca. 50% der transgenen Mais­ kalli, die das L-Phosphinothricinacetyltransferase- Gen in ihr Genom integriert haben, auf diesem Medium in Gegenwart von L-Phosphinothricin erste Pflanzen.

(e) Aufzucht transgener Regeneratpflanzen

Das embryogene transformierte Maisgewebe wird auf hormonfreiem N6-Medium (Chu C.C. et al., Sci. Sin. 16 (1975), 659) in Gegenwart von 5×10^-4 M L-Phosphi­ nothricin kultiviert. Auf diesem Medium entwickeln sich Maisembryonen, die das Phsphinothricinacetyl­ transferase-Gen (PAT-Gen) hinreichend stark expri­ mieren, zu Pflanzen. Nicht transformierte Embryonen oder solche mit nur sehr schwacher PAT-Aktivität sterben ab. Sobald die Blätter der in vitro-Pflanzen eine Länge von 4-6 mm erreicht haben, können diese in Erde transferiert werden. Nach Abwaschen von Agarresten an den Wurzeln werden die Pflanzen in ein Gemisch von Lehm, Sand, Vermiculit und Einheitserde im Verhältnis 3 : 1:1 : 1 gepflanzt und während der er­ sten 3 Tage nach dem Verpflanzen bei 90-100% re­ lativer Luftfeuchte an die Erdkultur adaptiert. Die Anzucht erfolgt in einer Klimakammer mit 14 h Licht­ periode ca. 25000 Lux in Pflanzenhöhe bei einer Tag/Nachttemperatur von 23 ± 1/17 ± 1°C. Die adap­ tierten Pflanzen werden bei einer Luft feuchte von 65 ± 5% kultiviert.

4. Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten

Die radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten wurde mit Hilfe eines DNA-Random Primer Labelling Kits der Firma Boehringer (Deutschland) nach den Angaben des Herstel­ lers durchgeführt.

Beispiel 1 Clonierung einer cDNA, die ein neues Debranching-Enzym aus Zea mays codiert

Zur Isolierung von cDNA-Molekülen, die ein Debranching-Enzym aus Mais codieren, wurde eine cDNA-Bibliothek ausgehend von polyA⁺-RNA aus Maisblättern in dem Vektor Lambda ZAPII (Stratagene) erstellt und in Phagenköpfe verpackt. E. coli- Zellen des Stammes XL1-Blue wurden anschließend mit den die cDNA-Fragmente enthaltenden Phagen infiziert (1 × 10⁶ pfu) und auf Medium in Petrischalen in einer Dichte von ca. 30.000 pro 75 cm² ausplattiert. Nach ca. 8 stündiger Inkuba­ tion wurden Nitrozellulosemembranen auf den lysierten Bakte­ rienrasen aufgelegt, die nach einer Minute abgenommen wur­ den. Die Filter wurden für 2 min in 0,2 M NaOH; 1,5 M NaCl, dann für 2 min in 0,4 M Tris/HCl pH 7,5 und anschließend für 2 min in 2 × SSC inkubiert. Nach Trocknung und Fixierung der DNA durch UV-Crosslinking wurden die Filter 3 h lang in Hy­ bridisierungspuffer bei 42°C inkubiert, bevor radioaktiv markierte Probe zugesetzt wurde.

Als Probe wurde eine cDNA aus Kartoffel verwendet, die ein Debranching-Enzym aus Kartoffel codiert (siehe Seq ID No. 3). Diese war zuvor mit Hilfe degenerierter Oligonucleotide isoliert worden, die von der partiellen Aminosäuresequenz eines Debranching-Enzyms aus Kartoffel abgeleitet worden wa­ ren.

Die Hybridisierung wurde bei 48°C durchgeführt in 2 × SSC, 10 × Dehnhardts-Lösung; 50 mM Na₂HPO₄, pH 7,2; 0,2% SDS; 5 mM EDTA und 250 µg/ml denaturierte Heringssperma-DNA.

Hybridisierende Phagenclone wurden unter Anwendung von Standardverfahren vereinzelt und weiter gereinigt. Mit Hilfe der in-vivo-excision Methode wurden von positiven Phagenclo­ nen E. coli-Clone gewonnen, die ein doppelsträngiges pBluescript-Plasmid mit der jeweiligen cDNA-Insertion ent­ halten. Nach Überprüfung der Größe und des Restriktionsmu­ sters der Insertion wurde von geeigneten Clonen Plasmid-DNA isoliert. Ein derart isoliertes Plasmid, pREM-53, besaß eine Insertion von 1195 bp.

Beispiel 2 Sequenzanalyse der cDNA-Insertion des Plasmids pREM-53

Bei dem entsprechend Beispiel 1 isolierten Plasmids pREM-53 wurde die Nucleotidsequenz der cDNA-Insertion durch Standardverfahren mittels der Didesoxymethode (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467) be­ stimmt. Die Insertion ist 1995 bp lang und die Nucleotidse­ quenz sowie die abgeleitete Aminosäuresequenz ist in Seq ID No. 1 angegeben.

Homologievergleiche ergaben, daß es sich bei dem codierten Protein um ein neues Debranching-Enzym aus Mais handelt.

Die unter Seq ID No. 1 angegebene Nucleotidsequenz repräsen­ tiert eine partielle cDNA, die ein bisher unbekanntes Debranching-Enzym aus Mais codiert. Mit Hilfe dieser Sequenz ist es möglich mittels konventioneller Methoden eine voll­ ständige cDNA-Sequenz oder eine genomische Sequenz aus ge­ eigneten cDNA- oder genomischen Bibliotheken zu isolieren.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (23)

1. Nucleinsäuremolekül, das ein Protein aus Zea mays mit der biologischen Aktivität eines Debranching-Enzyms oder ein biologisch aktives Fragment davon codiert, ausge­ wählt aus der Gruppe bestehend aus:

• (a) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein mit der unter SeqID No. 2 angegebenen Aminosäuresequenz codieren;
• (b) Nucleinsäuremolekülen, die die unter Seq ID No. 1 angegebene Nucleotidsequenz enthalten;
• (c) Nucleinsäuremolekülen, die mit einem Nucleinsäuremo­ lekül nach (a) oder (b) hybridisieren; und
• (d) Nucleinsäuremolekülen, deren Nucleotidsequenz auf­ grund der Degeneration des genetischen Codes von der Nucleotidsequenz eines Nucleinsäuremoleküls nach (a), (b) oder (c) abweicht.

2. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das ein cDNA-Mole­ kül ist.

3. Nucleinsäuremolekül von mindestens 15 bp Länge, das spe­ zifisch mit einem Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2 hybridisiert.

4. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 3, das spezifisch mit einem Transkript eines Nucleinsäuremoleküls nach An­ spruch 1 oder 2 hybridisiert und dadurch dessen Transla­ tion verhindert.

5. Vektor enthaltend ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2.

6. Vektor nach Anspruch 5, wobei das Nucleinsäuremolekül in sense-Orientierung mit regulatorischen Elementen ver­ knüpft ist, die die Transkription und Translation in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen ermöglichen.

7. Wirtszelle, die mit einem Nucleinsäuremolekül nach An­ spruch 1 oder 2 oder mit einem Vektor nach Anspruch 5 oder 6 transformiert wurde, oder von einer solchen Zelle abstammt.

8. Verfahren zur Herstellung eines Proteins aus Zea mays mit der biologischen Aktivität eines Debranching-Enzyms oder eines biologisch aktiven Fragments davon, bei dem Wirtszellen nach Anspruch 7 unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden und das synthetisierte Protein aus der Kultur gewonnen wird.

9. Protein aus Zea mays mit der biologischen Aktivität eines Debranching-Enzyms, das codiert wird von einem Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2.

10. Wirtszelle nach Anspruch 7, die eine transgene Pflanzen­ zelle ist und wobei ein Nucleinsäuremolekül nach An­ spruch 1 oder 2 stabil, im Genom integriert vorliegt und exprimiert wird.

11. Transgene Pflanze enthaltend transgene Pflanzenzellen nach Anspruch 10.

12. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 11, die eine stär­ kespeichernde Pflanze ist.

13. Transgene Pflanze nach Anspruch 12, die eine Getreide­ pflanze ist.

14. Transgene Pflanze nach Anspruch 13, die eine Maispflanze ist.

15. Stärke erhältlich aus Pflanzenzellen nach Anspruch 10 oder aus Pflanzen nach einem der Ansprüche 11 bis 14.

16. Transgene Pflanzenzelle, bei der die Aktivität eines Debranching-Enzyms, das durch ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2 codiert wird, reduziert ist im Vergleich zu nichttransformierten Zellen aufgrund der Inhibition der Transkription oder Translation von endo­ genen Nucleinsäuremolekülen, die ein Debranching-Enzym codieren.

17. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 16, enthaltend ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2 oder einen Teil eines solchen Nucleinsäuremoleküls, wobei das Nucleinsäuremolekül oder der Teil davon in antisense- Orientierung mit regulatorischen Elementen verknüpft ist, die die Transkription in pflanzlichen Zellen ge­ währleisten.

18. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 16 oder 17, expri­ mierend ein Ribozym, das spezifisch Transkripte von Nucleinsäuremolekülen nach Anspruch 1 oder 2 spaltet.

19. Transgene Pflanzen enthaltend Pflanzenzellen nach einem der Ansprüche 16 bis 18.

20. Transgene Pflanze nach Anspruch 19, die eine Maispflanze ist.

21. Stärke erhältlich aus Pflanzenzellen nach einem der An­ sprüche 16 bis 18 oder aus Pflanzen nach Anspruch 19 oder 21.

22. Vermehrungsmaterial von Pflanzen nach einem der Ansprü­ che 11 bis 14 oder nach Anspruch 19 oder 20 enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 10 oder einem der Ansprüche 16 bis 18.

23. Verwendung der Stärke nach Anspruch 15 oder 21 zur Her­ stellung von Lebensmitteln oder industriellen Produkten.