DE69737507T2

DE69737507T2 - Neue nukleinsäuremoleküle aus mais und deren verwendung zur herstellung modifizierter stärke

Info

Publication number: DE69737507T2
Application number: DE69737507T
Authority: DE
Inventors: Jens Dr. Kossmann; Michael Dr. Emmermann
Original assignee: Bayer Bioscience GmbH
Current assignee: Bayer Bioscience GmbH
Priority date: 1996-12-19
Filing date: 1997-12-18
Publication date: 2007-11-29
Anticipated expiration: 2017-12-19
Also published as: JP2001522223A; ATE357522T1; EP0950107B1; DE19653176A1; PT950107E; US7186898B1; EP0950107A1; JP4098365B2; ES2280086T3; AU740492B2; DE69737507D1; CA2272844A1; WO1998027212A1; AU5857798A; AU740492C; CA2272844C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäuremoleküle, die ein Stärkekorngebundenes Protein aus Mais codieren, sowie Verfahren und rekombinante DNA-Moleküle zur Herstellung transgener Pflanzenzellen und Pflanzen, die modifizierte Stärke synthetisieren. Die Erfindung betrifft ebenfalls die aus den Verfahren resultierenden transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen und ein Verfahren für die Herstellung einer modifizierten Stärke, umfassend den Schritt des Extrahierens der Stärke aus der Pflanze und/oder aus dem Stärke-speichernden Teil einer solchen Pflanze.
Das Polysaccharid Stärke, das einen der wichtigsten Speicherstoffe im Pflanzenreich darstellt, findet neben der Verwendung im Nahrungsmittelbereich auch eine breite Verwendung als nachwachsender Rohstoff für die Herstellung industrieller Produkte. Um die Anwendung dieses Rohstoffes in möglichst vielen Einsatzgebieten zu ermöglichen, ist es notwendig, eine große Stoffvielfalt und eine Anpassung dieser Stoffe an die vielfältigen Anforderungen der verarbeitenden Industrie zu erreichen.
Obwohl Stärke aus einem chemisch homogenen Grundbaustein, der Glucose, aufgebaut ist, stellt Stärke keinen homogenen Rohstoff dar. Es handelt sich dabei eher um ein komplexes Gemisch aus unterschiedlichen Molekülfarmen, die sich hinsichtlich ihres Polymerisationsgrades und des Verzweigungsgrades der Glucoseketten unterscheiden. Man unterscheidet insbesondere die Amylose-Stärke, ein im Wesentlichen unverzweigtes Polymer aus α-1,4-glycosidisch verknüpften Glucosemolekülen, von der Amylopektin-Stärke, die wiederum ein Gemisch aus mehr oder weniger stark verzweigten Glucoseketten darstellt, wobei die Verzweigungen durch das Auftreten von α-1,6-glycosidischen Verknüpfungen zustande kommen.
Die molekulare Struktur der Stärke, die zu einem großen Teil durch den Verzweigungsgrad, das Verhältnis von Amylose zu Amylopektin, die durchschnittliche Kettenlänge sowie das Vorhandensein von Phosphatgruppen bestimmt wird, ist ausschlaggebend für wichtige funktionelle Eigenschaften der Stärke bzw. ihrer wässrigen Lösungen. Als wichtige funktionelle Eigenschaften sind hierbei beispielsweise zu nennen die Löslichkeit, das Retrogradierungsverhalten, die Filmbildungseigenschaften, die Viskosität, die Verkleisterungseigenschaften, d.h. Binde- und Klebeigenschaften, sowie die Kältestabilität der Stärke. Auch die Stärkekorngröße kann für verschiedene Anwendungen von Bedeutung sein. Von Interesse ist insbesondere die Erzeugung von hochamylosehaltigen Stärken. Ferner kann eine in Pflanzenzellen enthaltene modifizierte Stärke das Verhalten der Pflanzenzelle unter bestimmten Bedingungen vorteilhaft verändern. Denkbar ist beispielsweise eine Verringerung des Stärkeabbaus während der Lagerung von Stärke-enthaltenden Organen wie z.B. Samen oder Knollen vor deren weiterer Verarbeitung, z.B. durch Extraktion der Stärke. Ferner ist es von Interesse, modifizierte Stärken herzustellen, die dazu führen, dass Pflanzenzellen oder pflanzliche Organe, die diese Stärke enthalten, besser zur Weiterverarbeitung geeignet sind, beispielsweise bei der Herstellung von Popcorn oder Cornflakes aus Mais oder von Pommes frites, Chips oder Kartoffelpulver aus Kartoffeln. Von besonderem Interesse ist hierbei die Verbesserung der Stärken in der Hinsicht, dass sie ein reduziertes "cold sweetening" aufweisen, d.h. eine verringerte Freisetzung von reduzierten Zuckern (insbesondere Glucose) bei einer längeren Lagerung bei niedrigen Temperaturen.
Stärke, die aus Pflanzen isoliert werden kann, wird häufig durch chemische Veränderungen, die in der Regel zeitaufwendig und teuer sind, der jeweiligen industriellen Verwendung angepasst. Es ist daher wünschenswert, Möglichkeiten zu finden, Pflanzen herzustellen, die eine Stärke synthetisieren, die in ihren Eigenschaften bereits den Anforderungen der verarbeitenden Industrie entspricht.
Herkömmliche Wege zur Herstellung derartiger Pflanzen bestehen in klassischen Züchtungsverfahren und der Erzeugung von Mutanten. So wurde beispielsweise bei Mais eine Mutante erzeugt, die eine Stärke mit veränderten Viskositätseigenschaften synthetisiert (US-Patentschrift 5,331,108), sowie eine Maisvarietät (waxy maize) durch Züchtung etabliert, deren Stärke zu nahezu 100% aus Amylopektin besteht (Akasuka und Nelson, J. Biol. Chem. 241 (1966), 2280-2285). Ferner sind bei Mais und Erbse Mutanten beschrieben worden, die Stärken mit hohem Amylosegehalt synthetisieren (70% in Mais bzw. bis zu 50% in Erbse). Diese Mutanten sind bisher nicht auf molekularer Ebene charakterisiert worden und erlauben somit auch nicht die Erzeugung entsprechender Mutanten in anderen Stärke-speichernden Pflanzen.
Alternativ können Pflanzen, die eine Stärke mit veränderten Eigenschaften synthetisieren, mit Hilfe rekombinanter DNA-Verfahren erzeugt werden. Beschrieben wurde beispielsweise in mehreren Fällen die Veränderung durch Rekombination von Kartoffelpflanzen mit dem Ziel der Veränderung der in den Pflanzen synthetisierten Stärke (z.B. WO 92/11376; WO 92/14827). Voraussetzung für die Anwendung rekombinanter DNA-Verfahren ist jedoch die Verfügbarkeit von DNA-Sequenzen, deren Genprodukte einen Einfluss auf die Stärkesynthese, die Stärkemodifikation oder den Stärkeabbau haben.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Nucleinsäuremoleküle und Verfahren zur Verfügung zu stellen, die es ermöglichen, Pflanzen dahingehend zu verändern, dass sie eine Stärke synthetisieren, die sich hinsichtlich ihrer physikalischen und/oder chemischen Eigenschaften von natürlicherweise in den Pflanzen synthetisierter Stärke unterscheidet und die somit für allgemeine und/oder spezielle Verwendungszwecke besser geeignet ist.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen bezeichneten Ausführungsformen gelöst.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit Nucleinsäuremoleküle, die ein Protein mit der unter SEQ ID NO:6 oder SEQ ID NO:8 angegebenen Aminosäuresequenz codieren. Derartige Proteine liegen in den Plastiden pflanzlicher Zellen sowohl an Stärkekörnern gebunden, als auch in freier, d.h. löslicher Form, vor.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremoleküle, die eine Sequenz mit der unter SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:7 angegebenen Nucleotidsequenz, insbesondere die in SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:7 angegebene codierende Region, umfassen.
Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Nucleinsäuremoleküle, die ein Maisprotein codieren, das in den Plastiden der Zellen zum Teil an Stärkekörnern gebunden vorliegt, und die mit den oben genannten erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen oder ihrem komplementären Strang hybridisieren. Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet in diesem Zusammenhang eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben sind.

Stärker bevorzugte Hybridisierungen treten unter den folgenden Bedingungen auf:

Hybridisierungspuffer:	2 × SSC; 10 × Denhardt-Lösung (Ficoll 400 + PEG + BSA; im Verhältnis 1:1:1); 0,1 % SDS; 5 mM EDTA; 50 mM Na₂HPO₄; 250 μg/ml Heringssperma-DNA; 50 μg/ml tRNA; oder 0,25 M Natrium-phosphatbuffer pH 7,2 1 mM EDTA 7% SDS
Hybridisierungstemperatur	T = 65 + 68°C
Waschpuffer:	0,2 × SSC; 0,1 % SDS
Waschtemperatur	T = 40 bis 68°C

Nucleinsäuremoleküle, die mit den erfindungsgemäßen Molekülen hybridisieren, können z.B. aus genomischen oder aus cDNA-Bibliotheken aus Maiszellen oder Maisgewebe isoliert werden.
Die Identifizierung und Isolierung derartiger Nucleinsäuremoleküle kann dabei unter Verwendung der erfindungsgemäßen Moleküle oder von Teilen dieser Moleküle oder ggf. der reversen komplementären Stränge dieser Moleküle erfolgen, z.B. mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe z.B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Als Hybridisierungssonde können z.B. Nucleinsäuremoleküle verwendet werden, die exakt die oder im Wesentlichen die unter SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:7 angegebene Nucleotidsequenz oder Teile davon aufweisen. Bei den als Hybridisierungssonde verwendeten DNA-Fragmenten kann es sich auch um synthetische DNA-Fragmente handeln, die mit Hilfe der gängigen DNA-Synthesetechniken hergestellt wurden und deren Sequenz im Wesentlichen mit der der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle übereinstimmt. Im Anschluss an die Identifizierung und Isolierung der Gene, die mit den erfindungsgemäßen Sequenzen hybridisieren, ist eine Bestimmung der Sequenz und eine Analyse der Eigenschaften der von dieser Sequenz codierten Proteine erforderlich.
Diese hybridisierenden Nucleinsäuremoleküle beinhalten auch Fragmente, Derivate und allelische Varianten der oben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle, die das oben beschriebene Protein codieren. Unter Fragmenten werden dabei in diesem Zusammenhang Teile der Nucleinsäuremoleküle verstanden, die lang genug sind, um das oben beschriebene Protein zu codieren. Der Ausdruck Derivat bedeutet, dass die Sequenzen dieser Moleküle sich von den Sequenzen der oben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle an einer oder mehreren Positionen unterscheiden und einen hohen Grad an Homologie zu den Sequenzen dieser Moleküle aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität von mindestens 80%, noch mehr bevorzugt eine Sequenzidentiät von mehr als 90% und besonders bevorzugt von mehr als 95%. Die Abweichungen zu den oben beschriebenen Nucleinsäuremolekülen können dabei durch Addition, Deletion, Substitution, Insertion oder Rekombination entstanden sein.
Homologie bedeutet ferner, dass funktionelle und/oder strukturelle Äquivalenz zwischen den betreffenden Nucleinsäuremolekülen oder den durch sie codierten Proteinen besteht. Bei den Nucleinsäuremolekülen, die homolog zu den oben beschriebenen Nucleinsäuremolekülen sind und Derivate dieser Moleküle darstellen, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Nucleinsäuremoleküle, die Modifikationen darstellen, die dieselbe biologische Funktion ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftretende Variationen oder Mutationen handeln, wobei diese Mutationen auf natürliche Weise aufgetreten sein können oder gezielt eingeführt wurden. Darüber hinaus kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln.
Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende Varianten handeln, als auch um synthetisch hergestellte oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugte Varianten.
Die von den verschiedenen Varianten der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codierten Proteine weisen bestimmte gemeinsame Charakteristika auf. Dazu können z.B. Enzymaktivität, Molekulargewicht, immunologische Reaktivität, Konformation etc. gehören, sowie physikalische Eigenschaften wie z.B. das Laufverhalten bei Gelelektrophoresen, chromatographisches Verhalten, Sedimentationskoeffizienten, Löslichkeit, spektroskopische Eigenschaften, Stabilität, pH-Optimum, Temperatur-Optimum etc.
Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremoleküle, deren Sequenzen im Vergleich zu den Sequenzen der oben genannten Moleküle auf Grund des genetischen Codes degeneriert sind und die ein Protein codieren, das in den Plastiden von Pflanzenzellen teils in an Stärkekörner gebundener Form, teils in freier Form, d.h. in löslicher Form, vorliegt.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können beispielsweise aus natürlichen Quellen isoliert werden, durch gentechnische Verfahren, z.B. PCR, hergestellt werden oder durch dem Fachmann bekannte Syntheseverfahren hergestellt werden.
Bei den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen kann es sich sowohl um DNA-Moleküle, beispielsweise um cDNA oder genomische DNA, als auch um RNA-Moleküle handeln.
Ferner betrifft die Erfindung Vektoren, insbesondere Plasmide, Cosmide, Viren, Bacteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren, die die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in den Vektoren enthaltenen Nucleinsäuremoleküle verknüpft mit regulatorischen Elementen, die die Transkription und Synthese einer translatierbaren RNA in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen gewährleisten.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Wirtszellen, insbesondere prokaryontische oder eukaryontische Zellen, die mit einem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül oder Vektor transformiert und/oder durch Rekombination manipuliert sind, sowie Zellen, die von solchen Zellen abstammen und ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül oder einen erfindungsgemäßen Vektor enthalten. Dabei handelt es sich vorzugsweise um bakterielle Zellen oder um Pflanzenzellen.
Es wurde nun gefunden, dass das durch die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codierte Protein einen Einfluss auf die Stärkesynthese bzw.-modifikation hat und eine Veränderung der Menge des Proteins in pflanzlichen Zellen zu Veränderungen im Stärkemetabolismus der Pflanzen führt, insbesondere zur Synthese von Stärken mit veränderten physikalischen und chemischen Eigenschaften.
Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle ist es somit möglich, mit Hilfe rekombinanter DNA-Verfahren Pflanzen herzustellen, die eine modifizierte Stärke synthetisieren, die sich in ihrer Struktur und ihren physikalischen und chemischen Eigenschaften von in Wildtyp-Pflanzen synthetisierter Stärke unterscheidet. Hierzu werden die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle mit regulatorischen Elementen verknüpft, die die Transkription und Translation in Pflanzenzellen gewährleisten, und in pflanzliche Zellen eingebracht.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch transgene Pflanzenzellen, die ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül enthalten, wobei dieses mit regulatorischen Elementen verknüpft ist, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten. Die regulatorischen Elemente sind vorzugsweise heterolog in Bezug auf das Nucleinsäuremolekül.
Solche erfindungsgemäßen Pflanzenzellen unterscheiden sich von natürlich vorkommenden Pflanzenzellen unter anderem darin, dass in ihr Genom mindestens eine Kopie des erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls integriert ist, möglicherweise zusätzlich zu den natürlich vorkommenden Kopien. Darüber hinaus befindet/befinden sich diese zusätzliche(n) Kopie(n) im Genom an einer Stelle, an der sie nicht natürlicherweise vorkommen. Dies lässt sich beispielsweise anhand der Southern-Blot-Analyse nachweisen. Außerdem ist es möglich, solche transgenen Pflanzenzellen von entsprechenden, natürlich vorkommenden Pflanzenzellen anhand mindestens einem der folgenden Merkmale zu unterscheiden: Wenn das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül, das in die Pflanzenzelle eingeführt wurde, in Bezug auf die Pflanzenzellen heterolog ist, können die transgenen Zellen von nicht transformierten Zellen auf Grund des Vorhandenseins von Transkripten des eingeführten erfindungsgemäßen Moleküls unterschieden werden. Solche Transkripte können z.B. anhand der Northern-Blot-Analyse nachgewiesen werden. Bevorzugt enthalten die transgenen Zellen außerdem das Protein, das vom erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolkül codiert wird. Das Vorhandensein des Proteins lässt sich z.B. mit immunologischen Methoden wie der Western-Blot-Analyse nachweisen.
Wenn das in die Zellen eingeführte erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül mit Bezug auf die Zellen homolog ist, können die transgenen Zellen beispielsweise auf Grund der zusätzlichen Expression des erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls von nicht-transformierten Zellen unterschieden werden. Insbesondere enthalten die transgenen Zellen bevorzugt mehr Transkripte der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle. Dies kann z.B. anhand der Northern-Blot-Analyse nachgewiesen werden. „Mehr" bedeutet bevorzugt mindestens 10% mehr, stärker bevorzugt 20% mehr und noch stärker bevorzugt mindestens 50% mehr. Entsprechend enthalten die transgenen Zellen bevorzugt mehr erfindungsgemäßes Protein im Vergleich zu nicht-transformierten Zellen. Dies kann z.B. anhand der Western-Blot-Analyse nachgewiesen werden. Bevorzugt enthalten die Zellen mindestens 10%, stärker bevorzugt mindestens 20% und noch stärker bevorzugt mindestens 50% mehr erfindungsgemäßes Protein.
Die transgenen Pflanzenzellen können nach dem Fachmann bekannten Techniken zu ganzen Pflanzen regeneriert werden. Die durch Regeneration der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen erhältlichen Pflanzen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Ferner sind Gegenstand der Erfindung Pflanzen, die die oben beschriebenen transgenen Pflanzenzellen enthalten. Bei den transgenen Pflanzen kann es sich prinzipiell um Pflanzen jeder beliebigen gewünschten Pflanzenspezies handeln, d.h. sie können sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen sein. Bevorzugt handelt es sich um Pflanzen, insbesondere Stärke-synthetisierende oder Stärkespeichernde Nutzpflanzen wie z.B. Getreidearten (Roggen, Gerste, Hafer, Weizen, Hirse, Sago etc.), Reis, Mais, Erbse, Markerbse, Maniok und Kartoffel, Tomate, Ölsaat, Raps mit ölhaltigem Samen, Sojabohne, Hanf, Flachs, Sonnenblume, Langbohne und Pfeilwurz.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren für die Herstellung einer modifizierten Stärke, umfassend den Schritte der Extraktion der Stärke aus den oben genannten erfindungsgemäßen Pflanzen und/oder aus Stärke-speichernden Teilen solcher Pflanzen. Bevorzugt umfasst ein solches Verfahren vor der Extraktion der Stärke außerdem die Schritte des Züchtens erfindungsgemäßer Pflanzen und des Erntens der gezüchteten Pflanzen und/oder Stärke-speichernder Teile dieser Pflanzen.
Verfahren für die Extraktion von Stärke aus Pflanzen oder aus Stärke-speichernden Teilen von Pflanzen sind dem Fachmann bekannt. Verfahren für die Extraktion von Stärke aus Maissamen sind z.B. in Eckhoff et al. (Cereal Chem. 73 (1996), 54-57) beschrieben. Die Extraktion von Maisstärke in industriellem Umfang erfolgt normalerweise mittels "Nassvermahlung". Darüber hinaus werden Methoden für die Extraktion von Stärke aus verschiedenen Stärke-speichernden Pflanzen u.a. beschrieben in: Starch: Chemistry and Technology (Hrsg.: Whistler, BeMiller und Paschall (1994) 2. Aufl., Academic Press Inc., London LTD; ISBN 0-12-746270-8; siehe z.B. Kapitel XII, S. 417-468: Corn and Sorghum Starches: Production; von Watson, S.A; Kapitel XIII, S. 469-479: Tapioca, Arrowroot and Sago Starches: Production; von Corbishley und Miller; Kapitel XIV, S. 479-490: Potato Starch: Production and Uses; von Mitch; Kapitel XV, S 491-506: Wheat Starch: Production, Modification and uses; von Knight und Olson; und Kapitel XVI, S. 507-528: Rice Starch: Production and Use; von Rohwer und Klem). Mittel, die gewöhnlich in den Methoden für die Extraktion von Stärken aus Pflanzenmaterial verwendet werden, sind Separatoren, Dekantiergefäße, Hydrozyklone sowie verschiedene Arten von Maschinen zum Trocknen der Stärke, z.B. Zerstäubungstrockner oder Luftstromtrockner.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren für die Herstellung einer modifizierten Stärke, das den Schritt der Extraktion der Stärke aus der Pflanze nach Anspruch 22 oder 27 und/oder aus einem Stärke-speichernden Teil einer solchen Pflanze umfasst. Auf Grund der Expression oder der zusätzlichen Expression eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls synthetisieren die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen eine Stärke, die im Vergleich zu Stärke aus Wildtyppflanzen, also nicht-transformierten Pflanzen, modifiziert ist.
Insbesondere weist eine solche Stärke bevorzugt einen höheren Phosphatgehalt als Stärke auf, die von entsprechenden nicht-transformierten Zellen oder Pflanzen synthetisiert wird. Ein höherer Phosphatgehalt bedeutet bevorzugt, dass die Stärke mindestens 10%, stärker bevorzugt mindestens 30%, noch stärker bevorzugt mindestens 50% und besonders bevorzugt mindestens 100% mehr Phosphat enthält als Stärke aus entsprechenden nicht-transformierten Zellen oder Pflanzen. Stärken mit einem hohen Phosphatgehalt sind u.a. von besonderem Interesse für die Papierindustrie, z.B. bei der Bearbeitung der Papieroberfläche. Normalerweise wird in der Papierindustrie bei der Oberflächenleimung bzw. dem Beschichten chemisch modifizierte Stärke, z.B. hydroxyethylierte oder phosphorylierte Stärke, verwendet. Mit der Herstellung von hochphosphorylierter Stärke in Pflanzen ließe sich somit die chemische Modifizierung zur Anpassung der Stärke an die Erfordernisse der Papierindustrie vermeiden.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das in pflanzlichen Zellen sowohl an Stärkekörner gebunden als auch in löslicher Form vorliegt, bei dem erfindungsgemäße Wirtszellen unter Bedingungen kultiviert werden, die die Expression des Proteins erlauben, und das Protein aus den gezüchteten Zellen und/oder dem Kulturmedium isoliert wird.
Ferner betrifft die Erfindung die durch die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codierten Proteine sowie Proteine, die durch das oben beschriebene Verfahren erhältlich sind. Es handelt sich dabei vorzugsweise um kerngencodierte Maisproteine, die in den Plastiden lokalisiert sind. In den Plastiden liegen diese Enzyme sowohl an Stärkekörmer gebunden als auch frei vor.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Antikörper, die spezifisch ein erfindungsgemäßes Protein erkennen. Es kann sich hierbei sowohl um monoclonale als auch um polyclonale Antikörper handeln. Verfahren zur Herstellung dieser Antikörper sind dem Fachmann bekannt.
Es wurde ferner gefunden, dass es möglich ist, die Eigenschaften der in Pflanzenzellen synthetisierten Stärke dadurch zu beeinflussen, dass die Menge an Proteinen, die durch die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codiert werden, in den Zellen verringert wird. Diese Verringerung kann beispielsweise durch Antisense-Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle, durch Expression geeigneter Ribozyme oder mittels Cosuppression erfolgen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit auch DNA-Moleküle, die eine Antisense-RNA codieren, die komplementär ist zu Transkripten eines erfindungsgemäßen DNA-Moleküls, und auch diese Antisense-Moleküle. Komplementär bedeutet dabei, dass die codierte RNA nicht 100% komplementär sein muss, sondern auch ein geringerer Grad an Komplementarität ausreicht, solange sie hoch genug ist, um bei Expression in pflanzlichen Zellen die Expression eines erfindungsgemäßen Proteine zu inhibieren. Die transkribierte RNA ist vorzugsweise mindestens 90% und besonders bevorzugt mindestens 95% komplementär zu dem Transkript des erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls. Um bei Transkription in pflanzlichen Zellen einen Antisense-Effekt zu bewirken, sind derartige DNA-Moleküle mindestens 15 by lang, vorzugsweise länger als 100 by und besonders bevorzugt länger als 500 bp, jedoch in der Regel kürzer als 5000 bp, vorzugsweise kürzer als 2500 bp.
Ferner betrifft die Erfindung auch DNA-Moleküle, die bei Expression in pflanzlichen Zellen zur Synthese einer RNA führen, die in den Pflanzenzellen aufgrund eines Cosuppressions-Effektes eine Verringerung der Expression erfindungsgemäßer Nucleinsäuremoleküle hervorruft, die das beschriebene Protein codieren. Die Erfindung betrifft ferner dadurch codierte RNA-Moleküle. Das Prinzip der Cosuppression sowie die Herstellung entsprechender DNA-Sequenzen ist beispielsweise in der WO 90/12084 ausführlich beschrieben. Derartige DNA-Moleküle codieren vorzugsweise eine RNA, die einen hohen Grad an Homologie zu Transkripten der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle hat. Es ist dabei allerdings nicht unbedingt erforderlich, dass die codierte RNA in ein Protein translatierbar ist.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung DNA-Moleküle, die ein RNA-Molekül mit Ribozymaktivität codieren, das spezifisch Transkripte eines erfindungsgemäßen DNA-Moleküls spaltet, wie auch diese codierten RNA-Moleküle. Ribozyme sind katalytisch aktive RNA-Moleküle, die in der Lage sind, RNA-Moleküle und spezifische Zielsequenzen zu spalten. Mit Hilfe rekombinanter DNA-Techniken ist es möglich, die Spezifität von Ribozymen zu verändern. Es existieren verschiedene Klassen von Ribozymen. Für die praktische Anwendung mit dem Ziel, das Transkript eines bestimmten Gens gezielt zu spalten, werden bevorzugt Vertreter zweier verschiedener Gruppen von Ribozymen verwendet. Die eine Gruppe wird gebildet von Ribozymen, die dem Typ der Gruppe-I-Intron-Ribozyme zuzuordnen sind. Die zweite Gruppe wird von Ribozymen gebildet, die als charakteristisches Strukturmerkmal ein sogenanntes "Hammerkopf"-Motiv aufweisen. Die spezifische Erkennung des Ziel-RNA-Moleküls kann modifiziert werden durch Änderung der Sequenzen, die dieses Motiv flankieren. Diese Sequenzen bestimmen über Basenpaarung mit Sequenzen im Zielmolekül die Stelle, an der die katalytische Reaktion und somit die Spaltung des Zielmoleküls erfolgt. Da die Sequenzanforderungen für eine effiziente Spaltung gering sind, ist es im Prinzip möglich, spezifische Ribozyme für praktisch jedes beliebige RNA-Molekül zu entwickeln.
Um DNA-Moleküle herzustellen, die ein Ribozym codieren, das spezifisch Transkripte eines erfindungsgemäßen DNA-Moleküls spaltet, wird beispielsweise eine DNA-Sequenz, die eine katalytische Domäne eines Ribozyms codiert, beiderseits mit DNA-Sequenzen verknüpft, die zu Sequenzen des Zielenzyms homolog sind. Als Sequenzen, die die katalytische Domänen codieren, kommen beispielsweise die katalytische Domäne der Satelliten-DNA des SCMo-Virus (Davies et al., Virology 177 (1990), 216-224) oder die der Satelliten-DNA des TobR-Virus (Steinecke et al., EMBO J. 11 (1992), 1525-1530; Haseloff und Gerlach, Nature 334 (1988), 585-591) in Frage. Die die katalytische Domäne flankierenden DNA-Sequenzen stammen vorzugsweise aus den oben beschriebenen erfindungsgemäßen DNA-Molekülen.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Vektoren, die die oben beschriebenen DNA-Moleküle enthalten, insbesondere solche, bei denen die beschriebenen DNA-Moleküle verknüpft sind mit regulatorischen Elementen, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die die beschriebenen DNA-Moleküle oder Vektoren enthalten. Die Wirtszelle kann eine prokaryontische, beispielsweise bakterielle, oder eukaryontische Zelle sein. Bei den eukaryontischen Wirtszellen handelt es sich vorzugsweise um pflanzliche Zellen.
Ferner betrifft die Erfindung transgene Pflanzenzellen, die ein oben beschriebenes DNA-Molekül enthalten, das eine Antisense-RNA, ein Ribozym oder eine RNA, die zu einem Cosuppressions-Effekt führt, codiert, wobei dieses DNA-Molekül mit DNA-Elementen verknüpft ist, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten. Diese transgenen Pflanzenzellen können nach gängigen Techniken zu ganzen Pflanzen regeneriert werden. Die Erfindung betrifft somit auch Pflanzen, die erhältlich sind durch Regeneration aus den beschriebenen transgenen Pflanzenzellen, sowie Pflanzen, die die beschriebenen transgenen Pflanzenzellen enthalten. Bei den transgenen Pflanzen kann es sich wiederum um Pflanzen jeder beliebigen Pflanzenspezies handeln, vorzugsweise um Nutzpflanzen, insbesondere Stärke-speichernde Pflanzen, wie oben angegeben, und am meisten bevorzugt um Mais-Pflanzenzellen.
Ferner betrifft die Erfindung die durch die beschriebenen DNA-Moleküle codierten Antisense-RNA-Moleküle sowie RNAMoleküle mit Ribozymaktivität und RNA-Moleküle, die einen Cosuppressions-Effekt hervorrufen, die zum Beispiel durch Transkription erhältlich sind.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzenzellen, die im Vergleich zu nicht-transformierten Zellen eine modifizierte Stärke synthetisieren, bei dem in den Pflanzenzellen die Menge an Proteinen verringert wird, die durch erfindungsgemäße DNA-Moleküle codiert werden, die endogen in den Zellen vorliegen.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt diese Verringerung mit Hilfe eines Antisense-Effektes. Hierzu werden erfindungsgemäße DNA-Moleküle oder Teile davon in Antisense-Orientierung mit einem Promotor verknüpft, der die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleistet, sowie gegebenenfalls mit einem Terminationssignal, das die Termination der Transkription sowie die Polyadenylierung des Transkriptes gewährleistet. Um einen effizienten Antisense-Effekt in den pflanzlichen Zellen zu gewährleisten, sollte die synthetisierte Antisense-RNA eine Mindestlänge von 15 Nucleotiden, vorzugsweise von mindestens 100 Nucleotiden und besonders bevorzugt von über 500 Nucleotiden aufweisen. Ferner sollte die die Antisense-RNA codierende DNA-Sequenz in Bezug auf die zu transformierende Pflanzenspezies homolog sein. Es können jedoch auch DNA-Sequenzen verwendet werden, die einen hohen Grad an Homologie zu endogen in den Zellen vorhandenen DNA-Sequenzen aufweisen, vorzugsweise eine Homologie von mehr als 90%, besonders bevorzugt von mehr als 95%.
In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Verringerung der Menge an Proteinen, die durch die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle codiert werden, durch einen Ribozym-Effekt. Die prinzipielle Wirkungsweise von Ribozymen sowie die Konstruktion von DNA-Molekülen, die derartige RNAMoleküle codieren, wurden bereits oben beschrieben. Um in transgenen Zellen eine RNA mit Ribozymaktivität zu exprimieren, werden die oben beschriebenen DNA-Moleküle, die ein Ribozym codieren, mit DNA-Elementen verknüpft, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten, insbesondere mit einem Promotor und einem Terminationssignal. Die in den Pflanzenzellen synthetisierten Ribozyme führen zur Spaltung von Transkripten von erfindungsgemäßen DNA-Molekülen, die endogen in den Pflanzenzellen vorliegen.
Eine weitere Möglichkeit der Verringerung der Menge an Proteinen, die durch die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codiert werden, ist die Cosuppression. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind dabei auch die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlichen Pflanzenzellen, die dadurch charakterisiert sind, dass bei ihnen die Menge an Proteinen verringert ist, die durch die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle codiert werden, und die im Vergleich zu Wildtyp-Zellen eine modifizierte Stärke synthetisieren.
Bevorzugt weisen die transgenen Zellen im Vergleich mit den entsprechenden nichttransformierten Zellen eine Verminderung der Anzahl der Transkripte, die ein erfindungsgemäßes Protein codieren, um mindestens 30%, stärker bevorzugt um mindestens 50%, noch stärker bevorzugt um mindestens 70% und am meisten bevorzugt um mindestens 90% auf. Die Menge der Transkripte kann z.B. durch Northern-Blot-Analyse bestimmt werden. Darüber hinaus weisen die Zellen eine entsprechende Verringerung der Menge an erfindungsgemäßem Protein auf. Diese kann z.B. mittels immunologischer Methoden wie die Western-Blot-Analyse bestimmt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in den transformierten Pflanzenzellen nicht nur die Synthese eines erfindungsgemäßen Proteins reduziert, sondern darüber hinaus auch die Synthese mindestens eines weiteren an der Stärkesynthese und/oder -modifikation beteiligten Enzyms. Bevorzugt sind dabei beispielsweise Stärkekorn-gebundene Stärkesynthasen oder Verzweigungsenzyme.
Ferner betrifft die Erfindung Pflanzen, die erhältlich sind durch Regeneration der beschriebenen Pflanzenteile, sowie Pflanzen, die die beschriebenen erfindungsgemäßen Zellen enthalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer modifizierten Stärke, das den Schritt der Extraktion der Stärke aus den oben beschriebenen erfindungsgemäßen Pflanzen und/oder aus Stärke-speichernden Teilen solcher Pflanzen umfasst. Bevorzugt umfasst ein solches Verfahren außerdem die Schritte des Kultivierens erfindungsgemäßer Pflanzen sowie des Erntens der kultivierten Pflanzen und/oder von Stärke-speichernden Teilen dieser Pflanzen vor der Stärkeextraktion.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Stärke, die aus den beschriebenen transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen oder mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens erhältlich ist. Auf Grund der Expression der beschriebenen DNA-Moleküle, die Antisense-RNA, ein Ribozym oder eine Cosupressions-RNA in den transgenen Pflanzenzellen codieren, wird die Menge von Proteinen reduziert, die von den erfindungsgemäßen, in den Zellen in endogener Form vorliegenden DNA-Molekülen codiert werden. Überraschenderweise führt diese Reduzierung zu einer entscheidenden Veränderung der physikalischen und chemischen Eigenschaften der in den Pflanzenzellen synthetisierten Stärke. Im Vergleich zu Stärke aus nicht-transformierten Zellen oder Pflanzen weist die modifizierte Stärke bevorzugt veränderte Verkleisterungseigenschaften auf, d.h. veränderte Viskosität der wässrigen Lösungen der Stärke und/oder einen veränderten, insbesondere reduzierten Phosphatgehalt.
Die Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle kann prinzipiell in allen Pflanzenspezies stattfinden. Bevorzugt werden monokotyle als auch dikotyle Pflanzen, insbesondere Nutzpflanzen und hierbei bevorzugt Stärke-speichernde Pflanzen wie z.B. Getreidepflanzen (Roggen, Gerste, Hafer, Weizen, Hirse, Sago, etc.), Reis, Mais, Erbse, Markerbse, Maniok, Kartoffel, Tomate, Raps mit ölhaltigem Samen, Sojabohne, Hanf, Flachs, Sonnenblume, Langbohne und Pfeilwurz.
Unter dem Begriff "regulatorische DNA-Elemente, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung DNA-Abschnitte verstanden, die die Initiation bzw. die Termination der Transkription in pflanzlichen Zellen ermöglichen. Zu den DNA-Abschnitten, die die Initiation der Transkription gewährleisten, zählen insbesondere Promotoren.
Für die Expression der verschiedenen, oben beschriebenen erfindungsgemäßen DNA-Moleküle in Pflanzen kommt jeder in pflanzlichen Zellen funktionale Promotor in Betracht. Der Promotor kann homolog oder heterolog in Bezug auf die verwendete Pflanzenspezies sein. Geeignet ist beispielsweise der 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus (Odell et al., Nature 313 (1985), 810-812), der eine konstitutive Expression in allen Geweben einer Pflanze gewährleistet, und das in der WO/9401571 beschriebene Promotorkonstrukt. Es können jedoch auch Promotoren verwendet werden, die nur zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt (siehe beispielsweise WO/9307279) oder in einem bestimmten Gewebe der Pflanze zu einer Expression nachfolgender Sequenzen führen (siehe z.B. Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2245-2251). Präferentiell werden Promotoren eingesetzt, die in den Stärke-speichernden Teilen der zu transformierenden Pflanzen aktiv sind. Dies sind beim Mais die Maiskörner, während es bei der Kartoffel die Knollen sind. Zur Transformation der Kartoffel kann insbesondere, aber nicht ausschließlich, der knollenspezifische B33-Promotor (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) verwendet werden. Neben Promotoren können DNA-Abschnitte zur Initiation der Transkription auch DNA-Sequenzen enthalten, die eine weitere Steigerung der Transkription gewährleisten, beispielsweise sogenannte Enhancer-Elemente.
Ferner kann der Begriff "regulatorische DNA-Elemente" auch Terminationssignale umfassen, die der korrekten Beendigung der Transkription sowie der Addition eines Poly-A-Schwanzes an das Transkript dienen, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben und sind beliebig austauschbar. Beispiele für derartige Terminationssequenzen sind die 3'-nichttranslatierbaren Regionen, die das Polyadenylierungssignal des Nopalin-Synthase-Gens (NOS-Gen) oder des Octopinsynthase-Gens (Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) aus Agrobakterien umfassen, oder die 3'-nichttranslatierbaren Regionen der Gene der Speicherproteine aus Sojabohne sowie die der Gene der kleinen Untereinheit der Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase (ssRUBISCO).
Die Einführung erfindungsgemäßer DNA-Moleküle in pflanzliche Zellen erfolgt vorzugsweise unter Verwendung von Plasmiden. Vorzugsweise werden dafür Plasmide verwendet, die eine stabile Integration der DNA in das pflanzliche Genom gewährleisten.
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen stehen eine große Anzahl von Clonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUCSerien, M13mp-Serien, pACYC184 usw.
Die gewünschte Sequenz kann an einer geeigneten Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation von E. coli-Zellen verwendet. Transformierte E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium kultiviert, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird nach Standardmethoden gewonnen. Als Analysemethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im Allgemeinen Restriktionsanalysen und Sequenzanalysen eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten werden und resultierende DNA-Fragmente können mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z.B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig.
Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z.B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so müssen mindestens die rechte Begrenzung, häufiger jedoch die rechte und linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid-T-DNA als Flankenbereich mit dem einzuführenden Gen verbunden werden.
Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide cloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). Die zur Transformation der Agrobakterien verwendeten Plasmide enthalten weiterhin ein Selektionsmarkergen, beispielsweise das NPT II-Gen, das die Selektion transformierter Bakterien erlaubt. Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.
Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht worden und ausreichend beschrieben in EP 120516 ; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Kapitel V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46 und An et al., EMBO J. 4 (1985), 277-287. Binäre Vektoren sind bereits z.T. kommerziell erhältlich, z.B. pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc., USA).
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobakterium rhizogenes kokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z.B. Blattstücke, Stängelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder in Suspension kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden. Weitere Möglichkeiten, Fremd-DNA mittels der biolistischen Methode oder mittels Protoplastentransformation einzuführen, sind dem Fachmann bekannt (vgl. z.B. Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, Hrsg.), Bd. 2, 627-659, VCH Weinheim – New York – Basel – Cambridge).
Während die Transformation dikotyler Pflanzen durch Ti-Plasmidvektorsysteme mittels Abgobacterium tumefaciens eine bekannte Methode darstellt, weisen neuere Untersuchungen darauf hin, dass bei monokotylen Pflanzen auch die Transformation mit auf Agrobakterium basierenden Vektoren angewendet werden kann (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6 (1994), 271-282).
Alternative Methoden für die Transformation von monokotylen Pflanzen sind die Transformation anhand des biolistischen Ansatzes, die Protoplastentransformation, die Elektroporation teilweise permeabilisierter Zellen, die Einführung von DNA mit Hilfe von Glasfasern.
In der Fachliteratur gibt es viele Referenzen, die sich spezifisch auf die Transformation von Mais beziehen (vgl. z.B. WO95/06128, EP 0513849 , EP 0 465 875 ). In EP 292 435 wird eine Methode beschrieben, mit Hilfe derer ausgehend von schleimfreiem, krümeligem Maiskallusgranulat fertile Pflanzen erhalten werden können. In diesem Zusammenhang wird in Shillito et al. (Bio/Technology 7 (1989), 581) festgestellt, dass die Regeneration fertiler Pflanzen von Kallus-Suspensions-Kulturen ausgehen muss, aus denen eine Kultur sich teilender Protoplasten hergestellt werden kann, die fähig ist, zu Pflanzen zu regenerieren. Nach 7 bis 8 Monaten In-vitro-Kultur erhielten Shillito et al. Pflanzen mit lebensfähigen Nachkommen, die jedoch Anomalien in Bezug auf Morphologie und Reproduktivität aufwiesen.
Prioli und Söndahl (Bio/Technology 7 (1989), 589) beschreiben, wie fertile Pflanzen aus Maisprotoplasten der Cateto-Mais-Inzuchtlinie Cat100-1 regeneriert und erhalten werden. Die Autoren nehmen an, dass die Regeneration von Protoplasten zu fertilen Pflanzen von einer Reihe unterschiedlicher Faktoren wie Genotyp, physiologischem Status der Donorzelle und Kulturbedingungen abhängen. Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin u.a. vermittelt. Der individuell gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten.
Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.
Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, dass das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, dass der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten bleiben werden.
Die aus den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen bzw. Pflanzen erhältliche Stärke oder die aus durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältliche Stärke eignet sich aufgrund ihrer Eigenschaften neben den bereits hierin angesprochenen speziellen Verwendungszwecken für verschiedene industrielle Verwendungen.
Grundsätzlich lässt sich Stärke in zwei große Kategorien unterteilen, die Hydrolyseprodukte der Stärke und die sogenannten nativen Stärken. Zu den Hydrolyseprodukten zählen im Wesentlichen die über enzymatische oder chemische Verfahren erhaltene Glucose sowie Glucane, die für weitere Prozesse wie Fermentation und chemische Modifikationen eingesetzt werden können. In diesem Bereich kann die einfache und kostengünstige Ausführung eines Hydrolyseverfahrens, wie es gegenwärtig im Wesentlichen enzymatisch unter Verwendung von Amyloglucosidase verläuft, von Bedeutung sein. Es ist vorstellbar, dass ein geringerer Einsatz von für die Hydrolyse eingesetzten Enzymen durch Veränderung der Struktur der Stärke, z.B. größere Oberfläche des Korns, leichtere Verdaulichkeit durch geringeren Verzweigungsgrad oder sterische, die Zugänglichkeit für die eingesetzten Enzyme limitierende Struktur, zu einer Kosteneinsparung führen kann.
Die Verwendungen der sogenannten nativen Stärken, die wegen ihrer polymeren Struktur eingesetzt werden, lassen sich in zwei weitere Bereiche unterteilen:
(a) Verwendung im Nahrungsmittelbereich
Stärke ist ein klassischer Zusatzstoff für viele Nahrungsmittel, bei denen sie im Wesentlichen die Funktion des Bindens von wässrigen Zusatzstoffen übernimmt und/oder eine Erhöhung der Viskosität oder eine erhöhte Gelbildung hervorruft. Wichtige Eigenschaftsmerkmale sind das Fließ- und Sorptionsverhalten, die Quell- und Verkleisterungstemperatur, die Viskosität und Dickungsleistung, die Löslichkeit der Stärke, die Transparenz und Kleisterstruktur, die Hitze-, Scher- und Säurestabilität, die Neigung zur Retrogradation, die Fähigkeit zur Filmbildung, die Gefrier/Taustabilität, die Verdaulichkeit sowie die Fähigkeit zur Komplexbildung mit z.B. anorganischen oder organischen Ionen.
(b) Einsatz im Nicht-Nahrungsmittelbereich
Der andere große Einsatzbereich liegt bei der Verwendung der Stärke als Hilfsstoff bei unterschiedlichen Herstellungsprozessen bzw. als Zusatzstoff in technischen Produkten. Der wesentliche Einsatzbereich für die Verwendung von Stärke als Hilfsstoff ist zum einen die Papier- und Pappeindustrie. Stärke wird dabei in erster Linie zur Retention (Zurückhaltung von Feststoffen), der Verleimung von Füllstoff- und Feinstoffteilchen, als Festigungsstoff und zur Entwässerung eingesetzt. Darüber hinaus werden die günstigen Eigenschaften der Stärke in Bezug auf die Steifigkeit, die Härte, den Klang, den Griff, den Glanz, die Glätte, die Reißfestigkeit sowie die Oberflächen ausgenutzt.
Innerhalb des Papierherstellungsprozesses sind vier Anwendungsbereiche, nämlich Oberfläche, Strich, Masse und Sprühen, zu unterscheiden.
Die Anforderungen an die Stärke in Bezug auf die Oberflächenbehandlung sind im Wesentlichen ein hoher Weißegrad, eine angepasste Viskosität, eine hohe Viskositätsstabilität, eine gute Filmbildung sowie eine geringe Staubbildung. Bei der Verwendung im Strich sind der Feststoffgehalt, eine angepasste Viskosität, ein hohes Bindevermögen sowie eine hohe Pigmentaffinität wichtig. Als Zusatz zur Masse ist eine rasche, gleichmäßige, verlustfreie Verteilung, eine hohe mechanische Stabilität und eine vollständige Zurückhaltung im Papierfaserbrei von Bedeutung. Beim Einsatz der Stärke im Sprühbereich sind ebenfalls ein angepasster Feststoffgehalt, hohe Viskosität sowie ein hohes Bindevermögen von Bedeutung.
Ein großer Einsatzbereich besteht beispielsweise in der Klebstoffindustrie, wo man die Einsatzmöglichkeiten in vier Teilbereiche gliedert: die Verwendung als reinem Stärkeleim, die Verwendung bei mit speziellen Chemikalien aufbereiteten Stärkeleimen, die Verwendung von Stärke als Zusatz zu synthetischen Harzen und Polymerdispersionen sowie die Verwendung von Stärken als Streckmittel für synthetische Klebstoffe. 90% der Klebstoffe auf Stärkebasis werden in den Bereichen Weilpappenherstellung, Herstellung von Papiersäcken, Beuteln oder Tüten, Herstellung von Verbundmaterialien für Papier und Aluminium, Herstellung von Kartonagen und Wiederbefeuchtungsleim für Briefumschläge, Briefmarken usw. eingesetzt.
Eine weitere mögliche Verwendung als Hilfsmittel und Zusatzstoff besteht bei der Herstellung von Textilien und Textilpflegemitteln. Innerhalb der Textilindustrie sind die folgenden vier Einsatzbereiche zu unterscheiden: Der Einsatz der Stärke als Schlichtemittel, d.h. als Hilfsstoff zur Glättung und Stärkung des Klettverhaltens zum Schutz gegen die beim Weben angreifenden Zugkräfte sowie zur Erhöhung der Abriebfestigkeit beim Weben, als Mittel zur Textilaufrüstung vor allem nach qualitätsverschlechternden Vorbehandlungen wie Bleichen, Färben usw., als Verdickungsmittel bei der Herstellung von Farbpasten zur Verhinderung von Farbstoffdiftusionen sowie als Zusatz zu Kettungsmitteln für Nähgarne.
Ferner kann die Stärke als Zusatz bei Baustoffen verwendet werden. Ein Beispiel ist die Herstellung von Gipskartonplatten, bei der die im Gipsbrei vermischte Stärke mit dem Wasser verkleistert, an die Oberfläche der Gipsplatte diffundiert und dort den Karton an die Platte bindet. Weitere Einsatzbereiche sind die Beimischung zu Gipsmörtel- und Mineralfasern. Bei Fertigbeton kann die Stärke zur Verzögerung der Abbindung eingesetzt werden.
Ferner bietet sich die Stärke zur Herstellung von Mitteln zur Bodenstabilisation an, die bei künstlichen Erdbewegungen zum temporären Schutz der Bodenpartikel gegenüber Wasser eingesetzt werden. Kombinationsprodukte aus Stärke und Polymenemulsionen sind nach heutiger Kenntnis in ihrer Erosion und Verkrustung mindernden Wirkung den bisher eingesetzten Produkten gleichzusetzen, liegen preislich aber deutlich unter diesen.
Ferner kann die Stärke in Pflanzenschutzmitteln zur Veränderung der spezifischen Eigenschaften der Präparate verwendet werden. So werden Stärken beispielsweise zur Verbesserung der Benetzung von Pflanzenschutz- und Düngemitteln, zur dosierten Freigabe der Wirkstoffe, zur Umwandlung flüssiger, flüchtiger und/oder riechender Wirkstoffe in mikrokristalline, stabile, formbare Substanzen, zur Mischung inkompatibler Verbindungen und zur Verlängerung der Wirkdauer durch Verminderung der Zersetzung eingesetzt. Ein weiteres Einsatzgebiet besteht im Bereich der Arzneistoffe, Medizin und Kosmetikindustrie. In der pharmazeutischen Industrie kann die Stärke als Bindemittel für Tabletten oder zur Bindemittelverdünnung in Kapseln eingesetzt werden. Weiterhin eignet sich die Stärke als Tablettensprengmittel, da sie nach dem Schlucken Flüssigkeit absorbiert und nach kurzer Zeit so weit quillt, dass der Wirkstoff freigesetzt wird. Medizinische Gleitpuder- und Pudermittel sind wegen ihrer Eigenschaften weitere Anwendungsmöglichkeiten. Im Bereich der Kosmetik kann die Stärke beispielsweise als Träger von Puderzusatzstoffen wie Düften und Salicylsäure eingesetzt werden. Ein relativ großer Anwendungsbereich für die Stärke liegt bei Zahnpasta.
Auch die Verwendung der Stärke als Zusatzstoff zu Kohle und Briketts ist denkbar. Kohle kann mit einem Stärkezusatz quantitativ hochwertig agglomeriert bzw. brikettiert werden, wodurch ein frühzeitiges Zerfallen der Briketts verhindert wird. Der Stärkezusatz liegt bei Grillkohle zwischen 4 und 6%, bei kalorierter Kohle zwischen 0,1 und 0,5%. Des Weiteren eignet sich die Stärke als Bindemittel, da durch ihren Zusatz zu Kohle und Brikett der Ausstoß schädlicher Stoffe deutlich vermindert werden kann.
Die Stärke kann ferner bei der Erz- und Kohleschlammaufbereitung als Flockungsmittel eingesetzt werden.
Ein weiterer Einsatzbereich besteht als Zusatz zu Gießereiarbeitsmaterialien. Bei verschiedenen Gussverfahren werden Kerne benötigt, die aus mit Bindemittel versetzten Sänden hergestellt werden. Als Bindemittel wird heute überwiegend Bentonit eingesetzt, der mit modifizierten Stärken, meist Quellstärken, versetzt ist.
Zweck des Stärkezusatzes ist die Erhöhung der Fließfestigkeit sowie die Verbesserung der Bindefestigkeit. Darüber hinaus können die Quellstärken weitere produktionstechnische Anforderungen erfüllen, indem sie in kaltem Wasser dispergierbar, rehydratisierbar und gut in Sand mischbar sind sowie ein hohes Wasserbindungsvermögen aufweisen.
In der Kautschukindustrie kann die Stärke zur Verbesserung der technischen und optischen Qualität eingesetzt werden. Gründe sind dabei die Verbesserung des Oberflächenglanzes, die Verbesserung des Griffs und des Aussehens. Dafür wird Stärke vor der Kaltvulkanisation auf die klebrigen gummierten Flächen von Kautschukstoffen gestreut. Ebenso kann sie für die Verbesserung der Bedruckbarkeit des Kautschuks eingesetzt werden.
Eine weitere Einsatzmöglichkeit der modifizierten Stärke besteht bei der Herstellung von Lederersatzstoffen.
Auf dem Kunststoffsektor zeichnen sich folgende Einsatzgebiete ab: die Einbindung von Stärkefolgeprodukten in den Verarbeitungsprozess (Stärke ist nur Füllstoff, es besteht keine direkte Bindung zwischen synthetischem Polymer und Stärke) oder alternativ die Einbindung von Stärkefolgeprodukten in die Herstellung von Polymeren (Stärke und Polymer gehen eine feste Bindung ein).
Die Verwendung der Stärke als reinem Füllstoff ist verglichen mit anderen Stoffen wie Talkum nicht wettbewerbsfähig. Anders sieht es aus, wenn die spezifischen Stärkeeigenschaften zum Tragen kommen und hierdurch das Eigenschaftsprofil der Endprodukte deutlich verändert wird. Ein Beispiel hierfür ist die Anwendung von Stärkeprodukten bei der Verarbeitung von Thermoplasten wie Polyethylen. Hierbei werden die Stärke und das synthetische Polymer durch Koexpression im Verhältnis von 1:1 zu einem 'Masterbatch' kombiniert, aus dem mit granuliertem Polyethylen unter Anwendung herkömmlicher Verfahrenstechniken diverse Produkte hergestellt werden. Durch die Einbindung der Stärke in Polyethylenfolien kann eine erhöhte Stoffdurchlässigkeit bei Hohlkörpern, eine verbesserte Wasserdampfdurchlässigkeit, ein verbessertes Antistatikverhalten, ein verbessertes Antiblockverhalten sowie eine verbesserte Bedruckbarkeit mit wässrigen Farben erreicht werden.
Eine andere Möglichkeit ist die Anwendung der Stärke in Polyurethanschäumen. Mit der Adaption der Stärkederivate sowie durch die verfahrenstechnische Optimierung ist es möglich, die Reaktion zwischen synthetischen Polymeren und den Hydroxygruppen der Stärke gezielt zu steuern. Das Ergebnis sind Polyurethanfolien, die durch die Anwendung von Stärke folgende Eigenschaftsprofile erhalten: eine Verringerung des Wärmeausdehnungskoeffizienten, Verringerung des Schrumpfverhaltens, Verbesserung des Druck-/Spannungsverhaltens, Zunahme der Wasserdampfdurchlässigkeit ohne Veränderung der Wasseraufnahme, Verringerung der Entflammbarkeit und der Aufrissdichte, kein Abtropfen brennbarer Teile, Halogenfreiheit und verminderte Alterung. Nachteile, die gegenwärtig noch vorhanden sind, sind verringerte Druckfestigkeit sowie eine verringerte Schlagfestigkeit.
Möglich ist nicht nur die Produktentwicklung von Folien. Auch feste Kunststoffprodukte wie Töpfe, Platten und Schalen sind mit einem Stärkegehalt von über 50% herzustellen. Ferner weisen die Stärke/Polymermischungen den Vorteil auf, dass sie eine sehr viel höhere biologische Abbaubarkeit aufweisen.
Außerordentliche Bedeutung haben weiterhin aufgrund ihres extremen Wasserbindungsvermögens Stärkepfropfpolymerisate gewonnen. Dies sind Produkte mit einem Rückgrat aus Stärke und einer nach dem Prinzip des Radikalkettenmechanismus aufgepfropften Seitengitters eines synthetischen Monomers. Die heute verfügbaren Stärkepfropfenpolymerisate zeichnen sich durch ein besseres Binde- und Rückhaltevermögen von bis zu 1000 g Wasser pro g Stärke bei hoher Viskosität aus. Diese Superabsorber werden hauptsächlich im Hygienebereich verwendet, z.B. bei Produkten wie Windeln und Unterlagen sowie im landwirtschaftlichen Sektor, z.B. bei Saatgutpellets.
Entscheidend für den Einsatz der neuen, durch DNA-Rekombinationsverfahren veränderten Stärke sind zum einen Struktur, Wassergehalt, Proteingehalt, Lipidgehalt, Fasergehalt, Asche/Phosphatgehalt, Amylose/Amylopektin-Verhältnis, Molmassenverteilung, Verzweigungsgrad, Korngröße und -form sowie Kristallisation, zum anderen auch die Eigenschaften, die in folgenden Merkmalen münden: Fließ- und Sorptionsverhalten, Verkleisterungstemperatur, Viskosität, Dickungsleistung, Löslichkeit, Kleisterstruktur, Transparenz, Hitze-, Scher- und Säurestabilität, Retrogradationsneigung, Gelbildungsfähigkeit, Gefrier/Taustabilität, Komplexbildungsfähigkeit, Jodbindung, Filmbildung, Klebekraft, Enzymstabilität, Verdaulichkeit und Reaktivität. Ganz besonders hervorzuheben ist die Viskosität.
Ferner kann die aus den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen bzw. Pflanzen erhältliche modifizierte Stärke weiteren chemischen Modifikationen unterworfen werden, was zu weiteren Verbesserungen der Qualität für bestimmte der oben beschriebenen Einsatzgebiete führt. Diese chemischen Modifikationen sind dem Fachmann grundsätzlich bekannt. Insbesondere handelt es sich dabei um Modifikationen durch

– Säurebehandlung
– Oxidation
– Veresterung (Entstehung von Phosphat-, Nitrat-, Sulfat-, Xanthat-, Acetat- und Citratstärken. Weitere organische Säuren können ebenfalls zur Veresterung eingesetzt werden.)
– Erzeugung von Stärkeethern (Stärke-Alkylether, O-Allylether, Hydroxylalkylether, O-Carboxylmethylether, N-haltige Stärkeether, S-haltige Stärkeether)
– Erzeugung von verzweigten Stärken
– Erzeugung von Stärke-Pfropfpolymerisaten.

Gegenstand der Erfindung ist auch Vermehrungsmaterial der erfindungsgemäßen Pflanzen wie z.B. Samen, Früchte, Stecklinge, Knollen oder Wurzel^e, wobei dieses erfindungsgemäße Pflanzenzellen enthält.
Hinterlegungen
Folgende im Rahmen der vorliegenden Erfindung hergestellten und/oder verwendeten Plasmide wurden bei der als internationale Hinterlegungsstelle anerkannten „Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM)" in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, entsprechend den Anforderungen des Budapester Vertrages für die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke der Patentierung hinterlegt (Hinterlegungsnummer; Hinterlegungsdatum):
Beschreibung der Abbildungen
1 zeigt das Plasmid p35S-anti-RL.
Aufbau des Plasmids:

A = Fragment A: CaMV-35S-Promotor, nt 6909-7437 (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294)
B = Fragment B: ca. 1949 bp langes Asp718-Fragment aus pRL1 Orientierung zum Promotor: antisense Der Pfeil gibt die Richtung des offenen Leserasters an.
C = Fragment C: nt 11748-11939 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835-846)

2 zeigt das Plasmid pB33-anti-RL
Aufbau des Plasmids:

A = Fragment A: B33-Promotor des Patatin-Gens B33 aus Solanum tuberosum (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29)
B = Fragment B: ca. 1949 bp-langes Asp718-Fragment aus pRL1 Orientierung zum Promotor: antisense Der Pfeil gibt die Richtung des offenen Leserasters an.
C = Fragment C: nt 11748-11939 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835-846)

3 zeigt eine mit einem Brabender-Viskograph vom Typ Viskograph E aufgezeichnete Brabender-Kurve einer wässrigen Lösung von Stärke, die aus nichttransformierten Kartoffelpflanzen der Varietät Desirée isoliert wurde (siehe Beispiel 8).
Dabei bedeuten:

Drehm.: Drehmoment
[BE]: Brabender-Einheiten
Temp.: Temperatur
A: Verkleisterungsbeginn
B: Maximale Viskosität
C: Start der 96°C-Periode
D: Start der Kühlzeit
E: Ende der Kühlzeit
F: Ende der End-50°C-Periode

Die blaue Linie gibt die Viskosität an; die rote den Temperaturverlauf.
4 zeigt eine mit einem Brabender-Viskograph vom Typ Viskograph E aufgezeichnete Brabender-Kurve einer wässrigen Lösung von Stärke, die aus Kartoffelpflanzen isoliert wurde, die mit dem Plasmid p35S-anti-RL transformiert worden waren (siehe Beispiel 8). Für die Bedeutung der Abkürzungen siehe 3.
5 zeigt eine mit einem Brabender-Viskograph vom Typ Viskograph E aufgezeichnete Brabender-Kurve einer wässrigen Lösung von Stärke. aus Kartoffeln, die mit dem Plasmid pB33-anti-RL transformiert worden waren (siehe Beispiel 8). Für die Bedeutung der Abkürzungen siehe 3.
6 zeigt mit einem Rapid Visco Analyser aufgezeichnete Kurven wässriger Stärkelösungen, die aus Kartoffelpflanzen isoliert wurden (siehe Beispiel 12). Die rote Linie gibt den Temperaturverlauf an, die blauen Linien 1, 2, 3 und 4 die Viskositäten folgender Stärkelösungen:

Linie 1: Stärke, die aus Wildtyppflanzen isoliert worden ist,
Linie 2: Stärke, die aus Pflanzen isoliert worden ist, bei denen das Verzweigungsenzym allein inhibiert wurde (vgl. Beispiel 1 der Patentanmeldung WO92/14827),
Linie 3: Stärke, die aus Pflanzen isoliert worden ist, bei denen lediglich die erfindungsgemäßen Proteine in ihrer Konzentration verringert wurden (vgl. Beispiel 6).
Linie 4: Stärke, die aus Pflanzen isoliert worden ist, die mit dem Plasmid p35S-anti-RL in Kombination mit dem Plasmid p35SH-anti-BE (vgl. Beispiel 12) transformiert worden sind.

7 zeigt mit einem Rapid Visco Analyser aufgezeichnete Kurven wässriger Stärkelösungen, die aus Kartoffelpflanzen isoliert wurden (siehe Beispiel 13). Die rote Linie gibt den Temperaturverlauf an, die blauen Linien 1, 2, 3 und 4 die Viskositäten folgender Stärkelösungen:

Linie 1: Stärke, die aus Wildtyppflanzen isoliert worden ist,
Linie 2: Stärke, die aus Pflanzen isoliert worden ist, die allein mit dem Plasmid pB33-anti-GBSSI isoliert wurden (sog. waxy-Kartoffel),
Linie 3: Stärke, die aus Pflanzen isoliert worden ist, die allein mit dem Plasmid p35S-anti-RL transformiert wurden (vgl. Beispiel 6),
Linie 4: Stärke, die aus Pflanzen isoliert worden ist, die mit dem Plasmid pB33-anti-RL in Kombination mit dem Plasmid pB33-anti-GBSSI (vgl. Beispiel 13) transformiert worden sind.

8 zeigt das pRL2-Plasmid, das eine vollständige cDNA aus Kartoffel umfasst, die ein R1-Enzym codiert.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Verwendete Medien und Lösungen

Elutionspuffer	25 mM Tris pH 8,3
	250 mM Glycin

Dialysepuffer	50 mM Tris-HC1 pH 7,0
	50 mM NaCl
	2 mM EDTA
	14,7 mM B-Mercaptoethanol
	0,5 mM PMSF

Proteinpuffer	50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,2
	10 mM EDTA
	0,5 mM PMSF
	14,7 mM β-Mercaptoethanol

Lugolsche Lösung	12 g KI
	6 g I₂
	ad 1,8 l mit ddH₂O

20 × SSC	175.3 g NaCl
	88.2 g Natrium-Citrat
	ad 1000 ml mit ddH₂O
	pH 7,0 mit 10 N NaOH

10 × MEN	200 mM MOPS
	50 mM Natriumacetat
	10 mM EDTA pH 7, 0

NSEB-Puffer	0,25 M Natriumphosphatpuffer pH 7,2
	7% SDS
	1 mM EDTA
	1 % BSA (Gew./Vol.)

YT	8 g Bacto-Hefeextrakt
	5 g Bacto-Trypton
	5 g NaCl
	ad 1.000 ml mit ddH₂O

Medium für die Protoplastenisolation (100 ml)

Cellulase Onuzuka R S (Meiji Seika, Japan)	800 mg
Pectolyase Y 23	40 mg
KNO₃	200 mg
KH₂PO₄	136 mg
K₂HPO₄	47 mg
CaCl₂2H₂O	147 mg
MgSO₄7H₂O	250 mg
Rinderserumalbumin (BSA)	20 mg
Glucose	4.000 mg
Fructose	4.000 mg
Saccharose	1.000 mg
pH-Wert	5,8
Osmolarität	660 mOsm

Protoplastenwaschlösung 1: entsprechend der Lösung für die Protoplastenisolation, jedoch ohne Cellulase, Pectolyase und BSA Transformationspuffer:

a) Glucose	0,5 M
MES	0,1 %
MgCl₂ 6H₂O	25 mM
pH-Wert	5,8

auf 600 mOsm einstellen.

b) PEG 6000-Lösung
Glucose	0,5 M
MgCl₂ 6H₂O	100 mM
Hepes	20 mM
pH-Wert	6,5

PEG 6000 wird dem unter b) beschriebenen Puffer unmittelbar vor der Verwendung der Lösung (40% Gew./Vol. PEG) zugefügt. Die Lösung wird mit sterilem 0,45 μm-Filter gefiltert. W5-Lösung

CaCl₂	125 mM
NaCl	150 mM
KCl	5 mM
Glucose	50 mM

Protoplastenkulturmedium (angegeben in mg/l)

KNO₃	3.000
(NH4)₂SO₄	500
MgSO₄ 7H₂O	350
KH₂PO₄	400
CaCl₂ 2 H₂O	300

Fe-EDTA und Spurenelemente wie im Musharige-Skoog-Medium (Physiol. Plant, 15 (1962), 473).

m-Inosit	100
Thiamin-HCl	1,0
Nikotinsäureamid	0,5
Pyridoxin-HCl	0,5
Glycin	2,0
Glucuronsäure	750
Galacturonsäure	750
Galactose	500
Maltose	500
Glucose	36.000
Fructose	36.000

Saccharose	30.000
Asparagin	500
Glutamin	100
Proline	300
Caseinhydrolysat	500
2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D)	0,5
pH-Wert	5,8
Osmolarität	600 mOsm.

Puffer A	2 × SSC
	10 × Denhardt-Lösung
	0,1 % SDS
	5 mM EDTA
	50 mM Dinatriumphosphat
	250 μg/ml DNA aus Herringssperma

In den Beispielen wurden folgende Standardtechniken angewendet:
1. Clonierungsverfahren
Zur Clonierung in E.coli wurde der Vektor pBluescriptSK verwendet.
Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Sci. 66 (1990), 221-230) und B33-Hyg cloniert.
2. Bakterienstämme
Für den Bluescript-Vektor und für die pBinAR- und B33-Hyg-Konstrukte wurde der E.coli-Stamm DH5α (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburgh, USA) verwendet.
Die Transformation der Plasmide in die Kartoffelpflanzen wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes C58C1 pGV2260 durchgeführt (Deblaere et al., Nucl. Acids Res. 13 (1985), 4777:4788).
3. Transformation von Agrobacterium tumefaciens
Der Transfer der DNA erfolgte durch direkte Transformation nach der Methode von Höfgen & Willmitzer (Nucleic Acids Res. 16 (1988), 9877). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim & Doly (Nucleic Acids Res. 7 (1979), 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch analysiert.
4. Transformation von Kartoffeln
Zehn kleine, mit einem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel-Sterilkultur (Solanum tuberosum L. cv. Désirée) wurden in 10 ml MS-Medium (Murashige und Skoog, Physiol. Plant. 15 (1962), 473-497) mit 2% Saccharose behandelt, welches 50 μl einer unter Selektion gewachsenen Agrobacterium tumefaciens-Übernachtkultur enthielt. Nach 3-5-minütigem leichtem Schütteln erfolgte eine weitere Inkubation für 2 Tage im Dunkeln. Daraufhin wurden die Blätter zur Kallusinduktion auf MS-Medium mit 1,6% Glucose, 5 mg/l Naphthylessigsäure, 0,2 mg/l Benzylaminopurin, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin bzw. 1 mg/l Hygromycin B, und 0,80% Bacto Agar gelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurden die Blätter zur Sprossinduktion auf MS-Medium mit 1,6% Glucose, 1,4 mg/l Zeatinribose, 20 mg/l Naphthylessigsäure, 20 mg/l Giberellinsäure, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin bzw. 3 mg/l Hygromycin B und 0,80% Bacto Agar gelegt.
5. Transformation von Mais
(a) Herstellung von Protoplasten der Zelllinie DSM 6009
Protoplastenisolation
2-4 Tage, bevorzugt 2 Tage nach dem letzen Wechsel des Mediums in einer Protoplasten-Supensionskultur wird das flüssige Medium abgepumpt und die zurückbleibenden Zellen werden in 50 ml Protoplasten-Waschlösung 1 gewaschen und noch einmal durch Absaugen getrocknet. 10 ml Protoplasten-Isolationsmedium werden zu 2 g der geernteten Zellmasse hinzugefügt. Die resuspendierten Zellen und Zellaggregate werden bei 27 ± 2°C für 4 bis 6 h im Dunkeln inkubiert und dabei währenddessen (bei 30 bis 40 UpM) leicht geschüttelt.
Protoplastenreinigung
Sobald mindestens 1 Million Protoplasten/ml freigesetzt wurden (mikroskopische Kontrolle), wird die Suspension durch ein Edelstahl- oder Nylonsieb mit einer Maschenweite von 200 oder 45 μm filtriert. Die Kombination von einem 100 μm- und einem 60 μm-Sieb ermöglicht eine ebenso gute Trennung der Zellagggreate. Das Protoplasten enthaltende Filtrat wird mikroskopisch untersucht. Gewöhnlich enthält es 98-99% Protoplasten. Der Rest sind unverdaute Einzelzellen. Protoplastenpräparate mit diesem Reinheitsgrad werden für Transformationsversuche ohne zusätzliche Gradientenzentrifugation verwendet. Die Protoplasten werden durch Zentrifugation (100 UpM im Ausschwingrotor (100 × g, 3 Minuten)) ausgefällt. Der Überstand wird weggeschüttet und die Protoplasten werden in Waschlösung 1 resuspendiert. Das Zentrifugieren wird wiederholt und die Protoplasten werden anschließend im Transformationspuffer resuspendiert.
(b) Protoplastentransformation
Die im Transformationspuffer resuspendierten Protoplasten werden mit einem Titer von 0,5 – 1 × 10⁶ Protoplasten/ml in 10 ml-Portionen in 50 ml-Polyallomer-Röhrchen gefüllt. Die für die Transformation verwendete DNA wird in Tris-EDTA- (TE-) Pufferlösung aufgelöst. Der Protoplastensuspension werden pro ml 20 μg Plasmid-DNA zugefügt. Ein Plasmid, das eine Phosphinothricinresistenz ermöglicht, wird als Vektor verwendet (vgl. z.B. EP 0 513 849 ). Nach dem Hinzufügen der DNA wird die Protoplastensuspension sorgfältig geschüttelt, um eine homogene Verteilung der DNA in der Lösung zu erreichen. Unmittelbar danach werden 5 ml PEG-Lösung in Tropfen hinzugefügt.
Durch sorgfältiges Schütteln der Röhrchen wird die PEG-Lösung homogen verteilt. Anschließend werden weitere 5 ml PEG-Lösung hinzugefügt und das homogene Mischen wird wiederholt. Die Protoplasten verbleiben 20 Minuten bei ± 2°C in der PEG-Lösung. Danach werden die Protoplasten durch 3-minütiges Zentrifugieren (100 g; 1.000 UpM) ausgefällt. Der Überstand wird weggeschüttet. Die Protoplasten werden unter sorgfältigem Schütteln in 20 ml W5-Lösung gewaschen und werden dann wieder einer Zentrifugierung ausgesetzt. Dann werden sie in 20 ml Protoplasten-Kulturmedium resuspendiert, wieder zentrifugiert und nochmals in Kulturmedium resuspendiert. Der Titer wird auf 6 – 8 × 10⁵ Protoplasten eingestellt und die Protoplasten werden in 3 ml-Portionen in Petrischalen (Ø 60 mm, Höhe 15 mm) gezüchtet. Die Petrischalen werden mit Parafilm verschlossen und bei 25 ± 2°C im Dunkeln gelagert.
(c) Protoplastenkultur
Während der ersten 2 bis 3 Wochen nach der Protoplastenisolation und -transformation werde die Protoplasten gezüchtet, ohne dass frisches Medium hinzugefügt wird. Sobald die aus den Protoplasten regenerierten Zellen sich zu Zellaggreggaten von mehr als 20 bis 50 Zellen entwickelt haben, wird 1 ml frisches Protoplasten-Kulturmedium, das Saccharose als Osmotikum (90 g/l) enthält, hinzugefügt.
(d) Selektion transformierter Maiszellen und Pflanzenregeneration
3 bis 10 Tage nach dem Hinzufügen des frischen Mediums können die Zellaggregate, die sich aus den Protoplasten entwickelt haben, auf Agar-Medien mit 100 mg/l L-Phoshpinothricin aufgebracht werden. N6-Medium mit den Vitaminen des Protoplasten-Kulturmediums, 90 g/l Saccharose und 1.0 mg/l 2,4-D ist ebenso geeignet wie ein analoges Medium wie beispielsweise ein Medium mit den Makro- und Mikronährsalzen des MS-Mediums (Murashige und Skoog (1962), siehe oben).
Die Kalli, die sich aus den stabil transformierten Protoplasten entwickeln, können auf dem Selektionsmedium weiter wachsen. Nach 3 bis 5 Wochen, bevorzugt nach 4 Wochen, können die transgenen Kalli in frisches Selektionsmedium übertragen werden, das ebenfalls 100 mg/l L-Phosphinotricin, jedoch kein Auxin mehr enthält. Innerhalb von 3 bis 5 Wochen beginnen etwa 50% der transgenen Maiskalli, die das L-Phosphinothricin-Acetyltransferase-Gen in ihrem Genom integriert haben, sich auf diesem Medium in Anwesenheit von L-Phosphinothricin zu Pflanzen zu differenzieren.
(e) Kultur transgener regenerativer Pflanzen
Das embryogene transformierte Maisgewebe wird auf hormonfreiem N6-Medium (Chu C.C. et al., Sci. Sin. 16 (1975), 669) in Anwesenheit von 5 × 10^-4 M L-Phophinothricin kultiviert. Auf diesem Medium entwickeln sich Maisembryonen, die das Phosphinothricin-Acetyltransferase-Gen (PAT-Gen) in ausreichend starker Weise exprimieren, zu Pflanzen. Nicht-transformierte Embryonen oder Embryonen mit nur sehr schwacher PAT-Aktivität sterben. Sobald die Blätter der In-vitro-Pflanzen eine Länge von 4 bis 6 mm erreicht haben, können sie in Erde gebracht werden. Nachdem die Agarreste an den Wurzeln abgewaschen worden sind, werden die Pflanzen in ein Gemisch aus Lehm, Sand, Vermiculit und Pflanzenerde im Verhältnis 3:1:1:1 gepflanzt und während der ersten drei Tage nach dem Pflanzen bei 90 bis 100% relativer Luftfeuchte an die Kultur in Erde gewöhnt. Die Kultur wird in einem Klimaschrank mit einer 14-stündigen Lichtperiode mit etwa 25.000 Lux auf Pflanzenhöhe und bei einer Tages-/Nachttemperatur von 23 ± 1/17 ± 1°C durchgeführt. Die adaptierten Pflanzen werden bei 65 ± 5% Luftfeuchte weiter kultiviert.
6. Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten
Die radiokative Markierung von DNA-Fragmenten wurde mit Hilfe eines DNA-Random Primer Labelling Kits der Firma Boehringer (Deutschland) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt.
7. Northern-Blot-Analyse
RNA wurde nach Standardprotokollen aus Blattgewebe isoliert. 50 μg der RNA wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt (1,5% Agarose, 1 × MEN-Puffer, 16,6% Formaldehyd). Das Gel wurde nach dem Gellauf kurz in Wasser gewaschen. Die RNA wurde mit 20 × SSC mittels Kapillarblot-Verfahren auf eine Nylonmembran vom Typ Hybond N (Amersham, GB) transferiert. Die Membran wurde anschließend bei 80°C unter Vakuum für zwei Stunden gebacken.
Die Membran wurde in NSEB-Puffer für 2 Stunden bei 68°C prähybridisiert und anschließend in NSEB-Puffer über Nacht bei 68°C in Gegenwart der radioaktiv markierten Sonde hybridisiert.
7. Pflanzenhaltung
Kartoffelpflanzen wurden im Gewächshaus unter folgenden Bedingungen gehalten:
Lichtperiode 16 h bei 25000 Lux und 22°C
Dunkelperiode 8 h bei 15°C
Luftfeuchte 60%
9. Bestimmung des Amylose/Amylopektinverhältnisses in Stärke aus Kartoffelpflanzen
Stärke wurde nach Standardmethoden aus Kartoffelpflanzen isoliert und das Verhältnis Amylose zu Amylopektin nach der von Hovenkamp-Hermelink et al. beschriebenen Methode (Potato Research 31 (1988) 241-246) bestimmt.
10. Bestimmung von Glucose, Fructose und Saccharose
Zur Bestimmung des Glucose-, Fructose- und/oder Saccharosegehalts werden kleine Knollenstücke (Durchmesser ca. 10 mm) von Kartoffelknollen in flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend für 30 min bei 80°C in 0,5 ml 10 mM HEPES, pH 7,5; 80% (Vol./Vol.) Ethanol extrahiert. Der überstand, der die löslichen Bestandteile enthält, wird abgenommen und das Volumen bestimmt. Der Überstand wird zur Bestimmung der Menge an löslichen Zuckern verwendet. Die quantitative Bestimmung von löslicher Glucose, Fructose und Saccharose wird in einem Reaktionsgemisch mit folgender Zusammensetzung durchgeführt:
100,0 mM Imidazol/HCl, pH 6,9
1,5 mM MgCl₂
0,5 mM NADP⁺
1,3 mM ATP
10-50 μg Probe
1,0 U Glucose-6-Phosphatdehydrogenase aus Hefe

Das Reaktionsgemisch wird für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Bestimmung der Zucker erfolgt anschließend mittels gängiger photometrischer Methoden durch Messung der Absorption bei 340 nm nach der aufeinanderfolgenden Zugabe von

1,0 Einheiten	Hexokinase aus Hefe (zur Bestimmung von Glucose)
1,0 Einheiten	Phosphoglucoisomerase aus Hefe (zur Bestimmung von Fructose) und
1,0 Einheiten	Invertase aus Hefe (zur Bestimmung von Saccharose).

Beispiel 1
Isolierung Stärkekorn-gebundener Proteine aus Kartoffelstärke
Die Isolierung von Stärkekorn-gebundenen Proteinen aus Kartoffelstärke erfolgte durch Elektroelution in einer Elutionsvorrichtung, die analog zu dem "Model 422 Electro Eluter" (BIORAD Laboratories Inc., USA) konstruiert war, aber ein wesentlich größeres Volumen aufwies (ca. 200 ml). Es wurden 25 g getrocknete Stärke in Elutionspuffer aufgelöst (Endvolumen 80 ml). Die Stärke stammte aus Kartoffeln, die aufgrund der Antisense-Expression einer DNA-Sequenz, die die Stärkekorngebundene Stärkesynthase I (GBSS I) aus Kartoffel codiert, eine nahezu amylosefreie Stärke produzieren. Die Suspension wurde im Wasserbad auf 70-80°C erwärmt. Anschließend wurden 72,07 g Harnstoff zugegeben (Endkonzentration 8 M) und das Volumen wurde mit Elutionspuffer auf 180 ml aufgefüllt. Die Stärke löste sich unter ständigem Rühren und bekam eine kleisterartige Konsistenz. Die Proteine wurden aus der Lösung mit Hilfe des Elutionsvorrichtung über Nacht elektroeluiert (100 V; 50-60 mA). Die eluierten Proteine wurden vorsichtig aus der Apparatur entnommen. Schwebstoffe wurden durch kurze Zentrifugation entfernt. Der Überstand wurde 2-3-mal je eine Stunde bei 4°C gegen Dialysepuffer dialysiert. Anschließend wurde das Volumen der Proteinlösung bestimmt. Die Proteine wurden durch Zugabe von Ammoniumsulfat (90% Endkonzentration) gefällt. Die Zugabe erfolgte unter ständigem Rühren bei 0°C. Die gefällten Proteine wurden durch Zentrifugation pelletiert und in Proteinpuffer aufgenommen.
Beispiel 2
Identifizierung und Isolierung von cDNA-Sequenzen, die Stärkekorn-gebundene Proteine codieren
Die gemäß Beispiel 1 isolierten Proteine wurden zur Herstellung von polyclonalen Antikörpern aus Kaninchen verwendet, die spezifisch Stärkekorn-gebundene Proteine erkennen.
Mit Hilfe derartiger Antikörper wurde anschließend nach Standardmethoden eine cDNA-Expressionsbibliothek nach Sequenzen durchmustert, die Stärkekorngebundene Proteine codieren.
Die Expressionsbibliothek wurde folgendermaßen hergestellt:
Aus Kartoffelknollen der Kartoffelvarietät "Berolina" wurde poly(A⁺)-mRNA isoliert. Ausgehend von der poly(A⁺)-mRNA wurde nach der Methode von Gubler und Hoffmann (Gene 25 (1983), 263-269) unter Verwendung eines XhoI-Oligod(t)₁₈-Primers cDNA hergestellt. Diese wurde nach EcoRI-Linkeraddition mit XhoI nachgeschnitten und orientiert in einen mit EcoRI und XhoI geschnittenen Lambda ZAP II-Vektor (Stratagene) ligiert. Ca. 500.000 Plaques einer derart konstruierten cDNA-Bibliothek wurden nach Sequenzen durchmustert, die von polyclonalen Antikörpern, die gegen Stärkekorn-gebundene Proteine gerichtet sind, erkannt wurden.
Zur Analyse der Phagenplaques wurden diese auf Nitrocellulosefilter übertragen, die vorher für 30-60 min in einer 10 mM IPTG-Lösung inkubiert und anschließend auf Filterpapier getrocknet wurden. Der Transfer erfolgte für 3 Stunden bei 37°C. Anschließend werden die Filter für 30 Minuten bei Raumtemperatur in Blockreagenz inkubiert und für 5-10 Minuten in TBST-Puffer gewaschen. Die Filter wurden mit den gegen Stärkekorn-gebundene Proteine gerichteten polyclonalen Antikörpern in geeigneter Verdünnung für 1 Stunde bei Raumtemperatur oder für 16 Stunden bei 4°C geschüttelt. Die Identifizierung von Plaques, die ein Protein exprimierten, das von den polyclonalen Antikörpern erkannt wurde, erfolgte mit Hilfe des "Blotting-Nachweiskits für Kaninchenantikörper RPN 23" (Amersham GB) nach den Angaben des Herstellers.
Phagenclone der cDNA-Bibliothek, die ein Protein exprimierten, das von den polyclonalen Antikörpern erkannt wurde, wurden unter Anwendung von Standardverfahren weiter gereinigt.
Mit Hilfe der in-vivo-Exzisions-Methode wurden von positiven Phagenclonen E. coli-Clone gewonnen, die ein doppelsträngiges pBluescript-Plasmid mit der jeweiligen cDNA-Insertion enthielten. Nach Überprüfung der Größe und des Restriktions musters der Insertionen wurde ein geeigneter Clon, pRL1, weiter analysiert.
Beispiel 3
Sequenzanalyse der cDNA-Insertion des Plasmids pRL1
Aus einem entsprechend Beispiel 2 erhaltenen E. coli-Clon wurde das Plasmid pRL1 isoliert und ein Teil der Sequenz seiner cDNA-Insertion durch Standardverfahren mittels der Didesoxynucleotidmethode (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467) bestimmt. Die Insertion ist ca. 2450 bp lang. Ein Teil der Nucleotidsequenz sowie die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz ist unter SEQ ID NO:3 und SEQ ID NO:4 angegeben.
Eine Sequenzanalyse und ein Sequenzvergleich mit bekannten DNA-Sequenzen zeigte, dass die unter SEQ ID NO:3 dargestellte Sequenz neu ist und keine signifikante Homologie zu bisher bekannten DNA-Sequenzen aufweist. Die Sequenzanalyse zeigte weiterhin, dass es sich bei der cDNA-Insertion nur um eine partielle cDNA handelt, bei der ein Teil der codierenden Region am 5'-Ende fehlt.
Beispiel 4
Identifizierung und Isolierung einer vollständigen cDNA, die ein Stärkekorn-gebundenes Protein aus Solanum tuberosum codiert
Zur Isolierung einer der partiellen cDNA-Insertion des Plasmids pRL1 entsprechenden, vollständigen cDNA wurde eine weitere cDNA-Bibliothek hergestellt. Dabei handelte es sich um eine Schließzellen-spezifische cDNA-Bibliothek aus Solanum tuberosum, die folgendermaßen konstruiert wurde:
Zunächst wurden Epidermisfragmente von Blättern von Kartoffelpflanzen der Varietät „Desirée" im Wesentlichen nach der Methode von Hedrich et al. (Plant Physiol. 89 (1989), 148) hergestellt, indem ca. 60 Blätter von sechs Wochen alten, im Gewächshaus gehaltenen Kartoffelpflanzen geerntet wurden. Aus den Blättern wurde die Mittelrippe entfernt. Anschließend wurden die Blätter in einem großen "Waring-Mischgerät" (Volumen 1 Liter) in gekühltem destilliertem H₂O viermal für je 15 Sekunden auf höchster Stufe zerkleinert. Die Suspension wurde durch ein Nylonsieb mit einer Maschenweite von 220 gm (Nybolt, Zürich, Schweiz) filtriert und mehrmals mit kaltem destilliertem Wasser gewaschen. Die Suspension wurde wiederum durch ein 220 μm-Nylonsieb filtriert und ausgiebig mit kaltem destilliertem Wasser gewaschen. Der Rückstand (Epidermisfragmente) wurde in einem kleineren "Waring-Mischgerät" (Volumen 250 ml) in destilliertem Wasser und Eis viermal für je 15 Sekunden auf einer kleinen Stufe zerkleinert. Die Suspension wurde durch ein 220 μm-Nylonsieb filtriert und ausgiebig mit kaltem destilliertem Wasser gewaschen. Die Epidermisfragmente (Rückstand) wurden mikroskopisch hinsichtlich einer Kontamination durch Mesophyllzellen untersucht. Lag eine Kontamination vor, wurde der Zerkleinerungsschritt im kleinen "Waring-Mischgerät" wiederholt.
Der Aufschluss der Schließzellen der Epidermisfragmente erfolgte durch Zermörsern in flüssigem Stickstoff in einem gekühlten Mörser für ca. 2 Stunden. Zur Überprüfung des Aufschlusses der Schließzellen wurden regelmäßig Proben genommen und mikroskopisch überprüft. Nach 2 Stunden oder wenn eine genügend große Anzahl von Schließzellen aufgeschlossen worden war, wurde das entstandene Pulver in ein Reaktionsgefäß (Volumen 50 ml) überführt und in einem Volumen GTC-Puffer (Chirgwin et al., Biochem. 18 (1979), 5294-5299) aufgenommen. Die Suspension wurde zentrifugiert und der Überstand durch Miracloth (Calbiochem, La Jolla, Kalifornien) filtriert. Das Filtrat wurde, wie in Glisin et al. (Biochemistry 13 (1974), 2633-2637) und Mornex et al. (J. Clin. Inves. 77 (1986), 1952-1961) für 16 Stunden einer Ultrazentrifugation unterzogen. Nach der Zentrifugation wurde der RNA-Niederschlag in 250 μl GTC-Puffer aufgenommen. Die RNA wurde durch Zugabe von 0,05 Volumina 1M Essigsäure und 0,7 Volumina Ethanol gefällt. Die RNA wurde abzentrifugiert und der Niederschlag mit 3M Natriumacetat (pH 4,8) und 70% Ethanol gewaschen. Die RNA wurde kurz getrocknet und in DEPC-behandeltem Wasser gelöst.
Aus der isolierten RNA wurde nach Standardverfahren poly(A)⁺-RNA isoliert. Ausgehend von der poly(A⁺)-mRNA wurde nach der Methode von Gubler und Hoffmann (Gene 25 (1983), 263-269) unter Verwendung eines XhoI-Oligod(t)₁₈-Primers cDNA hergestellt. Diese wurde nach EcoRI-Linkeraddition mit XhoI nachgeschnitten und orientiert in einen mit EcoRI und XhoI geschnittenen Lambda ZAP II-Vektor (Stratagene, GmbH, Heidelberg, Deutschland) ligiert. Das Verpacken in Phagenköpfe erfolgte unter Verwendung des Gigapack II Gold-Kits (Stratagene, GmbH, Heidelberg, Deutschland) nach den Angaben des Herstellers.
Aus einer derartigen cDNA-Bibliothek wurden nach Standardverfahren Phagenclone isoliert und gereinigt, die mit der cDNA-Insertion aus dem Plasmid pRL1 hybridisierten. Mit Hilfe der In-vivo-Exzisions-Methode wurden von positiven Phagenclonen E. coli-Clone gewonnen, die ein doppelsträngiges pBluescript-Plasmid mit der jeweiligen cDNA-Insertion enthielten. Nach Überprüfung der Größe und des Restriktionsmusters der Insertionen wurden geeignete Clone einer Restriktionskartierung und einer Sequenzanalyse unterzogen. Aus einem geeigneten Clon wurde das Plasmid pRL2 (DSM 10225) isoliert, das eine vollständige cDNA enthält, die ein Stärkekorn-gebundenes Protein aus Kartoffel codiert.
Beispiel 5
Sequenzanalyse der cDNA-Insertion des Plasmids pRL2
Die Nucleotidsequenz der cDNA-Insertion des Plasmids pRL2 wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, bestimmt. Die Insertion ist 4856 bp lang. Die Nucleotidsequenz sowie die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO:1 bzw. SEQ ID NO:2 angegeben. Das entsprechende Gen wird im Folgenden RL-Gen genannt. Das durch die codierende Region codierte Protein wird R1-Enzym genannt.
Beispiel 6
Konstruktion des Plasmids p35S-anti-RL und Einführung des Plasmids in das Genom von Kartoffelpflanzen
Aus dem Plasmid pRL1 wurde mit Hilfe der Restriktionsendonuclease Asp718 ein ca. 1800 bp langes DNA-Fragment isoliert. Dieses entspricht der unter SEQ ID NO:3. dargestellten DNA-Sequenz und enthält einen Teil des offenen Leserahmens. Das Fragment wurde in den mit Asp718 geschnittenen binären Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Sci. 66 (1990), 221-230) ligiert. Bei diesem handelt es sich um ein Derivat des binären Vektors pBin19 (Bevan, Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711-8721). pBinAR wurde folgendermaßen konstruiert:
Ein 529 bp langes Fragment, das die Nucleotide 6909-7437 des 35S-Promotors des Blumenkohl-Mosaik-Virus umfasst (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294), wurde als EcoRI/KpnI-Fragment aus dem Plasmid pDH51 (Pietrzak et al., Nucl. Acids Res. 14, 5857-5868) isoliert und zwischen die EcoRI- und die KpnI-Schnittstellen des Polylinkers von pBin19 ligiert. Dabei entstand das Plasmid pBin19-A.
Aus dem Plasmid pAGV40 (Herrera-Estrella et al., Nature 303, 209-213) wurde mit Hilfe der Restriktionsendonucleasen PvuII und HindIII ein 192 bp langes Fragment isoliert, das das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3, 835-846) umfasst (Nucleotide 11749-11939). Nach Addition von SphI-Linkern an die PvuI-Schnittstelle wurde das Fragment zwischen die SphI- und HindIII-Schnittstellen pBin19-A ligiert. Dabei entstand das Plasmid pBinAR.
Mit Hilfe von Restriktions- und Sequenzanalysen wurden rekombinante Vektoren identifiziert, bei denen das DNA-Fragment derart in den Vektor inseriert ist, dass ein Teil der codierenden Region der cDNA-Insertion aus pRL1 in Antisense-Orientierung mit dem 35S-Promotor verknüpft ist. Das resultierende Plasmid, p35S-anti-RL, ist in 1 dargestellt.
Durch die Insertion des cDNA-Fragmentes entsteht eine Expressionskassette, die aus den Fragmenten A, B und C aufgebaut ist:
Das Fragment A (529 bp) enthält den 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV). Das Fragment umfasst die Nucleotide 6909 bis 7437 des CaMV (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294).
Das Fragment B enthält neben flankierenden Bereichen einen Teil der Protein codierenden cDNA-Insertion aus dem Plasmid pRL1. Diese wurde, wie oben beschrieben, als Asp718-Fragment aus pRL1 isoliert und in Antisense-Orientierung an den 35S-Promotor fusioniert.
Fragment C (192 bp) enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835-846).
Die Größe des Plasmids p35S-anti-RL beträgt ca. 12,8 kb.
Das Plasmid wurde, wie oben beschrieben, mit Hilfe Agrobakterien-vermittelter Transformation in Kartoffelpflanzen transferiert. Aus den transformierten Zellen wurden ganze Pflanzen regeneriert. Die transformierten Pflanzen wurden unter Gewächshausbedingungen kultiviert. Die Überprüfung des Erfolges der genetischen Veränderung der Pflanzen erfolgte durch Analyse der Gesamt-RNA in einer Northern-Blot-Analyse hinsichtlich des Verschwindens der zu der cDNA komplementären Transkripte. Hierzu wurde Gesamt-RNA aus Blättern transformierter Pflanzen nach Standardmethoden isoliert, anschließend gelelektrophoretisch auf einem Agarosegel aufgetrennt, auf eine Nylonmembran transferiert und mit einer radioaktiv markierten Sonde hybridisiert, die die unter SEQ ID NO:1 dargestellte Sequenz oder einen Teil dieser Sequenz aufweist. In ca. 5-10% der transformierten Pflanzen fehlte in der Northern-Blot-Analyse die Bande, die das spezifische Transkript unter SEQ ID NO:1 anzeigt. Diese Pflanzen wurden zur Analyse der Stärkequalität verwendet.
Beispiel 7
Konstruktion des Plasmids UB33-anti-RL und Einführung des Plasmids in das Genom von Kartoffelpflanzen
Aus dem Plasmid pRL1 wurde mit Hilfe der Restriktionsendonuclease Asp718 ein ca. 1800 bp langes DNA-Fragment isoliert, das einen Teil des offenen Leserahmens der cDNA-Insertion umfasst, und in den mit Asp718 geschnittenen Vektor B33-Hyg ligiert. Dieser Vektor wurde folgendermaßen hergestellt:
Aus dem Vektor pBinAR Hyg (DSM 9505) wurde mit Hilfe der Restriktionsendonucleasen EcoRI und Asp718 der 35S-Promotor entfernt. Aus dem Plasmid p33-anti-BE (DSM 6146) wurde mit Hilfe von EcoRI und Asp718 ein ca. 1526 bp langes Fragment, das den B33-Promotor umfasst, isoliert und in den mit EcoRI und Asp718 geschnittenen Vektor pBinAR Hyg (DSM 9505) inseriert.
Durch die Insertion des cDNA-Fragmentes in die Asp718-Schnittstelle des Plasmids B33-Hyg entsteht eine Expressionskassette, die folgendermaßen aus den Fragmenten A, B und C aufgebaut ist (4):
Das Fragment A enthält den B33-Promotor aus Solanum tuberosum ( EP 3775 092 ; Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29).
Das Fragment B enthält neben flankierenden Bereichen einen Teil der Protein codierenden Region der cDNA-Insertion aus dem Plasmid pRL1. Diese wurde, wie oben beschrieben, als Asp718-Fragment aus pRL1 isoliert und in Antisense-Orientierung an den 35S-Promotor fusioniert.
Fragment C (192 bp) enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835-846).
Die Größe des Plasmids pB33-anti-RL beträgt ca. 12,8 kb.
Das Plasmid wurde mit Hilfe Agrobakterien-vermittelter Transformation in Kartoffelpflanzen transferiert, wie oben beschrieben. Aus den transformierten Zellen wurden ganze Pflanzen regeneriert. Die transformierten Pflanzen wurden unter Gewächshausbedingungen kultiviert. Die Überprüfung des Erfolges der genetischen Veränderung der Pflanzen erfolgte durch Analyse der Gesamt-RNA in einer Northern-Blot-Analyse hinsichtlich des Verschwindens der zu der cDNA komplementären Transkripte. Hierzu wurde Gesamt-RNA aus Blättern transformierter Pflanzen nach Standardmethoden isoliert, anschließend gelelektrophoretisch auf einem Agarosegel aufgetrennt, auf eine Nylonmembran transferiert und mit einer radioaktiv markierten Sonde hybridisiert, die die unter SEQ ID NO:1 dargestellte Sequenz oder einen Teil dieser Sequenz aufweist. In ca. 5-10% der transformierten Pflanzen fehlte in der Northern-Blot-Analyse die Bande, die Transkripte darstellt, die mit der erfindungsgemäßen cDNA hybridisieren. Aus diesen Pflanzen wurde aus Knollen die Stärke isoliert und, wie in Beispiel 8 beschrieben, analysiert.
Beispiel 8
Analyse der transformierten Kartoffelpflanzen
Die gemäß Beispiel 6 und Beispiel 7 transformierten Kartoffelpflanzen wurden hinsichtlich der Eigenschaften der synthetisierten Stärke untersucht. Die Analysen wurden an verschiedenen Linien von Kartoffelpflanzen durchgeführt, die mit dem Plasmid p35S-anti-RL bzw. mit dem Plasmid pB33-anti-RL transformiert worden waren und die in der Northern-Blot-Analyse die Bande nicht aufwiesen, die Transkripte darstellt, die mit den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen hybridisieren.
a) Bestimmung der Viskosität wässriger Lösungen der Stärke
Zur Bestimmung der Viskosität der wässrigen Lösungen der in transformierten Kartoffelpflanzen synthetisierten Stärke wurde aus Knollen von Pflanzen, die mit dem Plasmid p35S-anti-RL bzw. mit dem Plasmid pB33-anti-RL transformiert worden waren, Stärke nach Standardverfahren isoliert. Es wurden jeweils 30 g Stärke in 450 ml H₂O aufgenommen und für die Analyse in einem Viskograph E (Brabender OHG Duisburg (Deutschland)) verwendet. Der Betrieb des Gerätes erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Zur Bestimmung der Viskosität der wässrigen Lösung der Stärke wurde die Stärkesuspension zunächst von 50°C auf 96°C mit einer Geschwindigkeit von 3°C pro Minute erhitzt. Anschließend wurde die Temperatur für 30 Miunuten bei 96°C gehalten. Danach wurde die Lösung von 96°C auf 50°C mit einer Geschwindigkeit von 3°C pro Minute abgekühlt. Während der gesamten Dauer wurde die Viskosität bestimmt. Repräsentative Ergebnisse derartiger Messungen sind in Form von Kurven, in denen die Viskosität in Abhängigkeit von der Zeit dargestellt ist, in 3, 4 und 5 wiedergegeben. 3 zeigt eine typische Brabenderkurve für Stärke, die aus Wildtyp-Pflanzen der Kartoffelvarietät Désirée isoliert wurde. 4 und 5 zeigen eine typische Brabenderkurve für Stärke, die aus Kartoffelpflanzen isoliert wurde, die mit dem Plasmid p35S-anti-RL bzw. pB33-anti-RL transformiert worden waren. Aus den Kurven lassen sich charakteristische Werte ableiten.
Für Wildtyppflanzen ergeben sich dabei folgende charakteristische Werte: Tabelle 1
Die Werte geben Mittelwerte aus zwei verschiedenen Messungen wieder.
In der Tabelle 1 und den folgenden Tabellen 2 und 3 bedeuten die Abkürzungen Folgendes:

A:: Verkleisterungsbeginn
B:: Maximale Viskosität
C:: Start der 96°C-Periode
D:: Start der Kühlzeit
E:: Ende der Kühlzeit
F:: Ende der End-50°C-Periode.

Für Pflanzen, die mit dem Plasmid p35S-anti-RL transformiert worden waren (Linie P2), ergeben sich dabei folgende charakteristische Werte:
Tabelle 2
Für Pflanzen, die mit dem Plasmid pB33-anti-RL transformiert worden waren (Linie P3), ergeben sich dabei folgende charakteristische Werte: Tabelle 3
Aus den 3, 4 und 5 geht deutlich hervor, dass die Stärke aus transformierten Pflanzen sich von der aus Wildtyp-Pflanzen insbesondere dadurch unterscheidet, dass beim Erhitzen nur eine sehr geringe Viskositätszunahme erfolgt. So liegt die maximale Viskosität bei der modifizierten Stärke aus transformierten Pflanzen beim Erhitzen um mehr als 50% unter dem Wert der Wildtyp-Stärke.
Andererseits steigt die Viskosität der aus transformierten Pflanzen isolierten Stärke während des Abkühlens stärker an als bei Wildtyp-Stärke.
b) Bestimmung des Phosphatgehaltes der Stärke
Der Phosphatgehalt der Stärke wurde bestimmt, indem die Menge an Phosphat, das an der C-6-Position von Glucoseresten gebunden war, gemessen wurde. Hierzu wurde Stärke zunächst durch Säurehydrolyse gespalten und anschließend der Gehalt an Glucose-6-Phosphat mittels eines Enzymtests bestimmt, wie im Folgenden beschrieben.
100 mg Stärke wurden in 500 μl 0,7 N HCl 4 Stunden bei 100°C inkubiert. Nach der Säurehydrolyse wurden 10 μl des Ansatzes in 600 μl Imidazolpuffer (100 mM Imidazol, 5 mM MgCl₂, pH 6,9, 0,4 mM NAD⁺) gegeben. Die Bestimmung der Menge an Glucose-6-Phosphat in dem Reaktionsgemisch erfolgte durch Umsetzung mit dem Enzym Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase. Dazu wurde dem Ansatz 1E Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (aus Leuconostoc mesenteroides (Boehringer Mannheim)) zugesetzt und die Menge an gebildetem NADH durch Messung der Absorption bei 340 nm bestimmt.
Der Gehalt an Glucose-6-Phosphat in 1 mg Stärke ist in der folgenden Tabelle für nicht-transformierte Kartoffelpflanzen der Varietät Désirée sowie für zwei Linien (P1 (35S-anti-RL; P2 (35S-anti-RL)) transgener Kartoffelpflanzen, die mit dem Plasmid p35S-anti-RL transformiert worden waren, angegeben.
Tabelle 4
Die folgende Tabelle zeigt den Glucose-6-Phosphat-Gehalt pro Milligramm Stärke bei Kartoffelpflanzen, die mit dem Plasmid pB33-anti-RL transformiert worden waren, im Vergleich zu Stärke aus nicht-transformierten Pflanzen (S. tuberosum c.v. Désirée).
Tabelle 5
Die Pflanzen 7, 37, 45 und 31 stellen unabhängige Transformanten dar, die mit dem Plasmid pB33-anti-RL transformiert worden waren. Die Pflanze 37 repräsentiert die Linie P3, für die in 5 eine Brabenderkurve dargestellt ist.
Die Werte zeigen, dass der Phosphatgehalt der modifizierten Stärke aus transgenen Kartoffelpflanzen um mindestens ca. 50% im Vergleich zu Stärke aus Wildtyp-Pflanzen verringert ist.
c) Bestimmung des Glucose-, Fructose- und Saccharosegehalts von Knollen nach Lagerung bei 4°C
Knollen von Pflanzen verschiedener transgener Linien, die mit dem Antisense-Konstrukt p35S-anti-RL transformiert worden waren, und von Wildtyp-Pflanzen wurden für 2 Monate bei 4°C bzw. bei 20°C im Dunkeln gelagert. Anschließend wurden die Mengen an Glucose, Fructose und Saccharose bestimmt. Dabei ergaben sich für zwei transgene Linien folgende repräsentative Werte: Tabelle 6
Die Werte in der Tabelle sind in μMol Hexose bzw. Saccharose/g Frischgewicht angegeben.
Aus den Werten in Tabelle 6 wird deutlich, dass bei den transgenen Pflanzen bei einer Lagerung bei 4°C eine wesentlich geringere Akkumulation reduzierender Zucker in den Knollen stattfindet als bei Wildtyp-Pflanzen.
Insgesamt ähnelt die aus transgenen Kartoffelpflanzen isolierte modifizierte Stärke der Stärke aus Mais-Wildtyp-Pflanzen. Im Vergleich zu dieser besitzt sie den Vorteil, dass sie geschmacksneutral ist und so für verschiedene Verwendungsmöglichkeiten im Nahrungsmittelbereich besser geeignet ist.
Beispiel 9
Expression der cDNA-Insertion des Plasmids DRL2 in E. coli
(a) Transformation von Bakterienzellen
Zur Expression der cDNA-Insertion des Plasmids pRL2 wurden Zellen des E. coli-Stammes DH5α zunächst mit dem Plasmid pACAC transformiert. Dieses Plasmid enthält ein DNA-Fragment, das die ADP-Glucose-Pyrophosphorylase (AGPase) aus E. coli codiert, unter der Kontrolle des lac Z-Promotors. Das Fragment war als ca. 1,7 kb großes DraI/HaeII-Fragment aus dem Vektor pEcA-15 (siehe B. Müller-Röber (1992), Dissertation, FU Berlin) isoliert worden und nach Auffüllung seiner klebrigen Enden in einen mit HindIII linearisierten pACAC184-Vektor cloniert worden. Die Expression der AGPase soll eine Steigerung der Glycogensynthese in transformierten E. coli-Zellen bewirken. Die derart transformierten Zellen werden im Folgenden als E. coli-K1-Zellen bezeichnet.
Zur Bestimmung der Enzymaktivität des durch die cDNA des Plasmids pRL2 codierten Proteins, wurden E. coli-K1-Zellen mit dem Plasmid pRL2 transformiert. Die transformierten E. coli-Zellen, die sowohl das Plasmid pACAC als auch das Plasmid pRL2 enthalten, werden im Folgenden als E. coli-K2-Zellen bezeichnet.

Der Transfer der Plasmid-DNA in die Bakterienzellen erfolgte jeweils nach der Methode von Hanahan (J. Mol. Biol. 166 (1983), 557-580). Die transformierten E. coli-Zellen wurden auf Agarkulturschalen mit folgender Zusammensetzung ausgestrichen: YT-Medium mit

1,5%	Bacto-Agar
50 mM	Natriumphosphat-Puffer, pH 7,2
1 %	Glucose
10 μg/ml	Chloramphenicol bei E. coli-KI-Zellen bzw.
10 μg/ml	Chloramphenicol und
10 μg/ml	Ampicillin bei E. coli-K2-Zellen.

Escherichia coli-Zellen des Stammes DH5α, die mit dem Plasmid pRL2 + pACAC (E. coli-K2-Zellen) sowie als Kontrolle nur mit dem Plasmid pACAC (E. coli-KI-Zellen) transformiert worden waren, wurden auf Agarplatten angezogen. Das gebildete Glycogen der verschiedenen Kulturen wurde bezüglich des Phosphorylierungsgrades (an C-6-Position des Glucosemoleküls) hin untersucht, wie im Folgenden beschrieben wird.
(b) Isolierung von bakteriellem Glycogen
Zur Isolierung von bakteriellem Glycogen wurde der nach der Transformation gewachsene Bakterienrasen von jeweils 6 Agarplatten (Ø 135 mm) mit 5 ml YT-Medium/Platte abgeschwemmt. Die Bakteriensuspension wurde bei 4500 × g für 5 Minuten zentrifugiert. Der Bakterienniederschlag wurde in 10 ml YT-Medium resuspendiert. Der Aufschluss der Bakterien erfolgte durch Zugabe von 2 Volumina Aufschlussmedium (0,2 N NaOH; 1 % SDS) und Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Durch Zugabe von 3 Volumina EtOH abs., 30-minütige Inkubation bei 4°C und anschließende Zentrifugation von 15 Minuten bei 8000 gx wurde das Glycogen sedimentiert. Anschließend wurde der Niederschlag mit 100 ml 70%igem EtOH gewaschen und erneut durch einen Zentrifugationsschritt (10 Minuten bei 8000 xg) sedimentiert. Der Waschvorgang wurde 4-mal wiederholt.
(c) Bestimmung des Gesamtglycogengehaltes
Das isolierte und sedimentierte Glycogen wurde zunächst durch saure Hydrolyse (Lösen des Niederschlags in 2 ml 0,7 N HCl; Inkubation für 4 Stunden bei 100°C) in die einzelnen Glucosemoleküle aufgespalten. Der Glucosegehalt der Lösung wurde mittels gekoppelter enzymatischer Reaktion eines Stärke-Tests nach Angaben des Herstellers (Boehringer Mannheim) an einem Photometer (Firma Kontron) bei einer Wellenlänge von 340 nm bestimmt. Der Reaktionspuffer enthält:

100 mM MOPS, pH 7,5

10 mM MgCl₂

2 mM EDTA

0,25 mM NADP

1 mM ATP

1 E/ml Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase

2 E/ml Hexokinase
Die Messung erfolgte bei 25°C mit 10 μl Glucoselösung.
(d) Bestimmung des Glucose-6-Phosphat-Gehaltes
Zur Bestimmung des Gehaltes der an der C-6-Position phosphorylierten Glucosemoleküle wurden gleiche Mengen an Glucose der verschiedenen Bakterienkulturen eingesetzt. Durch Zugabe von gleichen Volumina an 0,7 N KOH zu dem mittels saurer Hydrolyse (siehe oben) in seine Glucosemoleküle aufgespaltenen Glycogens wurde die Lösung neutralisiert. Der Reaktionspuffer enthält:

100 mM MOPS, pH 7,5

10 mM MgCl₂

2 mM EDTA

0,25 mM NADP

2 E/ml Glucose-6-Phosphat-
Dehydrogenase
Die Messung erfolgte bei 25°C mit 100-150 μl Glucoselösung.
(e) Nachweis einer bakterielles Glycogen phosphorylierenden Enzymaktivität
Die Ergebnisse der Bestimmung des Phosphatgehaltes des in den Bakterienzellen synthetisierten Glycogens zeigen, dass das Glycogen der E. coli-Zellen, die mit den Plasmiden pACAC + pRL2 transformiert worden waren, eine zu 290 ± 25% erhöhte Phosphorylierung an der C-6-Position der Glucose aufweist, verglichen mit dem Kontrollansatz (E. coli-Zellen transformiert mit dem Plasmid pACYC) (siehe folgende Tabelle)

E. coli-Zellen Glucose-6-Phosphat: Glucose im Glycogen

E. coli-K1 1:(4600 ± 1150)

E. coli-K2 1:(1570 ± 390)
Die hier dargestellten Phosphorylierungsgrade sind der Mittelwert aus mindestens 6 Messungen ausgehend von 6 unabhängigen Transformationen und Glycogenisolierungen.
Beispiel 10
Einführung des Plasmids p35S-anti-RL in Kombination mit dem Plasmid p35SH-anti-BE in das Genom von Kartoffelpflanzen
Das Plasmid p35S-anti-RL wurde konstruiert, wie im Beispiel 6 beschrieben. Das Plasmid p35SH-anti-BE wurde konstruiert, wie in der Anmeldung WO95/07355, Beispiel 3, beschrieben. Beide Plasmide wurden mit Hilfe der Agrobakteriumvermittelten Transformation, wie oben beschrieben, sequenziell in Kartoffelpflanzen übertragen. Dazu wurde zunächst das Plasmid p35SH-anti-BE in Kartoffelpflanzen transformiert. Es wurden ganze Pflanzen regeneriert und auf eine verringerte Expression des Verzweigungs-Enzymgens selektiert. Anschließend wurde das Plasmid p35S-anti-RL in die bereits eine reduzierte Expression des Verzweigungs-Enzyms aufweisenden transgenen Pflanzen transformiert. Aus den transformierten Zellen wurden wiederum transgene Pflanzen regeneriert, und die transformierten Pflanzen wurden unter Gewächshausbedingungen kultiviert. Die Überprüfung des Erfolges der genetischen Veränderung der Pflanzen in Bezug auf eine stark reduzierte Expression sowohl des Verzweigungs-Enzymgens als auch in Bezug auf eine stark reduzierte Expression des RL-Gens erfolgte durch Analyse der gesamten RNA in einer RNA-Blot-Analyse bezüglich des Verschwindens der zu Verzweigungsenzym-cDNA bzw. RL-cDNA komplementären Transkripte. Hierzu wurde die Gesamt-RNA aus Blättern transformierter Pflanzen nach beschriebenen Methoden isoliert, anschließend gelelektrophoretisch aufgetrennt, auf eine Membran transferiert und mit einer radioaktiv markierten Sonde hybridisiert, die die unter SEQ ID NO:1 dargestellte Sequenz oder einen Teil dieser Sequenz aufweist, und anschließend mit einer radioaktiv markierten Probe hybridisiert, die die Sequenz der Verzweigungsenzym-cDNA (vgl. WO92/14827) oder einen Teil derselben aufweist. In ca. 5%-10% der transformierten Pflanzen fehlte in der RNA-Blot-Analyse sowohl die Bande, die das spezifische Transkript der unter SEQ ID No:1 dargestellten Sequenz darstellt, als auch die Bande, die das spezifische Transkript der Verzweigungsenzym-cDNA (vgl. WO92/14827) darstellt. Diese Pflanzen, welche als R4-Pflanzen bezeichnet wurden, wurden zur Analyse der Qualität der in den Knollen enthaltenen Stärke eingesetzt.
Beispiel 11
Einführung des Plasmids DB33-anti-RL in Kombination mit dem Plasmid pB33-anti-GBSSI in das Genom von Kartoffelpflanzen
Das Plasmid pH33-anti-RL wurde konstruiert, wie in Beispiel 7 beschrieben. Das Plasmid pB33-anti-GBSSI wurde wie folgt konstruiert:
Das DraI/DraI-Fragment aus der Promotorregion des Patatin Klasse I-Gens B33 von Solanum tuberosum, umfassend die Nucleotide -1512 bis +14 (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) wurde in die SmaI-Schnittstelle des Plasmids pUC19 ligiert. Aus dem entstandenen Plasmid wurde das Promotorfragment als EcoRI/HindIII-Fragment in die Polylinker-Region des Plasmids pBin19 (Bevan, Nucleic Acids Research 12 (1984), 8711-8721) ligiert. Anschließend wurde das 3'-EcoRI-Fragment 1181 bis 2511 des GBSSI-Gens von Solanum tuberosum (Hergersberg, Dissertation (1988) Universität zu Köln) in die EcoRI-Schnittstelle des entstandenen Plasmids ligiert.
Beide Plasmide wurden mit Hilfe von Agrobakterium vermittelter Transformation sequenziell in Kartoffelpflanzen transferiert, wie unter Beispiel 10 beschrieben. Aus den transformierten Zellen wurden Pflanzen regeneriert, und die transformierten Pflanzen wurden unter Gewächshausbedingungen kultiviert. Die Überprüfung des Erfolges der genetischen Veränderungen der Pflanzen erfolgte durch Analyse der Gesamt-RNA in einer RNA-Blot-Analyse bezüglich des Verschwindens der zu den beiden cDNAs komplementären Transkripte. Hierzu wurde die Gesamt-RNA aus Knollen transformierter Pflanzen nach Standardmethoden isoliert, anschließend gelelektrophoretisch auf einem Agarosegel aufgetrennt, auf eine Membran transferiert und mit einer radioaktiv markierten Sonde hybridisiert, die die unter SEQ ID NO:1 dargestellte Sequenz oder einen Teil der Sequenz aufweist. Danach wurde die gleiche Membran mit einer radioaktiv markierten Sonde hybridisiert, die die Sequenz des GBSSI-Gens oder einen Teil dieser Sequenz aufweist (Hergersberg, Dissertation (1988) Universität zu Köln). In ca. 5% bis 10% der transformierten Pflanzen fehlte in der RNA-Blot-Analyse die Bande, die Transkripte darstellt, die mit der erfindungsgemäßen cDNA bzw. mit der GBSSI-cDNA hybridisierten. Aus den Knollen dieser Pflanzen, welche als R3-Pflanzen bezeichnet wurden, wurde Stärke isoliert und analysiert.
Beispiel 12
Stärkeanalyse der R4-Pflanzen
Die gemäß Beispiel 10 transformierten Kartoffelpflanzen wurden hinsichtlich der Eigenschaften der synthetisierten Stärke untersucht. Die Analysen wurden an verschiedenen Linien von Kartoffelpflanzen durchgeführt, die mit den beiden Plasmiden p35S-anti-RL und p35SH-anti-BE transformiert worden waren und die in der RNA-Blot-Analyse die Banden nicht mehr oder nur stark reduziert aufwiesen, die Transkripte darstellen, die mit den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen bzw. mit der Sequenz der Verzweigungs-cDNA hybridisieren.
a) Bestimmung der Viskosität wässriger Lösungen der Stärke
Zur Bestimmung der Viskosität der wässrigen Lösungen der in transformierten Kartoffelpflanzen synthetisierten Stärke wurde aus Knollen von Pflanzen, die mit dem Plasmid p35S-anti-RL und mit dem Plasmid p35SH-anti-BE transformiert worden waren, Stärke isoliert. Es wurden jeweils 2 g Stärke in 25 ml H₂O gelöst und für die Analyse in einem Rapid Visco Analyser (Newport Scientific Pty Ltd, Investment Support Group, Warriewood NSW 2102, Australien) verwendet. Der Betrieb des Gerätes erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Zur Bestimmung der Viskosität der wässrigen Lösung der Stärke wurde die Stärkesuspension mit einer Geschwindigkeit von 12°C pro Minute zunächst von 50°C auf 95°C erhitzt. Anschließend wurde die Temperatur für 2,5 Minuten bei 95°C gehalten. Danach wurde die Lösung mit einer Geschwindigkeit von 12°C pro Minute von 95°C auf 50°C abgekühlt. Während der gesamten Dauer wurde die Viskosität bestimmt. Repräsentative Ergebnisse derartiger Messungen sind in Form von Kurven, in denen die Viskosität in Abhängigkeit von der Zeit dargestellt ist, wiedergegeben. 6 zeigt eine typische RVA-Kurve für Stärke, die aus Wildtyp-Pflanzen der Kartoffelvarietät Désirée isoliert wurde. Linie 2 bzw. 3 zeigen typische RVA-Kurven für Stärken, die aus Pflanzenknollen isoliert wurden, die mit dem Plasmid p35SH-anti-BE bzw. p35S-anti-RL transformiert worden waren. Linie 4 zeigt eine typische RVA-Kurve für Stärke, die aus den Knollen von Pflanzen isoliert worden ist, die mit dem Plasmid p35SH-anti-BE in Kombination mit dem Plasmid p35S-anti-RL transformiert wurde. Linie 4 zeichnet sich durch das Fehlen jedweder Viskositätszunahme in Abhängigkeit von der Temperatur aus.
b) Bestimmung des Verhältnisses von Amylose zu Amylopektin
Aus den Knollen von transformierten Kartoffelpflanzen isolierte Stärke wurde auf das Verhältnis von Amylose zu Amylopektin untersucht. Dabei ergab sich für die Pflanzenlinie R4-1 (dargestellt in Linie 4 der 6) ein Amylosegehalt von über 70%. Für die Pflanzenlinie R4-3 ergab sich ein Amylosewert von 27%, während der Amylosegehalt in Wildtypstärke aus der Varietät Désirée zwischen 19 und 22% liegt.
Beispiel 13
Stärkeanalyse der R3-Pflanzen
Die gemäß Beispiel 11 transformierten Kartoffelpflanzen wurden hinsichtlich der Eigenschaften der synthetisierten Stärke untersucht. Die Analysen wurden an verschiedenen Linien von Kartoffelpflanzen durchgeführt, die mit den beiden Plasmiden pB33-anti-RL und pB33-anti-GBSSI transformiert worden waren und die in der RNA-Blot-Analyse die Banden nicht mehr oder nur stark reduziert aufwiesen, die Transkripte darstellen, die mit den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen bzw. mit der Sequenz der GBSSI-cDNA hybridisieren.
a) Bestimmung der Viskosität wässriger Lösungen der Stärke
Zur Bestimmung der Viskosität der wässrigen Lösungen der in transformierten Kartoffelpflanzen synthetisierten Stärke wurde aus Knollen von Pflanzen, die mit dem Plasmid pB33-anti-RL in Kombination mit dem Plasmid pB33-anti-GBSSI transformiert worden waren, Stärke isoliert. Die Bestimmung der Viskosität mittels eines Rapid Visco Analysers erfolgte nach der in Beispiel 12, Teil a, beschriebenen Methode. Die Ergebnisse sind in 7 dargestellt. 7 zeigt in Linie 1 eine typische RVA-Kurve für Stärke, die aus Wildtyp-Pflanzen der Kartoffelvarietät Désirée isoliert wurde. Linie 2 bzw. 3 zeigen typische RVA-Kurven für Stärken, die aus Kartoffelpflanzen isoliert wurde, die mit dem Plasmid pB33-anti-GBSSI bzw. p35S-anti-RL transformiert worden waren. Linie 4 zeigt eine typische RVA-Kurve für Stärke, die aus den Kartoffelpflanzen isoliert wurde, die mit dem Plasmid pB33-anti-GBSSI in Kombination mit dem Plasmid pB33-anti-RL transformiert worden waren. Diese Kurve zeichnet sich durch das Fehlen des Viskositätsmaximums sowie dem Fehlen des Anstiegs der Viskosität bei 50°C aus. Des Weiteren zeichnet sich diese Stärke dadurch aus, dass der nach RVA-Behandlung erhalten Kleister so gut wie keine Retrogradation nach mehrtägiger Inkubation bei Raumtemperatur aufweist.
b) Bestimmung des Verhältnisses von Amylose zu Amylopektin
Aus den Knollen von transformierten Kartoffelpflanzen isolierte Stärke wurde auf das Verhältnis von Amylose zu Amylopektin untersucht. Dabei ergab sich für die Pflanzenlinie R3-5 (dargestellt in Linie 4 der 7) ein Amylosegehalt von unter 4%, für die Pflanzenlinie R3 ein Amylosegehalt von unter 3%. Der Amylosegehalt in Wildtypstärke aus der Varietät Désirée liegt zwischen 1 und 22%.
c) Bestimmung des Phosphatgehaltes der Stärke
Der Phosphatgehalt der Stärke wurde bestimmt, indem die Menge an Phosphat, das an der C-6-Position von Glucose-Resten gebunden war, gemessen wurde. Hierzu wurde Stärke zunächst durch Säurehydrolyse gespalten und anschließend der Gehalt an Glucose-6-Phosphat mittels eines Enzymtests bestimmt, wie im Folgenden beschrieben.
100 mg Stärke wurden in 500 μl 0,7 N HCl 4 Stunden bei 100°C inkubiert. Nach der Säurehydrolyse wurden 10 μl des Reaktionsgemisches in 600 μl Imidazolpuffer (100 mM Imidazol, 5 ml MgCl₂, pH 6,9, 0,4 mM NAD⁺) gegeben. Die Bestimmung der Menge an Glucose-6-Phosphat in dem Reaktionsgemisch erfolgte durch Umsetzung mit dem Enzym Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase. Dazu wurde dem Reaktionsgemisch 1E Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (aus Leuconostoc mesenteroides (Boehringer Mannheim)) zugesetzt und die Menge an gebildetem NADH durch Messung der Absorption bei 340 nm bestimmt.
Der Gehalt an Glucose-6-Phosphat pro 1 mg Stärke ist in der folgenden Tabelle für nicht-transformierte Kartoffelpflanzen der Varietät Désirée sowie für die Linien R3-5 und R3-6 transgener Kartoffelpflanzen, die mit dem Plasmid pB33-anti-RL in Kombination mit dem Plasmid pB33-anti-GBSSI transformiert worden waren, angegeben. Zum Vergleich ist der Wert für die Stärke aus der sog. waxy-Kartoffel (US2-10) mit angegeben, die mit dem Plasmid pB33-anti-GBSSI transformiert worden war.
Tabelle 7
Beispiel 14
Isolierung einer DNA-Sequenz, die ein R1-Enzym aus Zea mays codiert
Bakterien des XL1-Blue-Stamms wurden mit Lambda-Phagen infiziert, wobei die Phagenköpfe eine cDNA-Bibliothek des Endospermgewebes von Zea mays (Stratagene, Heideberg) enthielten. Die infizierten E. coli-Zellen wurden mit einer Dichte von etwa 25.000 Plaques pro etwa 75 cm² auf ein Medium in Petrischalen plattiert. Nach etwa 9-stündiger Inkubation wurden Nitrocellulosefilter auf die lysierten Bakterien gelegt und nach einer Minute entfernt. Die Filter wurden zuerst 2 Minuten in 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl, dann 2 Minuten in 0,5 M Tris-HCl, pH 7,0, inkubiert und anschließend 2 Minuten in 2 × SSC gewaschen. Nach dem Trocknen und Fixieren mittels UV-Vernetzung wurden die Filter 3 Stunden in Puffer A inkubiert, bevor eine radioaktiv markierte DNA-Sonde hinzugefügt wurde (Zufallspriming). Ein Fragment der DNA-Insertion des Plasmids pRL2 (siehe Beispiele 4 und 5) mit einer Größe von etwa 2,7 wurde als Sonde verwendet. Dieses Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen XhoI und HindIII geschnitten und stellten das 3'-Ende der cDNA-Insertion in pRL2 dar (siehe 8).
Nach 12-stündiger Hybridisierung bei 48°C wurden die Filter 1 × 10 Minuten in 2 × SSC/1% SDS bei Raumtemperatur und dann 2 × 20 Minuten in 1 × SSC/0,5% SDS bei 35°C gewaschen und anschließend autoradiographiert.
Phagenclone, die eine cDNA-Insertion umfassten, wurden in drei Durchmusterungszyklen ausselektiert. Auf diese Art wurden beim Durchmustern von circa 1.500.000 Phagenplaques etwa 6 Plaques identifiziert.
Diese positiven Phagenclone wurden zur In-vivo-Exzision eines pBluescript-Plasmids nach Standardverfahren verwendet. Die DNA-Sequenzen der entsprechenden Insertionen wurden anhand des Verfahrens von Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467) bestimmt. So konnte eine Anzahl von Clonen identifiziert werden, die ein R1-Enzym aus Mais codierende Insertionen enthielten. Die cDNA-Insertion eines geeigneten Clons, R1M, wurde vollständig bestimmt. Die Nucleinsäuresequenz ist in SEQ ID NO:5 angegeben. Die hieraus abgeleitete Aminosäuresequenz ist in SEQ ID No:6 angegeben.
Eine geeignete cDNA-Insertion des R1M-Clons wurde mit Hilfe von Standardmethoden (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborator Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbour Laboratory Press, (1989), NY, USA) mit Notl und XhoI aus dem pBluescript-Derivat isoliert. Die klebrigen Enden wurden aufgefüllt und das Fragment wurde an der HpaI-Schnittstelle in den pUBlbar-Vektor eingeführt. Dieses Plasmid kann zur Transformation von Pflanzenzellen, insbesondere Mais, nach den oben beschriebenen Verfahren verwendet werden. Da die in SEQ ID NO:5 aufgeführte Sequenz nur eine cDNA-Teilsequenz darstellt, wurden weitere Verfahren angewandt, um Sequenzen zu isolieren, die das 5'-Ende der cDNA darstellen. Hierzu wurde poly(A)⁺-RNA aus Maisblattgewebe nach Standardverfahren isoliert. Die isolierte RNA wurde für eine Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung des Titan^TM One Tube RT-PCR-Systems (Boehringer Mannheim, Deutschland) nach den Anweisungen des Herstellers verwendet. In dieser Reaktion wird die RNA in einem erstem Schritt in eine cDNA transkribiert, die dann als Vorlage für die PCR verwendet wird. Als Primer wurden die folgenden Oliogonucleotide verwendet:
Die Kombination von Primer 1 und 6 führte zu einem Fragment mit 560 bp. Die Primerkombination 1 und 2 führte zu einem PCR-Fragment von 2289 bp. Beide Fragmente wurden sequenziert. Die erhaltene Sequenz stellt den Großteil des 5'-Endes der cDNA dar. Die vollständige Sequenz des Teil-cDNA-Clons und der durch PCR erhaltenen Sequenzen, wie oben beschrieben, ist in SEQ ID NO:7 aufgeführt. Die abgeleitete Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO:8 aufgeführt.
Ein Vergleich mit der vollständigen cDNA aus Kartoffel zeigte, dass die erhaltene Sequenz wahrscheinlich noch nicht vollständig ist und dass etwa 420 by des 5'-Endes fehlen. Diese fehlende Sequenz kann anhand dem Fachmann bekannter Verfahren vervollständigt werden. So ist es zum Beispiel möglich, das 5'-Ende der cDNA mit Hilfe des 5'-RACE-Verfahrens (rapid amplification of cDNA ends, schnelle Amplifikation der cDNA-Enden) zu isolieren. Mit diesem Verfahren kann ein unbekanntes 5'-Ende einer cDNA durch PCR amplifiziert werden. Dieses Verfahren wird gewöhnlich verwendet, um cDNA herzustellen, die im Gegensatz zu einer bekannten cDNA am 5'-Ende erweitert ist. Zur Durchführung des RACE-Verfahrens kann z.B. der Marathon-cDNA-Amplifikationskit (Clontech) verwendet werden.
Andere Möglichkeiten, die vollständige cDNA zu isolieren, sind weitere PCRs, die zum Beispiel eine Lambda-ZAP-cDNA-Bibliothek von Mais (Stratagene) verwenden, Immundurchmusterung von Expressionsbibliotheken oder die Verwendung von Standardhybridierungsverfahren. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nucleinsäuremolekül, das ein Protein aus Mais codiert, welches in pflanzlichen Zellen sowohl an Stärkekörner gebunden vorliegt als auch in löslicher Form, und dessen Expression als Cosuppressor-RNA in pflanzlichen Zellen zu einer Reduktion des Phosphatgehalts der in den Pflanzenzellen synthetisierten Stärke führt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die wie in SEQ ID NO:6 oder in SEQ ID NO:8 angegebene Aminosäuresequenz umfasst; (b) Nucleinsäuremolekülen, die die codierende Region der unter SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:7 angegebenen Nucleotidsequenzen umfassen; (c) Nucleinsäuremolekülen, deren Sequenz zu mindestens 80% identisch ist mit der Sequenz eines unter (a) oder (b) angegeben Nucleinsäuremoleküls; und (d) Nucleinsäuremolekülen, deren Sequenz sich von der Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls von (c) gemäß der Degeneriertheit des genetischen Codes unterscheidet; sowie der entsprechende komplementäre Strang eines solchen Nucleinsäuremoleküls.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1(c), wobei die Sequenzidentität mindestens 90% beträgt.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1(c), wobei die Sequenzidentität mindestens 95% beträgt.
Vektor, enthaltend ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Vektor nach Anspruch 4, wobei das Nucleinsäuremolekül verknüpft ist mit regulatorischen Elementen, welche die Transkription in eukaryontischen und prokaryontischen Zellen gewährleisten.
Wirtszelle, umfassend ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das mit heterologen regulatorischen Elementen verknüpft ist, welche die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten, oder umfassend den Vektor nach Anspruch 4 oder 5.
Wirtszelle nach Anspruch 6, welche eine transgene Pflanzenzelle ist.
Pflanze, enthaltend die Pflanzenzelle nach Anspruch 7.
Verfahren zur Herstellung einer modifizierten Stärke, umfassend den Schritt der Extraktion der Stärke von Pflanzen nach Anspruch 8 und/oder von Stärkespeichernden Teilen solcher Pflanzen.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das durch ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert wird, wobei eine Wirtszelle nach Anspruch 6 kultiviert wird und diese das Protein exprimiert, und wobei das Protein aus den Zellen und/oder dem Kulturmedium isoliert wird.
Protein, das durch ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert wird, oder das erhältlich ist durch das Verfahren nach Anspruch 10.
Antikörper, der spezifisch das Protein nach Anspruch 11 erkennt.
DNA-Molekül, das eine Antisense-RNA codiert, welche einen Antisense-Effekt während der Transkription in pflanzlichen Zellen verursacht, und welche komplementär ist zu den Transkripten eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
DNA-Molekül nach Anspruch 13, wobei die codierte Antisense-RNA eine minimale Länge hat, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 15 Nucleotiden, 100 Nucleotiden und 500 Nucleotiden.
DNA-Molekül, das eine RNA mit Ribozymaktivität codiert, welche Transkripte eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 3 spezifisch schneidet.
DNA-Molekül, das eine RNA codiert, welche homolog ist zu einem Transkript eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 3, und welche bei Expression in einer pflanzlichen Zelle zu einer Reduktion der Expression eines Nucleinsäuremoleküls nach Anspruch 1 infolge eines Cosuppressions-Effektes führt.
Vektor, enthaltend ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 13 bis 16.
Vektor nach Anspruch 17, wobei das DNA-Molekül kombiniert ist mit regulatorischen DNA-Elementen, welche die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten.
Wirtszelle, enthaltend ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 13 bis 16, oder einen Vektor nach Anspruch 17 oder 18.
Transgene Pflanzenzelle, enthaltend ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 13 bis 16 in Kombination mit regulatorischen DNA-Elementen, welche die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 20, in welcher die Aktivität von mindestens einem weiteren Enzym, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Verzweigungsenzym und einer Stärkekorn-gebundenen Stärkesynthase des Isotyps I (GBSS I), im Vergleich zu nicht-transformierten Pflanzen reduziert ist.
Transgene Pflanze, enthaltend eine Pflanzenzelle nach Anspruch 20 oder 21.
RNA-Molekül, welches erhältlich ist durch Transkription eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 13 bis 16.
Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzenzellen, welche eine modifizierte Stärke synthetisieren, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge der Proteine nach Anspruch 11, welche in den Zellen in endogener Form synthetisiert werden, in den Zellen reduziert ist, und wobei die Reduktion hervorgerufen wird (i) durch einen Antisense-Effekt infolge der Expression eines DNA-Moleküls nach Anspruch 13 oder 14; oder (ii) durch einen Ribozym-Effekt infolge der Expression eines DNA-Moleküls nach Anspruch 15; oder (iii) durch einen Cosuppressions-Effekt infolge der Expression eines DNA-Moleküls nach Anspruch 16, wobei das Verfahren den Schritt des Einbringens eines DNA-Moleküls nach Anspruch 13, 14, 15 oder 16 in pflanzliche Zellen umfasst, wobei das DNA-Molekül mit DNA-Elementen verbunden ist, welche die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Enzymaktivität von mindestens einem weiteren Enzym, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Verzweigungsenzym und einer Stärkekorn-gebundenen Stärkesynthase des Isotyps I (GBSS I), reduziert ist.
Transgene Pflanzenzelle, umfassend: (a) ein DNA-Molekül, das eine Antisense-RNA codiert, welche einen Antisense-Effekt während der Transkription in pflanzlichen Zellen hervorruft, und welche komplementär ist zu den Transkripten eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 3; (b) ein DNA-Molekül, das eine RNA mit Ribozymaktivität codiert, welche Transkripte eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 3 spezifisch schneidet; oder (c) ein DNA-Molekül, das eine RNA codiert, welche homolog zu einem Transkript eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 3 ist, und welche bei Expression in einer pflanzlichen Zelle zu einer Reduktion der Expression eines Nucleinsäuremoleküls nach Anspruch 1 infolge eines Cosuppressions-Effekts führt, wobei das DNA-Molekül mit DNA-Elementen verbunden ist, welche die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten.
Transgene Pflanze, enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 26.
Verfahren zur Herstellung einer modifizierten Stärke, umfassend den Schritt der Extraktion der Stärke von der Pflanze nach Anspruch 22 oder 27 und/oder von einem Stärke-speichernden Teil einer solchen Pflanze.
Vermehrungsmaterial von Pflanzen nach Anspruch 8, enthaltend pflanzliche Zellen nach Anspruch 7.
Vermehrungsmaterial von Pflanzen nach Anspruch 22 oder 27, enthaltend Pflanzenzellen nach einem der Ansprüche 20 oder 21 oder nach Anspruch 26.
Transgene Pflanze nach Anspruch 22 oder 27, welche eine Maispflanze ist.
Samen einer Maispflanze nach Anspruch 31, welche Pflanzenzellen nach Anspruch 20 oder 26 enthält.