ES2280086T3 - Nuevas moleculas de acidos nucleicos procedentes de maiz y su uso para la produccion de un almidon modificado. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A UNAS MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICAN UNA PROTEINA FIJADA A LOS GRANULADOS DE ALMIDON Y PROCEDENTE DEL MAIZ, ASI COMO AL PROCEDIMIENTO Y A LAS MOLECULAS DE ADN RECOMBINANTES PARA LA OBTENCION DE CELULAS DE PLANTAS TRANSGENICAS Y PLANTAS QUE SINTETIZAN UN ALMIDON MODIFICADO. ADEMAS, SE DESCRIBEN LAS CELULAS DE PLANTAS Y LAS PLANTAS QUE RESULTAN DE DICHOS PROCEDIMIENTOS, ASI COMO EL ALMIDON QUE SE OBTIENE DE ELLAS.

Description

Nuevas moléculas de ácidos nucleicos procedentes de maíz y su uso para la producción de un almidón modificado.

El presente invento se refiere a moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una proteína procedente de maíz, unida a granos de almidón, así como a métodos y moléculas de ADN recombinantes para la producción de células de plantas transgénicas y de plantas que sintetizan un almidón modificado. El invento se refiere asimismo a las células de plantas transgénicas y a las plantas que resultan de estos métodos, y a un procedimiento para la producción de un almidón modificado, que comprende la operación de extraer el almidón a partir de dicha planta y/o a partir de una parte que almacena almidón de dicha planta.

El polisacárido almidón, que constituye una de las sustancias almacenadas más importantes en plantas, se usa no solamente en el sector de los alimentos, sino que desempeña un importante cometido como material renovable en la producción de productos industriales. Con el fin de hacer posible el uso de esta materia prima en el mayor número posible de sectores, es necesario obtener una gran diversidad de sustancias así como adaptar estas sustancias a las demandas variables de la industria elaboradora.

Aún cuando un almidón está constituido por un componente fundamental químicamente homogéneo, a saber la glucosa, no constituye ninguna materia prima homogénea. Es más bien una compleja mezcla de diferentes tipos de moléculas, que se diferencian unas de otras en lo que se refiere a su grado de polimerización y al grado de ramificación de las cadenas de glucosa. Se establece diferencia en particular entre un almidón de amilosa, que es un polímero fundamentalmente sin ramificar, constituido por moléculas de glucosa ramificadas con \alpha-1,4glicósidos, y un almidón de amilopectina, que a su vez es una mezcla de cadenas de glucosa más o menos fuertemente ramificadas. La ramificación resulta de la aparición de interenlaces \alpha-1,6-glicosídicos.

La estructura molecular de un almidón, que es determinada principalmente por su grado de ramificación, por la relación de amilosa a amilopectina, por la longitud media de las cadenas así como por la presencia de grupos de fosfatos, es decisiva para importantes propiedades funcionales del almidón o, respectivamente, de sus soluciones acuosas. Importantes propiedades funcionales son, por ejemplo, la solubilidad del almidón, su tendencia a la retrogradación, su capacidad de formación de películas, su viscosidad, sus propiedades de pastificación, es decir las propiedades de aglutinación y de encolado y fraguado, así como la resistencia al frío. También el tamaño de los granos de almidón puede ser importante para los diferentes usos. La producción de un almidón con un alto contenido de amilosa es particularmente importante. Además, un almidón modificado, contenido en células de plantas, puede alterar de una manera favorable, en determinadas condiciones, el comportamiento de la célula de planta. Por ejemplo, sería posible disminuir la degradación del almidón durante el almacenamiento de los órganos que contienen almidón, tales como semillas y tubérculos, antes de su elaboración ulterior, por ejemplo por extracción del almidón. Además, hay un cierto interés en producir almidones modificados, que pudieran conducir a que las células de plantas o los órganos de plantas, que contienen este almidón, sean más adecuados para la elaboración ulterior, por ejemplo en la producción de "popcorn" (maíz reventón de tostar) o "corn flakes" (copos de maíz) a partir de maíz, o de "french fries" (patatas fritas a la francesa), "crisps" (patatas onduladas) o polvo de patata, a partir de patatas. Hay un interés particular en este caso en mejorar a los almidones, de una manera tal que estos presenten una "cold sweetening" (dulcificación en frío) disminuida, es decir una liberación disminuida de azúcares reductores (especialmente de glucosa) durante un almacenamiento a largo plazo a bajas temperaturas.

Un almidón, que puede ser aislado a partir de plantas, es adaptado frecuentemente a determinadas finalidades industriales por medio de modificaciones químicas, que usualmente exigen una intensa dedicación de tiempo y son costosas. Por lo tanto, es deseable encontrar posibilidades de producir plantas que sinteticen un almidón, cuyas propiedades ya satisfagan los requisitos de la industria elaboradora.

Métodos convencionales para la producción de tales plantas son métodos clásicos de cultivación y la producción de mutantes. Así, por ejemplo, se producía un mutante a partir de un maíz que sintetiza un almidón con una viscosidad alterada (documento de patente de los EE.UU. US 5.331.108), y se estableció por medio de cultivación una variedad de maíz (waxy maize = maíz ceroso), cuyo almidón consiste casi en un 100% en amilopectina (Akasuka y Nelson, J. Biol. Chem. 241 (1966), 2280-2285). Además, se han descrito unos mutantes de maíz y guisantes, que sintetizan almidones con un alto contenido de amilosa (70% en el maíz o bien hasta 50% en los guisantes). Estos mutantes no han sido caracterizados hasta ahora en el nivel molecular y no permiten por consiguiente la producción de correspondientes mutantes en otras plantas que almacenan almidón.

Alternativamente, por medio de técnicas de ADN recombinantes se pueden producir plantas que sintetizan un almidón con propiedades alteradas. Se ha descrito, por ejemplo, en diversos casos la modificación recombinante de plantas de patata con la meta de alterar el almidón sintetizado en estas plantas (véanse p.ej. los documentos de solicitudes de patentes internacionales WO 92/11376; WO 92/14827). Sin embargo, con el fin de hacer uso de técnicas de ADN recombinantes, se requieren secuencias de ADN, cuyos productos génicos influyan sobre la síntesis del almidón, la modificación del almidón o la degradación del almidón.

Por lo tanto, el problema que subyace en el presente invento es el de proporcionar moléculas de ácidos nucleicos y métodos, que permitan la alteración de plantas de una manera tal que éstas sinteticen un almidón que se diferencie en lo que se refiere a sus propiedades físicas y/o químicas con respecto de un almidón sintetizado de una manera natural en las plantas y que sea por consiguiente más apropiado para usos generales y/o particulares.

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Este problema se resuelve mediante la puesta a disposición de las formas de realización descritas en las reivindicaciones.

El presente invento se refiere, por consiguiente, a moléculas de ácidos nucleicos que codifican una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en Seq ID No. 6 o en Seq ID No. 8. Tales proteínas se presentan en los plástidos de células de plantas, tanto unidas a granos de almidón como también en una forma libre, es decir soluble.

El presente invento se refiere además a moléculas de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia con la secuencia de nucleótidos indicada en Seq ID No. 5 o en Seq ID No. 7, particularmente la región codificadora indicada en Seq ID No. 5 o en Seq ID No. 7.

Son asimismo objeto del presente invento moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una proteína procedente de maíz, que se presenta parcialmente unida a granos en los plástidos de las células, y que se hibridan con las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, antes mencionadas, o con su cadena complementaria. El concepto de "hibridación" significa en este contexto una hibridación en condiciones convencionales de hibridación, preferiblemente en condiciones rigurosas, tal como se han descrito por ejemplo en la cita de Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning, A Laboratory Manual [Clonación molecular, un manual de laboratorio], 2ª edición (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Más preferiblemente, la hibridación se realiza en las siguientes condiciones:

Tampón de hibridación:

2 x SSC; 10 x solución de Denhard (Fikoll 400 + PEG + BSA relación 1:1:1); 0,1% de SDS; 5 mM de EDTA: 50 mM de Na_{2}HPO_{4}; 250 \mug/ml de ADN de esperma de arenque; 50 \mug/ml de ARNt; o

\quad

0,25 M de un tampón de fosfato de sodio de pH 7,2

\quad

1 mM de EDTA

\quad

7% de SDS

Temperatura de hibridación

T = 65 + 68ºC

Tampón de lavado:

0,2 x SSC; 0,1% de SDS

Temperatura de lavado:

T = de 40 a 68ºC.

Las moléculas de ácidos nucleicos, que se hibridan con las moléculas conformes al invento, se pueden aislar p.ej. a partir de bibliotecas genómicas o de ADNc (cromosomal) producidas a partir de las células o del tejido de maíz.

La identificación y el aislamiento de tales moléculas de ácidos nucleicos se puede efectuar usando las moléculas conformes al invento o partes de estas moléculas o, cuando se dé el caso, las cadenas complementarias inversas de estas moléculas, p.ej. mediante hibridación de acuerdo con métodos clásicos (véase p.ej. la cita de Sambrook y colaboradores 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Como una sonda para hibridación se pueden usar p.ej. moléculas de ácidos nucleicos que contienen exactamente, o en lo fundamental, la secuencia de nucleótidos indicada en Seq ID No. 5 o en Seq ID No. 7, o partes de la misma. Los fragmentos de ADN, usados como sonda de hibridación, pueden ser también fragmentos de ADN sintéticos, que se habían producido por medio de los métodos convencionales de sintetizar un ADN, y cuya secuencia es fundamentalmente idéntica con la de una molécula de ácido nucleico conforme al invento. Después de haber identificado y aislado unos genes que se hibridan con las secuencias de ácidos nucleicos conformes al invento, se ha de determinar la secuencia y se han de analizar las propiedades de las proteínas codificadas por esta secuencia.

Dichas moléculas de ácidos nucleicos que se hibridan, abarcan asimismo fragmentos, derivados y variantes alélicas de las moléculas de ácidos nucleicos que antes se han mencionado, las cuales codifican la proteína antes mencionada. En este contexto, los fragmentos se describen como partes de las moléculas de ácidos nucleicos, que son lo suficientemente largas como para codificar la proteína antes descrita. El concepto de "derivado" significa que las secuencias de estas moléculas se diferencian de las secuencias de las moléculas de ácidos nucleicos que antes se han mencionado, en una o más posiciones, y presentan un alto grado de homología con las secuencias de estas moléculas. Una "homología" significa una identidad entre secuencias de por lo menos un 80%, y de modo todavía más preferido una identidad entre secuencias de más que 90% y de modo particularmente preferido de más que 95%. Las desviaciones que aparecen cuando se compara con las moléculas de ácidos nucleicos antes descritas, pueden haberse causado por adición, deleción (supresión), sustitución, inserción (introducción) o recombinación.

El concepto de "homología" significa, además, que existe una equivalencia funcional y/o estructural entre las respectivas moléculas de ácidos nucleicos o las proteínas que éstas codifican. Las moléculas de ácidos nucleicos, que son homólogas con respecto a las moléculas de ácidos nucleicos antes descritas y que constituyen derivados de estas moléculas, son por lo general variaciones de estas moléculas de ácidos nucleicos, que constituyen unas modificaciones que ejercen la misma función biológica. Estas variaciones pueden ser variaciones que aparecen de un modo natural o mutaciones, pudiendo haber aparecido estas mutaciones de un modo natural o pudiendo haber sido introducidas de una manera deliberada. Además, las variaciones pueden ser secuencias producidas de una manera sintética.

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Las variantes alélicas pueden ser tanto variantes que aparecen de un modo natural como también variantes producidas sintéticamente, o variantes producidas por técnicas de ADN recombinantes.

Las proteínas codificadas por las diferentes variantes de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, exhiben determinadas características en común. A estas características pueden pertenecer la actividad enzimática, el peso molecular, la reactividad inmunológica, la conformación, etc., así como propiedades físicas tales como p.ej. la movilidad en una electroforesis en gel, las características cromatográficas, los coeficientes de sedimentación, la solubilidad, las propiedades espectroscópicas, la estabilidad, el valor óptimo del pH, el valor óptimo de la temperatura, etc.

Además, el presente invento se refiere a moléculas de ácidos nucleicos, cuyas secuencias, comparadas con las secuencias de las moléculas antes mencionadas, están degeneradas debido al código genético, y que codifican una proteína que está presente en los plástidos de células de plantas, parcialmente en una forma unida a los granos y parcialmente en una forma libre, es decir en una forma soluble.

Las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento se pueden aislar, por ejemplo, a partir de fuentes naturales, se pueden producir por métodos de ingeniería genética, por ejemplo por una PCR (reacción en cadena de la polimerasa), o se pueden producir mediante procedimientos de síntesis que son conocidos para un experto en la especialidad.

Las moléculas de ácidos nucleicos conforme al invento pueden ser moléculas de ADN, tales como un ADNc o un ADN genómico, así como moléculas de ARN.

Además, el invento se refiere a vectores, especialmente plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores corrientes en la ingeniería genética, que contienen las moléculas de ácidos nucleicos conforme al invento, que antes se han mencionado.

En una forma preferida de realización, las moléculas de ácidos nucleicos, contenidas en los vectores, están unidas a elementos reguladores, que garantizan la transcripción y la síntesis de un ARN traducible en el seno de células procarióticas o eucarióticas.

En una forma adicional de realización, el invento se refiere a células anfitrionas, en particular a células procarióticas o eucarióticas, que han sido transformadas y/o manipuladas de manera recombinante por una molécula de ácido nucleico conforme al invento como antes se ha descrito, o por un vector conforme al invento, así como a células que se derivan de tales células y que contienen una molécula de ácido nucleico conforme al invento o un vector conforme al invento. Éstas son preferiblemente una célula de bacteria o una célula de planta.

Se ha encontrado ahora que la proteína codificada por las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento influye sobre la síntesis o la modificación de un almidón, y que unos cambios en la cantidad de la proteína en células de plantas conducen a cambios en el metabolismo del almidón de las plantas, en particular a la síntesis de un almidón con propiedades físicas y químicas modificadas.

Mediante la puesta a disposición de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento es posible, por medio de técnicas de ADN recombinantes, producir plantas que sinteticen un almidón modificado, que se diferencie en cuanto a su estructura y sus propiedades físicas y químicas con respecto de un almidón sintetizado en plantas de tipo salvaje. Para esta finalidad, las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento son unidas con elementos reguladores, que garantizan la transcripción y la traducción en células de plantas, y éstos se introducen en las células de plantas.

El presente invento se refiere, por consiguiente, también a células de plantas transgénicas, que contienen una molécula de ácido nucleico conforme al invento, estando unida ésta con elementos reguladores, que garantizan la transcripción en células de plantas. Los elementos reguladores son preferiblemente heterólogos con respecto a la molécula de ácido nucleico.

Dichas células de plantas conformes al invento se diferencian de las plantas que se presentan de un modo natural, entre otras cosas, en el hecho de que por lo menos una copia de la molécula de ácido nucleico conforme al invento está integrada en su genoma, posiblemente además de las copias que se presentan de un modo natural. Además, ésta/éstas copia/copias adicional(es) es/son Integrada(s) junto a un sitio en el genoma en el que no se presenta(n) de un modo natural. Esto puede ser probado, por ejemplo, por medio de un análisis de transferencia de borrón (blot) Southern. Además, dichas células de plantas transgénicas se pueden distinguir preferiblemente, con respecto de las correspondientes células de plantas que se presentan de un modo natural, por al menos una de las siguientes características: Si la molécula de ácido nucleico conforme al invento, que había sido introducida en las células de plantas, es heteróloga con respecto a las células de plantas, las células transgénicas se pueden distinguir con respecto a las células no transformadas debido a la presencia de transcritos procedentes de la molécula introducida conforme al invento. Dichos transcritos pueden ser detectados, p.ej. por un análisis de transferencia de borrón Northern. Preferiblemente, las células transgénicas contienen además la proteína codificada por la molécula de ácido nucleico conforme al invento. La presencia de la proteína puede ser detectada, p.ej., por métodos inmunológicos tales como un análisis de transferencia de borrón Western.

Si la molécula de ácido nucleico conforme al invento, que había sido introducida en las células, es homóloga con respecto a estas células, las células transgénicas se pueden distinguir con respecto a las células no transformadas, por ejemplo, debido a la expresión adicional de la molécula de ácido nucleico conforme al invento. En particular, las células transgénicas contienen preferiblemente más transcritos de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento. Esto se puede detectar, p.ej., mediante un análisis de transferencia de borrón Northern. El término "más" significa preferiblemente por lo menos 10% más, con mayor preferencia por lo menos 20% más, e incluso con mayor preferencia por lo menos 50% más. Correspondientemente, las células transgénicas contienen preferiblemente más cantidad de la proteína conforme al invento en comparación con células no transformadas. Esto se puede detectar, p.ej., mediante un análisis de transferencia de borrón Western. Preferiblemente, las células contienen por lo menos 10% más de la proteína conforme al invento, con mayor preferencia por lo menos 20% más, e incluso con mayor preferencia por lo menos 50% más.

Por medio de los métodos conocidos para un experto en la especialidad, las células de plantas transgénicas se pueden regenerar para dar plantas enteras. Las plantas obtenibles por regeneración de las células de plantas transgénicas conformes al invento son asimismo el objeto del presente invento.

Un objeto adicional del invento son plantas que contienen las células de plantas transgénicas antes descritas. Las plantas transgénicas pueden ser en principio plantas de cualquier especie deseada de plantas, es decir pueden ser plantas tanto monocotiledóneas como también dicotiledóneas. Éstas son preferiblemente plantas útiles, en particular plantas que sintetizan almidón o que almacenan almidón, tales como cereales (centeno, cebada, avena, trigo, mijo, sagú, etc.), arroz, maíz, guisantes, guisantes arrugados, mandioca, patata, tomate, colza oleaginosa, soja, cáñamo, lino, girasol, garbanzos vigna y arrurruz.

El presente invento se refiere también a un procedimiento para la producción de un almidón modificado, que comprende la operación de extraer el almidón desde las plantas antes descritas conformes al invento y/o desde las partes que almacenan almidón de dichas plantas. Preferiblemente, dicho procedimiento comprende además las operaciones de cultivar plantas de acuerdo con el invento y de cosechar las plantas cultivadas y/o las partes que almacenan almidón de dichas plantas, antes de la extracción del almidón.

Métodos para extraer almidón desde plantas o desde partes que almacenan almidón de dichas plantas son bien conocidos para un experto en la especialidad. Se describen métodos para extraer almidón desde semillas de maíz, por ejemplo, en la cita de Eckhoff y colaboradores (Cereal Chem. 73 (1996), 54-57). La extracción de almidón de maíz a una escala industrial se consigue normalmente por "molienda en húmedo". Además, se describen métodos para la extracción de almidón desde plantas que almacenan almidón, por ejemplo, en la obra Starch: Chemistry and Technology [Almidón: Química y Tecnología] (coordinadores de edición: Whistler, BeMiller y Paschall (1994) 2ª edición, Academic Press Inc. London LTD; ISBN 0-12-746270-8; véanse p.ej. el Capítulo XIII, páginas 417-468: Almidones de maíz y sorgo: Producción; por Watson, S.A.; el Capítulo XIII, páginas 469-479: Almidones de tapioca, arruruz y sagú: Producción; por Corbishley y Miller; el Capítulo XIV, páginas 479-490: Almidón de patata: Producción y usos; por Mitch; el Capítulo XV, páginas 491-506: Almidón de trigo: Producción, modificación y usos; por Knight y Olson; y el Capítulo XVI, páginas 507-528: Almidón de arroz: producción y usos; por Rohwer y Klem). Los medios usualmente usados en métodos para la extracción de almidones a partir de materiales vegetales (de plantas) son separadores, decantadores, hidrociclones y diferentes clases de máquinas para secar el almidón, p.ej., un secador por atomización o un secador por chorros.

El presente invento se refiere también a un procedimiento para la producción de un almidón modificado, que comprende la operación de extraer el almidón a partir de la planta del invento y/o a partir de una parte que almacena almidón de dicha planta. Debido a la expresión, o a la expresión adicional, de una molécula de ácido nucleico conforme al invento, las células de plantas transgénicas y las plantas conformes al invento sintetizan un almidón que está modificado en comparación con un almidón procedente de plantas de tipo salvaje, es decir de plantas no trans-
formadas.

En particular, dicho almidón tiene preferiblemente un mayor contenido de fosfato que un almidón sintetizado por correspondientes células o plantas no transformadas. Un mayor contenido de fosfato significa que el almidón contiene por lo menos 10% más fosfato, más preferiblemente por lo menos 30%, incluso más preferiblemente por lo menos 50%, y de manera particularmente preferida por lo menos 100% más fosfato, que un almidón procedente de correspondientes células o plantas no transformadas. Los almidones con un alto contenido de fosfato son, por ejemplo de interés particular para la industria papelera, p.ej. para la preparación de la superficie de un papel. Normalmente, la industria papelera usa un almidón modificado químicamente, por ejemplo, un almidón hidroxietilado o fosforilado, para el encolado o revestimiento de las superficies. La producción de un almidón altamente fosforilado en plantas evitaría, por lo tanto, la necesidad de modificar químicamente un almidón con el fin de adaptarlo a los requisitos de la industria papelera.

Un objeto adicional del presente invento es un método para la producción de una proteína que está presente en células de plantas en una forma unida a granos así como también en una forma soluble, en el que las células anfitrionas conformes al invento se cultivan en unas condiciones que permiten la expresión de la proteína, y en el que la proteína se aísla luego a partir de las células y/o del medio de cultivo.

Además, el invento se refiere a las proteínas codificadas por las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, así como a las proteínas que son obtenibles mediante el método antes descrito. Éstas son preferiblemente proteínas procedentes de maíz, codificadas por genes nucleares y que están localizadas en los plástidos. En los plástidos, estas enzimas se presentan en una forma unida a los granos así como también en forma libre.

Un objeto adicional del invento son anticuerpos, que reconocen específicamente a una proteína conforme al invento. Éstos pueden ser monoclonales así como también policlonales. Métodos para la producción de tales anticuerpos son conocidos para un experto en la especialidad.

Se encontró, además, que es posible influir sobre las propiedades del almidón sintetizado en células de plantas mediante reducción de la cantidad de proteínas, que son codificadas por las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, en las células. Esta reducción puede efectuarse, por ejemplo, mediante una expresión antisentido de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, una expresión de apropiadas ribozimas o una cosupresión.

Son también objeto del presente invento, por consiguiente, moléculas de ADN, que codifican un ARN antisentido, que es complementario con relación a transcritos de una molécula de ADN conforme al invento, así como también estas moléculas antisentido. Por lo tanto, el concepto de "complementario" no significa, en este caso, que el ARN codificado debe ser complementario en un 100%. Es suficiente un bajo grado de complementariedad, siempre y cuando que éste sea lo suficientemente alto como para inhibir la expresión de una proteína conforme al invento, después de una expresión en células de plantas. El ARN transcrito es complementario preferiblemente por lo menos en un 90% y de modo sumamente preferido por lo menos en un 95% con respecto al transcrito de la molécula de ácido nucleico conforme al invento. Con el fin de causar un efecto antisentido durante la transcripción en células de plantas, tales moléculas de ADN tienen una longitud de por lo menos 15 pb (pares de bases), preferiblemente una longitud de más que 100 pb y de manera sumamente preferida una longitud de más que 500 pb, pero usualmente de menos que 5.000 pb, preferiblemente más cortas que 2.500 pb.

El invento se refiere además a moléculas de ADN que, durante una expresión en células de plantas, conducen a la síntesis de un ARN que en las células de plantas, debido a un efecto de cosupresión, reduce la expresión de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, que codifican la proteína descrita. El invento se refiere también a las moléculas de ARN codificadas de esta manera. El principio de la cosupresión, así como la producción de correspondientes secuencias de ADN, se describen con precisión, por ejemplo, en el documento WO 90/12084. Tales moléculas de ADN codifican preferiblemente un ARN, que tiene un alto grado de homología con transcritos de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento. No obstante, no es indispensablemente necesario que el ARN codificado sea traducible para dar una proteína.

En una forma de realización adicional, el presente invento se refiere a moléculas de ADN que codifican una molécula de ARN con una actividad de ribozima, que disocia específicamente a transcritos de una molécula de ADN conforme al invento, así como también a estas moléculas codificadas de ARN.

Las ribozimas son moléculas de ARN activas catalíticamente, que son capaces de disociar a moléculas de ARN y a secuencias dianas específicas. Por medio de técnicas de ADN recombinantes, es posible alterar la especificidad de ribozimas. Existen diferentes clases de ribozimas. Para aplicaciones prácticas, que tienen la meta de la disociación específica del transcrito de un gen determinado, se usan preferiblemente representantes de dos diferentes grupos de ribozimas. El primer grupo está constituido por ribozimas, que pertenecen al tipo de las ribozimas con intrones del grupo I. El segundo grupo consiste en ribozimas, que como una particularidad estructural característica exhiben el denominado motivo de "hammerhead" [= cabeza de martillo]. El reconocimiento específico de la molécula de ARN diana se puede modificar por alteración de las secuencias que flanquean a este motivo. Por medio de un apareamiento de bases con secuencias en la molécula diana, estas secuencias determinan la posición junto a la que se efectúa la reacción catalítica y por consiguiente la disociación de la molécula diana. Puesto que son bajos los requisitos de las secuencias para una disociación eficiente, en principio es posible desarrollar ribozimas específicas para prácticamente cualquier molécula deseada de ARN.

Con el fin de producir moléculas de ADN, que codifican una ribozima que disocia específicamente a transcritos de una molécula de ADN conforme al invento, por ejemplo una secuencia de ADN, que codifica un dominio catalítico de una ribozima, es unida bilateralmente con secuencias de ADN, que son homólogas con respecto a secuencias de la enzima diana. Las secuencias que codifican el dominio catalítico pueden ser por ejemplo los dominios catalíticos del ADN satélite del virus SCMo (Davies y colaboradores, Virology 177 (1990), 216-224) o del ADN satélite del virus TobR (Steinecke y colaboradores, EMBO J. 11 (1992), 1525-1530; Haseloff y Gerlach, Nature 334 (1988), 585-591). Las secuencias de ADN que flanquean al dominio catalítico se derivan preferentemente de las moléculas de ADN conformes al invento, arriba descritas.

En una forma de realización adicional, el presente invento se refiere a vectores que contienen las moléculas de ADN arriba descritas, en particular aquellas en las que las moléculas de ADN descritas están unidas con elementos reguladores, que garantizan la transcripción en células de plantas.

Además, el presente invento se refiere a células anfitrionas, que contienen las moléculas de ADN o los vectores, que se han descrito. La célula anfitriona puede ser una célula procariótica, tal como una célula bacteriana, o una célula eucariótica. Las células anfitrionas eucarióticas son preferiblemente células de plantas.

Además, el invento se refiere a células de plantas transgénicas, que contienen una molécula de ADN arriba descrita, que codifica un ARN antisentido, una ribozima, o un ARN que conduce a un efecto de cosupresión, con lo que la molécula de ADN es unida con elementos de ADN que garantizan la transcripción en células de plantas. Estas células de plantas transgénicas se pueden regenerar, de acuerdo con técnicas bien conocidas, para dar plantas enteras. El invento se refiere, por consiguiente, también a plantas, que se pueden obtener por medio de regeneración a partir de las células de plantas transgénicas que se han descrito, así como a plantas que contienen las células de plantas transgénicas que se han descrito. Las plantas transgénicas propiamente dichas pueden ser plantas de cualquier especie deseada de plantas, preferiblemente plantas útiles, en particular las que almacenan almidón, tal como arriba se ha indicado, y de modo sumamente preferible células de plantas de maíz.

Además, el invento se refiere a las moléculas de ARN antisentido, que son codificadas por las moléculas de ADN descritas, así como a las moléculas de ARN con una actividad de ribozimas y a las moléculas de ARN que conducen a un efecto de cosupresión, que son obtenibles, por ejemplo, por medio de una transcripción.

Un objeto adicional del invento es un método para la producción de células de plantas transgénicas que, en comparación con células no transformadas, sintetizan un almidón modificado. En este método, la cantidad de las proteínas codificadas por las moléculas de ADN conformes al invento, que se presentan en una forma endógena en las células, es reducida e las células de plantas.

En una forma preferida de realización, esta reducción se efectúa por medio de un efecto antisentido. Para esta finalidad, las moléculas de ADN conformes al invento, o partes de las mismas, son unidas en una orientación antisentido con un promotor, que garantiza la transcripción en células de plantas, y posiblemente con una señal de terminación, que garantiza la terminación de la transcripción así como la poliadenilación del transcrito. Con el fin de garantizar un eficiente efecto antisentido en las células de plantas, el ARN antisentido sintetizado debería presentar una longitud mínima de 15 nucleótidos, de modo preferido de por lo menos 100 nucleótidos y de modo sumamente preferido de por lo menos 500 nucleótidos. Además, la secuencia de ADN, que codifica el ARN antisentido, debería ser homóloga con respecto a la especie de planta que se ha de transformar. Sin embargo, se pueden usar también secuencias de ADN que presentan un alto grado de homología con las secuencias de ADN que están presentes en forma endógena en las células, de modo preferido con una homología de más que 90% y de modo sumamente preferido de más que 95%.

En otra forma de realización, la reducción de la cantidad de proteínas, que son codificadas por las moléculas de ADN conformes al invento, se efectúa mediante un efecto de ribozima. El efecto fundamental de las ribozimas, así como la construcción de moléculas de ADN, que codifican tales moléculas de ARN, ya se han descrito más arriba. Con el fin de expresar en células transgénicas un ARN con actividad de ribozima, las moléculas de ADN arriba descritas, que codifican una ribozima, son unidas con elementos de ADN que garantizan la transcripción en células de plantas, en particular con un promotor y una señal de terminación. Las ribozimas sintetizadas en las células de plantas conducen a la disociación de transcritos de moléculas de ADN conformes al invento, que se presentan en una forma endógena en las células de plantas.

Una posibilidad adicional de reducir la cantidad de proteínas, que son codificadas por las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, es la cosupresión. Por lo tanto, las células de plantas obtenibles mediante el método conforme al invento son un objeto adicional. Estas células de plantas están caracterizadas por el hecho de que se ha reducido su cantidad de proteínas que son codificadas por las moléculas de ADN conformes al invento, y de que, en comparación con células de tipo salvaje, éstas sintetizan un almidón modificado.

Preferiblemente, las células transgénicas muestran una reducción en la cantidad de transcritos, que codifican una proteína conforme al presente invento, de por lo menos 30%, más preferiblemente de por lo menos 50%, incluso más preferiblemente de por lo menos 70% y de modo sumamente preferible de por lo menos 90% en comparación con correspondientes células no transformadas. La cantidad de transcritos se puede determinar, por ejemplo, mediante un análisis de transferencia de borrón Northern. Además, las células muestran preferiblemente una correspondiente reducción de la cantidad de la proteína conforme al invento. Ésta se puede determinar, por ejemplo, por métodos inmunológicos, tales como un análisis de transferencia de borrón Western.

En una forma particularmente preferida del presente invento, se reduce en las células de plantas transformadas no solamente la síntesis de una proteína conforme al invento, sino además también la síntesis de por lo menos una enzima adicional implicada en la síntesis y/o modificación de un almidón. En este contexto, por ejemplo, se prefieren sintasas de almidón o enzimas de ramificación, unidas a granos de almidón.

Además, el invento se refiere a plantas obtenibles por regeneración de las células de plantas descritas, así como a plantas que contienen las células descritas conformes al invento.

El presente invento se refiere asimismo a un procedimiento para la producción de un almidón modificado, que comprende la operación de extraer el almidón a partir de las plantas conformes al invento, antes descritas, y/o a partir de partes que almacenan almidón de dichas plantas. Preferiblemente, dicho procedimiento comprende además las operaciones de cultivar plantas de acuerdo con el invento; y de cosechar las plantas cultivadas y/o las partes que almacenan almidón de dichas plantas, antes de la extracción del almidón.

El presente invento se refiere también al almidón obtenible a partir de las células de plantas transgénicas y de las plantas, u obtenible por el procedimiento antes descrito. Debido a la expresión de las moléculas de ADN descritas, que codifican un ARN antisentido, una ribozima y un ARN de cosupresión, en las células de plantas transgénicas se reduce la cantidad de proteínas codificadas por las moléculas de ADN conformes al invento, que están presentes en las células en una forma endógena. Sorprendentemente, esta reducción conduce a un drástico cambio de las propiedades físicas y químicas del almidón sintetizado en las células de plantas. Cuando se compara con un almidón procedente de células o plantas no transformadas, el almidón modificado presenta preferiblemente propiedades alteradas de pastificación, es decir, una viscosidad alterada de las soluciones acuosas del almidón, y/o un contenido alterado, en particular reducido de fosfatos.

La expresión de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento puede tener lugar en principio en cualquier clase de especies de plantas. Se prefieren plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, en particular plantas útiles, y preferiblemente plantas que almacenan almidón, tales como cereales (centeno, cebada, avena, trigo, mijo, sagú, etc.), arroz, maíz, guisantes, guisantes arrugados, mandioca, patata, tomate, colza oleaginosa, soja, cáñamo, lino, girasol, garbanzos vigna y arrurruz.

Dentro del marco del presente invento, la expresión "elementos reguladores, que garantizan la transcripción en células de plantas" son regiones de ADN que permiten la iniciación o la terminación de la transcripción en células de plantas. Las regiones de ADN, que garantizan la iniciación de la transcripción, son en particular promotores.

Para la expresión en plantas de las diferentes moléculas de ADN conformes al invento, arriba descritas, se puede usar cualquier promotor que funcione en células de plantas. El promotor puede ser homólogo o heterólogo con respecto a la especie usada de plantas. Se puede hacer uso, por ejemplo, del promotor 35S del virus del mosaico de coliflor (cauliflower mosaic) (Odell y colaboradores, Nature 313 (1985), 810-812), que garantiza una expresión constitutiva en todos los tejidos de una planta y también de la construcción artificial de promotor que se describe en el documento WO/9401571. Sin embargo, se puede también hacer uso de promotores, que conducen a una expresión de subsiguientes secuencias solamente en un momento determinado por factores exógenos (tal como en el documento WO/9307279) o en un tejido particular de la planta (véase p.ej. la cita de Stockhaus y colaboradores, EMBO J. 8 (1989), 2245-2251). Preferentemente, se usan unos promotores que son activos en las partes que almacenan almidón de la planta que se ha de transformar. En el caso del maíz, estas partes son las semillas de maíz, mientras que, en el caso de las patatas, éstas son los tubérculos. Con el fin de transformar las patatas, se puede usar en particular, pero no exclusivamente, el promotor B33 específico para tubérculos (Rocha-Sosa y colaboradores, EMBO J. 8 (1989), 23-29).

Aparte de los promotores, las regiones de ADN que inician la transcripción pueden contener también secuencias de ADN que garantizan un aumento adicional de la transcripción, tal como los denominados elementos intensificadores (en inglés, enhancer). Además, el concepto de "elementos de ADN reguladores" puede comprender también señales de terminación, que sirven para terminar de una manera correcta la transcripción y para añadir una cola poli-A al transcrito, lo cual se cree que estabiliza a los transcritos. Tales elementos están descritos en la bibliografía y se pueden intercambiar según los deseos. Ejemplos de tales secuencias de terminación son las regiones no traducibles en 3', que comprenden la señal de poliadenilación del gen de nopalina sintasa (gen de NOS) o el gen de octopina sintasa (Gielen y colaboradores, EMBO J. 8 (1989), 23-29) procedentes de Agrobacterias, o las regiones no traducibles en 3' de los genes de las proteínas almacenadoras procedentes de soja, así como la de los genes de la pequeña subunidad de la ribulosa-1,5-bisfosfato-carboxilasa (ssRUBISCO).

La introducción de las moléculas de ADN conformes al invento en células de plantas se efectúa preferiblemente usando plásmidos. Se prefieren unos plásmidos, que garantizan una integración estable del ADN en el genoma de la planta.

Con el fin de preparar la introducción de genes ajenos en plantas superiores, están a disposición un gran número de vectores de clonación, que contienen una señal de replicación para E. coli y un gen marcador para la selección de células bacterianas transformadas. Ejemplos de tales vectores son pBR322, series de pUC, series de M13mp, pACY184, etc. La secuencia deseada se puede integrar en el vector en un sitio adecuado de restricción. El plásmido obtenido se usa para la transformación de células de E. coli. Las células transformadas de E. coli son cultivadas en un medio apropiado y a continuación son cosechadas y lisadas. El plásmido es recuperado por medio de métodos clásicos. Como un método de análisis para la caracterización del ADN de plásmido obtenido, se hace uso por lo general de análisis por restricción y de análisis de secuencias. Después de cada manipulación, el ADN de plásmido puede ser disociado y los fragmentos de ADN obtenidos se pueden unir con otras secuencias de ADN.

Con el fin de introducir un ADN en células anfitrionas de plantas, están a disposición una amplia gama de técnicas. Estas técnicas comprenden la transformación de células de plantas con un ADN T, usando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como medio para transformación, la fusión de protoplastos, la inyección y la electroporación de un ADN, la introducción de un ADN mediante el método biolístico, así como otras posibilidades.

En el caso de una inyección y una electroporación de un ADN en células de plantas, no se plantea en sí ningún requisito especial a los plásmidos usados. Se pueden usar plásmidos simples, tales como p.ej. derivados de pUC. Sin embargo, en el caso de que se hayan de regenerar plantas enteras a partir de células transformadas de esta manera, debería estar presente un gen marcador seleccionable.

Dependiendo del método de introducción de genes deseados en la célula de una planta, pueden ser necesarias otras secuencias de ADN adicionales. Si, p.ej., para la transformación de la célula de una planta se usa el plásmido Ti o Ri, entonces por lo menos el límite derecho, pero con frecuencia los límites derecho e izquierdo de los plásmidos Ti y Ri de ADN T, se debe(n) conectar como una región flanqueadora con el gen ajeno que se ha de introducir.

Si para la transformación se usan Agrobacterias, el ADN que se ha de introducir se debe clonar dentro de plásmidos especiales, y concretamente o bien dentro de un vector intermedio o dentro de un vector binario. Debido a secuencias que son homólogas con respecto a las secuencias existentes dentro del ADN T, los vectores intermedios se pueden integrar dentro del plásmido Ti o Ri de las Agrobacterias, debido a una recombinación homóloga. Éste contiene además la región vir necesaria para la transferencia del ADN T. Los vectores intermedios no se pueden replicar en Agrobacterias. Mediante un plásmido cooperante, el vector intermedio se puede transferir a Agrobacterium tumefaciens (por conjugación). Los vectores binarios se pueden replicar tanto en E. coli como también en Agrobacterias. Ellos contienen un gen marcador seleccionable así como un engarzador (linker) o poliengarzador (polylinker), que está enmarcado por las regiones límites derecha e izquierda del ADN T. Ellos pueden ser transformados directamente dentro de las Agrobacterias (Holsters y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 163 (1987), 181-187). Los plásmidos usados para la transformación de las Agrobacterias comprenden además un gen marcador seleccionable, tal como el gen NPT II, que permite seleccionar bacterias transformadas. La Agrobacteria, que actúa como célula anfitriona, deberá contener un plásmido que sea portador de una región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del ADN T a la célula de la planta. Puede estar presente un ADN T adicional. La Agrobacteria transformada de tal manera se usa para la transformación de células de plantas.

El uso de un ADN T para la transformación de células de plantas ha sido intensamente investigado y suficientemente descrito en el documento de patente europea EP 120.516; y en las citas de: Hoekema, en: The Binary Plant Vector System [El sistema de vector binario de plantas] Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Capítulo V; Fraleyy colaboradores, Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46 y An y colaboradores, EMBO J. 4 (1985), 277-287. Ciertos vectores binarios pueden obtenerse ya a escala comercial, p.ej. el pBIN19 (de Clontech Laboratories, Inc., EE.UU.).

Para transferir el ADN a las células de plantas, se pueden cultivar conjuntamente de una manera apropiada explantes de plantas con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes. A partir del material infectado de plantas (p.ej. trozos de hojas, segmentos de tallos, raíces, pero también protoplastos o células de plantas cultivadas en suspensión) entonces se pueden regenerar plantas enteras en un medio apropiado, que puede contener antibióticos o biocidas para la selección de células transformadas. Las plantas obtenidas de tal manera se pueden examinar entonces para determinar si está presente o no el ADN introducido. Otras posibilidades con el fin de introducir un ADN ajeno. por uso del método biolístico o por transformación de protoplastos, son conocidos para un experto en la especialidad (compárese p.ej. la cita de Willmitzer, L., 1993 Transgenic Plants (plantas transgénicas). En: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise [Un tratado comprensivo de volúmenes múltiples] (H.J. Rehm, G. Reed, A. Fühler, P. Stadler, coordinadores de edición), volumen 2, 627-659, VCH Weinheim - Nueva York - Basilea - Cambridge).

Mientras que la transformación de plantas dicotiledóneas por sistemas de vector-plásmido Ti mediante Agrobacterium tumefaciens es un método bien consagrado, unos estudios más recientes indican que la transformación con vectores basados en Agrobacterium se puede usar también en el caso de plantas monocotiledóneas (Chan y colaboradores, Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiel y colaboradores, Plant J. 6 (1994), 271-282).

Sistemas alternativos para la transformación de plantas monocotiledóneas son la trasformación por medio del enfoque biolístico, la transformación de protoplastos, la electroporación de células parcialmente permeabilizadas, y la introducción de ADN por medio de fibras de vidrio.

Hay diversas referencias en la bibliografía relevante, que tratan específicamente acerca de la transformación de maíz (compárense p.ej. los documentos WO 95/06128, EP 0.513.849; EP 0.465.875). En el documento EP 292.435 se describe un método por medio del cual se pueden obtener plantas fértiles partiendo de callos de maíz granuloso friable, exento de mucosidades. En este contexto se observó adicionalmente por parte de Shillito y colaboradores (Bio/Technology 7 (1989), 581) que para regenerar plantas fértiles es necesario partir de cultivos en suspensión de callos, a partir de los cuales se puede producir un cultivo de protoplastos en división, que es capaz de regenerarse para dar plantas. Después de un período de cultivación in vitro de 7 a 8 meses, Shillito y colaboradores obtuvieron plantas con descendientes viables que, sin embargo, exhibían anormalidades en cuanto a la morfología y a la reproducibilidad.

Prioli y Söndahl (Bio/Technology 7 (1989), 589) han descrito cómo regenerar y obtener plantas fértiles a partir de protoplastos de maíz de la especie de cría de maíz Cateto Cat 100-1. Los autores suponen que la regeneración de protoplastos para dar plantas fértiles depende de un cierto número de diversos factores, tales como el genotipo, el estado fisiológico de la célula donante y las condiciones de cultivación. Una vez que el ADN introducido ha sido integrado en el genoma de la célula de una planta, continúa siendo estable allí y permanece también dentro de los descendientes de la célula transformada originalmente. Éste contiene normalmente un marcador seleccionable, que confiere a las células de plantas transformadas una resistencia frente a biocidas o frente a un antibiótico tal como kanamicina, G 418, bleomicina, higromicina o fosfinotricina, etc.. El marcador seleccionado individualmente debería permitir, por lo tanto, una selección de células transformadas frente a células a las que les falta el ADN introducido.

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Las células transformadas crecen dentro de la planta del modo usual (véase también la cita de McCormick y colaboradores, Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). Las plantas resultantes se pueden cultivar del modo usual y cruzar con plantas que posean la misma herencia genética transformada u otra herencia genética. Los individuos híbridos resultantes tienen las correspondientes propiedades fenotípicas.

Se deberían hacer crecer dos o más generaciones con el fin de asegurarse de si la característica fenotípica se conserva de una manera estable y de si se ha transferido. También, se deberían cosechar semillas con el fin de garantizar que permanezcan el correspondiente fenotipo u otras propiedades.

Debido a sus propiedades, el almidón obtenido a partir de las células de plantas o a partir de las plantas conformes al invento, u obtenible por los procedimientos del invento, no sólo es apropiado para las finalidades específicas ya mencionadas aquí, sino también para diferentes usos industriales.

Fundamentalmente, un almidón se puede subdividir en dos grandes categorías. Una categoría comprende los productos de hidrólisis del almidón y los denominados almidones naturales. Los productos de hidrólisis comprenden esencialmente glucosa y componentes de glucanos, que se han obtenido por procedimientos enzimáticos o químicos. Ellos se pueden emplear para otros procesos adicionales, tales como fermentación y modificaciones químicas. En este contexto, puede ser importante el hecho de que el procedimiento de hidrólisis se puede llevar a cabo de una manera sencilla y barata. Actualmente, se lleva a cabo sustancialmente por vía enzimática, usando una amilo- glucosidasa. Se puede concebir que los costos se pueden reducir usando menores cantidades de enzimas para la hidrólisis debido a cambios en la estructura del almidón, p.ej. aumentando la superficie del grano, mediante una digestibilidad mejorada debido
a un menor grado de ramificación o a una estructura estérea, que limita la accesibilidad para las enzimas empleadas.

El uso del denominado almidón natural, que se emplea a causa de su estructura polimérica, se puede subdividir en dos grandes sectores:

(a) Uso en alimentos

El almidón es un aditivo clásico para diversos alimentos, en los que sirve esencialmente para la finalidad de fijar aditivos acuosos y/o provoca una viscosidad aumentada o una aumentada formación de geles. Importantes propiedades características son el comportamiento de fluidez y de sorción, la temperatura de hinchamiento y pastificación, la viscosidad y el rendimiento de espesamiento, la solubilidad del almidón, la transparencia y la estructura de la pasta, la resistencia al calor, a la cizalladura y a los ácidos, la tendencia a la retrogradación, la capacidad para la formación de películas, la resistencia a congelaciones y descongelaciones, la digestibilidad así como la capacidad para la formación de complejos, p.ej., con iones inorgánicos u orgánicos.

(b) Uso en los productos que no son alimentos

El otro sector principal de empleo es el uso de un almidón como sustancia coadyuvante en diferentes procesos de producción o como un aditivo en productos técnicos. Los sectores principales de empleo para el uso de un almidón como sustancia coadyuvante es, ante todo, la industria del papel y del cartón. En este sector, el almidón es usado principalmente para la retención de materiales sólidos, para encolar partículas de materiales de carga y materiales finos, como sustancia que solidifica y para la deshidratación. Además de esto, se aprovechan las ventajosas propiedades de un almidón en lo que se refiere a la rigidez, la dureza, el sonido, el tacto, el brillo, la lisura, la resistencia al desgarramiento, así como a las superficies.

Dentro del proceso de producción de papel, se puede diferenciar entre cuatro sectores de aplicación, a saber la superficie, el revestimiento, la masa y la rociada. Los requisitos establecidos en cuanto a un almidón en lo que se refiere al tratamiento de superficies, son en lo esencial un alto grado de brillo, una viscosidad apropiada, una alta estabilidad de la viscosidad, una buena formación de películas así como una baja formación de polvos finos. Cuando se usa para el revestimiento, desempeñan un cometido importante el contenido de materiales sólidos, una viscosidad apropiada, una alta capacidad de fijación, así como una alta afinidad con los pigmentos. Como un aditivo a la masa, presentan importancia una distribución rápida, uniforme y exenta de pérdidas, una alta estabilidad mecánica y una completa retención en la pasta papelera. Cuando se usa el almidón para rociar, son asimismo importantes un contenido correspondiente de materiales sólidos, una alta viscosidad así como una alta capacidad de fijación. Un sector principal de empleo se encuentra, por ejemplo, en la industria de los adhesivos, en donde los campos de empleo se clasifican en cuatro sectores parciales: el uso como una pura cola de almidón, el uso en colas de almidón tratadas con productos químicos especiales, el uso de un almidón como un aditivo para resinas sintéticas y para dispersiones de polímeros, así como el uso de almidones como agentes extendedores (diluyentes) para adhesivos sintéticos. Un 90% de todos los adhesivos a base de almidón se usan en la producción de cartón ondulado, sacos y bolsas de papel, materiales compuestos para papel y aluminio, cajas y cartonajes y una cola de humedecimiento renovado para sobres de cartas, sellos de correo, etc.

Otro posible uso como coadyuvante y como aditivo se encuentra en la producción de géneros textiles y productos para el cuidado de géneros textiles. Dentro de la industria textil, se puede diferenciar entre los siguientes cuatro sectores de empleo: el uso de un almidón como agente de apresto y encolado, es decir como coadyuvante para el alisamiento y el refuerzo del comportamiento de trepa para la protección contra las fuerzas de tracción que actúan al tejer en telar, así como para aumentar la resistencia al desgaste durante la tejedura, como un agente para el mejoramiento de materiales textiles sobre todo después de tratamientos previos que deterioran la calidad, tales como los de blanqueo, tinción, etc., como un agente espesante en la producción de pastas de tinción con el fin de evitar difusiones de los colorantes, y como un aditivo para agentes de urdidura para hilos de costura.

Además, un almidón se puede usar como un aditivo en materiales de construcción. Un ejemplo es la producción de placas de cartón yeso, en las que el almidón mezclado en la argamasa diluida de yeso se empasta con el agua, se difunde junto a la superficie de la placa de yeso, y de esta manera fija el cartón a la placa. Otros sectores de empleo son su adición a fibras de yeso y minerales. En el caso de un hormigón transportable, el almidón se puede emplear con el fin de retrasar el proceso de fraguado.

Además, el almidón es ventajoso para la producción de agentes y medios destinados a la estabilización de los suelos, que se usan para la protección provisional de las partículas del suelo frente al agua en movimientos artificiales de tierras. De acuerdo con los conocimientos del estado de la técnica, se puede considerar que los productos combinados, que consisten en un almidón y en emulsiones de polímeros, tienen el mismo efecto de reducción de la erosión y del encostramiento que los productos empleados hasta ahora, pero son considerablemente menos caros.

Otro sector de empleo es el uso de un almidón en agentes protectores de las plantas, con el fin de modificar las propiedades específicas de estas formulaciones. Por ejemplo, se emplean almidones con el fin de mejorar la mojadura de los agentes protectores de las plantas y de los fertilizantes, para la liberación dosificada de los ingredientes activos, para la transformación de ingredientes activos líquidos, volátiles y/o malolientes en sustancias deformables, estables y microcristalinas, con el fin de mezclar composiciones incompatibles, y para la prolongación de la duración del efecto debido a una desintegración reducida.

Un almidón se puede usar también en los sectores de los fármacos, de la medicina y de la industria cosmética. En la industria farmacéutica, el almidón se puede emplear como agente aglutinante para tabletas o para la dilución de los agentes aglutinantes en cápsulas. Además, el almidón es apropiado como agente disgregante de tabletas, puesto que, después de la deglución, absorbe líquido y después de un breve tiempo se hincha en tal grado que se libera el ingrediente activo. Por razones cualitativas, los polvos para fluir y espolvorear medicinales son otros campos de empleo. En el sector de los cosméticos, el almidón se puede usar por ejemplo como un soporte de aditivos para polvos, tales como perfumes y ácido salicílico. Un sector de empleo relativamente extenso para el almidón se encuentra en las pastas dentífricas.

También se puede concebir el uso de un almidón como un aditivo a carbón y briquetas. Por adición de un almidón, un carbón se puede aglomerar y/o briquetear cuantitativamente con una alta calidad, con lo que se impide una desintegración prematura de las briquetas. Un carbón para parrillas de asar contiene entre 4 y 6% de almidón añadido, un carbón con poder calorífico aumentado contiene entre 0,1 y 0,5%. Por lo demás, el almidón se adecua como agente aglutinante, puesto que mediante su adición al carbón y a las briquetas se puede disminuir de manera considerable la emisión de sustancias tóxicas.

Además, el almidón se puede emplear como agente de floculación en el tratamiento de lodos de minerales y carbón.

Otro sector de empleo es el uso como un aditivo a materiales de tratamiento en la fundición (moldeo por colada). Para diferentes procedimientos de moldeo por colada, se necesitan machos que se producen a partir de arenas mezcladas con agentes aglutinantes. Hoy en día, el agente aglutinante más corrientemente usado es una bentonita mezclada con almidones modificados, en la mayor parte de los casos almidones hinchables.

La finalidad de añadir un almidón es una resistencia aumentada a la fluidez, así como una mejorada resistencia de aglutinación. Sin embargo, los almidones hinchables pueden cumplir más requisitos previos para el proceso de producción, tales como los de ser dispersables en agua fría, rehidratables, bien miscibles en arena y presentar una alta capacidad de fijación de agua.

En la industria de los cauchos, el almidón se puede emplear para mejorar las calidades técnicas y ópticas. Son razones para esto un brillo, un agarre y un aspecto mejorado de las superficies. Para esta finalidad, el almidón, antes de la vulcanización en frío, se deipersa sobre las superficies engomadas y pegajosas de las sustancias de caucho. Asimismo se puede emplear para el mejoramiento de la aptitud del caucho para la impresión (imprimibilidad).

Otro sector de empleo de un almidón modificado es la producción de materiales sustitutivos del cuero.

En el mercado de los materiales sintéticos (plásticos) están surgiendo los siguientes sectores de empleo: la integración de productos derivados del almidón dentro del proceso de elaboración (el almidón es solamente un material de carga, no existe ninguna unión directa entre un polímero sintético y un almidón) o, alternativamente, la integración de productos derivados del almidón en la producción de polímeros (un almidón y un polímero pasan a formar una fijación estable).

El uso del almidón como un material de carga puro no puede competir con el de otras sustancias tales como el talco. Esta situación es diferente cuando pasan a ser efectivas las propiedades específicas de los almidones y de esta manera se modifica manifiestamente el perfil de propiedades de los productos finales. Un ejemplo de esto es el uso de productos del almidón en la elaboración de materiales termoplásticos, tales como los de polietileno. En este caso, el almidón y el polímero sintético se combinan mediante expresión conjunta en una relación de 1 : 1 para formar una tanda patrón (en inglés master batch), a partir de la cual se producen diversos productos por medio de técnicas habituales, usando un polietileno granulado. La integración de un almidón en películas de polietileno puede causar una permeabilidad aumentada a sustancias en el caso de cuerpos huecos, una permeabilidad mejorada al vapor de agua, un comportamiento antiestático mejorado, un comportamiento antiapelmazante mejorado, así como una aptitud mejorada para la impresión con tintes acuosos.

Otra posibilidad es el uso del almidón en espumas de poliuretanos. Debido a la adaptación de los derivados de almidones, así como debido a la optimización de las técnicas de tratamiento, es posible controlar específicamente la reacción entre polímeros sintéticos y los grupos hidroxi del almidón. Los resultados de esto son unas películas de poliuretanos que, debido al uso de un almidón, tienen los siguientes perfiles de propiedades: un reducido coeficiente de dilatación térmica, un disminuido comportamiento de contracción, un mejorado comportamiento frente a la presión y las tensiones, una aumentada permeabilidad al vapor de agua sin ninguna modificación en la absorción y aceptación de agua, una inflamabilidad y una densidad de agrietamiento reducidas, ningún escurrimiento de partes y piezas combustibles, ausencia de halogenuros y envejecimiento reducido. Las desventajas, que actualmente existen todavía, son una resistencia a la presión así como una resistencia a los golpes, que han disminuido.

El desarrollo de productos de láminas y películas no es la única opción. También se pueden producir productos sólidos de materiales sintéticos (plásticos), tales como macetas, placas y cubetas, por medio de un contenido de almidón situado por encima de 50%. Además, las mezclas de almidones y polímeros tienen la ventaja de que son biodegradables con mucha mayor facilidad.

Además, a causa de su extremada capacidad para fijar agua, los polímeros de injerto con almidón han adquirido una extraordinaria importancia. Éstos son productos con una cadena principal a base de un almidón y con un retículo lateral a base de un monómero sintético, injertado de acuerdo con el principio del mecanismo de encadenamiento de radicales. Los polímeros de injerto con almidón, hoy en día disponibles, se caracterizan por una mejor capacidad de fijación y retención de hasta 1.000 g de agua por g de almidón, con una alta viscosidad. Estos super absorbentes se usan principalmente en el sector de la higiene, p.ej. en el caso de productos tales como pañales y láminas, así como en el sector agrícola, p.ej. en el caso de gránulos de semillas.

Lo que es decisivo para el empleo de los nuevos almidones modificados por técnicas de ADN recombinantes son, por una parte, la estructura, el contenido de agua, el contenido de proteínas, el contenido de lípidos, el contenido de fibras, el contenido de cenizas y fosfatos, la relación entre amilosa y amilopectina, la distribución de la masa molecular relativa, el grado de ramificación, el tamaño y la forma de los granos, así como la cristalización, y, por otra parte, también las propiedades que dan como resultado las siguientes características: el comportamiento de fluidez y sorción, la temperatura de pastificación, la viscosidad, el rendimiento de espesamiento, la solubilidad, la estructura de la pasta, la transparencia, la resistencia al calor, a la cizalladura y a los ácidos, la tendencia a la retrogradación, la capacidad de formación de geles, la resistencia frente a congelaciones y descongelaciones, la capacidad de formación de complejos, la fijación de yodo, la formación de películas, la fuerza adhesiva, la estabilidad frente a las enzimas, la digestibilidad y la reactividad. La característica más notable es la viscosidad.

Además, el almidón modificado obtenido a partir de las células de plantas conformes al invento se puede someter a otras modificaciones químicas adicionales, lo cual dará como resultado una mejoría adicional de la calidad para ciertos de los sectores de empleo, que antes se han descrito. Estas modificaciones químicas son fundamentalmente conocidas para un experto en la especialidad. Éstas son particularmente modificaciones por medio de

-

un tratamiento con ácidos

-

una oxidación

-

una esterificación (formación de almidones esterificados con fosfatos, nitratos, sulfatos, xantatos, acetatos y citratos. Otros ácidos orgánicos se pueden emplear asimismo para la esterificación)

-

una formación de éteres de almidones (alquil-éteres, O-alil-éteres, hidroxialquil-éteres y O-carboximetil-éteres de almidones, éteres de almidones que contienen N, éteres de almidones que contienen S)

-

una formación de almidones reticulados

-

una formación de polímeros de injerto con almidones.

El invento se refiere también a un material de propagación (reproducción) de las plantas conformes al invento, tales como p.ej. semillas, frutas, plantones, tubérculos o cepellones de raíces, conteniendo este material de propagación células de plantas conformes al invento.

Depósitos

Los plásmidos producidos y/o usados dentro del marco del presente invento se depositaron en el Centro de depósito reconocido internacionalmente "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen" (DSM = Colección alemana de microorganismos) con sede en Braunschweig, República Federal Alemana, de modo correspondiente a los requisitos del convenio de Budapest para el reconocimiento internacional de los depósitos de microorganismos con finalidades de obtención de patentes (número del depósito, fecha de la deposición):

Plásmido	pBinAR Hyg	(DSM 9505)	(20.10.1994)
Plásmido	p33-anti-BE	(DSM 6146)	(20.08.1990)
Plásmido	pRL2	(DSM 10225)	(04.09.1995)

Descripción de las figuras

La Figura 1 muestra el plásmido p35S-anti-RL

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Estructura del plásmido

A =

Fragmento A: Promotor CaMV 35S, nt (nucleótidos) 6909-7437 (Franck y colaboradores, Cell 21 (1980), 285-294)

B =

Fragmento B: Fragmento para Asp718 a partir de pRL1, con una longitud de aproximadamente 1.949 pb

\quad

Orientación con relación al promotor: antisentido

\quad

La flecha indica la dirección del cuadro de lectura abierto.

C =

Fragmento C: nt 11748-11939 del ADN T del plásmido Ti pTiACH5 ADN-T.(Gielen y colaboradores, EMBO J. 3 (1984), 835-846)

La Figura 2 muestra el plásmido pB33-anti-RL

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Estructura del plásmido

A =

Fragmento A: Promotor B33 del gen de patatina B33 procedente de Solanum tuberosum (Rocha-Sosa y colaboradores, EMBO J. 8 (1989), 23-29)

B =

Fragmento B: Fragmento para Asp718 a partir de pRL1, con una longitud de aproximadamente 1.949 pb

\quad

Orientación con relación al promotor: antisentido

\quad

La flecha indica la dirección del cuadro de lectura abierto.

C =

Fragmento C: nt 11748-11939 del ADN T del plásmido pTiACH5 ADN-T (Gielen y colaboradores, EMBO J. 3 (1984), 835-846).

La Figura 3 muestra una curva de Brabender, registrada con un viscógrafo de Brabender del tipo del Viscógrafo E, de una solución acuosa de un almidón, que se había aislado a partir de plantas de patata no transformadas de la variedad Désirée (véase también el Ejemplo 8).

En este caso significan: \hskip0,3cm mom.rot.

momento de rotación

[BE]

unidad de Brabender

Temp.

temperatura

A

comienzo de la pastificación

B

máximo grado de viscosidad

C

comienzo del período de tiempo de 96ºC

D

comienzo del período de tiempo de enfriamiento

E

final del período de tiempo de enfriamiento

F

final del período de tiempo de 50ºC final.

La línea azul indica la viscosidad; la línea roja representa la temperatura.

\global\parskip1.000000\baselineskip

La Figura 4 muestra una curva de Brabender, registrada con un viscógrafo de Brabender del tipo del Viscógrafo E, de una solución acuosa de un almidón, que se había aislado a partir de plantas de patata, que habían sido transformadas con el plásmido p35S-anti-RL (véase también el Ejemplo 8). Acerca del significado de las abreviaturas, véase la Figura 3.

La Figura 5 muestra una curva de Brabender, registrada con un viscógrafo de Brabender del tipo del Viscógrafo E, de una solución acuosa de un almidón procedente de patatas, que habían sido transformadas con el plásmido pB33-anti-RL (véase también el Ejemplo 8). Acerca del significado de las abreviaturas véase la Figura 3.

La Figura 6 muestra curvas de soluciones acuosas de un almidón, que se había aislado a partir de plantas de patata, que se habían registrado con un analizador Rapid Visco Analyser (véase también el Ejemplo 12). La línea roja representa la temperatura, las líneas azules 1, 2, 3 y 4 muestran las viscosidades de las siguientes soluciones de almidones.

Línea 1:

un almidón que se ha aislado a partir de plantas de tipo salvaje,

Línea 2:

un almidón que se ha aislado a partir de plantas, en las que se había inhibido solamente la enzima de ramificación (compárese el Ejemplo 1 de la solicitud de patente WO 92/14827),

Línea 3:

un almidón que se ha aislado a partir de plantas en las cuales se había reducido solamente la concentración de las proteínas conformes al invento (compárese el Ejemplo 6),

Línea 4:

un almidón que se ha aislado a partir de plantas, que habían sido transformadas con el plásmido p35S-anti-RL en combinación con el plásmido p35SH-anti-BE (compárese el Ejemplo 12).

La Figura 7 muestra curvas de soluciones acuosas de un almidón, que se había aislado a partir de plantas de patata, que se habían registrado con un analizador Rapid Visco Analyser (véase también el Ejemplo 13). La línea roja representa la temperatura, las líneas azules 1, 2, 3 y 4 muestran las viscosidades de las siguientes soluciones de almidones.

Línea 1:

un almidón que se ha aislado a partir de plantas de tipo salvaje,

Línea 2:

un almidón que se ha aislado a partir de plantas, que se habían transformado solamente con el plásmido pB33-anti-GBSSI (la denominada patata cerosa),

Línea 3:

un almidón que se ha aislado a partir de plantas, que se habían transformado solamente con el plásmido p35S-anti-RL (compárese el Ejemplo 6),

Línea 4:

un almidón que se ha aislado a partir de plantas, que se habían transformado con el plásmido pB33-anti-RL en combinación con el plásmido pB33-anti-GBSSI (compárese el Ejemplo 13).

La Figura 8 muestra el plásmido pRL2 que comprende un ADNc de plena longitud procedente de patata, que codifica una enzima R1.

Los Ejemplos ilustran el invento.

Medios y soluciones que se usan

Tampón para elución

25 mM de Tris, de pH 8,3

\quad

250 mM de glicina

\vskip1.000000\baselineskip

Tampón para diálisis

50 mM de Tris-HCl, de pH 7,0

\quad

50 mM de NaCl

\quad

2 mM de EDTA

\quad

14,7 mM de \beta-mercaptoetanol

\quad

0,5 mM de PMSF

\vskip1.000000\baselineskip

Tampón para proteínas

50 mM de un tampón de fosfato de sodio, de pH 7,2

\quad

10 mM de EDTA

\quad

0,5 mM de PMSF

\quad

14,7 mM de \beta-mercaptoetanol

\vskip1.000000\baselineskip

Solución del Lugol

12 g de Kl

\quad

6 g de I_{2}

\quad

hasta 1,8 l con ddH_{2}O (agua doblemente destilada)

\vskip1.000000\baselineskip

20 x SSC

175,3 g de NaCl

\quad

88,2 g de citrato de sodio

\quad

hasta 1.000 ml con ddH_{2}O

\quad

pH 7,0 con NaOH 10 N

\vskip1.000000\baselineskip

10 x MEN

200 mM de MOPS

\quad

50 mM de acetato de sodio

\quad

10 mM de EDTA

\quad

pH 7,0

\vskip1.000000\baselineskip

Tampón NSEB

0,25 M de un tampón de fosfato de sodio, de pH 7,2

\quad

7% deSDS

\quad

1 mM de EDTA

\quad

1% de BSA (p/v = peso/volumen)

\vskip1.000000\baselineskip

YT

8 g de un extracto de levadura Bacto

\quad

5 g de Bacto triptona

\quad

5 g de NaCl

\quad

hasta 1.000 ml con ddH_{2}O

\vskip1.000000\baselineskip

Medio de aislamiento de protoplastos (100 ml)

Celulasa Onozuka R S (Meiji Seika, Japón)	800 mg
Pectoliasa Y 23	40 mg
KNO_{3}	200 mg
KH_{2}PO_{4}	136 mg
K_{2}HPO_{4}	47 mg
CaCl_{2} 2H_{2}O	147 mg
MgSO_{4} 7H_{2}O	250 mg
Albúmina de suero bovino (BSA)	20 mg
Glucosa	4.000 mg
Fructosa	4.000 mg
Sacarosa	1.000 mg
pH	5,8
Osmolaridad	660 mosm.

Solución 1 de lavado de protoplastos: como la solución de aislamiento de protoplastos, pero sin celulasa, pectoliasa ni BSA.

Tampones de transformación

a)	Glucosa	0,5 M
	MES	0,1%
	MgCl_{2} 6H_{2}O	25 mM
	pH	5,8
	se ajusta a 600 mosm.

b)	Solución de PEG 6000
	Glucosa	0,5 M
	MgCl_{2} 6H_{2}O	100 mM
	Hepes	20 mM
	pH	6,5

El PEG 6000 se añade al tampón descrito en b) inmediatamente antes del uso de la solución (al 40% p/v = peso/ volumen, de PEG). La solución se filtra con un filtro estéril de 0,45 \mum.

Solución W5

CaCl_{2}	125 mM
NaCl	150 mM
KCl	5 mM
Glucosa	50 mM

\vskip1.000000\baselineskip

Medio de cultivo de protoplastos (indicado en mg/ml)

KNO_{3}	3000
(NH_{4})_{2}SO_{4}	500
MgSO_{4} 7H_{2}O	350
KH_{2}PO_{4}	400
CaCl_{2} 2H_{2}O	300
El Fe-EDTA y los elementos traza como en el medio de Murashige-Skoog
(Physiol. Plant, 15 (1962), 473).

m-Inosita	100
Tiamina HCl	1,0
Amida de ácido nicotínico	0,5
Piridoxina HCl	0,5
Glicina	2,0
Ácido glucurónico	750
Ácido galacturónico	750
Galactosa	500
Maltosa	500
Glucosa	36.000
Fructosa	36.000
Sacarosa	30.000
Asparagina	500
Glutamina	100
Prolina	300
Hidrolizado de caseína	500
Ácido 2,4-dicloro-fenoxi-acético (2,4-D)	0,5
pH	5,8
Osmolaridad	600 mosm.

Tampón A	2x	SSC
	10x	solución de Denhardt
	0,1%	SDS
	5 mM	EDTA
	50 mM	fosfato de disodio
	250 \mug/ml	ADN de esperma de arenque

En el Ejemplo se usaron las siguientes técnicas clásicas:

1.

Clonación

\quad

Para la donación en E. coli se usó el vector pBluescriptSK.

\quad

Para la transformación de plantas, las construcciones artificiales de genes se donaron en el vector binario pBinAR (Höfgen y Willmitzer, Plant. Sci. 66 (1990), 221-230) y B33-Hyg.

2.

Cepas de bacterias

\quad

Para el vector pBluescript y para las construcciones artificiales pBinAR y B33-Hyg se usó la cepa DH5\alpha de E. coli (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburgh, EE.UU.).

\quad

La transformación del plásmido en las plantas de patata se llevó a cabo por medio de la cepa C58C1 pGV2260 de Agrobacterium tumefaciens (Deblaere y colaboradores, Nucl. Acids Res. 13 (1985), 4777: 4788).

3.

Transformación de \underbar{Agrobacterium \ tumefaciens}

\quad

La transferencia del ADN se efectuó por transformación directa de acuerdo con el método de Höfgen & Willmitzer (Nucleic Acids Res. 16 (1988), 9877). El ADN de plásmido de las Agrobacterias transformadas se aisló de acuerdo con el método de Birnboim & Doly (Nucleic Acids Res. 7 (1979), 1513-1523) y se analizó por electroforesis después de una adecuada disociación por restricción.

4.

Transformación de patatas

\quad

Diez pequeñas hojas de un cultivo estéril de patata (Solanum tuberosum variedad L. cv. Désirée), lesionadas con un escalpelo, se trataron con 10 ml de un medio MS (Murashige & Skoog, Physiol. Plant. 15 (1962), 473-497) con 2% de sacarosa. El medio contenía 50 \mul de un cultivo durante una noche de Agrobacterium tumefaciens, que había crecido mediando selección. Después de haberlo agitado ligeramente durante 3-5 minutos, se efectuó otra incubación durante dos días en la oscuridad. Subsiguientemente, las hojas se colocaron, para la inducción de callos, sobre un medio MS con 1,6% de glucosa, 5 mg/l de ácido naftil-acético, 0,2 mg/l de bencil-amino-purina, 250 mg/l de Claforan, 50 mg/l de kanamicina o 1 mg/l de higromicina B, y 0,80% de Bacto Agar. Después de una incubación durante una semana a 25ºC y 3.000 Lux, las hojas se colocaron, para la inducción de retoños, sobre un medio MS con 1,6% de glucosa, 1,4 mg/l de zeatina ribosa, 20 mg/l de ácido naftil-acético, 20 mg/l de ácido giberélico, 250 mg/l de Claforan, 50 mg/l de kanamicina o 3 mg/l de higromicina B, y 0,80% de Bacto Agar.

5.

Transformación de maíz

(a)

Producción de protoplastos del linaje celular DSM 6009

\quad

Aislamiento de protoplastos

\quad

2-4 días, preferiblemente 3 días, después del último cambio de medio en un cultivo en suspensión de protoplastos, el medio líquido se evacua por bombeo y las restantes células se lavan en 50 ml de la solución 1 de lavado de protoplastos y se seca por aspiración una vez más. Se añaden 10 ml del medio de aislamiento de protoplastos a 2 g de la masa de células cosechadas. Las células resuspendidas y los aglomerados de células se incuban a 27 \pm 2ºC durante 4 a 6 horas en la oscuridad, mientras que se les agita ligeramente (a 30 hasta 40 rpm (revoluciones por minuto))

\quad

Purificación de protoplastos

\quad

Tan pronto como ha tenido lugar la liberación de por lo menos 1 millón de protoplastos/ml, la suspensión se tamiza a través de un tamiz de acero inoxidable o de nilón con un tamaño de mallas de 200 o 45 \mum. La combinación de un tamiz de 100 \mum y de otro de 60 \mum permite separar justamente asimismo los aglomerados de células. El material filtrado, que contiene protoplastos, se examina en un microscopio. Éste contiene usualmente 98 - 99% de protoplastos. El resto es de células individuales sin digerir. Las preparaciones de protoplastos con dicho grado de pureza se usan para experimentos de transformación sin ninguna adicional centrifugación en gradiente. Los protoplastos se sedimentan por medio de una centrifugación (100 rpm en el rotor oscilante (100 x g, durante 3 minutos)). El material sobrenadante se abandona y los protoplastos se vuelven a suspender en la solución 1 de lavado. La centrifugación se repite y los protoplastos se vuelven a suspender subsiguientemente en el tampón de transformación.

(b)

Transformación de protoplastos

\quad

Los protoplastos resuspendidos en el tampón de transformación se cargan en porciones de 10 ml dentro de tubos de un polialómero con una capacidad de 50 ml, en un título de 0,5 - 1 x 10^{6} protoplastos/ml. El ADN usado para la transformación se disuelve en una solución tamponadora de Tris-EDTA (TE). Se añaden 20 \mug de ADN de plásmido a cada ml de la suspensión de protoplastos. Un plásmido que proporciona resistencia a fosfinotricina se usa como vector (compárese p.ej. el documento EP 0.513.849). Después de la adición del ADN, la suspensión de protoplastos se agita cuidadosamente con el fin de distribuir homogéneamente el ADN en la solución. Inmediatamente después de esto, se añaden en gotas 5 ml de una solución de PEG.

\quad

Por cuidadosa agitación de los tubos, la solución de PEG se distribuye homogéneamente. Después de esto, se añaden 5 ml adicionales de la solución de PEG y se repite la mezcladura homogénea. Los protoplastos permanecen en la solución de PEG durante 20 minutos a \pm 2ºC. Después de esto, los protoplastos se sedimentan por centrifugación durante 3 minutos (100 g; 1.000 rpm). El material sobrenadante se abandona. Los protoplastos se lavan en 20 ml de una solución W5 por cuidadosa agitación y se someten de nuevo a centrifugación. Luego se vuelven a suspender en 20 ml de un medio de cultivo de protoplastos, se centrifugan de nuevo y nuevamente se vuelven a suspender en el medio de cultivo.. El título se ajusta a 6 - 8 x 10^{5} protoplastos y los protoplastos se cultivan en porciones de 3 ml en cápsulas de Petri (\diameter 60 mm, altura 15 mm). Las cápsulas de Petri se cierran herméticamente con una película de Parafilm y se almacenan en la oscuridad a 25 \pm 2ºC.

(c)

Cultivo de protoplastos

\quad

Durante las primeras 2 - 3 semanas después del aislamiento y de la transformación de los protoplastos, estos protoplastos se cultivan sin añadir medio de nueva aportación. Tan pronto como las células regeneradas a partir de los protoplastos se han desarrollado a la forma de aglomerados de células con más de 20 a 50 células, se añade 1 ml de un medio de cultivo de protoplastos, que contiene sacarosa como agente osmótico (90 g/l).

(d)

Selección de células transformadas de maíz y regeneración de plantas

\quad

A los 3 - 10 días después de haber añadido medio de nueva aportación, los aglomerados de células, desarrollados a partir de los protoplastos, se pueden extender sobre un medio de Agar con 100 mg/l de L-fosfinotricina. El medio N6 con las vitaminas del medio de cultivo de protoplastos, 90 g/l de sacarosa y 1,0 mg/l de 2,4D es tan apropiado como un medio análogo, tal como un medio con las sales macro- y micro-nutritivas del medio MS (Murashige y Skoog (1962), véase más arriba).

\quad

Los callos desarrollados a partir de protoplastos establemente transformados pueden crecer adicionalmente en el medio selectivo. Después de 3 a 5 semanas, preferiblemente 4 semanas, los callos transgénicos pueden ser transferidos a un medio de selección de nueva aportación, que también contiene 100 mg/l de L-fosfinotricina, el cual, sin embargo, ya no contiene auxina. En el transcurso de 3 a 5 semanas, aproximadamente un 50% de los callos de maíz transgénico, que tenían integrado en su genoma el gen de L-fosfinotricina - acetil - transferasa, comienzan a diferenciarse a la forma de plantas en este medio en la presencia de L-fosfinotricina.

(e)

Crecimiento de plantas regenerativas transgénicas

\quad

El tejido de maíz transformado embriogénicamente se cultiva en un medio N6 exento de hormonas (Chu C.C. y colaboradores, Sci. Sin. 16 (1975), 659) en la presencia de 5x10^{-4} M de L-fosfinotricina. En este medio, embriones de maíz, que expresan el gen de L-fosfinotricina - acetil - transferasa (gen PAT) de una manera suficientemente fuerte, se desarrollan a la forma de plantas. Los embriones no transformados, o los que solamente tienen una actividad de PAT muy débil, se mueren. Tan pronto como las hojas de las plantas in vitro han alcanzado una longitud de 4 a 6 mm, ellas pueden ser transferidas a una tierra. Después de haber separado por lavado los residuos de Agar situados junto a las raíces, las plantas son plantadas en una mezcla de arcilla, arena, vermiculita y tierra para plantar con la relación 3:1:1:1 y son adaptadas al cultivo en tierra con una humedad atmosférica relativa de 90 - 100% durante los primeros 3 días después de haber plantado. El crecimiento se lleva a cabo en una cámara climatizada con un período de luz durante 14 horas de aproximadamente 25.000 lux a la altura de la planta, a unas temperaturas de día/noche de 23 \pm 1/17 \pm 1ºC. Las plantas adaptadas son cultivadas a una humedad atmosférica de 65 \pm 5%.

6.

Marcación radiactiva de fragmentos de ADN

\quad

La marcación radiactiva de fragmentos de ADN se llevó a cabo por medio de un estuche de marcación con cebadores aleatorios de ADN (DNA-Random Primer Labelling Kits) de la entidad Boehringer (Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

7.

Análisis por transferencia de borrones Northern

\quad

El ARN se aisló, de acuerdo con protocolos clásicos, a partir de un tejido de hojas. 50 \mug del ARN fueron separados sobre un gel de agarosa (1,5% de agarosa, tampón 1 x MEN, 16,6% de formaldehído). Después del desarrollo del gel, el gel se lavó brevemente en agua. El ARN se transfirió con 20 x SSC mediante una transferencia de borrón capilar sobre una membrana de nilón del tipo Hybond N (Amersham, Reino Unido). La membrana se coció a continuación a 80ºC bajo vacío durante dos horas.

\quad

La membrana se hibridó previamente durante dos horas a 68ºC en un tampón NSEB y a continuación se hibridó en el tampón NSEB durante una noche a 68ºC en presencia de la sonda marcada radiactivamente.

8.

Mantenimiento de las plantas

\quad

Las plantas de patata se cultivaron en un invernadero en las siguientes condiciones:

Período de luz

16 horas a 25000 lux y 22ºC

Período de oscuridad

8 horas a 15ºC

Humedad del aire

60%

9.

Determinación de la relación de amilosa a amilopectina en un almidón obtenido a partir de plantas de patata

\quad

El almidón se aisló de acuerdo con métodos clásicos a partir de plantas de patata, y la relación de amilosa a amilopectina se determinó de acuerdo con el método descrito por Hovenkamp-Hermelink y colaboradores (Potato Research 31 (1988) 241-246).

10.

Determinación de glucosa, fructosa y sacarosa

\quad

Con el fin de determinar los contenidos de glucosa, fructosa y/o sacarosa, se congelan pequeños trozos (con un diámetro de aproximadamente 10 mm) de tubérculos de patata en nitrógeno líquido y a continuación se extraen durante 30 minutos a 80ºC en 0,5 ml de HEPES 10 mM, de pH 7,5; 80% (vol./vol.) de etanol. El material sobrenadante, que contiene los componentes solubles, se retira y se determina el volumen. El material sobrenadante se usa para determinar la cantidad de azúcares solubles. La determinación cuantitativa de glucosa, fructosa y sacarosa solubles se lleva a cabo en una mezcla de reacción que tiene la siguiente composición:

100,0

mM de imidazol/HCl, de pH 6,9

1,5

mM de MgCl_{2}

0,5

mM de NADP^{\pm}

1,3

mM de ATP

10-50

\mul de una muestra

1,0

U de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa procedente de levadura.

La mezcla de reacción se incuba a la temperatura ambiente durante 5 minutos. La subsiguiente determinación de los azúcares se efectúa a continuación mediante métodos fotométricos clásicos por medición de la absorción a 340 nm después de la adición consecutiva de

1,0 unidad

de una hexocinasa procedente de levadura

\quad

(con el fin de determinar glucosa)

1,0 unidad

de una fosfoglucoisomerasa procedente de levadura

\quad

(con el fin de determinar fructosa) y

1,0 unidad

de una invertasa procedente de levadura

\quad

(con el fin de determinar sacarosa).

Ejemplo 1 El aislamiento de proteínas unidas a granos de almidón, a partir de almidón de patata

El aislamiento de proteínas unidas a granos de almidón, a partir de almidón de patata se efectúa mediante electroelución en un dispositivo para elución que se había construido de una manera análoga al electroelutor "Modelo 422 Electro-Eluter" (BIORAD Laboratories Inc., EE.UU.), pero tenía un volumen esencialmente mayor (aproximadamente 200 ml). 25 g de un almidón secado se disolvieron en un tampón para elución (volumen final 80 ml). El almidón se derivó de patatas, que producen un almidón casi exento de amilosa, a causa de la expresión antisentido de una secuencia de ADN que codifica la sintasa 1 de almidón, unida a granos de almidón (GBSS I) procedente de patata. La suspensión se calentó a 70-80ºC en un baño de agua. A continuación, se añadieron 72,07 g de urea (concentración final 8 M) y el volumen se completó hasta 180 ml con un tampón para elución. El almidón se disolvió mediando constante agitación y adquirió una consistencia a modo de pasta. Las proteínas fueron electroeluidas durante una noche a partir de la solución por medio del dispositivo para elución (100 V; 50-60 mA). Las proteínas eluidas se sacaron cuidadosamente desde el dispositivo. Las sustancias en suspensión se eliminaron mediante una breve centrifugación. El material sobrenadante se dializó a 4ºC de 2 a 3 veces, cada vez durante una hora, frente a un tampón para diálisis. A continuación, se determinó el volumen de la solución de proteínas. Las proteínas se precipitaron por adición de sulfato de amonio (concentración final 90%), lo cual se efectuó mediando agitación constante a 0ºC. Las proteínas precipitadas se sedimentaron por centrifugación y se recogieron en un tampón para proteínas.

Ejemplo 2 Identificación y aislamiento de secuencias de ADNc, que codifican proteínas unidas a granos de almidón

Las proteínas aisladas de acuerdo con el Ejemplo 1 se usaron para la producción de anticuerpos policlonales de conejo, que reconocen específicamente a proteínas unidas a granos de almidón.

Por medio de tales anticuerpos se escrutó a continuación, usando métodos clásicos, una biblioteca de expresión de ADNc para encontrar secuencias que codifican proteínas unidas a granos de almidón.

La biblioteca de expresión se produjo de la siguiente manera:

A partir de tubérculos de patata de la variedad "Berolina" se aisló de acuerdo con métodos clásicos un ARNm (mensajero) de poli(A^{+}). Partiendo del ARNm poli(A^{\pm}) se produjo un ADNc de acuerdo con el método de Gubler y Hoffmann (Gene 25 (1983), 263-269), usando un cebador de Xho I-Oligo d(t)_{18}. Este ADNc se cortó con Xho I después de la adición de un engarzador de EcoR I y se ligó de una manera orientada en un vector lambda ZAP II (de Stratagene) cortado con EcoR I y Xho I. Aproximadamente 500.000 placas de una biblioteca de ADNc, construida de esta manera, se escrutaron para descubrir secuencias que eran reconocidas por anticuerpos policlonales, que están dirigidos contra proteínas unidas a granos de almidón.

Para analizar las placas de fagos, éstas se transfirieron a filtros de nitrocelulosa, que previamente se habían incubado durante 30 a 60 minutos en una solución 10 mM de IPTG, y a continuación se habían secado sobre un papel de filtro. La transferencia se efectuó durante 3 h a 37ºC. A continuación, los filtros se incuban durante 30 minutos a la temperatura ambiente en un reactivo de bloqueo y se lavaron durante 5-10 minutos en un tampón de TBST. Los filtros se agitaron con los anticuerpos policlonales dirigidos contra proteínas unidas a granos de almidón, en una dilución apropiada, durante una hora a la temperatura ambiente o durante 16 horas a 4ºC. La identificación de placas, que expresaban una proteína, que había sido reconocida por los anticuerpos policlonales, se efectuó por medio del "Blotting detection kit for rabbit antibodies RPN 23" [Estuche para detección por transferencia de borrones para anticuerpos de conejo RPN 23] (de Amersham Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los clones de fagos de la biblioteca de ADNc, que expresaban una proteína que era reconocida por los anticuerpos policlonales. se purificaron adicionalmente usando métodos clásicos.

Por medio del método de excisión in vivo, se obtuvieron clones de E. coli a partir de clones de fagos positivos que contenían un plásmido pBluescript bicatenario con la correspondiente inserción de ADNc. Después de haber comprobado el tamaño y el modelo de restricción de las inserciones, se analizó ulteriormente un clon apropiado, el pRL1.

Ejemplo 3 Análisis de secuencias de la inserción de ADNc del plásmido pRL1

A partir de un clon de E. coli, obtenido correspondientemente al Ejemplo 2, se aisló el plásmido pRL1 y se determinó una parte de la secuencia de su inserción de ADNc mediante procedimientos clásicos usando el método de los didesoxi-nucleótidos (Sangery colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467). La inserción tiene una longitud de aproximadamente 2.450 pb. Una parte de la secuencia de nucleótidos, así como la secuencia de aminoácidos derivada a partir de ella, se indica en Seq ID No. 3 y Seq ID No. 4.

Un análisis de las secuencias y una comparación de las secuencias con secuencias conocidas de ADN mostraron que es nueva la secuencia indicada en Seq ID No. 3 y no presenta ninguna homología significativa con secuencias de ADN hasta ahora conocidas. Además, el análisis de las secuencias mostró que la inserción de ADNc es solamente un ADNc parcial, en el que falta una parte de la región codificadora junto al extremo 5'.

Ejemplo 4 Identificación y aislamiento de un ADNc completo, que codifica una proteína unida a granos de almidón, procedente de Solanum tuberosum

Con el fin de aislar un ADNc completo que corresponde a la inserción parcial de ADNc del plásmido pRL1, se produjo una biblioteca de ADNc adicional. Ésta era una biblioteca de ADNc procedente de Solanum tuberosum, específica para células de guarda, que se había construido de la siguiente manera:

Primeramente, se produjeron fragmentos de epidermis a partir de hojas de plantas de patata de la variedad "Désirée", en lo esencial de acuerdo con el método de Hedrich y colaboradores (Plant Physiol. 89 (1989), 148), cosechando aproximadamente 60 hojas de plantas de patata con una edad de seis semanas, que habían sido mantenidas en un invernadero. A partir de las hojas se retiró el nervio central. A continuación, las hojas se trituraron cuatro veces, cada vez durante 15 segundos, al nivel más alto en un aparato "Waring blender" [mezclador Waring] grande (con un volumen de 1 litro), en H_{2}O destilada y enfriada. La suspensión se filtró a través de un tamiz de nilón con un tamaño de mallas de 220 \mum (Nybolt, Zurich, Suiza) y se lavó varias veces en agua destilada fría. La propia suspensión se filtró de nuevo a través de un tamiz de nilón de 220 \mum y se lavó intensamente con agua destilada fría. Los residuos (fragmentos de epidermis) se trituraron un mezclador "Waring blender" de menor tamaño (con un volumen 250 ml) cuatro veces, cada vez durante 15 segundos, en un nivel más bajo en agua destilada y en hielo. La suspensión se filtró a través de un tamiz de nilón de 220 \mum y se lavó intensamente con agua destilada fría. Los fragmentos de epidermis (= residuos) se examinaron con un microscopio para detectar una contaminación por células mesófilas. Si se había producido una contaminación, se repitió la etapa de trituración en un pequeño mezclador "Waring blender".

La disgregación de las células de guarda de los fragmentos de epidermis se efectuó por medio de una pulverización en nitrógeno líquido en un mortero enfriado, durante aproximadamente dos horas. Con el fin de examinar la disgregación de las células de guarda, se tomaron regularmente muestras y se examinaron con un microscopio. Después de dos horas, o si se había disgregado un número suficientemente grande de células de guarda, el polvo obtenido se cargó dentro de un tubo de reacción (con un volumen de 50 ml) y se volvió a suspender en un volumen de tampón para GTC (Chirgwin y colaboradores, Biochem. 18 (1979), 5294-5299). La suspensión se centrifugó y el material sobrenadante se filtró a través de una tela Miracloth (Calbiochem, La Jolla, California). El material filtrado se sometió durante 16 h a una centrifugación, tal como se describe en las citas de Glisin y colaboradores (Biochemistry 13 (1974), 2633-2637) y de Mornex y colaboradores (J. Clin. Inves. 77 (1986), 1952-1961). Después de la centrifugación, el precipitado de ARN se disolvió en 250 \mul de un tampón para GTC. El ARN se precipitó por adición de 0,05 volúmenes de ácido acético 1 M y de 0,7 volúmenes de etanol. El ARN se precipitó por centrifugación y el precipitado se lavó con acetato de sodio 3 M (de pH 4,8) y etanol al 70%. El ARN se secó brevemente y se disolvió en agua tratada con
DEPC.

A partir del ARN aislado, se aisló de acuerdo con métodos clásicos el ARN poli(A^{\pm}). Partiendo del ARNm poli(A^{\pm}) se produjo, de acuerdo con el método de Gübler y Hoffmann (Gene 25 (1983), 263-269), un ADNc por medio de un cebador para Xho I-Oligo d(t)_{18}. Éste ADNc se cortó con Xho I después de la adición de un engarzador para EcoR I y se ligó de una manera orientada en un vector lambda ZAP II (de Stratagene, GmbH, Heidelberg, Alemania) cortado con EcoR I y Xho I. El empaquetamiento en cabezas de fagos se efectuó usando el estuche Gigapack II Gold kit (Stratagene, GmbH, Heidelberg, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

A partir de dicha biblioteca de ADNc se aislaron y purificaron, de acuerdo con métodos clásicos, clones de fagos, que se hibridan con la inserción de ADNc del plásmido pRL1. Por medio del método de excisión in vivo se obtuvieron clones de E. coli a partir de clones de fagos positivos, que contienen un plásmido pBluescript bicatenario con la correspondiente inserción de ADNc. Después de haber comprobado el tamaño y el modelo de restricción de las inserciones, unos clones apropiados se sometieron a un cartografiado por restricción y a un análisis de las secuencias. A partir de un clon apropiado, se aisló el plásmido pRL2 (DSM 10225), que contiene un ADNc completo, que codifica una proteína unida a granos de almidón, procedente de patata.

Ejemplo 5 Análisis de la secuencia de la inserción de ADNc del plásmido pRL2

La secuencia de nucleótidos de la inserción de ADNc del plásmido pRL2 se determinó, tal como se ha descrito en el Ejemplo 3. La inserción tiene una longitud de 4.856 pb. La secuencia de nucleótidos, así como la secuencia de aminoácidos derivada a partir de ella, se indican en Seq ID No. 1 y/o Seq ID No. 2. En lo sucesivo el correspondiente gen será denominado gen de RL. La proteína codificada por la región de codificación será denominada enzima R1.

Ejemplo 6 La construcción del plásmido p35S-anti-RL y la introducción del plásmido en el genoma de plantas de patata

A partir del plásmido pRL1 se aisló, por medio de la endonucleasa de restricción Asp718, un fragmento de ADN con una longitud de aproximadamente 1.800 pb. Éste corresponde a la secuencia de ADN indicada en Seq ID No. 3 y contiene una parte del cuadro abierto de lectura. El fragmento se ligó en el vector binario pBinAR, cortado con Asp718 (Höfgen y Willmitzer, Plant Sci. 66 (1990), 221-230). Éste es un derivado del vector binario pBin19 (Bevan, Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711-8721). El pBinAR se construyó de la siguiente manera:

Un fragmento con una longitud de 529 pb, que comprende los nucleótidos 6909-7437 del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (Franck y colaboradores, Cell 21 (1980), 285-294), se aisló como un fragmento para EcoR I/Kpn I a partir del plásmido pDH51 (Pietrzak y colaboradores, Nucl. Acids Res. 14, 5857-5868), y se ligó entre los sitios de corte con EcoR I y Kpn I del poliengarzador de pBin19. Esto condujo al plásmido pBin19-A.

Por medio de las endonucleasas de restricción Pvu II y Hind III, se aisló un fragmento con una longitud de 192 pb, a partir del plásmido pAGV40 (Herrera-Estrella y colaboradores, Nature 303, 209-213) que comprende la señal de poliadenilación del gen 3 del ADN T del plásmido Ti pTiACH5 (Gielen y colaboradores, EMBO J. 3, 835-846) (nucleótidos 11749- 11939). Después de la adición de engarzadores para Sph I al sitio de corte con Pvu I el fragmento se ligó entre los sitios de corte con Sph I y Hind III de pBin 19-A. Esto condujo al plásmido pBinAR.

Por medio de un análisis por restricción y de secuencias, se identificaron vectores recombinantes, en los cuales el fragmento de ADN está insertado en el vector, de tal manera que una parte de la región codificadora de la inserción de ADNc procedente de pRL1 está unida en orientación antisentido con el promotor 35S. El resultante plásmido, p35S-anti-RL, está representado en la Figura 1.

Mediante la inserción del fragmento de ADNc se produce un casete de expresión, que está constituido por los fragmentos A, B y C:

El fragmento A (de 529 pb) contiene el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV). El fragmento comprende los nucleótidos 6909 hasta 7437 del CaMV (Franck y colaboradores, Cell 21 (1980), 285-294).

Aparte de secuencias flanqueadoras, el fragmento B contiene una parte de la inserción de ADNc procedente del plásmido pRL1. Ésta se aisló a partir de pRL1 como un fragmento Asp718 de pRL1 tal como arriba se ha descrito, y se fusionó en una orientación antisentido con el promotor 35S.

El fragmento C (de 192 pb) contiene la señal de poliadenilación del gen 3 del ADN T del plásmido Ti pTiACH5 (Gielen y colaboradores, EMBO J. 3 (1984) 835-846).

El plásmido p35S-anti-RL tiene un tamaño de aproximadamente 12,8 kb.

El plásmido se transfirió a plantas de patata por medio de una transformación mediada por Agrobacterias, tal como antes se ha descrito. A partir de las células transformadas, se regeneraron plantas enteras. Las plantas transformadas se cultivaron en condiciones de invernadero.

Analizando el ARN total en un análisis por transferencia de borrón Northern en lo que se refiere a la desaparición de los transcritos complementarios con el ADNc, se comprobó el éxito de la modificación genética de las plantas. Para esta finalidad, el ARN total se aisló a partir de hojas de plantas transformadas de acuerdo con métodos clásicos, y subsiguientemente se separó por electroforesis sobre un gel de agarosa. Luego, se transfirió a una membrana de nilón, y se hibridó con una sonda marcada radiactivamente, que tenía la secuencia indicada en Seq ID No. 1 o una parte de ésta. En aproximadamente 5-10% de las plantas transformadas faltaba, en el análisis por transferencia de borrón Northern, la banda que indica el transcrito específico de la secuencia en Seq ID No. 1. Las plantas se usaron para analizar la calidad del almidón.

Ejemplo 7 La construcción del plásmido pB33-anti-RL y la introducción del plásmido en el genoma de plantas de patata

Por medio de la endonucleasa de restricción Asp718, un fragmento de ADN con una longitud de aproximadamente 1.800 pb, que comprende una parte del cuadro de lectura abierto de la inserción de ADNc, se aisló a partir del plásmido pRL1 y se ligó en el vector B33-Hyg que había sido cortado con Asp718. Este vector se construyó de la siguiente manera:

\newpage

El promotor 35S se eliminó a partir del vector pBinAR Hyg (DSM 9505) por medio de las endonucleasas de restricción EcoR I y Asp718. Un fragmento con una longitud de aproximadamente 1.526 pb, que comprende el promotor B33, se aisló a partir del plásmido p33-anti-BE (DSM 6146) por medio de EcoR I y Asp718 y se insertó en el vector pBinAR Hyg (DSM 9505) cortado con EcoR I y Asp718.

Mediante la inserción del fragmento de ADNc en el sitio de corte con Asp718 del plásmido B33-Hyg, se produce un casete de expresión, que está constituido por los fragmentos A, B y C (Figura 4):

El fragmento A contiene el promotor B33 procedente de Solanum tuberosum (documento EP 3775092; Rocha-Sosa y colaboradores, EMBO J. 8(1989), 23-29).

Aparte de regiones flanqueadoras, el fragmento B contiene una parte de la región codificadora de proteína de la inserción de ADNc procedente del plásmido pRL1. Ésta se aisló como un fragmento Asp718 a partir de pRL1 como antes se ha descrito y se fusionó en una orientación antisentido con el promotor B33.

El fragmento C (de 192 pb) contiene la señal de poliadenilación del gen 3 del ADN T del plásmido Ti pTiACH5 (Gielen y colaboradores, EMBO J. 3 (1984) 835-846).

El plásmido pB33-anti-RL tiene un tamaño de aproximadamente 12,8 kb.

El plásmido se transfirió a plantas de patata por medio de una transformación mediada por Agrobacterias, tal como antes se ha descrito. A partir de las células transformadas, se regeneraron plantas enteras. Las plantas transformadas se cultivaron en condiciones de invernadero.

Analizando el ARN total en un análisis por transferencia de borrón Northern en lo que se refiere a la desaparición de los transcritos complementarios con el ADNc, se comprobó el éxito de la modificación genética de las plantas. Para esta finalidad, el ARN total se aisló a partir de hojas de plantas transformadas de acuerdo con métodos clásicos, y subsiguientemente se separó por electroforesis sobre un gel de agarosa. Luego, se transfirió a una membrana de nilón, yse hibridó con una sonda marcada radiactivamente, que tenía la secuencia indicada en Seq ID No. 1 o una parte de ésta. En aproximadamente 5-10% de las plantas transformadas faltaba, en el análisis por transferencia de borrón Northern, la banda que indica el transcrito específico de la secuencia en Seq ID No. 1. A partir de estas plantas se aisló el almidón a partir de tubérculos, y se analizó tal como se describe en el Ejemplo 8.

Ejemplo 8 Análisis de las plantas de patata transformadas

Las plantas de patata, transformadas de acuerdo con el Ejemplo 6 y el Ejemplo 7, se examinaron en lo que se refería a las propiedades del almidón sintetizado. Los análisis se llevaron a cabo con diferentes linajes de plantas de patata, que habían sido transformadas con el plásmido p35S-anti-RL o bien con el plásmido pB33-anti-RL, y que en el análisis por transferencia de borrón Northern ya no tenían la banda, que indica transcritos que se hibridan con las secuencias de ADN conformes al invento.

a) Determinación de la viscosidad de soluciones acuosas del almidón

Con el fin de determinar la viscosidad de las soluciones acuosas del almidón sintetizado en plantas de patata transformadas, se aisló un almidón a partir de tubérculos de plantas, que habían sido transformadas con el plásmido p35S-anti- RL o con el plásmido pB33-anti-RL, usando métodos clásicos. Se recogieron en cada caso 30 g de almidón en 450 ml de H_{2}O y se usaron para el análisis en un viscógrafo E (de Brabender OHG Duisburg (Alemania)). El aparato se usó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Con el fin de determinar la viscosidad de la solución acuosa del almidón, la suspensión de almidón se calentó primeramente desde 50ºC hasta 96ºC con una velocidad de 3ºC por minuto. A continuación se mantuvo la temperatura en 96ºC durante 30 min. Después de ello, la solución se enfrió desde 96ºC hasta 50ºC con una velocidad de 3ºC por min. Durante todo el proceso, se determinó la viscosidad. Resultados representativos de tales mediciones se reproducen en las Figuras 3, 4 y 5, en forma de gráficos, en los que se representa la viscosidad en función del tiempo. La Figura 3 muestra una típico gráfico de Brabender para un almidón que se había aislado a partir de plantas de tipo salvaje de la variedad de patata Désirée. Las Figuras 4 y 5 muestran un típico gráfico de Brabender para un almidón, que se había aislado a partir de plantas de patata, que habían sido transformadas con el plásmido p35S-anti-RL o pB33-anti-RL. A partir de estos gráficos se pueden deducir diferentes valores característicos.

\newpage

Los valores característicos para plantas de tipo salvaje son los siguientes:

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TABLA 1

1

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Los valores representan los valores medios obtenidos de dos diferentes mediciones

En la Tabla 1 y en las siguientes Tablas 2 y 3, las abreviaturas significan lo siguiente:

A:

Comienzo de la pastificación

B:

Viscosidad máxima

C:

Comienzo del período de tiempo de 96ºC

D:

Comienzo del período de tiempo de enfriamiento

E:

Final del período de tiempo de enfriamiento

F:

Final del período de tiempo de 50ºC.

Para plantas, que habían sido transformadas con el plásmido p35S-anti-RL (linaje P2), se establecen en tal caso los siguientes valores característicos:

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TABLA 2

2

\newpage

Para plantas, que habían sido transformadas con el plásmido pB33-anti-RL (linaje P3), se establecen en tal caso los siguientes valores:

TABLA 3

3

Las Figuras 3, 4 y 5 muestran explícitamente que el almidón obtenido a partir de plantas transformadas se diferencia del almidón obtenido a partir de plantas de tipo salvaje, en particular, por el hecho de que la viscosidad aumenta sólo muy ligeramente durante el calentamiento. Así, durante el calentamiento, la viscosidad máxima del almidón modificado procedente de plantas transformadas es menor en más de un 50% que en el caso de un almidón de tipo salvaje.

Durante el enfriamiento, por otra parte, la viscosidad del almidón aislado a partir de plantas transformadas aumenta más que en el caso del almidón de tipo salvaje.

b) Determinación del contenido de fosfato del almidón

Se determinó el contenido de fosfato del almidón, midiendo la cantidad de fosfato que se había fijado a la posición C-6 de los radicales de glucosa. Para esta finalidad, un almidón fue primeramente degradado mediante hidrólisis con un ácido y a continuación se determinó el contenido de glucosa-6-fosfato mediante un ensayo con enzimas, tal como se describe a continuación.

100 mg de un almidón se incubaron a 100ºC durante 4 horas en 500 \mul de HCl 0,7 N. Después de la hidrólisis con un ácido, 10 \mul de la mezcla de reacción se añadieron a 600 \mul de un tampón de imidazol (100 mM de imidazol, 5 mM de MgCl_{2}, de pH 6,9, 0,4 mM de NAD^{+}). La cantidad de glucosa-6-fosfato en la mezcla de reacción se determinó mediante conversión con la enzima glucosa-6-fosfato- deshidrogenasa. Para esta finalidad, a la mezcla de reacción se le añadió 1 U (unidad) de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (procedente de Leuconostoc mesenteroides (de Boehringer Mannheim)) y se determinó la cantidad de NADH producida mediante medición de la absorción a 340 nm.

El contenido de glucosa-6-fosfato de 1 mg de almidón se indica en la siguiente tabla para plantas de patata no transformadas de la variedad Désirée así como para dos linajes (P1 (35S-anti-RL); P2 (35S-anti-RL)) de plantas de patata transgénicas, que habían sido transformadas con el plásmido p35S-anti-RL.

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TABLA 4

4

La siguiente Tabla muestra el contenido de glucosa-6-fosfato por miligramo de almidón en plantas de patata, que habían sido transformadas con el plásmido pB33-anti-RL, en comparación con un almidón procedente de plantas no transformadas (S. tuberosum c.v. Désirée).

TABLA 5

5

Las plantas 7, 37, 45 y31 constituyen transformantes independientes, que habían sido transformados con el plásmido pB33-anti-RL. La planta 37 representa al linaje P3, para el que se representa un gráfico de Brabender en la Figura 5.

Los valores muestran que el contenido de fosfato del almidón modificado procedente de plantas de patata transgénicas se ha reducido en por lo menos aproximadamente un 50% en comparación con un almidón procedente de plantas de tipo salvaje.

c) Determinación de los contenidos de glucosa, fructosa y sacarosa de tubérculos después de un almacenamiento a 4ºC.

Tubérculos de plantas de diferentes linajes transgénicos, que habían sido transformados con la construcción artificial antisentido p35S-anti-RL, así como de plantas de tipo salvaje, se almacenaron durante 2 meses a 4ºC o, respectivamente, a 20ºC en la oscuridad. A continuación, se determinaron, tal como antes se ha descrito, las cantidades de glucosa, fructosa y sacarosa. Para dos linajes transgénicos los valores representativos eran los siguientes:

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TABLA 6

6

Los valores presentados en la tabla se indican en \mumol de hexosa y respectivamente sacarosa/g de peso fresco.

A partir de los valores de la Tabla 6 resulta evidente que la acumulación de azúcares reductores en los tubérculos es considerablemente menor en plantas transgénicas almacenadas a 4ºC que en plantas de tipo salvaje.

En conjunto, el almidón modificado que se ha aislado a partir de plantas de patata transgénicas se asemeja a un almidón procedente de plantas de maíz de tipo salvaje. Sin embargo, en comparación él posee la ventaja de que su sabor es neutro y que por lo tanto es más apropiado para diferentes usos en el sector alimentario.

Ejemplo 9 Expresión de la inserción de ADNc del plásmido pRL2 en E. coli (a) Transformación de células de bacterias

Con el fin de expresar la inserción de ADNc del plásmido pRL2, las células de la cepa DH5\alpha de E. coli se transformaron primeramente con el plásmido pACAC. Este plásmido contiene un fragmento de ADN, que codifica la ADP-glucosa pirofosforilasa (AGPasa) procedente de E. coli, bajo el control del promotor lac Z. El fragmento había sido aislado como un fragmento para DraI/HaeII con un tamaño de aproximadamente 1,7 kb a partir del vector pEcA-15 (véase B. Müller-RÖber (1992), tesis doctoral, Universidad Libre FU Berlín) y después de haber rellenado sus extremos pegajosos había sido clonado en un vector pACAC184 linealizado con HindIII. La expresión de la AGPasa debe producir un aumento de la síntesis de glicógeno en células de E. coli transformadas. Las células transformadas de tal manera se designarán en lo sucesivo células K1 de E. coli. Con el fin de determinar la actividad enzimática de la proteína codificada por el ADNc del plásmido, células K1 de E. coli se transformaron con el plásmido pRL2. Las células de E. coli transformadas, que contienen tanto el plásmido pACAC como también el plásmido pRL2, se designarán en lo sucesivo células K2 de E. coli.

La transferencia del ADN de plásmido a las células de bacterias se efectuó en cada caso de acuerdo con el método de Hanahan (J. Mol. Biol. 166 (1983), 557- 580). Las células de E. coli transformadas se extendieron sobre cubetas de cultivo en agar, con la siguiente composición:

Medio YT que contiene

1,5%

de Bacto agar

50 mM

de un tampón de fosfato de sodio, de pH 7,2

1%

de glucosa

10 \mug/ml

de cloramfenicol, en el caso de células K1 de E. coli

o

10 \mug/ml

de cloramfenicol y

10 \mug/ml

de ampicilina, en el caso de células K2 de E. coli.

Las células de la cepa DH5\alpha de Escherichia coli, que habían sido transformadas con el plásmido pRL2 + pACAC (células K2 de E. coli) así como, en calidad de testigo, solamente con el plásmido pACAC (células K1 de E. coli), se cultivaron sobre placas de agar. El glicógeno formado de los diferentes cultivos se examinó en lo que se refiere a su grado de fosforilación (en la posición C-6 de la molécula de glucosa), tal como se describe a continuación.

(b) Aislamiento de un glicógeno bacteriano

Con el fin de aislar un glicógeno bacteriano, la colonia de bacterias, que había crecido después de la transformación, se hizo flotar en cada caso a partir de 6 placas de agar (\diameter 135 mm) con 5 ml de un medio YT/placa. La suspensión de bacterias se centrifugó a 4.500 xg durante 5 minutos. El precipitado de bacterias se volvió a suspender en 10 ml de un medio YT. La disgregación de las bacterias se efectuó por adición de 2 volúmenes de un medio de disgregación (0,2 N de NaOH; 1% de SDS) y por incubación durante 5 minutos a la temperatura ambiente. Por adición de 3 volúmenes de EtOH absoluto, incubación durante 30 minutos a 4ºC y subsiguiente centrifugación durante 15 minutos a 8.000 xg, se sedimentó el glicógeno. A continuación, el precipitado se lavó con 100 ml de EtOH al 70% y se sedimentó de nuevo por
medio de una etapa de centrifugación (durante 10 minutos a 8.000 xg). El proceso de lavado se repitió cuatro veces.

(c) Determinación del contenido total de glicógeno

El glicógeno aislado y sedimentado se degradó primeramente para dar moléculas individuales de glucosa mediante una hidrólisis con un ácido (disolución del precipitado en 2 ml de HCl 0,7 N; incubación durante 4 horas a 100ºC). El contenido de glucosa de la solución se determinó mediante una reacción enzimática acoplada de un ensayo de almidón con un fotómetro (de Kontron) a una longitud de onda de 340 nm de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Boehringer Mannheim).

El tampón de reacción contiene:

100

mM de MOPS, de pH 7,5

10

mM de MgCl_{2}

2

mM de EDTA

0,25

mM de NADP

1

mM de ATP

1

U/ml de glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa

2

U/ml de hexocinasa

La medición se efectuó a 25ºC con 10 \mul de una solución de glucosa.

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(d) Determinación del contenido de glucosa-6-fosfato

Con el fin de determinar el contenido de moléculas de glucosa fosforiladas en la posición C-6, se emplearon iguales cantidades de sustancia de glucosa de los diferentes cultivos de bacterias. Por adición de volúmenes iguales de KOH 0,7 N a los glicógenos degradados para dar sus moléculas de glucosa mediante una hidrólisis con un ácido (véase más arriba), se neutralizó la solución.

El tampón para reacción contiene:

100

mM de MOPS, de pH 7,5

10

mM de MgCl_{2}

2

mM de EDTA

0,25

mM de NADP

2

U/ml de glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa

La medición se efectuó a 25ºC con 100 a 150 \mul de una solución de glucosa.

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(e) Identificación de una actividad de enzima que fosforila a un glicógeno bacteriano

Los resultados de la determinación del contenido de fosfato del glicógeno sintetizado en las células de bacterias, muestran que el glicógeno de las células de E. coli, que habían sido transformadas con los plásmidos pACAC + pRL2, presenta una fosforilación aumentada hasta en 290 \pm 25% en la posición C-6 de la glucosa, en comparación con la mezcla de reacción testigo (células de E. coli transformadas con el plásmido pACYC) (véase la siguiente tabla).

Células de E. coli

Glucosa-6-fosfato: glucosa en el glicógeno

K1 de E. coli

1:(4.600 \pm 1.150)

K2 de E. coli

1:(1.570 \pm 390)

Los grados de fosforilación aquí indicados son los valores medios en cada caso de 6 mediciones partiendo de 6 transformaciones y aislamientos de glicógeno independientes.

Ejemplo 10 Integración del plásmido p35S-anti-RL en combinación con el plásmido p35SH-anti-BE en el genoma de plantas de patata

El plásmido p35S-anti-RL fue construido tal como se ha descrito en el Ejemplo 6. El plásmido p35SH-anti-BE fue construido tal como se ha descrito en la solicitud de patente internacional WO 95/07355, Ejemplo 3. Ambos plásmidos fueron transferidos secuencialmente a plantas de patata, por medio de la transformación mediada por Agrobacterias, tal como antes se ha descrito. Para esta finalidad, en primer lugar, el plásmido p35SH-anti-BE fue transformado en plantas de patata. Se regeneraron plantas enteras y se seleccionaron en cuanto a una expresión disminuida del gen de la enzima de ramificación. A continuación, el plásmido p35S-anti-RL fue transformado en las plantas transgénicas, que ya muestran una expresión reducida de la enzima de ramificación. A partir de las células transformadas se regeneraron de nuevo plantas transgénicas, y las plantas transformadas se cultivaron en condiciones de invernadero. Analizando el ARN total en un análisis por transferencia de borrón del ARN en lo que se refiere a la desaparición del ADNc de la enzima de ramificación o del ADNc de RL de transcritos complementarios, se comprobó el éxito de la modificación genética de las plantas, en lo que se refiere a una expresión muy reducida tanto del gen de la enzima de ramificación así como también en lo que se refiere a una expresión grandemente reducida del gen de RL. Para esta finalidad, el ARN total se aisló a partir de hojas de plantas transformadas de acuerdo con los métodos que se han descrito, y subsiguientemente se separó por medio de una electroforesis en gel, se transfirió a una membrana, se hibridó con una sonda marcada radiactivamente, que muestra la secuencia indicada en Seq ID No. 1 o una parte de la misma, y a continuación se hibridó con una sonda marcada radiactivamente, que muestra la secuencia del ADNc de la enzima de ramificación (compárese el documento WO 92/14827, Ejemplo 1) o una parte de la misma. En aproximadamente un 5-10% de las plantas transformadas faltaban, en el análisis por transferencia de borrón de ARN, tanto la banda que indica el transcrito específico de la secuencia indicada en Seq ID No. 1 como también la banda que indica el transcrito específico del ADNc de la enzima de ramificación (compárese el documento WO 92/14827, Ejemplo 1). Estas plantas, que se designaron como plantas R4, se emplearon para el análisis de la calidad del almidón contenido en los tubérculos.

Ejemplo 11 Introducción del plásmido p33-anti-RL en combinación con el plásmido p33-anti-GBSSI en el genoma de plantas de patata

El plásmido p353-anti-RL fue construido tal como se ha descrito en el Ejemplo 7. El plásmido p33-anti-GBSSI fue construido de la siguiente manera:

El fragmento para DraI/DraI procedente de la región de promotor del gen B33 de la clase I de patatina procedente de Solanum tuberosum, que comprende los nucleótidos -1.512 hasta +14 (Rocha-Sosa y colaboradores, EMBO J. 8 (1989), 23-29) fue ligado en el sitio de corte con SmaI del plásmido pUC19. A partir del plásmido resultante, el fragmento de promotor se ligó en la región de poliengarzador del plásmido pBin19 (Bevan, Nucleic Acids Research 12 (1984), 8711-8721) como un fragmento para EcoRI/HindIII. A continuación, el fragmento para 3' EcoRI de 1.181 a 2.511 del gen de GBSSI de Solanum tuberosum (Hergersberg, tesis doctoral (1988) Universidad de Colonia) se ligó en el sitio de corte con EcoRI del plásmido resultante.

Ambos plásmidos fueron transferidos secuencialmente a plantas de patata por medio de una transformación mediada por Agrobacterias, tal como se describe en el Ejemplo 10. A partir de las células transformadas, se regeneraron plantas enteras, y las plantas transformadas se cultivaron en condiciones de invernadero. Analizando el ARN completo en un análisis por transferencia de borrón del ARN en lo que se refiere a la desaparición de los transcritos complementarios con los dos ADNc, se comprobó el éxito de la modificación genética de las plantas. Para esta finalidad, el ARN total se aisló a partir de tubérculos de plantas transformadas, de acuerdo con métodos clásicos, y subsiguientemente se separó sobre un gel de agarosa por medio de una electroforesis en gel, se transfirió a una membrana y se hibridó con una sonda marcada radiactivamente, que muestra la secuencia indicada en Seq ID No. 1 o una parte de la misma. Después de esto, la misma membrana se hibridó con una sonda marcada radiactivamente, que tiene la secuencia del gen de GBSSI o una parte de esta secuencia (Hergersberg, tesis doctoral (1988) Universidad de Colonia). En aproximadamente un 5-0% de las plantas transformadas faltaba, en el análisis por transferencia de borrón de ARN, la banda que indica los transcritos, que se hibridan con el ADNc conforme al invento o bien con el ADNc de GBSSI. A partir de los tubérculos de estas plantas, que se designaron como plantas R3, se aisló el almidón y se analizó.

Ejemplo 12 Análisis del almidón de las plantas R4

Las plantas de patata transformadas de acuerdo con el Ejemplo 10 se examinaron en lo que se refiere a las propiedades del almidón sintetizado. Los análisis se llevaron a cabo con diferentes linajes de las plantas de patata, que habían sido transformadas con los plásmidos p35S-anti-RL y p35SH-anti-BE, y que en un análisis por transferencia de borrón de ARN ya no muestran - o las muestran en forma extremadamente reducida - las bandas que indican a transcritos que se hibridan con las secuencias de ADN conformes al invento o con las secuencia del ADNc de ramificación.

a) Determinación de la viscosidad de soluciones acuosas del almidón

Con el fin de determinar la viscosidad de las soluciones acuosas del almidón sintetizado en plantas de patata transformadas, se aisló almidón a partir de tubérculos de plantas, que habían sido transformadas con el plásmido p35S-anti-RL y con el plásmido p35SH-anti-BE. Se disolvieron en cada caso 2 g de almidón en 25 ml de H_{2}O y se usaron para un análisis con un analizador Rapid Visco Analysers (Newport Scientific Pty Ltd, Investment Support Group, Warriewood NSW 2102, Australia). El equipo se usó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Con el fin de determinar la viscosidad de la solución acuosa del almidón, la suspensión de almidón se calentó primeramente desde 50ºC hasta 95ºC con una velocidad de 12ºC por min. La temperatura se mantuvo luego a 95ºC durante 2,5 minutos. Después de esto, la solución se enfrió desde 95ºC hasta 50ºC con una velocidad de 12ºC por min. Durante todo el proceso, se midió la viscosidad. Resultados representativos de tales mediciones se reproducen en forma de unas gráficos, en los que se representa la viscosidad en función del tiempo. La Figura 6 muestra un típico gráfico de RVA para un almidón que había sido aislado a partir de plantas de tipo salvaje de patata de la variedad Désirée. Las líneas 2 y 3 muestran respectivamente un típico gráfico de RVA para un almidón que se había aislado a partir de los tubérculos de plantas que habían sido transformadas con el plásmido p35SH-anti-BE y con el plásmido p35S-anti-RL. La línea 4 muestra un típico gráfico de RVA para un almidón que se había aislado a partir de los tubérculos de plantas, que habían sido transformadas con el plásmido p35SH-anti-BE en combinación con el plásmido p35S-anti-RL. La línea 4 se caracteriza porque no hay ningún aumento de la viscosidad en función de la temperatura.

(b) Determinación de la relación de amilosa a amilopectina

Un almidón que se había aislado a partir de los tubérculos de plantas de patata transformadas, se examinó en cuanto a la relación de amilosa a amilopectina. El linaje R4-1 de plantas (mostrado en la línea 4 de la Figura 6) presentaba un contenido de amilosa de más de 70%. Para el linaje R4-3 de plantas se midió un valor de amilosa de 27%, mientras que el contenido de amilosa en un almidón de tipo salvaje de la variedad Désirée está situado entre 19 y 22%.

Ejemplo 13 Análisis del almidón de las plantas R3

Las plantas de patata transformadas de acuerdo con el Ejemplo 11, se examinaron en lo que se refiere a las propiedades de los almidones sintetizados. Los análisis se llevaron a cabo con diferentes linajes de plantas de patata, que habían sido transformados con los dos plásmidos pB33-anti-RL y pB33-anti-GBSS,I y que en el análisis de transferencia de borrón de ARN ya no tenían - o las tenían de forma extremadamente reducida - las bandas que indican a transcritos, que se hibridan con las secuencias de ADN conformes al invento o con las secuencias del ADNc de GBSSI.

a) Determinación de la viscosidad de soluciones acuosas del almidón

Con el fin de determinar la viscosidad de las soluciones acuosas del almidón sintetizado en plantas de patata transformadas, se aisló un almidón a partir de tubérculos de plantas que habían sido transformadas con el plásmido pB33-anti- RL en combinación con el plásmido pB33-anti-GBSSI. La viscosidad se determinó por medio de un analizador Rapid Visco Analysers de acuerdo con el método que se ha descrito en el Ejemplo 12, parte a. Los resultados están representados en la Figura 7. La Figura 7 muestra en la línea 1 un típico gráfico de RVA para un almidón que había sido aislado a partir de las plantas de tipo salvaje de la variedad de patata Désirée. Las líneas 2 y 3 muestran típicos gráficos de RVA para almidones, que habían sido aislados a partir de plantas de patata que habían sido transformadas con el plásmido pB33-anti-GBSSI y con el plásmido p35S-anti-RL. La línea 4 muestra un típico gráfico de RVA para un almidón, que había sido aislado a partir de las plantas de patata que habían sido transformadas con el plásmido pB33-anti-GBSSI en combinación con el plásmido pB33-anti-RL. Este gráfico se caracteriza porque faltan el máximo de viscosidad y el aumento de la viscosidad a 50ºC. Además, este almidón se caracteriza porque la cola obtenida después de un tratamiento con RVA no tiene prácticamente ninguna retrogradación después de haber incubado durante varios días a la temperatura ambiente.

b) Determinación de la relación de amilosa a amilopectina

Un almidón que se había aislado a partir de los tubérculos de plantas de patata transformadas, se examinó en cuanto a la relación de amilosa a amilopectina. El linaje R3-5 de plantas (mostrado en la línea 4 de la Figura 7) presentó un contenido de amilosa de menos que 4%. Para el linaje R3-6 de plantas se midió un contenido de amilosa de menos que 3%. El contenido de amilosa en un almidón de tipo salvaje de la variedad Désirée está situado entre 19 y 22%.

c) Determinación del contenido de fosfato del almidón

El contenido de fosfato del almidón se determinó midiendo la cantidad de fosfato, que se había fijado a la posición C-6 de los radicales de glucosa. Con esta finalidad, el almidón fue degradado primeramente por hidrólisis con un ácido y a continuación se determinó el contenido de glucosa-6-fosfato mediante un ensayo con una enzima, tal como se describe a continuación.

100 mg de un almidón se incubaron a 100ºC durante 4 h en 500 \mul de HCl 0,7 N.

Después de una hidrólisis con un ácido se añadieron 10 \mul de la mezcla de reacción a 600 \mul de un tampón de imidazol (100 mM de imidazol, 5 mM de MgCl_{2}, de pH 6,9, 0,4 mM de NAD^{+}). La cantidad de glucosa-6-fosfato en la mezcla de reacción se determinó mediante conversión con la enzima glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa. Con esta finalidad, a la mezcla de reacción se le añadió 1 U de glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (procedente de Leuconostoc mesenteroides (de Boehringer Mannheim)) y se determinó la cantidad de NADH producido midiendo la absorción a 340 nm.

El contenido de glucosa-6-fosfato de 1 mg de almidón se indica en la siguiente tabla para plantas de patata de la variedad Désirée no transformadas así como para los linajes R3-5 y R3-6 de plantas de patata transgénicas, que habían sido transformadas con el plásmido pB33-anti-RL, en combinación con el plásmido pB33-anti-GBSSI. Como comparación, se indica también el valor para el almidón procedente de la denominada patata cerosa (US2-10), que había sido transformada con el plásmido pB33-anti-GBSSI.

TABLA 7

7

Ejemplo 14 Aislamiento de una secuencia de ADNc que codifica una enzima R1 procedente de Zea mays

Bacterias de la cepa XL1-Blue fueron infectadas con fagos lambda, cuyas cabezas de fagos contenían una biblioteca de ADNc de tejido de endospermo procedente de Zea mays (de Stratagene, Heidelberg). Las células infectadas de E. coli se extendieron sobre un medio en cápsulas de Petri con una densidad de alrededor de 25.000 placas por aproximadamente 75 cm^{2}. Después de alrededor de 9 horas de incubación, se colocaron filtros de nitrocelulosa sobre las bacterias lisadas y se sacaron después de un minuto. El filtro se incubó primeramente en NaOH 0,5 M y NaCl 1,5 M durante dos minutos, y luego en Tris HCl 0,5 M de pH 7,0 durante dos minutos y subsiguientemente se lavó en 2x SSC durante dos minutos. Después de haber secado y fijada mediante reticulación por UV, los filtros fueron incubados en un tampón A durante 3 horas antes de que se añadiese una sonda de ADN marcada radiactivamente (cebado aleatorio). Se usó como sonda un fragmento de la inserción de ADN del plásmido pRL2 (véanse los Ejemplos 4 y 5) con un tamaño de aproximadamente 2,7. Este fragmento fue cortado con las enzimas de restricción XhoI y HindIII y representaba el extremo 3' de la inserción de ADNc en pRL2 (véase la Figura 8).

Después de hibridar durante 12 horas a 48ºC, los filtros se lavaron durante 1 x 10 minutos en 2x SSC/1% de SDS a la temperatura ambiente y luego durante 2 x 20 minutos en 1x SSC/0,5% de SDS a 35ºC y subsiguientemente se autorradiografiaron.

Los clones de fagos que comprendían una inserción de ADNc se aislaron individualmente en tres ciclos de escrutinio. De esta manera, cuando se hubieron escrutado aproximadamente 1.500.000 de placas de fagos, se identificaron aproximadamente 6 placas.

Estos clones de fagos positivos se usaron para la excisión in vivo de un plásmido pBluescript de acuerdo con métodos clásicos. Las secuencias de ADN de las correspondientes inserciones se determinaron de acuerdo con el método de Sanger y colaboradores (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467). De esta manera, se podría identificar un cierto número de clones que contienen inserciones que codifican una enzima R1 procedente de maíz. Se determinó completamente la inserción de ADNc de un clon apropiado, el R1M. La secuencia de ácido nucleico (nucleótidos) se indica en Seq ID No. 5. La secuencia de aminoácidos derivada a partir de ella se indica en Seq ID No. 6. Una apropiada inserción de ADNc del clon R1 M se aisló a partir del derivado de pBluescript por corte con NotI y XhoI mediante métodos clásicos (Sambrook y colaboradores 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EE.UU.). Los extremos pegajosos fueron rellenados y el fragmento fue insertado en el vector pUBlbar junto al sitio HpaI. Este plásmido se puede usar para transformar células de plantas, particularmente de maíz, de acuerdo con los métodos arriba descritos. Puesto que la secuencia descrita en Seq ID No. 5 representa solamente una secuencia parcial de ADNc, se aplicaron técnicas adicionales para aislar secuencias que representan el extremo 5' del ADNc. Para esta finalidad, se aisló el ARN poliA^{+} con métodos clásicos. El ARN aislado se usó para una reacción en cadena de la polimerasa usando el sistema de RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa) de un tubo Titan® (de Boehringer Mannheim, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En esta reacción, el ARN es transcrito en una primera etapa para dar un ADNc, que luego se usa como molde para la PCR. Como cebadores se usaron los siguientes oligonucleótidos:

Cebador 1 (Seq ID No.9):

5' GCAAAGTTTT CAAGGACAAG ACTGATGAAG 3'

Cebador 2 (Seq ID No. 10):

5' CCAGATGGCA CGACAGTGTA CAAGAACA 3'

y

Cebador 6 (Seq ID No. 11).

5' AATGACTGCA AAGGIGGIAT GATGGA 3'

La combinación de cebadores 1 y 6 condujo a un fragmento de 560 pb. La combinación de cebadores 1 y 2 condujo a un fragmento de PCR de 2.289 pb. Ambos fragmentos fueron secuenciados. La secuencia obtenida representa a la mayor parte del extremo 5' del ADNc. La secuencia completa del clon de ADN parcial y las secuencias obtenidas por PCR, como se han descrito más arriba, se indican en Seq ID No. 7. La secuencia de aminoácidos, derivada a partir de ella, se indica en Seq ID No. 8.

Una comparación con el ADNc de plena longitud de patata reveló que la secuencia obtenida, probablemente no está todavía completa y que falta alrededor de 420 pb del extremo 5'. Esta secuencia que falta puede ser completada por métodos bien conocidos para la persona experta en la especialidad. Es posible, por ejemplo, aislar el extremo 5' del ADNc usando el método de 5'-RACE (de rapid amplification of cDNA ends = amplificación rápida de extremos de ADNc). Con este método, un extremo 5' desconocido de un ADNc puede ser amplificado por una PCR. Este método se usa normalmente para producir un ADNc que, en comparación con un ADNc conocido, está prolongado en el extremo 5'. Con el fin de aplicar el método de 5'RACE, se puede usar, p.ej., el estuche de amplificación de ADNc Marathon (de Clontech).

Otras posibilidades de aislar el ADNc completo son las de usar PCR's adicionales usando, por ejemplo, una biblioteca de ADNc lambda ZAP de maíz (de Stratagene), escrutinio inmunológico de bibliotecas de expresión o el uso de métodos clásicos de hibridación.

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\vskip1.000000\baselineskip

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: PlantTec Biotechnologie GmbH Forschung&Entwicklung

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

DIRECCIÓN DE CALLE: Hermannswerder 14

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Potsdam

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAIS: DE (Alemania)

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 14473

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DEL INVENTO: Nuevas moléculas de ácidos nucleicos procedentes de maíz y su uso para la producción de un almidón modificado

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE LAS SECUENCIAS: 11

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

REDACCIÓN LEGIBLE POR ORDENADOR

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

SOPORTE DE DATOS: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.30 (EPA)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID N: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4.856 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: Cadena única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc para ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Solanum tuberosum

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: C.V. Berolina

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 105 ... 4497

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

10

11

12

13

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1.464 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: Proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

16

17

18

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID N: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1.918 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: Cadena única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc para ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Solanum tuberosum

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: C.V. Désirée

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1 ... 1555

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

21

22

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 518 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: Proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

24

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2.307 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: Cadena única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc para ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Zea mays

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 33 ... 1943

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

27

28

29

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 637 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: Proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

31

32

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4.329 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: Cadena única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc para ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Zea mays

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 2... 4009

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

34

35

36

37

38

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1.336 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: Proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

40

41

42

43

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: Cadena única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCAAAGTTTT CAAGGACAAG ACTGATGAAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: Cadena única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCAGATGGCA CGACAGTGTA CAAGAACA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 11:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

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(C)

FORMA DE CADENA: Cadena única

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(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

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(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

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(iii)

HIPOTÉTICO: SI

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(iv)

ANTISENTIDO: NO

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(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B)

SITUACIÓN: 15

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /base_modificada

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B)

SITUACIÓN: 18

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /base_modificada

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATGACTGCA AAGGGGGGAT GATGGA

\hfill

Claims (32)

1. Una molécula de ácido nucleico, que codifica una proteína procedente de maíz, que está presente en células de plantas tanto en una forma unida a granos de almidón como también en forma soluble, conduciendo dicha molécula de ácido nucleico a una reducción del contenido de fosfato del almidón sintetizado en células de plantas cuando se expresa como un ARN de cosupresión en células de plantas, y estando seleccionada entre el conjunto que consiste
en:

(a)

moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en Seq ID No: 6 o en Seq ID No: 8;

(b)

moléculas de ácidos nucleicos, que comprenden la región codificadora de la secuencia de nucleótidos indicada en Seq ID No: 5 o en Seq ID No: 7;

(c)

moléculas de ácidos nucleicos, cuya secuencia muestra una identidad entre secuencias por lo menos de un 80% con la secuencia de una molécula de ácido nucleico indicada bajo (a) o (b);

(d)

moléculas de ácidos nucleicos, cuya secuencia difiere de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (c) debido a la degeneración del código genético;

así como la respectiva cadena complementaria de dicha molécula de ácido nucleico.

2. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1(c), en la que la identidad entre secuencias es por lo menos de un 90%.

3. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1(c), en la que la identidad entre secuencias es por lo menos de un 95%.

4. Un vector que contiene una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. El vector de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la molécula de ácido nucleico está unida a elementos reguladores que garantizan la transcripción en células eucarióticas y procarióticas.

6. Una célula anfitriona que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que está unida a elementos reguladores heterólogos, que garantizan la transcripción en células de plantas o que comprenden un vector de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5.

7. La célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 6, que es una célula de planta transgénica.

8. Una planta que contiene la célula de planta de acuerdo con la reivindicación 7.

9. Un procedimiento para la producción de un almidón modificado que comprende la operación de extraer el almidón a partir de plantas de acuerdo con la reivindicación 8 y/o a partir de partes que almacenan almidón de dichas plantas.

10. Un método para la producción de una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que una célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 6 es cultivada y expresa dicha proteína, y en el que dicha proteína es aislada a partir de las células y/o del medio de
cultivo.

11. Una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, o que es obtenible mediante el método de acuerdo con la reivindicación 10.

12. Un anticuerpo que reconoce específicamente a la proteína de acuerdo con la reivindicación 11.

13. Una molécula de ADN que codifica un ARN antisentido, que causa un efecto antisentido durante la transcripción en células de plantas y que es complementario con los transcritos de una molécula de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

14. La molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 13, en la que el ARN antisentido codificado tiene una longitud mínima seleccionada entre el conjunto que consiste en 15 nucleótidos, 100 nucleótidos y 500 nucleóti-
dos.

15. Una molécula de ADN que codifica un ARN con actividad de ribozima que disocia específicamente a transcritos de una molécula de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

16. Una molécula de ADN que codifica un ARN que es homólogo con respecto a un transcrito de una molécula de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y que, después de una expresión en una célula de planta, conduce a una reducción de la expresión de una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 debido a un efecto de cosupresión.

17. Un vector que contiene una molécula de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16.

18. El vector de acuerdo con la reivindicación 17, en el que la molécula de ADN está combinada con elementos de ADN reguladores que garantizan la transcripción en células de plantas.

19. Una célula anfitriona que contiene una molécula de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 o un vector de acuerdo con la reivindicación 17 ó 18.

20. Una célula de planta transgénica que contiene una molécula de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 en combinación con elementos de ADN reguladores que garantizan la transcripción en células de plantas.

21. La planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 20, en la que la actividad de por lo menos una enzima adicional, seleccionada entre el conjunto que consiste en una enzima de ramificación y en una sintasa de almidón unida a granos de almidón del isotipo I (GBSS I), es reducida cuando se compara con la de plantas no transformadas.

22. Una planta transgénica que contiene una célula de planta de acuerdo con la reivindicación 20 ó 21.

23. Una molécula de ARN obtenible por transcripción de una molécula de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16.

24. Un método para la producción de células de plantas transgénicas que sintetizan un almidón modificado, caracterizado porque la cantidad de proteínas de acuerdo con la reivindicación 11, que son sintetizadas en las células en una forma endógena, es reducida en las células, y en que la reducción es causada

(i)

por un efecto antisentido debido a la expresión de una molécula de ADN de la reivindicación 13 ó 14; o

(ii)

por un efecto de ribozima debido a la expresión de una molécula de ADN de la reivindicación 15; o

(iii)

por un efecto de cosupresión debido a la expresión de una molécula de ADN de la reivindicación 16,

comprendiendo dicho método la operación de introducir en células de plantas una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 13, 14, 15 ó 16, en que dicha molécula de ADN está unida a elementos de ADN que garantizan la transcripción en células de plantas.

25. El método de acuerdo con la reivindicación 24, en el que la actividad enzimática de por lo menos una enzima adicional seleccionada entre el conjunto que consiste en una enzima de ramificación y en una sintasa de almidón unida a granos de almidón del isotipo I (GBSS I), es reducida.

26. Una célula de planta transgénica, que comprende

(a)

una molécula de ADN, que codifica un ARN antisentido, que causa un efecto antisentido durante la transcripción en células de plantas yque es complementario con los transcritos de una molécula de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; o

(b)

una molécula de ADN, que codifica un ARN con actividad de ribozima, que disocia específicamente a transcritos de una molécula de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; o

(c)

una molécula de ADN, que codifica un ARN que es homólogo con respecto a un transcrito de una molécula de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y que después de una expresión en una célula de planta conduce a una reducción de la expresión de una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 debido a un efecto de cosupresión,

en la que dicha molécula de ADN está unida a elementos de ADN que garantizan la transcripción en células de plantas.

27. Una planta transgénica que contiene células de plantas de acuerdo con la reivindicación 26.

28. Un procedimiento para la producción de un almidón modificado, que comprende la operación de extraer el almidón a partir de la planta de acuerdo con la reivindicación 22 ó 27 y/o a partir de una parte que almacena almidón de dicha planta.

29. Material de propagación de plantas de acuerdo con la reivindicación 8, que contiene células de plantas de acuerdo con la reivindicación 7.

30. El material de propagación de acuerdo con la reivindicación 22 ó 27, que contiene células de plantas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 ó 21 o con la reivindicación 26.

31. La planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 22 ó 27, que es una planta de maíz.

32. Semillas de una planta de maíz de acuerdo con la reivindicación 31, que contiene células de plantas de acuerdo con la reivindicación 20 o de acuerdo con la reivindicación 26.