PT950107E

PT950107E - Novas moléculas de ácidos nucleicos provenientes de milho e a sua utilização para a produção de amido modificado

Info

Publication number: PT950107E
Application number: PT97954424T
Authority: PT
Inventors: Jens Kossmann; Michael Emmermann
Original assignee: Bayer Bioscience Gmbh
Priority date: 1996-12-19
Filing date: 1997-12-18
Publication date: 2007-05-31
Also published as: AU5857798A; DE69737507D1; DE69737507T2; ES2280086T3; WO1998027212A1; EP0950107A1; JP2001522223A; JP4098365B2; AU740492B2; AU740492C; US7186898B1; EP0950107B1; CA2272844A1; CA2272844C; DE19653176A1; ATE357522T1

Description

DESCRIÇÃO

NOVAS MOLÉCULAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS PROVENIENTES DE MILHO E A SUA UTILIZAÇÃO PARA A PRODUÇÃO DE AMIDO

MODIFICADO A presente invenção tem por objecto moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína ligada aos grânulos de amido de milho assim como processos e moléculas de ADN recombinante para a produção de células de plantas transgénicas e de plantas que sintetizam um amido modificado. A presente invenção também tem por objecto as plantas e as células de plantas transgénicas que resultam desses processos e um processo para a produção de um amido modificado que compreende a etapa de extracção da referida planta e/ou a partir de uma parte que armazena amido no amido dessa planta. 0 amido de polissacárido, que constitui uma das substâncias de armazenagem mais importantes nas plantas não se utiliza apenas na área dos alimentos, mas também desempenha um papel significativo como um material de regeneração na produção de produtos industriais. Para tornar possível a utilização desta matéria-prima em tantas áreas quantas as possíveis, é necessário obter uma grande variedade de substâncias assim como adaptar essas substâncias aos vários requisitos da indústria do processo.

Embora o amido consista num componente básico, homogéneo sob o ponto de vista químico, nomeadamente a glicose, não constitui uma matéria-prima homogénea. É uma mistura bastante complexa de vários tipos de moléculas que diferem umas das outras no seu grau de polimerização e no grau de ramificação das cadeias de glicose. Diferencia-se particularmente entre 1 amido-amilose, um polímero basicamente não ramificado constituído por moléculas de glicose ramificadas de forma a-1,4-glicosídica e amido-amilopectina que, por sua vez, é uma mistura de cadeias de glicose mais ou menos altamente ramificadas. A ramificação resulta da ocorrência de interligações a-1,6-glicosídicas. A estrutura molecular do amido que é determinada principalmente pelo seu grau de ramificação, a relação amilose/amilopectina, o comprimento médio da cadeia e a ocorrência de grupos de fosfato é significativa para as propriedades funcionais importantes do amido ou, respectivamente, das suas soluções aquosas. As propriedades funcionais importantes são, por exemplo, a solubilidade do amido, a tendência para retrogradar, a capacidade de formação de filmes, a viscosidade, as propriedades de formação de pasta, isto é, as propriedades de ligação e de colagem, assim como a resistência ao frio. A dimensão do grânulo de amido pode também ser significativa em várias utilizações. A produção de amido com um teor elevado de amilose é particularmente significativa. Além disso, o amido modificado contido nas células de plantas pode, em certas condições, alterar favoravelmente o comportamento da célula da planta. Por exemplo, seria possível diminuir a degradação do amido durante a armazenagem dos órgãos contendo amido tal como sementes e tubérculos, antes do seu posterior tratamento por meio de, por exemplo, extracção do amido. Além disso, hã algum interesse na produção de amidos modificados que tornarão as células das plantas e os órgãos das plantas que contêm este amido, mais apropriados para posterior tratamento, tal como para a produção de pipocas ou de corn flakes a partir de milho ou de batatas fritas, batatas onduladas ou pó de batata a partir de batatas. Há um interesse particular na melhoria dos amidos de tal modo que 2 eles exibam um "adoçamento a frio" (cold sweetening) reduzido, isto é, uma menor libertação dos açúcares reduzidos {especialmente glicose) durante uma armazenagem de longo prazo, a baixas temperaturas. 0 amido que pode ser isolado das plantas é muitas vezes adaptado a certos fins industriais por meio de modificações químicas que são normalmente consumidoras de tempo e caras. Por isso, é desejável encontrar possibilidades para produzir plantas que sintetizem um amido cujas propriedades jã cumprem os requisitos da indústria transformadora.

Os processos convencionais para a produção dessas plantas são processos clássicos de criação e de produção de mutantes. Assim, por exemplo, produziu-se um mutante a partir de amido sintetizado do milho, com uma viscosidade alterada (descrição da patente de invenção norte-americana U.S. No. 5.331.108) e estabeleceu-se uma variedade de milho (milho ceroso - waxi maize) por meio da criação de amido que consiste em quase 100 % de amilopectina (Akasuka e Nelson, J. Biol. Chem. 241 (1966), 2280-2285). Além disso, jã se descreveram mutantes de milho e de ervilha que sintetizam amidos com um elevado teor de amilose (70 % no milho e até 50 % nas ervilhas). Estes mutantes até agora não foram caracterizados ao nível molecular e, por isso, não permitem a produção dos mutantes correspondentes noutras plantas que armazenam amido.

Alternativamente, as plantas que sintetizam amido com propriedades alteradas podem ser produzidas por meio de técnicas de ADN recombinante. Em vários casos, por exemplo, a modificação recombinante de plantas de batata que levam a uma alteração do amido sintetizado nessas plantas já foi descrita (por exemplo, patentes de invenção WO 92/11376; WO 92/14827). 3

Contudo, para utilizar as técnicas de ADN recombinante, são necessárias sequências de ADN cujos produtos dos genes influenciam a síntese do amido, a modificação do amido ou a degradação do amido.

Por isso, o problema subjacente à presente invenção, consiste em providenciar moléculas de ácidos nucleicos e processos que permitem a alteração de plantas de tal modo que elas sintetizem um amido que difere do amido sintetizado naturalmente em plantas, no que respeita às suas propriedades físicas e/ou químicas e é por isso mais apropriado para as utilizações gerais e/ou particulares.

Este problema tem sido resolvido por meio dos enquadramentos descritos nas presentes reivindicações.

Por isso, a presente invenção tem por objecto moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos indicada na Seq ID n° 6 ou na Seq ID n° 8. Essas proteínas estão presentes nos plastidos das células de plantas, ligadas aos grânulos de amido, assim como na forma livre, isto é, na forma solúvel. A presente invenção tem ainda por objecto moléculas de ácido nucleico que compreendem uma sequência com a sequência de nucleótidos indicada na Seq ID n° 5 ou na Seq ID n° 7, particularmente a região de codificação indicada na Seq ID n° 5 ou na Seq ID n° 7.

As moléculas de ácidos nucleico que codificam uma proteína da milho, a qual, nos plastidos das células, está parcialmente ligada aos grânulos e que hidridam com as moléculas de ácidos nucleicos mencionadas antes na presente invenção ou a sua estrutura helicoidal complementar são 4 também matéria da presente invenção. Neste contexto, o termo "hibridação" significa a hibridação em condições de hibridação convencionais, preferencialmente em condições severas, tal como descrito, por exemplo, em Sambrook et al.( Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2 a Edição (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Mais preferencialmente, a hibridação ocorre nas seguintes condições:

Tampão de 2 x SCC; 10 x solução de Denhard (Fikoll 400 hibridação + PEG + ASB; relação 1:1:1); SDS a 0,1 %; EDTA 5 mM; Na2HP04 50 mM; 50 yg/mL de ARNt; ou tampão de fosfato de sódio 0,25 M a pH 7,2 EDTA 1 mM SDS a 7 % Temperatura de T = 65 + 68 °C hibridação Tampão de 0,2 x SCC; SDS a 0,1 % lavagem Temperatura de T = 40 a 68 °C lavagem

As moléculas de ácido nucleico que hibridizam com as moléculas de acordo com a presente invenção podem se isoladas, por exemplo, a partir de bibliotecas de ADNc ou genómico produzidas a partir de células ou tecido de milho. A identificação e o isolamento dessas moléculas de ácido nucleico podem ter lugar utilizando moléculas de acordo com a presente invenção ou partes dessas moléculas ou, se for caso disso, as estruturas helicoidais complemetares reversas 5 destas moléculas, por exemplo, por hibridação de acordo com processos normalizados (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.),

Como uma sonda de hibridação, pode utilizar-se, por exemplo, moléculas de ácido nucleico que contêm exactamente ou basicamente a sequência de nucleótidos indicada na Seq ID N° 5 ou na Seq ID n° 7 ou em partes delas. Os fragmentos de ADN utilizados como sonda de hibridação podem também ser fragmentos de ADN sintéticos que foram produzidos por meio de processos de sintetização ADN comuns e cuja sequência é praticamente idêntica à da molécula de ácido nucleico da presente invenção. Depois da identificação e do isolamento dos genes de hibridação com as sequências de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção, a sequência tem de ser determinada e as propriedades das proteínas codificadas por esta sequência têm de ser analisadas.

Essas moléculas de ácidos nucleicos que hibridam também englobam fragmentos, derivados e variantes alélicas das moléculas de ácidos nucleicos mencionadas antes, que codificam a proteína mencionada antes. Neste contexto, descrevem-se fragmentos que são partes das moléculas de ácidos nucleicos que são suficientemente longas de modo a codificarem a proteína descrita antes. Neste contexto, o termo derivado significa que as sequências destas moléculas diferem das sequências das moléculas de ácidos nucleicos mencionadas antes em uma ou mais posições e exibem um elevado grau de homologia com as sequências destas moléculas. Aqui, homologia significa uma identidade da sequência de pelo menos 80 % e ainda mais preferencialmente uma identidade de sequências de mais do que 90 % e ainda particularmente preferida mais do que 95 %. Os desvios que ocorrem quando se 6 comparam as moléculas de ácidos nucleicos descritas antes podem ter sido causados por adição, eliminação, substituição, inserção ou recombinação.

Além disso, homología significa que existe equivalência funcional e/ou estrutural entre as respectivas moléculas de ácidos nucleicos ou as proteínas que elas codificam. As moléculas de ácidos nucleicos, que são homólogas das moléculas de ácidos nucleicos descritas antes e representam derivados destas moléculas, são geralmente variações das moléculas de ácidos nucleicos que constituem modificações que exercem a mesma função biológica. Estas variações podem ser variações ou mutações que ocorrem naturalmente, em que estas mutações podem ter ocorrido naturalmente ou podem ter sido introduzidas deliberadamente. Além disso, as variações podem ser sequências produzidas sinteticamente.

As variantes alélicas podem ser variantes que ocorrem tanto naturalmente assim como podem ser produzidas sinteticamente ou podem ser variantes produzidas por técnicas de ADN recombinante.

As proteínas codificadas pelas várias variantes das moléculas de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção exibem certas características comuns. A actividade da enzima, o peso molecular, a reactividade imunológica, a conformação, etc., podem pertencer a estas características, assim como propriedades físicas tal como a mobilidade em gel de electroforese, características cromatográficas, coeficientes de sedimentação, solubilidade, propriedades espectros-cópicas, estabilidade, pH óptimo, temperatura óptima, etc.

Além disso, a presente invenção tem por objecto moléculas de ácidos nucleicos cujas sequências, comparadas 7 com as sequências das moléculas mencionadas antes, são degeneradas devido ao código genético e que codificam uma proteína que está presente nos plastidos das células da planta, parcialmente ligadas aos grânulos e parcialmente sob a forma livre, isto é, numa forma solúvel.

As moléculas de ácido nucleicos da presente invenção podem ser isoladas, por exemplo, de fontes naturais, produzidas por processos de engenharia genética, por exemplo, por RCP (reacção em cadeia de polimerase) ou produzidas por meio de processos de síntese conhecidos pelos especialistas na matéria.

As moléculas de ácido nucleico da presente invenção podem ser moléculas de ADN, tal como ADNc ou ADN genómico, assim como moléculas de ARN.

Além disso, a presente invenção tem por objecto vectores, em particular plasmidos, cosmidos, vírus, bacteriófagos e outros vectores comuns na engenharia genética, que contêm as moléculas de ácido nucleico da presente invenção mencionadas antes.

Num enquadramento preferido, as moléculas de ácido nucleico contidas nos vectores estão ligadas a elementos reguladores que asseguram a transcrição e a síntese de um ARN traduzível em células procarióticas e eucarióticas.

Num outro enquadramento, a presente invenção tem por objecto células hospedeiras, em particular células procarióticas ou eucarióticas, que tenham sido transformadas e/ou manipuladas de forma recombinante por meio de uma das moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção mencionadas antes ou por meio de um vector da presente 8 invenção, assim como as células derivadas dessas células e que contêm uma molécula de ácido nucleico da presente invenção ou um vector da presente invenção. Preferencialmente são células de bactérias ou células de plantas.

Verificou-se agora que a proteína codificada pelas moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção influencia a síntese ou a modificação do amido e que altera a quantidade de proteína nas células das plantas conduzindo a alterações no metabolismo do amido da planta, em particular na síntese de amido com propriedades físicas e químicas modificadas.

Providenciando as moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção, é assim possível produzir plantas por meio de técnicas de ADN recombinante que sintetizam um amido modificado que difere do amido sintetizado em plantas de tipo selvagem, no que respeita à sua estrutura e às suas propriedades físicas e químicas. Com esta finalidade, as moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção estão ligadas a elementos reguladores que asseguram a transcrição e translação em células de plantas e são introduzidas nas células de plantas.

Por isso, a presente invenção também tem por objecto células de plantas transgénicas que contêm uma molécula de ácido nucleico da presente invenção, em que a mesma está ligada a elementos reguladores que asseguram a transcrição em células de plantas. Os elementos reguladores são preferencialmente heterólogos no que respeita à molécula de ácido nucleico.

Essas células de plantas da presente invenção diferem das de plantas que ocorrem naturalmente, entre outras coisas pelo facto de pelo menos uma cópia da molécula de ácido 9 nucleico da presente invenção estar integrada no seu genoma, possivelmente para além das cópias de ocorrência natural. Além disso, esta/estas cópia/cõpias adicionais é/são integradas numa localização do genoma onde não ocorrem naturalmente. Isto pode ser provado, por exemplo, por meio de uma análise de mancha de Southern. Além disso, essas células de plantas transgénicas podem distinguir-se, preferencialmente, a partir das células de plantas de ocorrência natural por meio de pelo menos uma das características seguintes: se a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção, que foi introduzida nas células de plantas, é heteróloga em relação às células da planta, as células transgénicas podem distinguir-se das células não transformadas devido à presença dos transcritos da molécula introduzida de acordo com a presente invenção. Esses transcritos podem ser detectados, por exemplo, por análise de mancha de Northern. Preferencialmente, as células transgénicas contêm, ainda, a proteína codificada pela molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. A presença da proteína pode ser detectada, por exemplo, por processos imunológicos tal como a análise de mancha de Southern.

Se a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção, que foi introduzida nas células de plantas, é homóloga em relação às células da planta, as células transgénicas podem distinguir-se das células não transformadas, por exemplo, devido à expressão adicional das moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Em particular, as células transgénicas contêm preferencialmente mais transcritos das moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Isto pode ser detectado, por exemplo, por análise de mancha de Northern. "Mais" preferencialmente significa pelo menos mais 10 %, mais 10 preferencialmente pelo menos mais 20 % e ainda mais preferencialmente, pelo menos mais 50 %. De acordo com isto, as células transgénicas contêm preferencialmente mais proteína de acordo com a presente invenção, em comparação com as células não transformadas. Isto pode ser detectado, por exemplo, por análise de mancha de Southern. Preferencialmente, as células contêm pelo menos mais 10 % de proteína de acordo com a presente invenção, mais preferencialmente pelo menos mais 20 % e ainda mais preferencialmente, pelo menos mais 50 %.

Por meio de processos conhecidos dos especialistas na matéria, as células de plantas transgénicas podem ser regeneradas e originar plantas inteiras. As plantas que se podem obter por regeneração de células de plantas transgénicas da presente invenção constituem também um dos objectos da presente invenção.

Um outro objecto da presente invenção são plantas que contêm as células de plantas transgénicas descritas antes. As plantas transgénicas podem, em princípio, ser plantas de qualquer espécie desejada, isto é, podem ser plantas monocotiledóneas assim como dicotiledóneas. Estas são plantas preferencialmente úteis, em particular plantas que sintetizam ou armazenam amido tal como cereais (tal como cevada, centeio, cevada, trigo, painço, sagu, etc.), milho, arroz, ervilhas, ervilhas espalmadas, mandioca, batata, tomate, óleo de semente de colza, soja, limho, fibra, girassol, feijão-frade e araruta. A presente invenção tem também por objecto um processo para a produção de amido modificado que compreende a etapa de extracção das plantas descritas antes de acordo com a presente invenção e/ou a partir de partes dessas plantas que 11 armazenam amido. Preferencialmente, esse processo compreende ainda as etapas de cultivo das plantas de acordo com a presente invenção e a colheita das plantas cultivadas e /ou de partes dessas plantas que armazenam amido antes da extracção do amido.

Os processos para a extracção do amido das plantas ou de partes dessas plantas que armazenam amido são bem conhecidos pelos especialistas na matéria. Os processos para extrair amido de sementes de milho estão descritos, por exemplo, em Eckhoff e tal. (Cereal Chem. 73 (1996), 54-57). A extracção do amido de milho a uma escala industrial consegue-se normalmenet por "moagem húmida". Além disso, os processos para a extracção do amido a partir de várias plantas que armazenam amido estão descritos, por exemplo, em Starch: Chemistry and Technology (eds.: Whistler, BeMiller e Paschall (1994) 2a edição, Academic Press Inc. Londres LTD; ISBN 0-12-746270-8; ver, por exemplo, capitlo XII, página 417-468: Corn and Sorghum Starches: Production; por Watson, S. A.; capitulo XIII, página 469-479: Tapioca, Arrowroot e Sago Atarches: Production; por Corbishley e Miller; capítulo XIV, página 479-490; Potato starch: production ans uses; por Mitch; capítulo XV, página 491-506: Wheat starch: production, modification and uses; por Knight e Olson; e capítulo XVI, página 507-528: Rice starch: production ans uses; por Rohwer e Klem). Os meios normalmente utilizados nos processos para a extracção de amidos de material de plantas são separadores, decantadores, hidroclones e diferentes tipos de máquinas para a secagem do amido, por exemplo, secadores de pulverização e secadores de jacto. A presente invenção também tem por objecto um processo para a produção de um amido modificado que compreende a etapa de extracção da planta da invenção e/ou de uma parte dessa planta que armazenam amido, tal como o amido da planta. Devido à expressão ou à expressão adicional de uma molécula de ácido nucleico da presente invenção, as células de plantas transgénicas e as plantas da presente invenção sintetizam um amido que está modificado, quando comparado com o amido de plantas de tipo selvagem, isto é, plantas não transformadas. Um teor de fosfato mais elevado significa, preferencialmente, que o amido contém pelo mais 10 % de fosfato, mais preferencialmente pelo menos 30 %, ainda mais preferencialmente pelo menos 50 % e particularmente preferido pelo menos mais 100 % de fosfato do que o amido de células ou plantas não transformadas correspondentes. Os amidos com um teor de fosfato elevado são, por exemplo, de particular interesse para a indústria do papel, por exemplo, para a preparação da superfície do papel. Normalmente, a indústria do papel utiliza amido quimicamente modificado, por exemplo, amido hidroxietilado ou fosforilado, para o ajustamento ou revestimento da superfície. A produção de amido altamente fosforilado em plantas evitará assim a necessidade de amido quimicamente modificado de modo a adaptá-lo aos requisitos da indústria do papel. Este último está normalmente aumentado no amido das células de plantas transgénicas ou plantas transgénicas, alterando assim as propriedades físicas do amido.

Uma outra matéria da presente invenção é um processo para a produção de uma proteína que está presente nas células de plantas numa forma ligada aos grânulos, assim como sob a forma solúvel, em que se faz uma cultura de células do hospedeiro da presente invenção, em condições que permitam a expressão da proteína e em que a proteína é então isolada das células de cultura e/ou do meio de cultura. 13

Além disso, a presente invenção tem por objecto proteínas codificadas pelas moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção, assim como proteínas que se podem obter pelo processo descrito antes. São preferencialmente proteínas de milho codificadas por genes nucleares e que se localizam nos plastidos. Nos plastidos, estas enzimas estão presentes sob uma forma ligada aos grânulos assim como sob a forma livre.

Um outro tema da presente invenção diz respeito a anticorpos que reconhecem especificamente uma proteína da presente invenção. Podem ser anticorpos monoclonais assim como policlonais. Os processos para a produção desses anticorpos são conhecidos pelos especialistas na matéria.

Além disso, verificou-se que é possível influenciar as propriedades do amido sintetizado em células de plantas por meio da redução da quantidade de proteínas codificadas pelas moléculas de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção, nas células. Esta redução pode ser efectuada, por exemplo, por meio da expressão, em sentido inverso, das moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção, expressão de ribozimas apropriados ou co-supressão.

Por isso, as moléculas de ADN que codificam um ARN de sentido inverso que é complementar dos transcritos de uma molécula de ADN da presente invenção são também matéria objecto da presente invenção, assim como estas moléculas de sentido inverso. Aqui, complementar não significa que o ARN codificado tenha de ser 100 % complementar. Um baixo grau de complementaridade é suficiente, desde que seja suficientemente elevado de modo a inibir a expressão de uma proteína da presente invenção, após a expressão em células de plantas. 0 ARN transcrito é preferencialmente pelo menos 90 % e mais 14 preferencialmente pelo menos 95 % complementar de um transcrito da molécula de ácido nucleico da presente invenção. Para causar um efeito de sentido inverso duradouro durante a transcrição em células de plantas, essas moléculas de ADN têm um comprimento de pelo menos 15 pb, preferencialmente um comprimento de mais do que 100 pb e o mais preferencial, um comprimento de mais do que 500 pb, contudo, normalmente inferior a 5000 pb, preferencialmente inferior a 2500 pb. A presente invenção tem ainda por objecto moléculas de ADN que, durante a expressão nas células das plantas, levam à síntese de um ARN que, nas células das plantas, devido ao efeito de co-supressão, reduz a expressão das moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção que codificam a proteína descrita. A presente invenção também tem por objecto moléculas de ARN assim codificadas. O princípio da co-supressão, assim como a produção das sequências de ADN correspondentes está descrito com precisão, por exemplo, na patente de invenção WO 90/12084. Essas moléculas de ADN codificam, preferencialmente, um ARN com um elevado grau de homologia com os transcritos das moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção. Aqui, não é contudo absolutamente necessário que a codificação de ARN seja traduzida numa proteína.

Num outro enquadramento, a presente invenção tem por objecto moléculas de ADN que codificam uma molécula de ARN com actividade de ribozima, cujos transcritos clivam especificamente de uma molécula de ADN da presente invenção, assim como estas moléculas de ARN codificadas.

As ribozimas são moléculas de ARN activas sob o ponto de vista catalítico capazes de clivar moléculas de ARN e 15 sequências alvo específicas. Por meio de técnicas de ADN recombinante é possível alterar a especificidade das ribozimas. Há várias classes de ribozimas. Para aplicações práticas que visam a clivagem específica do transcrito de um certo gene, utiliza-se, preferencialmente, representantes de dois grupos de ribozimas diferentes. 0 primeiro grupo é constituído por ribozimas que pertencem ao grupo I de intrões do tipo da ribozima. 0 segundo grupo consiste em ribozimas que, como uma característica estrutural característica exibem a estrutura chamada "cabeça de martelo" (hammerhead). 0 reconhecimento específico da molécula alvo de ARN pode ser modificado alterando as sequências que flanqueiam esta estrutura. Emparelhando bases com sequências na molécula alvo, estas sequências determinam a posição em que a reacção catalítica e portanto a clivagem da molécula alvo têm lugar. Dado que os requisitos da sequência para uma clivagem eficiente são baixos, é possível, em princípio, desenvolver ribozimas específicas para praticamente cada molécula de ARN desejada.

Para produzir moléculas de ADN que codificam uma ribozima que cliva especificamente as cópias de uma molécula de ADN da presente invenção, por exemplo, liga-se bilateralmente uma sequência de ADN que codifica um domínio catalítico de uma ribozima, às sequências de ADN que são homologas das sequências da enzima alvo. As sequências que codificam o domínio catalítico podem ser, por exemplo, domínios catalíticos do ADN satélite do vírus SCMo (Davies et al., Virology 177 (1990), 216-224) ou o do ADN satélite do vírus TobR (steinecke et al., EMBO J. 11 (1992), 1525-1530; Haseloff e Gerlach, Nature 334 (1988) , 585-591) . As sequências de ADN que flanqueiam o domínio catalítico derivam, preferencialmente, das moléculas de ADN da presente invenção descritas antes. 16

Num outro enquadramento, a presente invenção tem por objecto vectores que contêm as moléculas de ADN descritas antes, em particular aquelas em que as moléculas de ADN descritas estão ligadas a elementos reguladores que asseguram a transcrição em células de plantas.

Além disso, a presente invenção tem por objecto células hospedeiras contendo as moléculas de ADN ou os vectores descritos. A célula hospedeira pode ser uma célula procariótica, tal como uma célula bacteriana ou uma célula eucariótica. Preferencialmente, as células eucarióticas hospedeiras são células de plantas.

Além disso, a presente invenção tem por objecto células de plantas transgénicas contendo uma molécula de ADN descrita antes codificando um ARN de sentido inverso, uma ribozima ou um ARN o que leva a um efeito de co-supressão, em que a molécula de ADN está ligada a elementos de ADN que asseguram a transcrição em células de plantas. Estas células de plantas transgénicas podem ser regeneradas para plantas completas de acordo com técnicas bem conhecidas. Assim, a presente invenção tem também por objecto plantas que se podem obter através da regeneração das células de plantas transgénicas descritas, assim como plantas que contém as células de plantas transgénicas descritas. As próprias plantas transgénicas podem ser plantas de qualquer espécie de planta desejada, preferencialmente plantas úteis, particularmente as que armazenam amido, tal como indicado antes e mais preferencialmente as células de pantas de milho.

Além disso, a presente invenção tem por objecto moléculas de ARN de sentido inverso codificadas pelas moléculas de ADN descritas, assim como moléculas de ARN com actividade de ribozima e moléculas de ARN que levam ao efeito 17 de co-supressão que se obtêm, por exemplo, por meio da transcrição.

Um outro tema que é objecto da presente invenção é um processo para a produção de células de plantas transgênicas que, em comparação com as células não transformadas, sintetizam um amido modificado. Neste processo, a quantidade de proteínas codificadas pelas moléculas de ADN da presente invenção, que estão presentes sob a forma endogénica, é reduzida nas células da planta.

Num enquadramento preferido, esta redução é efectuada por meio de um efeito de sentido inverso. Com este fim, as moléculas de ADN da presente invenção ou as suas partes são ligadas, numa orientação de sentido inverso, com um promotor que assegura a terminação da transcrição assim como a poliadenilação da cópia. Para assegurar um efeito de sentido inverso eficiente nas células das plantas, o ARN de sentido inverso sintetizado deve exibir um comprimento mínimo de 15 nucleótidos, preferencialmente de pelo menos 100 nucleótidos e, mais preferencialmente, de pelo menos 500 nucleótidos. Além disso, a sequência de ADN que codifica o ARN de sentido inverso deve ser homóloga no que respeita às espécies de plantas a ser transformadas. Contudo, as sequências de ADN que exibem um elevado grau de homologia com as sequências de ADN que estão presentes nas células sob a forma endogénica, podem também ser utilizadas, preferencialmente com uma homologia de mais do que 90 % e, mais preferencialmente, com uma homologia de mais do que 95 %.

Num outro enquadramento preferido, a redução da quantidade de proteínas codificadas pelas moléculas de ADN da presente invenção ê efectuada por um efeito da ribozima. 0 efeito básico dos ribozimas assim como a construção de moléculas de ADN que codificam essas moléculas de ARN já foi descrito antes. Para expressar um ARN com actividade de ribozima nas células transgénicas, as molécylas de ADN descritas antes que codificam uma ribozima estão ligadas aos elementos de ADN que asseguram a transcrição em células de plantas, particularmente com um promotor e um sinal de terminação. As ribozimas sintetizadas nas células das plantas levam à clivagem das cópias das moléculas de ADN da presente invenção que estão presentes nas células de plantas sob a forma endogénica.

Uma outra possibilidade de reduzir a quantidade de proteínas codificadas pelas moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção é a co-supressão. Por isso, as células de plantas obtidas pelo processo da presente invenção constituem mais um outro objecto. Estas células de plantas são caracterizadas pelo facto de a quantidade de proteínas codificadas pelas moléculas de ADN da presente invenção ser reduzida e por, em comparação com as células de tipo selvagem, sintetizarem um amido modificado.

Preferencialmente, as células transgénicas mostram uma redução na quantidade de cópias que codificam uma proteína de acordo com a presente invenção de pelo menos 30 %, mais preferencialmente de pelo menos 50 %, ainda mais preferencialmente de pelo menos 70 % e o que é mais preferível de pelo menos 90 % em comparação com as células não transformadas correspondentes. A quantidade de cópias pode ser determinada, por exemplo, por análise de mancha de Northern. Além disso, as células mostram preferencialmente uma redução correspondente da quantidade de proteína de acordo com a presente invenção. Esta pode ser determinada, por exemplo, por processos imunológicos tais como a por análise de mancha de Western. 19

Num enquadramento particularmente preferido da presente invenção não se reduz apenas a síntese de uma proteína da presente invenção nas células de plantas transformadas, mas além disso também a síntese de pelo menos uma outra enzima envolvida na síntese e/ou ma modificação do amido. Neste contexto, por exemplo, as sintases de amido ligadas aos grânulos de amido ou as enzimas de ramificação são as preferidas.

Além disso, a presente invenção tem por objecto plantas que se obtêm por meio da regeneração das células de plantas descritas, assim como as plantas que contêm as células da presente invenção descritas. A presente invenção também tem por objecto um processo para a produção de um amido modificado que compreende a etapa de extracção das plantas de acordo com a presente invenção descritas antes e/ou a partir de partes dessas plantas que armazenam amido. Preferencialmente, esse processo compreende ainda as etapas de cultivo das plantas de acordo com a presente invenção; e a colheita das plantas cultuvadas e/ou de partes dessas plantas que armazenam amido, antes da extracção do amido. A presente invenção também tem por objecto o amido que se obtém das células de plantas transgénicas e das plantas descritas ou que se obtêm pelo processo descrito antes. Devido à expressão das moléculas de ADN descritas que codificam o ARN de sentido inverso, uma ribozima ou um ARN de co-supressão nas células transgénicas, a quantidade de proteínas codificadas pelas moléculas de ADN da presente invenção, que estão presentes nas células na forma endogénica, é reduzida. Surpreendentemente, esta redução leva a uma alteração drástica das propriedades físicas e químicas 20 do amido sintetizado nas células das plantas. Quando comparado com o amido das células ou das plantas não transformadas, o amido modificado exibe, preferencialmente, alteração das propriedades de formação de pasta, isto é, uma viscosidade alterada das soluções aquosas do amido e/ou um teor de fosfato alterado, particularmente um teor de fosfato reduzido. A expressão das moléculas de ácido nucleico da presente invenção pode ter lugar, em princípio, em qualquer tipo de espécie de planta. As plantas monocotiledóneas e dicotiledôneas são as preferidas, em particular plantas úteis e preferencialmente plantas que armazenam amido tal como cereais (centeio, cevada, aveia, trigo, painço, sagu, etc.), arroz, milho, ervilhas, ervilhas frizadas, mandioca, batata, tomate, óleo de semente de colza, soja, linho, fibra, girassol, feijão frade e araruta.

Dentro do âmbito da presente invenção, a expressão "elementos de ADN reguladores que asseguram a transcrição em células de plantas" está relacionada com as regiões de ADN que permitem a iniciação ou o término da transcrição nas células de plantas. As regiões de ADN que asseguram a iniciação da transcrição são, em particular, promotores.

Para a expressão das várias moléculas de ADN da presente invenção descritas antes, pode-se utilizar qualquer promotor que funcione nas células das plantas. 0 promotor pode ser homólogo ou heterõlogo no que respeita âs espécies de plantas utilizadas. Pode-se utilizar, por exemplo, o promotor 35S do vírus em mosaico da couve-flor (Odell et al., Nature 313 (1985), 810-812) que assegura uma expressão constitutiva em todos os tecidos das plantas e também da estrutura do promotor descrita na patente de invenção WO/9401571. Contudo, 21 também se podem utilizar promotores que levem a uma expressão das sequências subsequentes apenas num momento determinado por factores exógenos (tal como na patente de invenção WO/9307279) ou num tecido particular da planta (ver, por exemplo, Stockhaus et al. , EMBO J. 8 (1989), 2245-2251). Os promotores que são activos nas partes que armazenam amido da planta que vai ser transformada são os que se utilizam preferencialmente. No caso do milho, estas partes são sementes de milho, no caso das batatas, estas partes são os tubérculos. Para transformar as batatas, pode-se utilizar, particularmente, mas não exclusivamente, o promotor B33 (Rocha-Sosa et al. , EMBO J. 8 (1989), 23-29) específico dos tubérculos. Independentemente dos promotores, as regiões de ADN que iniciam a transcrição podem também conter sequências de ADN que asseguram um outro elemento da transcrição, tal como os chamados elementos melhoradores. Além disso, a expressão "elementos de ADN reguladores" podem também compreender sinais de terminação que servem para terminar correctamente a transcrição e para adicionar uma cauda de poli-A à cópia, que se acredita que estabilize as cópias. Esses elementos estão descritos na literatura e podem-se trocar como se queira. Exemplos dessas sequências de terminação são as regiões 3' que não se podem traduzir, que compreendem o sinal de poliadenilação do gene de nopalina sintase (gene de NOS) ou o gene de octopina sintase (Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) da agrobactéria ou as regiões 3' que não se podem traduzir dos genes das proteínas de armazenagem da soja, assim como os genes da sub-unidade pequena de ribulose-1,5-bifosfato-carboxílase (ssRUBISCO). A introdução das moléculas de ADN da presente invenção em células de plantas é realizada, preferencialmente, utilizando plasmídos. Os plasmidos que asseguram uma integração estável do ADN no genoma da planta são preferidos. 22 A introdução das moléculas de ADN da presente invenção nas células das plantas realiza-se, preferencialmente utilizando plasmidos. Os plasmidos que asseguram uma integração estável do ADN no genoma da planta são os preferidos.

Para preparar a introdução de genes estranhos em plantas superiores, está à disposição um grande número de vectores de clonagem, contendo um sinal de replicação para E. coli e um gene marcador para a selecção das células bacterianas transformadas. Exemplos desses vectores são pBR322, séries de pUC, séries de M13mp, pACIC184 etc. A sequência desejada pode ser integrada no vector num sítio de restrição apropriado. 0 plasmido obtido é utilizado para a transformação das células de E. coli. Faz-se uma cultura das células de E. coli transformadas num meio apropriado e em seguida colhem-se e faz-se a lise. Recupera-se o plasmido por meio de processos padrão, Como um processo de análise para a caracterização do ADN do plasmido obtido, utiliza-se geralmente análise de restrição e análise de sequências. Depois de cada manipulação, pode-se clivar o ADN do plasmido e os fragmentos de ADN obtidos podem ligar-se a outras sequências de ADN.

Para introduzir o ADN em células da planta hospedeira, está disponível uma vasta gama de técnicas. Estas técnicas compreendem a transformação das células das plantas com ADN-T, utilizando Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes como meio de transformação, a fusão de protoplastos, a injecção e a electroporação de ADN, a introdução de ADN por meio do processo biolístico, assim como por meio de outras possibilidades.

No caso de injecção e electroporação de ADN nas células das plantas, não há requisitos especiais para a utilização 23 dos plasraidos. Os plasraidos simples tais como os derivados de pUC podem ser utilizados. Contudo, no caso de serem regeneradas plantas completas a partir de células transformadas dessa forma, deve estar presente um gene marcador seleccionável.

Consoante o processo de introdução de genes desejados nas células das plantas, podem ser necessárias mais sequências de ADN. Se, por exemplo, os plasmidos Ti ou Ri forem utilizados para a transformação da célula da planta, pelo menos a borda do lado direito, mais frequentemente, contudo, os bordos direito e esquerdo do ADN T dos plasmidos Ti e Ri têm se ser ligados ao gene estranho a ser introduzido como região de flanqueio.

Se se utilizam Agrobactérias para a transformação, o ADN a ser introduzido deve ser clonado em plasmidos especiais, nomeadamente quer num vector intermédio ou num vector binário. Devido às sequências homólogas com as sequências dentro do ADN-T, os vectores intermédios podem ser integrados no plasmido Ti ou Ri da Agrobacterium devido à recombinação homóloga. Esta também contém a região vir necessária para a transferência do ADN-T. Os vectores intermédios não podem replicar na Agrobactéria. Por meio de um plasmido auxiliar, o vector intermédio pode ser transferido para Agrobacterium tumefaciens (conjugação). Os vectores binários podem replicar em E. coli, assim como nas Agrobactérias. Contêm um gene marcador seleccionável assim como um ligante ou um poli-ligante que é emuldorado à direita e à esquerda pela região da fronteira de ADN-T. Podem ser transformados directamente na Agrobactéria (Holsters et al. Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187) . Os plasmidos utilizados para a transformação das Agorbactérias contêm ainda um gene marcador seleccionável, tal como o gene NPT II que permite a selecção das bactérias 24 transformadas. A Agrobacterium que actua como célula hospedeira deve conter um plasmido que comporta uma região vir. A região vir é necessária para a transferência do ADN-T para as células de plantas. 0 ADN-T adicional pode estar presente. A Agrobacterium transformada dessa maneira é utilizada para a transformação das células das plantas. A utilização de ADN-T para a transformação de células de plantas foi investigada intensamente e descrita suficientemente na patente de invenção europeia EP 120 516; Hoekema, em: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B. V. , Alblasserdam (1985), Capítulo V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sei., 4, 1-46 e An et al. EMBO J. 4 (1985), 277-287. Alguns vectores binários podem já ser obtidos comercialmente, tal como pBIN19 (Clontech Laboratoryes, Inc., EUA).

Para transferir o ADN para as células das plantas, os explantes das plantas podem ser co-cultivados apropriadamente com Agrobacterium tumefacíens ou Agrobacterium rhizogenes. A partir do material de plantas infectadas (por exemplo, bocados de folhas, segmentos de estema, raízes, mas também protoplastos ou células de plantas em cultura numa suspensão), podem-se então ser regeneradas plantas completas num meio apropriado que pode conter antibióticos ou biózidos para a selecção de células transformadas. As plantas obtidas dessa forma podem então ser examinadas para avaliar se o ADN introduzido está presente ou não. Outras possibilidades para introduzir o ADN estranho utilizando o processo biolístico ou por transformação de protoplastos são conhecidas pelos especialistas na matéria (ver, por exemplo, Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. Em: Biotechnology, a multi-volume comprehensive treatise (H. J. Rehm, G. Reed, A. Puhler, P. 25

Stadler editores), vol. 2, 627-659, VCH Weinheim - Nova Iorque - Basel - Cambridge).

Dado que a transformação das plantas dicotiledóneas pelos sistemas do vector do plasmido Ti por meio de Agrobacterium tumefaciens é um processo bem estabelecido, estudos mais recentes indicam que a transformação com vectores à base de Agrobacterium pode também ser utilizada no caso das plantas monocotiledóneas (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei et al. , Plant J. 6 (1994), 271-282) .

Os sistemas alternativos para a transformação de plantas monocotiledóneas são a transformação por meio da abordagem biolística, a transformação de protoplastos, a electroporação das células parcealmente permeabilizadas, a introdução de ADN por meio de fibras de vidro. Há várias referências na literatura relevante que tratam especificamente da transformação do milho (ver, por exemplo, a patente de invenção WO 95/06128, as patentes de invenção europeias EP 0 513 849 e EP 0 465 875) . Na patente de invenção europeia EP 292 435, descreve-se um processo por meio do qual se podem obter plantas férteis a partir de caules de milho granuloso, friáveis, sem serem mucosos. Neste contexto, Shillito et al. (Bio/Technology 7 (1989), 581) ainda observou que para regenerar plantas férteis é necessário começar pelas culturas em suspensão de caules a partir das quais se pode produzir uma cultura de protoplastos de divisão que são capazes de regenerar as plantas. Depois de um período de cultura in vitro de 7 a 8 meses, Shillito et al. obtiveram plantas com descendentes viáveis que, contudo, exibiam anomalias na morfologia e na reprodutividade. 26

Piroli e Sõndahl (Bio/Technology 7 (1989), 589) descreveram como se regenera e obter plantas férteis consoante um certo número de factores variados tais como o genotipo, o estado fisiológico da célula dadora e as condições da cultura. Logo que o ADN introduzido tenha sido integrado no genoma da célula da planta, normalmente continua a ser estável aí e também permanece nos descendentes da célula originalmente transformada. Normalmente contém um marcador seleccionável que confere resistência contra biozidas ou contra antibióticos tal como a canamicina, G 418, bleomicina, higromicina ou fosfinotricina, etc. às células de plantas transformadas. Os marcadores seleccionados indivudalmente devem por isso permitir uma selecção das células transformadas contra as células que não têm o ADN introduzido.

As células transformadas crescem da forma usual dentro da planta (ver também McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). As plantas resultantes podem ser postas em cultura da forma usual e serem cruzadas com plantas que têm a mesma herança genética transformada ou outra herança genética. Os indivíduos híbridos resultantes têm as propriedades fenotípicas correspondentes. Devem crescer duas ou mais gerações para assegurar que a característica fenotípica é conservada de forma estável e que é transferida. Além disso, devem colher-se sementes de modo a assegurar que o fenotipo correspondente ou outras propriedades permanecerão .

Devido às suas propriedades, o amido obtido das células das plantas ou das plantas da presente invenção não só é apropriado para os fins específicos já mencionados antes, mas também para várias utilizações industriais. 27

Em princípio, o amido pode ser sub-dívidido em dois domínios principais. Um campo compreende os produtos da hidrólise do amido e os amidos designados por originais. Os produtos da hidrólise compreendem essencialmente glicose e componentes de glucanos obtidos por processos enzimáticos ou químicos. Eles podem ser utilizados para outros processos, tal como fermentação ou modificações químicas. Neste contexto, pode ser importante que o processo de hidrólise pode ser realizado de uma forma simples e barata. Normalmente, realiza-se praticamente de uma forma enzimãtica utilizando amiloglicosidase. É provável que os custos possam ser reduzidos utilizando quantidades menores de enzimas para hidrólise devido às alterações na estrutura do amido, por exemplo, aumentando a superfície do grão, melhorando a possibilidade de digerir devido a uma estrutura menos ramificada ou estérica do grão, o que limita a acessibilidade para as enzimas utilizadas. A utilização do chamado amido natural que se utiliza, por causa da sua estrutura polimérica, pode ser sub-dividida em mais duas áreas: (a)_Utilização em alimentos 0 amido é um aditivo clássico para vários alimentos, em que serve essencialmente a finalidade de ligação dos aditivos aquosos e/ou causa uma viscosidade aumentada ou uma formação de gel aumentada. As propriedades importantes características são o comportamento de fluidez e de absorção, o aumento de volume e a temperatura de pastificação, a viscosidade e o desempenho no espeçamento, a solubilidade do amido, a transpareência e a estrutura da pasta, a resistência ao corte, ao calor e aos ácidos, a tendência para retrogradação, a capacidade de formação de filmes, a resistência à congelação/descongelação, a capacidade de ser digerível, assim como capacidade de formação de complexos com, por exemplo, iões inorgânicos ou orgânicos. (b)_Utilização em substâncias não comestíveis 0 outro campo principal de aplicação é a utilização do amido como um adjuvante em vários processos de produção ou como um aditivo em produto técnicos. Os principais campos de aplicação para se utilizar o amido como adjuvantes são, primeiro que tudo, a indústria do papel e do cartão. Neste domínio, o amido é principalmente utilizado para a retenção (segurar os sólidos), para o dimensionamento das cargas e das partículas finas, como uma substância de solidificação e para a desidratação. Além disso, as propriedades vantajosas do amido que se utilizam dizem respeita à dureza, som, força, brilho, maciez, força da lágrima, assim como o uso que se faz das superfícies.

Dentro do processo para produção de papel, pode-se fazer uma diferenciação entre quatro campos de aplicação, nomeadamente superfície, revestimento, massa e pulverização.

Os requisitos do amido no que respeita ao tratamento da superfície são essencialmente um elevado grau de brilho, a viscosidade correspondente, a estabilidade a alta viscosidade, uma boa formação de filme, assim como uma baixa formação de pó. Quando utilizado no revestimento, o teor de sólidos, a viscosidade correspondente, a elevada capacidade para se ligar, assim como uma elevada afinidade para pigmentos, desempenham um papel importante. Como aditivo para a massa, a rapidez, a 29 uniformidade, a dispersão isenta de perdas, a elevada estabilidade mecânica e a retenção completa na pasta de papel são de grande importância. Quando se utiliza o amido na pulverização, o teor de sólidos correspondente, a elevada viscosidade, assim como uma elevada capacidade de ligação são também significativas.

Um domínio principal de aplicação é, por exemplo, na indústria dos adesivos, em que os campos de aplicação se sub-dividem em quatro áreas: a utilização como cola de amido puro, a utilização em colas de amido preparadas com produtos químicos especiais, a utilização do amido como um aditivo das resinas sintéticas e das dispersões de polímeros, assim como a utilização de amidos como extensores dos adesivos sintéticos. 90 % de todos os adesivos à base de amido são utilizados na produção de cartão canelado, sacos de papel, materiais compósitos para papel e alumínio, caixas e cola molhável para envelopes, selos, etc.

Uma outra utilização possível como adjuvante e aditivo é na produção de têxtiles e produtos para tratar os têxteis. Dentro da indústria têxtil, pode-se fazer uma diferenciação entre os quatro campos de aplicação seguintes: a utilização de amido como um agente de colagem, isto é, como um adjuvante para o amacíamento e o reforço do comportamento das brocas para a protecção contra forças tênseis activas na tecelagem, assim como para aumentar a resistência ao atrito durante a tecelagem, como um agente para a melhoria dos têxteis príncipalmente depois dos pré-tratamentos que deterioram a qualidade, tal como lixiviamento, coloração, etc., como espessante na produção de pastas de corantes para a 30 prevenção da difusão do corante e como um aditivo para agentes de deformação para fios de costura.

Além disso, o amido pode ser utilizado como um aditivo em materiais de construção. Um exemplo é a produção de quadros de gesso e giz, em que o amido misturado no gesso fino pastifica com a água, difunde-se na superfície do quadro de gesso e assim liga-se ao cartão do quadro. Outros campos de aplicação são a mistura do amido ao gesso e a fibras minerais. Em cimento pronto para utilizar, o amido pode ser utilizado para a desaceleração do processo de colagem.

Além disso, o amido é vantajoso para a produção de meios para a estabilização dos solos utilizados para a protecção temporária de partículas de solo contra a água em pisos de terra artificial. De acordo com o conhecimento do estado da técnica, os produtos de combinação que consistem em amido e emulsões de polímeros podem ser considerados como tendo o mesmo efeito de redução da erosão e da incrustação que os produtos utilizados até aqui; contudo, eles são consideravelmente mais baratos.

Outro domínio de aplicação é a utilização do amido em protectores de plantas para a modificação das propriedades específicas destas preparações. Por exemplo, os amidos utilizam-se para melhorar a molhagem de protectores de plantas e de fertilizantes, para a libertação doseada dos ingredientes activos, para a conversão de ingredientes activos líquidos, voláteis e/ou cheirosos em substâncias microcristalinas, estáveis, deformáveis, para a mistura de composições incompatíveis 31 e para o prolongamento da duração do efeito devido a uma desintegração reduzida.

Domínios importantes de aplicação são os domínios dos fãrmacos, da medicina e da indústria dos cosméticos. Na indústria farmacêutica, o amido pode ser utilizado como um ligante para comprimidos ou para a diluição do ligante em cápsulas. Além disso, o amido é apropriado como desintegrante para comprimidos, dado que, após aumentar de volume, absorve o fluido e, depois de um curto espaço de tempo, aumenta tanto de volume que o ingrediente activo se liberta. Por razões qualitativas, os fluidos medicinais e os pós são outros domínios de aplicação. No domínio dos cosméticos, o amido pode, por exemplo, ser utilizado como um veículo de aditivos em pó, tal como essências e ácido salicílico. Um campo relativamente extenso de aplicação do amido é a pasta de dentes. É possível a utilização do amido como um aditivo para o carvão e as briquetes. Adicionando amido, o carvão pode ser quantitativamente aglomerado e/ou transformado em briquetes de alta qualidade, prevenindo assim a desintegração prematura das briquetes. 0 carvão para churrasco contém entre 4 e 6 % de amido adicionado, o carvão calorífero tem entre 0,1 % e 0,5 %. Além disso, o amido é apropriado como um agente de ligação, dado que a sua adição a carvão e a briquetes pode reduzir consideravelmente a emissão de substâncias tóxicas.

Além disso, o amido pode ser utilizado como um floculante no tratamento de minério e pasta de carvão.

Um outro campo de aplicação é a utilização como um aditivo para tratar materiais de processo na fundição. 32

Para vários processos da fundição, são necessários núcleos produzidos a partir de areias misturadas com agentes de ligação. Hoje em dia, o agente de ligação mais frequentemente utilizado é a bentonite misturada com amidos modificados, a maior parte amidos que aumentam de volume. A finalidade da adição do amido é aumentar a resistência do fluxo assim como melhorar a força de ligação. Além disso, os amidos que aumentam de volume podem cumprir mais pré-requisitos para o processo de produção, tal como dispersibilidade em água fria, capacidade de re-hidratação, boa capacidade de se misturar com a areia e uma elevada capacidade de se ligar com água.

Na indústria da borracha, pode-se utilizar o amido para melhorar a qualidade técnica e óptica. As razões para isto são a melhoria do brilho da superfície, a resistência e a aparência. Com esta finalidade, dispersa-se o amido nas superfícies aborrachadas pegajosas das substâncias de borracha antes da vulcanização a frio. Também pode ser utilizado para melhorar a capacidade de imprimir da borracha.

Um outro domínio de aplicação para o amido modificado é a produção de substitutos de couro.

No mercado dos plásticos, estão a emergir os seguintes campos de aplicação: a integração de produtos derivados de amido no processo de transformação (o amido é apenas uma carga, não há uma ligação directa entre o polímero sintético e o amido) ou, alternativamente, a integração de produtos derivados de amido na produção de polímeros (amido e polímero formam uma ligação estável). 33 A utilização do amido como uma carga pura não pode concorrer com outras substâncias tal como o talco. Esta situação é diferente quando as propriedades específicas do amido se tornam efectivas e o perfil de propriedades dos produtos finais está assim claramente alterado. Um exemplo é a utilização de produtos de amido na transformação de materiais termoplásticos, tal como polietileno. Aqui, o amido e o polímero sintético são combinados, numa relação de 1 : 1, por meio da co-expressão para formar um "lote padrão", a partir do qual se produzem vários produtos por meio de técnicas comuns utilizando polietileno granulado. A integração de amido nos filmes de polietileno pode causar uma permeabilidade acrescida das substâncias em corpos ocos, uma permeabilidade ao vapor de água melhorada, um comportamento anti-estático melhorado, um comportamento anti-bloco melhorado, assim como uma capacidade melhorada de ser impresso com corantes aquosos. Outra possibilidade é a utilização de amido em espumas de poliuretano. Devido à adaptação dos derivados de amido, assim como devido à optimização das técnicas de transformação, é possível controlar especificamente a reacção entre polímeros sintéticos e os grupos hidroxi do amido. Os resultados são filmes de poliuretano com os perfis de propriedades que se seguem, devido à utilização do amido: um coeficiente reduzido de expansão térmica, uma diminuição do comportamento de enrugamento, uma melhoria do comportamento da pressão/tensão, um aumento da permeabilidade do vapor de água sem uma alteração na absorção de água, redução da inflamabilidade e densidade de craqueamento, sem derrames de partes do combustível, sem halogenetos e uma redução do envelhecimento. As desvantagens que existem presentemente são a pressão reduzida e a força de impacto. 34 0 desenvolvimento do produto do filme não é a única opção. Também produtos plásticos sólidos, tal como potes, pratos e tigelas, podem ser produzidos por meio de um teor de amido superior a 50 %. Além disso, as misturas de amido/polímero oferecem a vantagem de serem mais facilmente biodegradáveis.

Além disso, devido à sua extrema capacidade de se ligarem à água, os polímeros de enxerto de amido ganharam uma enorme importância. Trata-se de produtos que têm uma estrutura de amido e um gradeamento lateral de um monómero sintético enxertado de acordo com o princípio de mecanismo de cadeia do radical. Os polímeros de enxerto de amido disponíveis hoje em dia são caracterizados por uma ligação melhorada e a capacidade de retenção melhorada até 1000 g de água por g de amido a uma elevada viscosidade. Estes super absorventes são utilizados principalmente no domínio da higiene, por exemplo, em produtos tais como guardanapos e toalhas, assim como no sector da agricultura, por exemplo em aglomerados de sementes.

Os factores decisivos para a utilização do novo amido modificado pelas técnicas de ADN recombinante são, por outro lado, a estrutura, o teor de água, o teor de proteína, o teor de lípido, o teor de fibra, o teor de cinzas/f osfato, a relação de amilose/amilopectina, a distribuição da massa molar relativa, o grau de ramificação, a dimensão e a forma dos grânulos, assim como a cristalização e, por outro lado, as propriedades que resultam nas características seguintes: comportamento do fluxo e da absorção, temperatura de pastificação, viscosidade, desempenho do espeçamento, solubilidade, estrutura da pasta, transparência, calor, corte e resistência ao ácido, tendência para a retrogradação, capacidade de formação de gel, resistência à 35 congelaçao/descongelação, capacidade de formação de complexos, ligação ao iodo, formação de filmes, força adesiva, estabilidade da enzima, digestibilidade e reactividade. A característica mais marcante é a viscosidade.

Além disso, o amido modificado obtido das células das plantas ou das plantas da presente invenção pode ser submetido a outras modificações químicas, o que resultará noutra melhoria da qualidade para alguns dos campos de aplicação descritos antes. Estas modificações químicas são conhecidas principalmente dos especialistas na matéria. Em particular, trata-se de modificações por meio de - tratamento com ácido - oxidação e - esterificação (formação de amidos de fosfato , nitrato, sulfato, xantato, acetato e citrato de amido. Também se podem utilizar outros ácidos orgânicos para a esterificação) - formação de éteres de amido (éter de alquilo e amido, éter de O-alilo e amido, éter de hidroxialquilo e amido, éter de O-carboxilmetilo e amido, éteres de amido contendo N, éteres de amido contendo S) - formação de amidos ramificados - formação de polímeros enxertados com amido. A presente invenção também tem por objecto o material de propagação de plantas da presente invenção, tal como sementes, frutas, cortes, tubérculos ou stocks de raízes, em 36 que este material de propagação contém células de plantas da presente invenção.

Depósitos

Os plasmidos produzidos e/ou utilizados dentro do âmbito da presente invenção têm sido depositados no depósito conhecido internacionalmente "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM)" em Braunschweig, República Federal da Alemanha, de acordo com os requisitos do Tratado de Budapeste para o reconhecimento internacional de depósitos de microrganismos para serem patenteados (número de depósito; data de depósito):

Plasmido pBinARHig (DSM 9505) (10/20/94)

Plasmido p33-anti-BE (DSM 6146) (08/20/90)

Plasmido pRL2 (DSM 10225) (09/04/95)

Descrição das figuras A fig. 1 mostra o plasmido p35S-anti-RL.

Estrutura do plasmido: A = fragmento A: promoter CaMV 35S, nt 6909-7437 (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294) B = fragmento B: fragmento Asp718 de pRLl com um comprimento aproximado de 1949 pb

Orientação como para o promotor: sentido inverso A seta indica a direcção do fragmento de leitura aberta. 37 C = fragmento C: nt 11748-11939 do AND-T do plasmido Ti pTiACH5 ADN-T (Gielen et al. , EMBO J. 3 (1984), 835-846) A fig. 2 mostra o plasmido p35S-anti-RL.

Estrutura do plasmido: A = fragmento A: promotor B33 do gene B33 de patatina a partir de Solanum tuberosum (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) B = fragmento B: fragmento Asp718 de pRLl com um comprimento aproximado de 1949 pb

Orientação como para o promotor: sentido inverso A seta indica a direcção do fragmento de leitura aberta. C = fragmento C: nt 11748-11939 do ADN-T do plasmido de Ti, ADN-T de pTiACHS (Gielen et al. , EMBO J. 3 (1984), 835-846) A fig. 3 mostra uma curva de Barbender de uma solução aquosa de amido, registada com um viscógrafo do tipo

Viskograph-E da Brabender, batata não transformadas da exemplo 8).

Significando o Drehm. seguinte: [BE]

Temp.

A B C D E F que foi isolada de plantas de variedade Désirée (ver também o

Torque

Unidade de Brabender

Temperatura

Início da pastificação

Grau de viscosidade máxima

Início do período de 96 CC

Início do período de arrefecimento

Fim do período de arrefecimento

Fim do período final de 50 °C 38 A linha azul indica a viscosidade; a linha vermelha representa a temperatura. A fig. 4 mostra uma curva de Barbender de uma solução aquosa de amido, registada com um viscógrafo do tipo Viskograph-E da Brabender, que foi isolada de plantas de batata transformadas com o plasmido p35S-anti-RL (ver também Exemplo 8). Quanto ao significado das abreviaturas ver figura 3 . A fig. 5 mostra uma curva de Barbender de uma solução aquosa de amido de batatas transformadas com o plasmido p35S-antí-RL (ver também Exemplo 8) , registada com um viscógrafo do tipo Viskograph-E da Brabender. Quanto ao significado das abreviaturas ver figura 3. A fig. 6 mostra as curvas de soluções aquosas de amido isolado de plantas de batata (ver também exemplo 12) , que foram registadas com um analisador rápido de viscosidade. A linha vermelha corresponde à temperatura; as linhas azuis 1, 2, 3 e 4 mostram as viscosidades das soluções de amido que se seguem:

Linha 1: Linha 2:

Linha 3:

Linha 4:

Amido isolado de plantas de tipo selvagem Amido isolado de plantas em que apenas a enzima de ramificação foi inibida (ver o exemplo 1 do pedido de patente de invenção W092/14827), Amido isolado de plantas em que somente a concentração das proteínas da presente invenção tinha sido reduzida (ver exemplo 6). Amido isolado de plantas que tinham sido transformadas com o plasmido p35S~anti-RL em combinação com o plasmido p35SH-anti-BE (ver. Exemplo 12) . 39 A fig. 7 mostra curvas de soluções aquosas de amido isolado de plantas de batata (ver também exemplo 13), que foram registadas com um analisador rápido de viscosidade. A linha vermelha corresponde à temperatura; as linhas azuis 1, 2, 3 e 4 mostram as viscosidades das soluções de amido que se seguem:

Linha 1: Linha 2:

Linha 3:

Linha 4:

Amido isolado de plantas de tipo selvagem Amido isolado de plantas que tinham sido apenas transformadas com o plasmido pB33-anti-GBSSI (chamada batata cerosa), Amido isolado de plantas que tinham sido transformadas apenas com o plasmido p35S-anti-RL (ver exemplo 6), Amido isolado de plantas que tinham sido transformadas com o plasmido pB33-anti-RL em combinação com o plasmido pB33-anti-GBSSI (ver Exemplo 13). A fig. 8 mostra o plasmido pRL2 que compreende um ADNc de comprimento completo de batata que codifica uma enzima Rl.

Os exemplos ilustram a presente invenção.

Meios e soluções utilizados

Tampão de eluição Tris 25 mM a pH 8,3

Glicina a 250 mM

Tampão de díãlíse: Tris-HCl 50 mM a pH 7,0

NaCl 50 mM EDTA 2 mM

β-mercaptoetanol 14,7 mM 40

PMSF 0,5 mM

Tampão de proteína: Tampão de fosfato de sódio i pH 7,2 EDTA 10 mM PMSF 0,5 mM β-mercaptoetanol 14,7 mM Solução de lugol: 12 g de Kl 6 g de I2 ad de 1,8 L com ddH20 20 x SSC: 175,3 g de NaCl 88,2 g de citrato de sódio ad 1000 mL com ddH20 pH 7,0 com NaOH 10 N 10 X MEN: MOPS 200 mM Acetato de sódio 50 mM EDTA 10 mM pH 7,0 Tampão de NSEB: Tampão de fosfato de sódio 0,25 M a pH 7,2 SDS a 7 % EDTA 1 mM ASB a 1 % (p/v) YT 8 g de extracto de bacto-levedura 5 g de bacto-triptona 5 g de NaCl ad 1000 mL com ddH20 41

Meio de isolamento do protoplasto (100 mL)

Celulase Onozuka R S (Meiji Seika, Japão) 800 mg 40 mg 200 mg 136 mg 4 7 mg 14 7 mg 250 mg 20 mg 4000 mg 4000 mg 1000 mg 5,8 660 mosm.

Pectoliase Y 23 KN03 kh2po4 k2hpo4 CaCl2 2H20 MgS04 7 H20

Albumina de soro bovino (ASB)

Glicose

Frutose

Sacarose

PH

Osmolaridade

Solução de lavagem de protoplastos 1: semelhante à solução de isolamento do protoplasto, mas sem celulase, pectoliase e ASB

Tampões de transformação: a)

Glicose 0,5 M MES 0,1%

MgCl2 6H20 25 mM pH 5,8

Ajustar para 600 mosm. b)

Solução de PEG 6000 Glicose 0,5 M

MgCl2 6H20 10 0 mM 42

Hepes pH

20 mM 6,5

Adiciona-se PEG 6000 ao tampão descrito em b) imediatamente antes de utilizar a solução (4 0 % p/v de PEG) . Filtra-se a solução com um filtro esterilizado de 0,45 pm.

Solução W5

CaCl 125 mM NaCl 150 mM KCL 5 mM Glicose 50 mM

Meio de cultura de protoplasto (indicado em mg/L) kno3 3000 (nh4)2 so4 500 MgS04 7H20 350 kh2po4 400 CaCl2 2H20 300

Fe-EDTA e traços de elementos tal como mo meio de MurashigeSkoog (Physíol. Plant, 15 (1962), 473). m-inosito 100 Tiamina HCl 1,0 Amida do ácido nicotínico 0,5 Piridoxina HCl 0,5 Glicina 2,0 Ácido glucorónico 750 Ácido galacturónico 750 Galactose 500 Maltose 500 43

Glicose 36.000 Frutose 36.000 Sacarose 30.000 Asparagina 500 Glutamina 100 Prolina 300 Hidrolisado de caseína 500 Ácido 2,4-diclorofenoxí-acético (2,4-D) 0,5 PH 5,8 Osmolaridade 600 mosm

Tampão A 2 x SSC 10 x solução de Denhardts SDS a 0,1 %

EDTA 5 mM

Fosfato di-sódico 50 mM 250 yg/mL de ADN de esperma de arenque

Nos exemplos, utilizaram-se os seguintes processos padrão: 1. Clonagem

Para a clonagem de E. coli utilizou-se o vector pBluescriptSK.

Para a transformação da planta, clonaram-se as estruturas do gene no vector binário pBinAR (Hofgen e Willmitzer, Plant Sei. 66 (1990), 221-230) e B33-Hig. 2. Estirpes bacterianas 44

Para o vector Bluescript e para as estruturas de pBinAR e B33-Hig utilizou-se a estirpe de E. coli DHS.alpha. (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburgh, EUA). A transformação dos plasmidos em plantas de batata foi realizada por meio de pGV2260 da estirpe C58C1 de Agrobacterium tumefaciens (Deblaere et al., Nucl. Acids Res. 13 (1985), 4777-4788). 3. Transformação de Agrobacterium tumefaciens A transferência do ADN foi realizada por meio da transformação directa de acordo com o processo de transformação de Hofgen & Willmitzer (Nucleic Acids Res. 16 (1988), 9877). 0 ADN do plasmido da Agrobacteria transformada foi isolado de acordo com o processo de Birnboim & Doli (Nucleic Acids Res. 7 (1979), 1513-1523) e analisada por electroforese depois da clivagem de restrição apropriada. 4. Transformação de batatas

Trataram-se dez folhas pequenas de uma cultura de batata esterilizada (Solanum tuberosum L. cv. Désirée) cortadas por um cortante, com 10 mL de meio MS (Murashige & Skoog, Phisiol. Plant. 15 (1962), 473-497) com sacarose a 2 %. 0 meio continha 50 pL de uma cultura de Agrobacterium tumefaciens que cresceu durante a noite sob selecção. Depois de se agitar ligeiramente durante 3-5 minutos, fez-se mais uma incubação no escuro durante dois dias. As folhas foram em seguida postas num meio MS com glicose a 1,6 %, 5 mg/L de ácido naftil-acético, 0,2 mg/L de benzilaminopurina, 250 mg/L de claforano, 50 mg/L de canamicina ou 1 mg/L de higromicina B e Bacto Agar a 0,80 45 % para a indução de caules. Passada uma semana de incubação a 25 °C e 3000 lux, colocaram-se as folhas em meio MS com glicose a 1,6 %, 1,4 mg/L de zeatina ribose, 20 mg/L de ácido naf til-acético, 20 mg/L de ácido giberélico, 250 mg/L de claforano, 50 mg/L de canamicina ou 3 mg/L de higromicina B e Bacto Agar a 0,80 % para a indução de rebentos. 5. Transformação de milho (a) Produção de protoplastos da linha de células DSM 6009

Isolamento do protoplasto 2-4 dias, preferencialmente 3 dias depois da última mudança do meio numa cultura de uma suspensão de protoplasto, bombeia-se o meio líquido e lavam-se as células remanescentes em 5 0 mL da solução 1 de lavagem de protoplasto e sugou-se até à secagem uma vez mais. Adiciona-se 10 mL do meio de isolamento do protoplasto a 2 g da massa de células colhida. Fez-se a incubação a 27 + 2 °C durante 4 a 6 horas, no escuro, as células novamente em suspensão e os agregados de células, enquanto se agitava ligeiramente (a 30 a 40 rpm).

Purificação do protoplasto

Quanto tem lugar a libertação de pelo menos 1 milhão de protoplastos/mL (inspecção microscópica), faz-se passar a suspensão através de peneiros de aço inoxidável ou de nylon com 46 uma dimensão de mesh de 200 ou 45 μπι. A combinação de um peneiro de 100 μιη e um peneiro de 60 pm permite também uma boa separação dos agregados de células. O filtrado que continha o protoplasto foi examinado microscopicamente. Normalmente contém 98 - 99 % de protoplastos. O resto são células simples não digeridas. As preparações de protoplastos com esse grau de pureza são utilizadas para experiências de transformação sem uma centriguação com um gradiente adicional. Os protoplastos sedimentaram por meio de centrifugação (100 UpM num roto (100 x g, 3 minutos)). Abandona-se o sobrenadante e faz-se uma nova suspensão dos protoplastos na solução de lavagem 1. Repete-se a cenrtifugação e os protoplastos são em seguida novamente suspensos no tampão de transformação. (b) Transformação de protoplastos

Com os protoplastos novamente suspensos no tampão de transformação enche-se, com porções de 10 mL, tubos de 50 mL de polialómero a um título de 0,5 - 1 x 106 protoplastos/mL. O ADN utilizado para a transformação é dissolvido numa solução tampão de Tris-EDTA (TE). Adiciona-se 20 pg de ADN do plasmido a cada mL de suspensão de protoplasto. Utiliza-se como vector um plasmido que confere resistência a fosfinotricina (ver, por exemplo, a patente de invenção europeia EP 0 513 849). Depois da adição do ADN, agita-se cuidadosamente a suspensão de protoplasto de modo a distribuir homogeneamente o protoplasto 47 na solução. Imediatamente a seguir adiciona-se, em gotas, 5 mL de solução de PEG.

Agitando cuidadosamente os tubos a solução de PEG é distribuída de forma homogénea. Depois adiciona-se mais 5 mL de solução de PEG e mistura-se de forma homogénea repetidamente. Os protoplastos permanecem na solução de PEG durante 20 minutos a + 2 °C. Depois os

protoplastos sedimentam por centrifugação durante 3 minutos (100 g; 1000 Upm) . O sobrenadante é abandonado. Lavam-se os protoplastos em 20 mL de solução W5 agitando cuidadosamente e submetem-se novamente a centrifugação. Depois suspendem-se novamente em 20 mL de meio de cultura de protoplasto. Ajusta-se o título para 6 - 8 x 105 protoplastos e faz-se uma cultura dos protoplastos em porções de 3 mL em pratos de Petri (0 60 mm, altura 15 mm) . Selam-se os pratos de Petri com parafilme e armazenam-se no escuro a 25 + 2 °C. (c) Cultura do protoplasto

Durante as primeiras 2-3 semanas depois do isolamento e da transformação os protoplastos são postos em cultura sem adicionar meio fresco. Logo que as células regeneradas dos protoplastos se desenvolvem em agregados de células com mais do que 20 a 50 células, adiciona-se 1 mL de meio de cultura fresco de protoplasto, contendo a sacarose como substância osmótica (90 g/L). 48 (d) Selecção de células de milho transformadas e regeneração de plantas 3-10 dias depois de se adicionar meio fresco, o agregado de células desenvolvido a partir de ptotoplastos pode ser colocado em placa em meio de agar com 100 mg/L de L-fosfinotricina. 0 meio N6 com as vitaminas do meio de cultura de protoplasto, 90 g/L de sacarose e 1,0 mg/L de 2,4 D é tão apropriado como um meio análogo tal como um meio com os sais macro- e micro-nutritivos do meio MS (Murashige e Skoog (1962), ver antes).

Os caules desenvolvidos a partir de protoplastos transformados de forma estável podem crescer mais no meio selectivo. Passadas 3 a 5 semanas, preferencialmente 4 semanas, os caules transgénicos podem ser transferidos para um meio de selecção fresco que também contém 100 mg/L de fosfinotricina que, contudo, já não contém auxina. No prazo de 3 a 5 semanas aproximadamente 50 % dos caules transgénicos de milho que tinham integrado o gene de L-fosfinotricina-acetl-transferase no seu genoma, começa a diferenciar-se em plantas neste meio na presença de L-fosfinotricina. (e) Crescimento das plantas regenerativas transgénicas

Faz-se a cultura de tecido de milho embriogénico, transformado em meio N6 isento de hormona (Chu C. C. e tal., Sei. Sin. 16 (1975), 49 659) na presença de L-fosfinotricina 5xlCT4 M, Neste meio os embriões de milho, que expressam o gene de L-fosfinotricina-acetl-transferase (gene PAT) de uma forma suficientemente forte, desenvolvem-se em plantas. Os embriões não transformados, apenas com uma actividade de PAT muito fraca, morrem. Logo que as as folhas das plantas in vitro atingem um comprimento de 4 a 6 mm podem ser transferidas para o solo. Depois de se lavaram os resíduos de agar nas raízes, plantam-se as plantas numa mistura de argila, areia, vermiculite e terra para vasos com a relação de 3:1:1:1 e adaptam-se à cultura no solo a uma humidade atmosférica relativa de 90 - 100 % durante os primeiros 3 dias após a plantação. 0 crescimento dá-se numa câmara climatizada com um período de luz de 14 horas a aproximadamente 25000 lux à altura da planta, a uma temperatura de dia/noite de 23 ± 1/17 + 1 ° C. Cultivam-se as plantas adaptadas a uma humidade atmosférica de 65 + 5 %.

6. Marcação radioactiva de fragmentos de ADN A marcação radioactiva dos fragmentos de ADN foi realizada por meio de kits de marcação aleatória de iniciadores de ADN da Boehringer (Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante. 7. Análise de mancha de Northern

Isolou-se o ARN a partir do tecido das folhas das plantas de acordo com protocolos padrão. Separou-se 50 μg do ARN num gel de agarose (agarose a 1,5 %, 1 x tampão de MEN, 50 formaldeído a 16,6 %). Depois da passagem pelo gel, lavou-se rapidamente o gel em água. Transferiu-se o ARN para uma membrana de nylon do tipo N da Hybond (Amersham, RU) com 20 x SSC por meio de uma mancha capilar. A membrana foi em seguida levada a um forno em vácuo durante duas horas a 80 °C. A membrana foi pré-hibridada em tampão de NSEB durante duas horas a 68 °C e em seguida hibridou-se durante a noite em tampão de NSEB, na presença da sonda marcada radioactivamente a 68 °C. 8. Manutenção da planta

Mantiveram-se as plantas de batata na estufa nas seguintes condições:

Período de luz 16 horas a 25000 lux e 22 °C

Período de escuridão 8 horas a 15 °C

Humidade atmosférica 60 % 9. Determinação da relação amilose/amilopectina no amido obtido das plantas da batata

Isolou-se o amido das plantas das batatas de acordo com processos padrão e determinou-se a relação amilose/amilopectina de acordo com o processo descrito por Hovenkamp-Hermelink et al. (Potato Research 31 (1988) 241-246) . 10. Determinação da glicose, frutose e sacarose

Para determinar o teor de glicose, fructose e/ou sacarose, congelaram-se pequenos bocados de tubérculos de batata 51 (com um diâmetro de aprox. 10 mm) em azoto líquido e em seguida extraiu-se durante 30 min a 80 °C no seio de 0,5 mL de HEPES 10 mM, a pH 7,5; etanol a 80 % (vol./vol.). Retirou-se o sobrenadante contendo os componentes solúveis e determinou-se o volume. Utilizou-se o sobrenadante para a determinação da quantidade de açúcares solúveis. A determinação quantitativa de glicose, frutose e sacarose solúveis realiza-se no seio de uma mistura reaccional com a seguinte composição: imidazole/HCl 100,0 mM, a pH 6,9

MgCl2 1,5 mM

NADP+ 0,5 mM

ATP 1,3 mM amostra de 10-50 μύ 1.0 U de glicose-6-fosfato desidrogenase obtida a partir de levedura

Incubou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 5 minutos. A determinação subsequente de açúcares realiza-se por meio de processos fotométricos normalizados, medindo a absorção a 340 nm, depois da adição sucessiva de 1.0 unidade de hexocinase a partir de levedura (para a determinação de glicose) 1.0 unidade de fosfoglícoisomerase a partir de levedura (para a determinação de frutose) e 52 1,0 unidade de invertase a partir de levedura (para a determinação de sacarose)

Exemplo 1

Isolamento das proteínas ligadas a grânulos de amido originário de amido de batata

0 isolamento das proteínas ligadas a grânulos de amido originário de amido de batata tem sido realizado por meio de electro-eluição numa aplicação da eluição que se construiu em analogia com o "Model 422 Electro Eluter" (BIORAD

Laboratories Inc., EUA) mas tinha um volume consideravelmente maior (aprox. 200 mL). Dissolveu-se 25 g de amido anidro num tampão de eluição (volume final de 80 mL). O amido derivou de batatas que produzem um amido quase isento de amilose devido à expressão em sentido inverso de uma sequência de ADN que codifica a sintase I de amido ligado a grânulos de amido (SALGA I) da batata. Aqueceu-se a suspensão a 70-80 °C num banho de água. Em seguida, adicionou-se 72,07 g de ureia (concentração final de 8 M) e completou-se o volume para 180 mL com um tampão de eluição. Dissolveu-se o amido com uma agitação permanente e obteve-se uma consistência semelhante a uma pasta. Eluíram-se as proteínas por electroeluíção a partir da solução da noite por meio de um aparelho de eluição (100 V; 50-60 mA) . As proteínas eluídas foram cuidadosamente retiradas do aparelho. Eliminaram-se as partículas em suspensão com uma centrifugação curta. Fez-se a diálise do sobrenadante a 4 °C, 2 a 3 vezes durante uma hora, com um tampão de diálise. Em seguida, determinou-se o volume da solução de proteína. As proteínas precipitaram por meio da adição de sulfato de amónio (concentração final de 90 %) , o que foi feito com agitação permanente, a 0 °C. As proteínas 53 precipitaram e foram amalgamadas por centrifugação e foram novamente suspensas no seio de um tampão de proteína.

Exemplo 2

Identificação e isolamento de sequências de ADNc que codificam as proteínas ligadas a grânulos de amido

As proteínas isoladas, de acordo com o exemplo 1, foram utilizadas para a produção de anticorpos policlonais de coelho, que reconhecem especificamente as proteínas ligadas a grânulos de amido. Por meio desses anticorpos, analisou-se em seguida uma biblioteca de expressão de ADNc no que respeita às sequências de codificação de proteínas ligadas a grânulos de amido, utilizando processos padrão. A biblioteca de expressão produziu-se como se segue:

Isolou-se poli (A+)-ARNm a partir de tubérculos de batata da variedade "Berolina". Partindo de poli (A+)-ARNm, produziu-se ANc de acordo com o processo de Gubler e Hoffmann (Gene 25 (1983), 263-269), utilizando um iniciador de oligo d(t)18 Xho I. Cortou-se este ADNc com Xho I depois da adição do ligante Eco R I e ligou-se de uma forma orientada num vector lambda ΖΑΡ II (Stratagene) e cortou-se com EcoR I e Xho I. Avaliaram-se aproximadamente 500.000 placas de uma biblioteca de ADNc construída dessa forma, para determinar quais as sequências que eram reconhecidas pelos anticorpos policlonais dirigidos contra as proteínas ligadas a grânulos de amido.

Para analisar as placas de fagos, transferiram-se estas para filtros de nítrocelulose que tinham sido previamente incubados numa solução de IPTG 10 mM, durante 30 a 60 minutos 54

e secaram-se em seguida em papel de filtro. A transferência deu-se a 37 °C durante 3 horas. Em seguida, incubaram-se os filtros à temperatura ambiente durante 30 minutos num reagente de bloco e lavaram-se durante 5-10 minutos em tampão de TBST. Os filtros foram agitados com os anticorpos policlonais dirigidos contra proteínas ligadas a grânulos de amido, numa diluição apropriada, durante uma hora, à temperatura ambiente ou durante 16 horas a 4 °C. A identificação das placas que expressam uma proteína que foi reconhecida pelos anticorpos policlonais foi realizada por meio do "Kit de detecção de manchas para os anticorpos de coelhos RPN 23" (Amersham, RU), de acordo com as instruções do fabricante.

Os clones de fago da biblioteca de ADNc que expressam uma proteína que era reconhecida pelos anticorpos policlonais foram ainda purificados por meio da utilização de processos padrão.

Por meio do método de excisão in vivo, obtiveram-se clones de E. coli a partir de clones positivos de fagos contendo um plasmido pBluescript de estrutura helicoidal dupla com a inserção de ADNc correspondente. Depois de se verificar a dimensão e o modelo de restrição das inserções, analisou-se ainda um clone apropriado, pRLl.

Exemplo 3

Análise de sequências da inserção de ADNc do plasmido pRLl

Isolou-se o plasmido pRLl a partir de um clone de E. coli obtido de acordo com o exemplo 2 e determinou-se uma parte da sequência da sua inserção de ADNc por processos 55 normalizados utilizando o processo do didesoxinucleótido (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 74 (1977), 5463- 5467). A inserção tem um comprimento de cera de 2450 pb. Uma parte da sequência de nucleótidos, assim como a sequência de aminoãcidos derivada dela, está indicada na Seq. ID n° 3 e na Seq. ID n° 4.

Uma análise das sequências e uma comparação das sequências com sequências de ADN conhecidas mostraram que a sequência indicada por Seq ID n° 3 é nova e não exibe homologia significativa com as sequências de ADN conhecidas até agora. Além disso, a análise das sequências mostrou que a inserção de ADNc é apenas um ADNc parcial em que falta uma parte da região de codificação na extremidade 5'.

Exemplo 4

Identificação e isolamento de um ADNc completo que codifica e uma proteína ligada a grânulos de amido a partir de Solanum

Tuberosum

Para isolar um ADNc completocorrespondendo à inserção parcial de ADNc do plasmido pRLl, produziu-se mais uma biblioteca de ADNc. Trata-se de uma biblioteca de ADNc específica de células de guarda, a partir de Solanum Tuberosum, que se construiu como se segue:

Primeiro, produziram-se fragmentos de epiderme de folhas de plantas de batata da variedade "Désirée", praticamente de acordo com o processo de Hedrich et al. (Plant Phisiol. 8 9 (1989), 148), colhendo aproximadamente 60 folhas de plantas de batatas de seis semanas mantidas em estufa. Retirou-se a nervura central das folhas. Em seguida moeram-se as folhas num grande "misturador da Waring" (com um volume de 1 litro) 56 quatro vezes, em H20 destilada, arrefecida, no seu nível mais elevado, durante 15 segundos de cada vez. Filtrou-se a suspensão através de um peneiro de nylon com uma dimensão de poros de 220 μπι (Nibolt, Zurique, Suiça) e lavou-se várias vezes em água destilada fria. Filtrou-se a própria suspensão intensivamente através de um peneiro de nylon com uma dimensão de poros de 220 μ™ e lavou-se intensamente com água destilada fria. Os fragmentos da epiderme (resíduos) foram moídos num "misturador de Waring" mais pequeno (com um volume de 250 mL) , quatro vezes, em água destilada e gelo a uma velocidade inferior a 15 segundos em cada uma das vezes. Filtrou-se a suspensão através de um peneiro de nylon com uma dimensão de poros de 220 μιη e lavou-se intensamente com água destilada. Os fragmentos da epiderme (resíduos) foram examinados ao microscópio para avaliar a contaminação por células de mesófilo. Se ocorrer contaminação, repete-se a etapa de moagem num pequeno "misturador da Waring". 0 rompimento das células de guarda dos fragmentos da epiderme foi realizado por meio da pulverização em azoto líquido num almofariz arrefecido, durante aproximadamente duas horas. Para examinar o rompimento das células da guarda, recolheram-se regularmente sondas e examinaram-se ao microscópio. Passadas duas horas ou quando uma quantidade suficientemente grande de células de guarda se tinham rompido, encheu-se um tubo de reacção com o pó que se obteve (com um volume de 50 mL) e fez-se uma nova suspensão num volume de tampão de GTC (Chirgwin et al., Biochem. 18 (1979), 5294-5299). Centrifugou-se a suspensão e filtrou-se o sobrenadante através de um Miracloth (Calbiochem, La Jolla, Calif.). Submeteu-se o filtrado a ultracentrifugação durante 16 horas, tal como descrito em Glisin et al. (Biochemistry 13 (1974), 2633-2637) e Mornex et al. (J. Clin. Inves. 77 (1986), 1952-1961). Depois da centrifugação, dissolveu-se o 57 precipitado de ARN no seio de 250 μ]3 de tampão de GTC. 0 ARN precipitou por centrifugação adicionando 0,05 volumes de ácido acético 1 M e 0,7 volumes de etanol. 0 ARN precipitou por centrifugação e lavou-se o precipitado com acetato de sódio 3M (pH 4,8) e etanol a 70 %. Secou-se rapidamente o ARN e dissolveu-se em água tratada com DEPC.

Isolou-se o ARN de poli A+ a partir de ARN isolado, de acordo com processos padrão. Partindo do ARNm de poli (A+) , produziu-se o ADNc de acordo com o processo de Gubler e Hoffmann (Gene 25 (1983), 263-269) por meio do iniciador de oligo d(t)i8 de Xho I. Este ADNc foi cortado com Xho I depois da adição do ligante EcoR I e ligou-se de uma forma orientada num vector lambda ΖΑΡ II (Stratagene GmbH, Heidelberg, Alemanha) e cortou-se com EcoR I e Xho I. O empacotamento nas cabeças dos fagos realizou-se utilizando o kit dourado da Gigapack II (Stratagene GmbH, Heidelberg, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante. A partir desses clones de fagos da biblioteca de ADNc que hibridam com a inserção de ADNc do plasmido pRLl, isolaram-se e purificaram-se de acordo com processos padrão. Por meio do processo da excisão in vivo, obtiveram-se clones de E. coli a partir de clones positivos de fagos contendo um plasmido pBluescript de estrutura helicoidal dupla, com a correspondente inserção de ADNc. Depois de se verificar a dimensão e o modelo de restrição das inerções, submeteram-se os clones apropriados a um mapeamento de restrição e a uma análise da sequência. A partir de um clone apropriado isolou-se o plasmido pRL2 (DSM 10225) que contém um ADNc completo que codifica uma proteína ligada a grânulos de amido de batata. 58

Exemplo 5

Análise da sequência da inserção de ADNc do plasmido pRL2 A sequência de nucleótido da inserção de ADNc do plasmido pRL2 foi determinada como se descreveu no exemplo 3. A inserção tinha um comprimento de 4856 pb. A sequência de nucleótidos, assim como a sequência de aminoãcidos dela derivada estão indicadas nas Seq ID n° 1 e/ou Seq ID n° 2. A partir daqui, o gene correspondente será designado por gene RL. A proteína codificada pela região de codificação será designada por enzima de RI.

Exemplo 6

Construção do plasmido P35S-anti-RL e introdução do plasmido no genoma de plantas de batata

Por meio da endonuclease de restrição Asp718, isolou-se um fragmento de ADN com um comprimento aproximado de 1800 pb a partir do plasmido pRLl. Isto corresponde à sequência de ADN indicada pela Seq ID n° 3 e contém uma parte do fragmento de leitura aberta. Ligou-se o fragmento ao vector binário pBinAR cortado com Asp718 (Hofgen e Willmitzer, Plant Sei. 66 (1990), 221-230). Trata-se de um derivado do vector binário pBínl9 (Bevan, Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711-8721). pBinAR foi construído como se segue:

Isolou-se um fragmento com um comprimento de 529 pb compreendendo os nucleótidos 6909-7437 do promotor 35S do vírus de mosaico da couve-flor (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294), a partir do plasmido pDH51 (Pietrzak et al., Nucl. Acids Res. 14, 5857-5868) como um fragmento de 59

EcoR Ι/Κρη I e ligou-se entre os sítios de EcoR I e de Kpn I do poligante pBinl9. Isto conduziu ao plasmido pBin!9-A.

Por meio das endonucleases de restrição Pvu II e Hind III, isolou-se um fragmento com um comprimento de 192 pb a partir do plasmido pAGV40 (Herrera-Estrella et al.( Nature 303, 209-213) compreendendo o sinal de poliadenilação do gene 3 do ADN-T do plasmido de Ti pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3, 835-846) (nucleótidos 11749-11939). Depois da adição dos ligantes de Sph I ao sítio Pvu I, ligou-se o fragmento de Sph I e os sítios Hind III de pBinl9-A. Isto conduziu ao plasmido pBinAR.

Por meio das análises das sequências e da restrição, identificaram-se os vectores recombinantes em que se inseriu o fragmento de ADN no vector, de tal modo que uma parte da região de codificação da inserção de ADNc do pRLl está ligada ao promotor 35S numa orientação de sentido inverso (antisense). 0 plasmido resultante p35S-anti-RL está indicado na figura l.

Inserindo o fragmento de ADNc, produz-se uma cassete de expressão que consiste nos fragmentos A, B e C: O fragmento A (529 pb) contém o promotor 35S do vírus de mosaico da couve-flor (VMCf). O fragmento compreende os nucleótidos 6909 a 7437 do VMCf (Franck et al. , Cell 21 (1980), 285-294).

Independentemente das regiões que o flanqueiam, o fragmento B contém uma parte da proteína que codifica a inserção de ADNc do plasmido pRLl. Isolou-se este como um fragmento de Asp718 a partir de pRLl, tal como se descreveu 60 antes e fundiu-se com o promotor 35S em pBinAR numa orientação antisense. 0 fragmento C (192 pb) contém o sinal de poliadenilaçào do gene 3 do ADN-T do plasmido de Ti pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) , 835-846) . O plasmido p35S-anti-RL tem uma dimensão aproximada de 12,8 kb. Transferiu-se o plasmido para plantas de batata por meio de uma transformação mediada por agrobactérias, tal como se descreveu antes. A partir das células transformadas, regeneraram-se plantas completas. Cultivaram-se as plantas transformadas em condições de estufa. Analisando o ARN total numa análise de mancha de Northern no que respeita ao desaparecimento dos transcritos complementares ao ADNc, avaliou-se o sucesso da modificação genética das plantas. Com este fim, isolou-se o ARN total a partir de folhas de plantas transformadas de acordo com processos padrão e, em seguida, separou-se por meio de electroforese num gel de agarose. Depois transferiram-se para uma membrana de nylon e hibridaram-se com uma sonda marcada radioactivamente tendo a sequência indicada pela designação Seq ID n° 1 ou uma parte dela. Na análise de mancha de Northern, em cerca de 5-10 % das plantas transformadas, a banda indicou que faltava o transcrito específico na Seq ID n° 1. Utilizaram-se as plantas para análise da qualidade do amido.

Exemplo 7

Construção do plasmido pB33-anti-RL e a introdução do plasmido no genoma das plantas de batata

Por meio da endonuclease de restrição Asp718, isolou-se um fragmento de ADN com um comprimento aporximado de 1800 pb, 61 que compreende uma parte do fragmento de leitura aberta da inserção de ADNc isolada do plasmido pRLl e ligou-se no vector B33-Hyg que foi cortado com Asp718. Construiu-se este vector como se segue:

Eliminou-se o promotor 35S do vector Hyg do pBinAr (DSM 9505) por meio da endonuclease de restrição EcoR I e Asp718. Isolou-se um fragmento com um comprimento de cerca de 1526 pb, compreendendo o promotor B33 a partir do plasmido p33-anti-BE (DSM 6146) por meio de EcoR I e Asp718 e inseriu-se no vecto pBinAR Hig (DSM 9505) cortou-se com EcoR I e Asp718. Inserindo o fragmento de ADNc num sítio de Asp718 do plasmido B33-Hyg, produz-se uma cassete de expressão que consiste nos fragmentos A, B e C, como se segue (figura 4): 0 fragmento A contém o promotor B33 de Solanum tuberosum (patente de invenção europeia EP 3775 092; Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989) , 23-29). Independentemente das regiões que o flanqueiam, o fragmento B contém uma parte da região que codifica a proteína da inserção de ADNc do plasmido pRLl. Isolou-se este plasmido como um fragmento de Asp718 a partir de pRLl, tal como se descreveu antes e fundiu-se com o promotor 35S em pBinAR numa orientação antisense. 0 fragmento C (192 pb) contém o sinal de políadenilação do gene 3 do ADN-T do plasmido de Ti pTiACHS (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835-846). O plasmido pB33-anti-RL tem uma dimensão aproximada de 12,8 kb. Transferiu-se o plasmido para plantas de batata por meio de uma transformação mediada por agrobactérias, tal como se descreveu antes. A partir das células transformadas, regeneraram-se plantas completas. Fez-se uma cultura das plantas transformadas em condições de estufa. Analisando o 62 ARN total numa análise de mancha de Northern no que respeita ao desaparecimento dos transcritos complementares ao ADNc, avaliou-se o sucesso da modificação genética das plantas. Com este fim, isolou-se o ARN total a partir de folhas de plantas transformadas de acordo com processos padrão e, em seguida, separou-se por meio de electroforese num gel de agarose. Depois transferiu-se para uma membrana de nylon e hibridaram-se com uma sonda marcada radioactivamente exibindo a sequência indicada pela designação Seq ID n° 1 ou uma parte dela. Na análise de mancha de Northern, em cerca de 5-10 % das plantas transformadas, a banda indicou que faltava o transcrito que hibridava com o ADNc da presente invenção. A partir destas plantas, isolou-se o amido dos tubérculos e analisou~se tal como se descreveu no exemplo 8.

Exemplo 8

Análise das plantas de batata transformadas

Examinaram-se as plantas transformadas de acordo com o exemplo 6 e o exemplo 7, no que respeita as propriedades do amido sintetizado. Realizaram-se as análises com várias linhas de plantas de batata que tinham sido transformadas com o plasmido p35S-anti-RL ou com o plasmido pB33-anti-RL e em que, na análise de mancha de Northern não exibiram a banda indicando os transcritos hibridizando com as sequências de ADN da presente invenção. a) Determinação da viscosidade das soluções aquosas do amido

Para determinar a viscosidade das soluções aquosas do amido sintetizado nas plantas de batata transformadas, isolou-se o amido dos tubérculos das plantas que tinham sido transformadas com o plasmido p35S-anti-RL ou com o plasmido pB33-anti-RL, utilizando processos padrão. Recolheu-se 30 g de amido por cada 450 mL de H20 e utilizou-se para análise num viscosímetro E (Brabender OHG Duisburg (Alemanha)). Utilizou-se o aparelho de acordo com as instruções do fabricante. Para determinar a viscosidade da solução aquosa do amido, aqueceu-se primeiro a suspensão de amido de 50 °C a 96 °C a uma velocidade de 3 °C por minuto. Manteve-se em seguida a temperatura a 96 °C durante 30 min. Durante todo o processo determinou-se a viscosidade. Os resultados representativos dessas medidas estão indicados sob a forma de gráficos nas figuras 3, 4 e 5, em que se mostra a viscosidade em função do tempo. A figura 3 mostra um gráfico típico de Brabender para amido isolado de plantas de tipo selvagem da variedade Désirée da batata. As figuras 4 e 5 mostram um gráfico típico de Brabender para o amido isolado de plantas de batata que foram transformadas com o plasmido p35S-anti-RL ou pB33-anti-RL. A partir destes gráficos, podem-se deduzir diferentes valores característicos.

Os valores característicos para as plantas de tipo selvagem são os seguintes:

Quadro 1 Valor Tempo Torque Temperatura [min : seg] [BE] [°C] A 6 : 30 60,5 ± 17,7 69,9 ± 0,57 B 11 : 30 1838,0 ± 161,2 86,0 + 2,1 C 15 : 15 1412,0 ± 18,4 96,0 D 45 : 15 526,0 ± 17,0 96,0 E 60 : 30 812,0 ± 8,5 50,0 F 70 : 45 853,0 ± 5,7 50,0 64

Os valores representam os valores médios obtidos de duas medições diferentes.

No quadro 1 e nos quadros 2 e 3 que se seguem, as abreviaturas têm os significados seguintes: A: Início da pastificação B: Viscosidade máxima

C: Início do período de 96 °C D: Início do período de arrefecimento E: Fim do período de arrefecimento

F: Fim do período final de 50 0 C

Para plantas que tenham sido transformadas com o plasmido p35S-anti~ RL (linha P2) , os valores característicos são os seguintes: Quadro 2 Valor Tempo Torque Temperatura [min : seg] [BE] [°C] A 6 : 00 50,0 69,0 B 14 : 00 820,0 93,0 C 15 : 15 815,0 96,0 D 45 : 15 680, 0 96,0 E 60 : 30 1150,0 50,0 F 70 : 45 1200,0 50,0

Para plantas que tenham sido transformadas com o plasmido pB33-anti-RL (linha P3) , os valores característicos são os seguintes: 65

Quadro 3

Valor Tempo Torque Temperatura [min : seg] [BE] [°C] A 7 : 0 31, 0 71,0 B 12 : 45 671,0 88,3 c 15 : 15 662,0 96,0 D 45 : 15 607,0 96,0 E 60 : 30 1063,0 50,0 F 70 : 45 1021,0 50,0

As figuras 3, 4 e 5 mostram claramente que o amido obtido das plantas transformadas difere do amido das plantas de tipo selvagem particularmente no facto de a viscosidade aumentar apenas muito ligeiramente durante o aquecimento. Assim, durante o aquecimento, a viscosidade máxima do amido modificado das plantas transformadas é mais do que 50 % inferior ao do caso do amido de tipo selvagem.

Durante o arrefecimento, por outro lado, a viscosidade do amido isolado das plantas transformadas aumenta mais do que no caso das plantas de tipo selvagem. b) Determinação do teor de fosfato do amido O teor de fosfato do amido determinou-se medindo a quantidade de fosfato ligado à posição de C-6 dos resíduos de glicose. Para este fim, primeiro degradou-se o amido por hidrólise ácida e determinou-se em seguida o teor de glicose-6-fosfato, por meio de um ensaio da enzima, tal como se descreve a seguir. 66

Fez-se a incubação de 100 mg de amido em 500 μΐ, de HC1 0,7 N, durante 4 horas a 100 °C. Depois da hidrólise ácida, adicionou-se 10 μΐ da mistura reaccional a 600 μΐι de tampão de imidazole (imidazole 100 mM, MgCl2 5 mM, a pH 6,9, NAD+ 0,4 mM) . Determinou-se a quantidade de glicose-6-fosfato na mistura reaccional por conversão com a enzima glicose-6-fosfato-desidrogenase. Para este fim, adicionou-se 1 u de glicose-6-fosfato-desidrogenase (a partir de mesenteroides de Leuconostoc (Boehringer Mannheim)) à mistura reaccional e determinou-se a quantidade de NADH produzida medindo a absorção a 340 nm. 0 teor de glícose-6-fosfato de 1 mg de amido está indicado no quadro seguinte para as plantas de batatas não transformadas da variedade Désirée, assim como para as duas linhas (PI (35S-anti-RL); P2(35S-anti-RL)) das plantas transgénicas de batata que tinham sido transformadas com o plasmido p35S-anti-RL.

Quadro 4

Plantas nmole de glicose-6-fosfato/mg de ç, ”0 amido de tipo selvagem 12,89 ± 1,34 100 PI (35S-anti-RL) 2,25 ± 0,41 17,4 P2 (35S-anti-RL) 1,25 ± 0 9,7 O quadro que se segue mostra o teor de glicose-6-fosfato por miligrama de amido de batata em plantas de batata que foram transformadas com o plasmido pB33-anti-RL, comparado com o amido de plantas não transformada (S. tuberosum c.v. Désirée). 67

Quadro 5

Plantas nmole de glicose-6- fosfato/mg de amido de tipo selvagem 9,80 ± 0,68 100 7 4,50 ±0,73 45,9 37 2,64 ± 0,99 26,9 45 1,14 ± 0,44 11,6 31 1,25 ± 0,49 12,8 As plantas 7, 37, 45 e 31 representam transformantes independentes que tinham sido transformados com o plasmido pB33- •anti- •RL. A planta 37 representa a linha P3 para a qual se desenha um gráfico de Brabender na figura 5.

Os valores mostram que o teor de fosfato do amido modificado das plantas transgénicas de batata ê pelo menos 50 % inferior quando comparado com o amido das plantas de tipo selvagem.

c) Determinação do teor de glicose, frutose e sacarose dos tubérculos depois da armazenagem a 4 °C

Tubérculos de plantas de várias linhas transgénicas que tinham sido transformadas com o p35S-anti-RL de estrutura de sentido inverso, assim como tubérculos de plantas de tipo selvagem armazenados a 4 °C ou, respectivamente, a 20 °C, na escuridão, durante dois meses. Em seguida, determinaram-se as quantidades de glicose, frutose e sacarose. Para duas linhas transgénicas, os valores representativos obtidos foram os seguintes: 68

Quadro 6

Glicose Frutose Sacarose 20 °C 4 °C 20 °C 4 °C 20 “C 4 °C De tipo selvagem 0,84 55,4 0,52 52,8 8,5 13,1 cv Désirée Linha 1,12 5,7 0,75 7,8 7,5 10,1 transgénica 15 Linha 1,00 6,4 0,75 7,5 5,9 6,9 transgénica 11 Os valores no quadro estão indicados em μτηοΐθ de hexose ou sacarose/g de peso fresco

Dos valores do quadro 6, torna-se óbvio que a acumulação dos açúcares redutores nos tubérculos é consideravelmente mais baixa nas plantas transgénicas armazenadas a 4 “C do que em plantas de tipo selvagem.

Considerando tudo, o amido modificado isolado das plantas transgénicas da batata parece-se com o amido das plantas de milho do tipo selvagem. Contudo, em comparação, tem a vantagem de que o seu gosto é neutro e que por isso é mais apropriado para várias utilizações na área dos produtos comestíveis.

Exemplo 9

Expressão da inserção de ADNc do plasmido pRL2 em E. coli (a) Transformação das células bacterianas

Para expressar a inserção de ADNc do plasmido pRL2, transformam-se primeiro as células da estirpe DH5a de E. 69 coli com o plasmido pACAC. Este plasmido contém um fragmento de ADN que codifica a ADP-glicose-pirofosforilase (AGPase) de E. coli, sob o controlo do promotor lac Z. 0 fragmento tinha sido isolado do vector pEcA-15 como um fragmento de Dral/HaelI com uma dimensão de cerca de 1,7 kb (ver B. Muller-Ròber (1992), dissertação, fu Berlin) e depois de se preencher nas suas extremidades pegajosas, tinha sido clonado num vector do pACAC184 linearizado com HindIII. A expressão de AGPase causa um aumento da síntese do glicogénio nas células de E. coli transformadas. As células transformadas deste modo serão a seguir designadas por células Kl de E. coli.

Para determinar a actividade da enzima da proteína codificada pelo ADNc do plasmido pRL2, transformaram-se as células Kl de E. coli com o plasmido pACAC. As células de E. coli transformadas que contêm o plasmido pACAC assim como o plasmido pRL2 serão a seguir designadas por células K2 de E. coli. A transferência do ADN do plasmido para as células bacterianas foi realizada de acordo com o processo de Hanahan (J. Mol. Biol. 166 (1983), 557-580). As células de E. coli transformadas foram colocadas em placas de pratos de cultura de agar com a seguinte composição:

Meio YT contendo:

1,5 % 50 mM 1% 10 pg/mL ou 10 μg/mL 10 pg/mL

Bacto agar

Tampão de fosfato de sódio, pH 7,2 Glicose

Cloranfenicol no caso das células Kl de E. coli Cloranfenicol e

Ampicilina no caso das células de E. coli K2 70

As células de Escherichia coli da estirpe DH5cx que tinham sido transformadas com o plasmido pRL2 + pACAC (células K2 de E. coli) e também - para controlo - apenas com o plasmido PACAC (células Kl de E. coli) cresceram em placas de agar. 0 glicogénio formado das várias culturas foi examinado no que respeita ao grau de fosforilação (na posição C-6 da molécula de glicose), tal como se descreve a seguir. (b) Isolamento do glicogénio bacteriano

Para isolar o glicogénio bacteriano, a colónia de bactérias que tinham crescido depois da transformação flutuaram de cada uma das 6 placas de agar (0 13 5 mm) com 5 mL de meio YT para cada placa. A suspensão bacteriana foi centrifugada a 4500 x g durante 5 minutos. O rompimento da bactéria foi realizado por meio da adição de 2 volumes de meio de rompimento (NaOH 0,2 N; 1% de SDS) e por incubação à temperatura ambiente, durante 5 minutos. Adicionando 3 volumes de EtOH abs., incubando a 4 °C durante 30 minutos e a centrifugando em seguida a 8000 x g durante 15 minutos, sedimentou o glicogénio. Depois, lavou-se o precipitado com 100 mL de EtOH a 70 % e sedimentou novamente por meio da etapa de centrifugação (10 minutos a 8000 x g) . O processo de lavagem foi repetido quatro vezes. (c) Determinaçãodo teor total de glicogénio

Primeiro degradou-se o glicogénio isolado e sedimentado em moléculas simples de glicose por meio de hidrólise ácida (dissolvendo o precipitado em 2 mL de HC1 0,7 N; incubando-se durante 4 horas a 100 °C) . O teor de glicose da solução foi determinado por meio de uma reacção 71 enzimática acoplada a um ensaio de amido com um fotómetro (Kontron) a um comprimento de onde de 340 nm, de acordo com as instruções dos fabricantes (Boehringer Mannheim). O tampão de reacção contém:

MOPS , a pH 7,5 100 mM MgCl2 10 mM EDTA 2 mM NADP LD CM O ATP 1 mM Glicose-6-fosfato-desidrogenase 1 U/mL hexocinase 2 U/mL A medição foi feita a 25 °C com 10 pL de uma solução de glicose. (d) Determinação do teor de glicose-6-fosfato

Para determinar o teor de moléculas de glicose fosforiladas na posição C-6, utilizaram-se quantidades iguais de glicose de várias culturas de bactérias. Adicionando os mesmos volumes de KOH 0,7 N aos glicogénios degradados nas suas moléculas de glicose por hidrólise ácida (tal como antes), a solução foi neutralizada. O tampão da reacção contém:

MOPS , a pH 7,5 100 mM MgCl;, 10 mM 3DTA 2 mM NADP 0,25 mM ATP 1 mM Glicose-É-fosfato-desidrogenase 2 U/mL 72 A medição foi feita a 25 °C com uma solução de 100 a 150 pL de glicose. (e) Identificação de uma actividade de enzima fosforilando o glicogénio bacteriano

Os resultados da determinação do teor de fosfato do glicogénio sintetizado nas células bacterianas mostram que o glicogénio das células de E. coli, que tinham sido transformadas com os plasmidos pACAC + pRL2, exibem um aumento da fosforilação de 290 + 25 % na posição 0 6 da glicose, em comparação com a mistura reaccional de controlo (células de E. coli transformadas com o plasmido pACYC) (ver o quadro seguinte). Células de E. coli Glicose-6-fosfase: glicose em glicogénio E. COli Kl 1 : (4600 ± 1150) E. coli K2 1 : (1570 ± 390)

Os graus de fosforilação indicados aqui são o valor médio de pelo menos 6 medições partindo de 6 transformações independentes e dos isolamentos de glicogénio.

Exemplo 10

Integração do plasmido p35S-anti-RL em combinação com o plasmido p35SH-anti-BE no genoma de plantas de batata O plasmido p35S-anti-RL foi construído como se descreveu no exemplo 6. Construíu-se o plasmido p35SH-anti-BE conforme descrito no pedido de patente de invenção WO 95/07355, no exemplo 3. Ambos os plasmidos foram transferidos 73 sequencialmente para plantas de batata por meio de uma transformação mediada por Agrobacterium, tal como se descreveu antes. Com esta finalidade, transformou-se primeiro o plasmido p35SH-anti-BE em plantas de batata. Regeneraram-se plantas completas e seleccionaram-se para uma expressão reduzida do gene da enzima ramificada. Em seguida, transformou-se o plasmido p35S-anti-RL nas plantas transgénicas que mostravam jã uma expressão reduzida da enzima de ramificação. A partir das células transformadas, as plantas transgénicas foram novamente regeneradas e as plantas transformadas foram cultivadas em condições de estufa. Analisando o ARN total numa análise de mancha do ARN, no que respeita ao desaparecimento dos transcritos complementarmente ao ADNc da enzima ramificada ou o ADNc de RL, avaliou-se o sucesso da modificação genética das plantas no que respeita a uma expressão altamente reduzida do gene da enzima ramificada assim como no que respeita a uma expressão altamente reduzida do gene RL. Para este fim, isolou-se o ARN total das folhas de plantas transformadas de acordo com os processos descritos e subsequentemente separou-se por meio de electroforese em gel, transferiu-se para uma membrana, hibridou-se com uma sonda marcada radioactivamente mostrando a sequência indicada na Seq ID N° 1 ou uma parte dela e depois foi hibridada com uma sonda marcada radioactivamente mostrando a sequência do ADNc da enzima de ramificação (ver patente de invenção WO 92/14827, exemplo 1) ou uma parte dela. Na análise de mancha de ARN, em cerca de 5 % - 10 % das plantas transformadas, a banda indicava o transcrito específico da sequência indicada sob a designação de Seq ID N° 1, assim como faltava a banda indicando o transcrito específico do ADNc da enzima de ramificação (ver patente de invenção WO 92/14827) . Estas plantas, que foram designadas por plantas R4 foram utilizadas para a análise da qualidade do amido contido nos tubérculos. 74

Exemplo 11

Integração do plasmido pB33-anti-RL em combinação com o plasmido pB33-anti-SALGAI no genoma de plantas de batata

Construiu-se o plasmido pB33-anti-RL tal como se descreveu no exemplo 7. Construiu-se o plasmido pB33-anti-SALGAI como se segue:

Ligou-se o fragmento Dral/Dral da região promotora do gene B3 3 da classe I da patatina a partir de Solanum tuberosum compreendendo os nucleótidos -1512 a +14 (Rocha-Sosa et al., EMBO j 8 ¢1989), 23-29) no sítio de Smal do plasmido pUCIS. Do plasmido resultante, ligou-se o fragmento de promotor numa região de poli-ligante do plasmido pBin 19 (Bevan, Nucleic Acids Research 12 (1984), 8711-8721) como um fragmento de EcoRI/HindIII. Em seguida, o fragmento de EcoRI de 3' de 1181 a 2511 do gene SALGAI de Solanum tuberosum (Hergersberg, dissertação (1988) , Universidade de Colónia) foi ligado no sítio de clivagem de EcoRI do plasmido resultante.

Ambos os plasmidos foram transferidos sequencialmente para plantas de batata por meio de uma transformação mediada por Agrobacterium, tal como descrito no exemplo 10. A partir das células transformadas, regeneraram-se plantas completas e cultivaram-se as plantas transformadas, em condições de estufa. Analisando o ARN completo numa análise de mancha de ARN no que respeita ao desaparecimento dos transcritos complementares aos dois ADNcs, avaliou-se o sucesso da modificação genética das plantas. Com este objectivo, isolou-se o ARN total dos tubérculos das plantas transformadas, de acordo com processos padrão e em seguida separou-se em gel de agarose por meio de electroforese em gel, transferindo para a 75 membrana e hibridando com uma sonda marcada radioactivamente, exibindo a sequência indicada na Seq ID N° 1 ou uma parte dela. Depois, hibridou-se a mesma membrana com uma sonda marcada radioactivamente comportando a sequência do gene SALGAI ou uma parte desta sequência (Hergersberg, dissertação (1988), Universidade de Colónia). Na análise de mancha de ARN, em cerca de 5 % - 10 % das plantas transformadas, a banda indica a hibridação dos transcritos com o ADNc da presente invenção ou o ADNc de SALGAI estava faltando. A partir dos tubérculos destas plantas, que se designaram por plantas R3, isolou-se e analisou-se o amido.

Exemplo 12

Análise do amido de plantas R4

Examinaram-se as plantas de batata transformadas de acordo com o exemplo 10, no que respeita as propriedades do amido sintetizado. Realizaram-se as análises com várias linhas das plantas de batata que tinham sido transformadas com os plasmidos p35S-anti-RL e p35SH-anti-BE e que já não exibiam - ou só exibiam de uma forma muito reduzida - as bandas que indicavam a hibridação dos transcritos com as sequências de ADN da presente invenção ou com a sequência do ADNc de ramificação na análise de mancha de ARN. a) Determinação da viscosidade de soluções aquosas do amido

Para determinar a viscosidade das soluções aquosas do amido sintetizado nas plantas de batata transformadas, isolou-se o amido dos tubérculos das plantas que tinham sido transformadas com o plasmido p35S-anti-RL e o plasmido p35SH-anti-BE utilizando processos padrão. Dissolveu-se 2 g de cada um dos amidos em 25 mL de H20 e 76 utilizou-se para análise com um Analisador rápido de viscosidade (Newport Scientific Pty Ltd, Investment Support Group, Warriewood NSW 2102, Austrália). Utilizou-se o equipamento de acordo com as instruções do fabricante. Para determinar a viscosidade da solução aquosa do amido, aqueceu-se primeiro a suspensão de amido de 50 °C para 95 °C com uma velocidade de 12 °C por minuto. Manteve-se então a temperatura a 95 °C durante 2,5 minutos. Depois, arrefeceu-se a solução de 95 °c para 50 °C com uma velocidade de 12 °C por minuto. Durante todo o processo, mediu-se a viscosidade. Os resultados representativos dessas medições são dados sob a forma de gráficos em que se mostra que a viscosidade depende do tempo. A figura 6 mostra um gráfico de ARV típico para amido isolado de plantas de tipo selvagem de batata da variedade Désirée. As colunas 2 e 3 mostram um gráfico de ARV típico para amido isolado de tubéculos de plantas que tinham sido transformadas com o plasmido p35S-anti-RL e o plasmido p35SH-anti-BE, respectiva-mente. A linha 4 mostra um gráfico de ARV típico para amido isolado de tubéculos de plantas que tinham sido transformadas com o plasmido p35SH-anti-BE em combinação com o plasmido p35S-anti-RL. A coluna 4 é caracterizada pelo facto de o aumento da viscosidade não ser dependente da temperatura. b) Determinação da relação amilose/amilopectina

Examinou-se o amido que foi isolado de tubéculos de plantas de batata que tinham sido transformadas, no que respeita à relação entre amilose e amilopectina. A linha de plantas R4-1 (mostrada na coluna 4 da fig. 6) exibiu um teor de amilose de mais do que 70 %. Para a linha de plantas R4-3, mediu-se um valor de amilose de 27 %, em 77 que o teor de amilose no amido de tipo selvagem da variedade Désirée varia entre 19 e 22 %.

Exemplo 13

Análise do amido das plantas R3

As plantas de batata transformadas de acordo com o exemplo 11 foram examinadas no que respeita às propriedades do amido sintetizado. As análises foram realizadas com várias linhas de plantas de batata que tinham sido transformadas com os plasmidos pB33-anti-RL e pB33-anti-SALGAI que já não exibiam - ou só exibiam de uma forma extremamente reduzida -as bandas que indicavam a hibridação dos transcritos com as sequências de ADN da presente invenção ou com as sequêncis do ADNc de SALGAI na análise de mancha de ARN. a) Determinação da viscosidade de soluções aquosas do amido

Para determinar a viscosidade das soluções aquosas do amido sintetizado nas plantas de batata transformadas, isolou-se o amido dos tubérculos das plantas que tinham sido transformadas com o plasmido pB33-anti-RL em combinação com o plasmido pB33-anti-SALGAI utilizando processos padrão. Determinou-se a viscosidade por meio de um Analisador rápido de viscosidade, de acordo com o processo descrito no exemplo 12, parte a. Os resultados estão indicados na figura 7. Na linha 1 da figura 7, mostra-se um gráfico de ARV típico para amido isolado de plantas de tipo selvagem de batata da variedade Désirée. As linhas 2 e 3 mostram gráficos de ARV típicos para amidos isolados de plantas de batata que tinham sido transformadas com o plasmido pB33-anti-SALGAI e com o 78 plasmido pB33-anti-RL, respectivamente. A linha 4 mostra um gráfico de ARV típico para amido isolado de plantas de batatas que tinham sido transformadas com o plasmido pB33-anti-SALGAI em combinação com o plasmido pB33S-anti-RL. Este gráfico é caracterizado pelo facto de faltar a viscosidade máxima e o aumento da viscosidade a 50 °c. Além disso, este amido é caracterizado pelo facto de a cola obtida depois do tratamento da ARV, quase não exibir retrogradação depois da incubação à temperatura ambiente durante vários dias. b) Determinação da relação amilose/amilopectina

Examinou-se o amido que foi isolado de tubéculos de plantas de batata que tinham sido transformadas, no que respeita à relação amilose para amilopectina. A linha de plantas R3-5 (mostrada na linha 4 da fig. 7) exibiu um teor de amilose inferior a 4 %. Para a linha de plantas R3-6, mediu-se um teor de amilose inferior a 3 %. 0 teor de amilose no amido de tipo selvagem da variedade Désirée varia entre 19 e 22 %. c) Determinação do teor de fosfato do amido

Determinou-se o teor de fosfato do amido medindo a quantidade de fosfato ligado na posição C-6 dos resíduos de glicose. Com esta finalidade, primeiro degradou-se o amido por meio de hidrólise ácida e em seguida determinou-se o teor de glicose-6-fosfato, por meio de um ensaio da enzima, tal como se descreve a seguir.

Fez-se a incubação de 100 mg de amido em 500 pL de HC1 0,7 N, durante 4 horas, a 100 °C. Depois da hidrólise ácida, adicionou-se 10 μΐί da mistura reaccional a 600 μ]3 79 de tampão de imidazole (imidazole 100 mM, MgCl2 5 mM, a pH 6,9, NAD+ 0,4 mM) . A quantidade de glicose-6-fosfato na preparação é determinada pela conversão com a enzima glicose-6-fosfato-desidrogenase. Para este fim, adicionou-se 1 U de glicose-6-fosfato-desidrogenase (de Leuconostoc mesenteroides (Boehringer Mannheim)) à mistura reaccional e determinou-se a quantidade de NADH produzida por meio da absorção a 340 nm. 0 teor de glicose-6-fosfato em 1 mg de amido está indicado no quadro que se segue para as plantas de batata não transformadas da variedade Désirée, assim como para a linha R3-5 e a linha R3-6 das plantas de batata transgénicas que tinham sido transformadas com pB33-anti-RL em combinação com o plasmido pB33-anti-SALGAI. Como comparação, o valor do amido da chamada batata cerosa (US2-10) que tinha sido transformada com o plasmido pB33-anti-SALGAI, está também identificado.

Quadro 7

Plantas nmole de glicose-6-fosfato/mg de % De tipo selvagem amido R3-5 9,80 ± 0,68 100 R3-6 1,32 ± 0,10 13 US2-10 1,37 ± 0,15 14 10,82 ±0,42 100

Exemplo 14

Isolamento de uma sequência de ADNc que codifica uma enzima RI do milho Zea

Infectaram-se bactérias da estirpe azul de XL1 com fagos lambda cujas cabeças continham uma biblioteca de ADNc de tecido de tecido de endoesperma de milhos Zea (Stratagene, Heidelberg). As células de E. coli infectadas foram colocadas em placa em pratos de Petri médios com uma densidade de cerca de 25000 placas por aproximadamente 75 cm2. Passadas cerca de 9 horas de incubação colocaram-se filtros de nitro-celulose nas bactérias lisadas e retiraram-se após um minuto. Incubou-se primeiro o filtro em NaOH 0,5 M, NaCl 1,5 M durante dois minutos, depois em Tris HCL 0,5 M a pH 7,0 durante dois minutos, em seguida lavou-se em 2 x SSC durante dois minutos. Depois de se secar e de se fixar por reticulação com UV incubaram-se os filtros em tampão A durante 3 horas antes de se adicionar a sonda de ADN marcada radioactivamente (iniciação aleatória). Utilizou-se como sonda um fragmento da inserção do ADN do plasmido pRL2 (ver exemplos 4 e 5) com uma dimensão de aproximadamente 2,7. Este fragmento foi cortado com as enzimas de restrição XHol e HindIII e representou a extremidade 3' da inserção de ADNc em pRL2 (ver figura 8).

Depois da hibridação durante 12 horas a 48 °C lavaram-se os filtros durante 1 x 10 minutos em 2 x SSC/SDS a 1 % à temperatura ambiente e depois durante 2 x 20 minutos em 1 x SSC/SDS a 0,5 % a 35 °C e em seguida fez-se uma auto-radiografia.

Os fagos de clones que compreendem uma inserção de ADNc foram separados em três ciclos de rastreio. Assim, quando se rastreou cerca de 1.500.000 placas de fago, identificaram-se aproximadamente 6 placas. Estes clones positivos de fagos foram utilizados para a excisão in vivo de um plasmido pBluescript de acordo com processos normalizados. As sequências de ADNc das inserções correspondentes foram determinadas de acordo com o processo de Sanger et al. (Proc. 81

Natl. Acad. Sei. EUA 74 ¢1977), 5463-5467). Assim, podia identificar-se um certo número de clones contendo inserções que codificam uma enzima RI do milho. A inserção de ADNc de um clone apropriado, RIM, foi completamente determinada. A sequência de ácido nucleico está indicada na Seq ID n" 5. A sequência de aminoácidos dela derivada está indicada na Seq ID n° 6.

Isolou-se uma inserção de ADNc apropriada do clone RIM do derivado de pBluescript por Notl e Xhol por meio de processos padrão (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 a edição, Cold Spring Harbour Laboratory Press, (1989), NY, EUA). Carregaram-se as extremidades pegajosas e inseriu-se o fragmento no vector pUBIbar no sítio Hpal. Este plasmido pode ser utilizado para as células de plantas transformadas, particularmente milho, de acordo com os processos descritos antes. Dado que a sequência descrita na Seq ID n° 5 representa apenas uma sequência parcial de ADNc, aplicaram-se outras técnicas para isolar sequências que representam a extremidade 5' do ADNc. Com este fim isolou-se ARN de poliA+ de tecido de folhas de milho de acordo com processos padrão. 0 ARN isolado foi utilizado para uma reacção em cadeia de polimerase utilizando o sistema de RCP-TI num tubo Titan™ (Boehringer Mannheim, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Nesta reacção o ARN é transcrito numa primeira etapa para ADNc que é então utilizado como uma matriz para a RCP. Como iniciadores utilizaram-se os seguintes oligunucleõtidos:

Iniciador 1 (Seq ID n° 9): 5' GCAAAGTTTT CAAGGACAAG ACTGATGAAG 3'

Iniciador 2 (Seq ID n° 10): 5' GCAGATGGCA CGACAGTGTA CAAGAACA 3' 82 e

Iniciador 6 (Seq ID N° 11) 5' AATGACTGCA AAGGIGGIAT GATGGA 3' A combinação dos iniciadores 1 e 6 conduziu a um fragmento de 560 pb. A combinação dos iniciadores 1 e 2 levou a um fragmento de RCP de 2289 pb. Ambos os fragmentos foram sequenciados. A sequência obtida representa a maior parte da estremidade 5' do ADNc. A sequência completa do clone parcial de ADNc e a sequência obtida por RCP conforme descrito antes, está descrita na Seq ID n° 7. A sequência de aminoácidos derivada está descrita na Seq ID n° 8. A comparação com o ADNc de comprimento completo da batata revelou que a sequência obtida ainda não está provavelmente completa e que faltam cerca de 420 pb da extremidade 5' . Esta parte da sequência que falta pode ser completada por processos bem conhecidos dos especialistas na matéria. É possível, por exemplo, isolar a extremidade 5' do ADNc utilizando o processo RACE de 5' pode utilizar-se, por exemplo, o kit de amplificação do ADNc Marathon (Clontech).

Outras possibilidades para isolar o ADNc completo consistem em utilizar, por exemplo, uma biblioteca de ADNc de ZAP lambda de milho (Stratagene), imuno-rastreio de bibliotecas de expressão ou na utilização de processos padrão de hibridação. 83

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: (A) NOME: PantTec Biotechnologies GmbH Forschung & Entwicklung (B) ENDEREÇO: Hermammswerder 14 (C) CIDADE: Potsdam

(E) PAÍS: DE (F) CÓDIGO POSTAL: 14473 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Novas moléculas de ácido nucleico de milho e a sua utilização para a produção de amido modificado (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 11 (iv) VERSÃO LISÍVEL EM COMPUTADOR: (A) SUPORTE DOS DADOS: Floppy disk

(B) COMPUTADOR: compatível com IBM PC

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versãp #1.30 (EPA) (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 4856 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: helicoidal simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Solanum tuberosum (B) ESTIRPE: C.V. Berolina (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO:105..4497 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: CATCTTCATC GAATTTCTCG AAGCTTCTTC GCTAATTTCC TGGTTTTTTC ACTCAAAATC 60 GACGTTTCTA QCTGAACTTG AGTGAATTAA GCCAGTGGGA GGAT ATG AGT AAT TCC 116

Met Ser Asn Ser 1 TTA GGG AAT AAC TTG CTG TAC CAG GGA TTC CTA ACC TCA ACA GTG TTG 164 Leu Gli Asn Asn Leu Leu Tir Gin Gli Fen Leu Tre Ser Tre Vai Leu 5 10 15 20 GAA CAT AAA AGT ASA ATC AGT CCT CCT TGT GTT GGA GGC AAT TCT TTG 212 Glu His Lis Ser Arg Ile Ser Pro Pro Cís Vai G11 Gli Asn Ser Leu 25 30 35 CAA CAA CAA GTG ATC TCG AAA TCA CCT TTA TCA ACT GAG TTT CGA 260 Fen Gin Gin Gin Vai Ile Ser Lis Ser Pro Leu Ser Tre Glu Fen Arg 40 45 50 GGT AAC AGG TTA AAG GTG CAG AAA AAG AAA ATA CCT ATG GAA AAG AAG 308 Gli Asn Arg Leu L r s Vai Gin Li S Lis LÍS Ile Pro Met Glu Lis Lis 55 60 65 CGT GCT TTT TCT AGT TCT CCT CAT GCT GTA ctt ACC ACT GAT ACC TCT 356 Arg Ala Fen Ser Ser Ser Pro His Ala Vai Leu Tre Tre Asp Tre Ser 70 75 80 TCT GAG CTA GCA GAA AAG TTC AGT CTA GGG GGG AAT ATT GAG CTA CAG 404 Ser Glu Leu Ala Glu LÍS Fen Ser Leu Gli Gli Asn lie Glu Leu Gin 85 90 95 100 85 452

GTT GAT GTT AGG CCT ccc ACT TCA GGT GAT GTG TCC TTT GTG GAT TTT Vai Asp Vai Arg Pro Pro Tre Ser Gli Asp Vai Ser Fen Vai Asp Fen 105 110 115 CAA GTA ACA AAT GGT AGT GAT AAA GTG TTT TTG CAC TCG GGG GCA GTA Gin Vai Tre Asn Gli Ser Asp Lis Leu Fen Leu His Trp Gli Ala Vai 120 125 130 AAA TTC GGG AAA GAA ACA TGG TCT CTT CCG AATGAT CGT CCA GAT GGG Lis Fen Gli Lis Glu Tre Trp Ser Leu Pro Asn Asp Arg Pro Asp Gli 135 140 145 ACC AAA GTG TAC AAG AAC AAA GCA CTT AGA ACT CCA TTT GTT AAA TCT Tre Lis Vai Tir Lis Asn Lis Ala Leu Arg Tre Pro Fen Vai Lis Ser 150 155 160 GGC TCT AAC TCC ATC CTG AGA CTG GAG ATA CGA GAC ACT GCT ATC GAA Gli Ser Asn Ser Ile Leu Arg Leu Glu Ile Arg Asp Tre Ala Ile Glu 165 170 175 180 GCT ATT GAG TTT CTC ATA TAC GAT GAA GCC CAC GAT AAA TGG ATA AAG Ala 11a Glu Fen Leu Ile Tir Asp Glu Ala His Asp Lis Trp Ile Lis 185 190 195 AAT AAT GGT GGT AAT TT'T CGT GTC AAA TTG TCA AGA AAA GAG ATA CGA Asn Asn Gli Gli Asn Fen Arg Vai Lis Leu Ser Arg Lis Glu Ile Arg 200 205 210 GGC CCA GAT GTT TCT GTT CCT GAG GAG CTT GTA CAG ATC CAA TCA TAT Gli Pro Asp Vai Ser Vai Pro Glu Glu Leu Vai Gin Ile Gin Ser Tir 215 220 225 TTG AGG TGG GAG AGG AAG GGA AAA CAG AAT TAC CCC CCT GAG AAA GAG Leu Arg Trp Glu Arg Lis Gli Lis Gin Asn Tir Pro Pro Glu Lis Glu 230 235 240 AAG GAG GAA TAT GAG GCT GCT CGA ACT GTG CTA CAG GAG GAA ATA GCT Lis Glu Glu Tir Glu Ala Ala Arg Tre Vai Leu Gin Glu Glu Ile Ala 245 250 255 260 CGT GGT GCT TCC ATA CAG GAC ATT CGA GCA AGG CTA &CA AAA ACT AAT 500 548 596 644 692 740 788 836 884 932 86

Arg Gli Ala Ser Ile Gin Asp Ile Arg Ala Arg Leu Tre Lis Tre Asn 265 270 275 GAT AAA AGT CAA AGC AAA GAA GAG CCT CTT CAT GTA ACA AAG AGT GAT 980 Asp Lis Ser Gin Ser Lis Glu GlU Pro Leu His Vai Tre Lis Ser Asp 280 285 290 ATA CCT GAT GAC CTT GCC CAA GCA CAA GCT TAC ATT AGG TGG GAG AAA 1028 Ile Pro Asp Asp Leu Ala Gin Ala Gin Ala Tir Ile Arg Trp Glu Lis 295 3 00 305 GCA GGA AAG CCG AAC TAT CCT CCA QAA AAG CAA ATT GAA GAA CTC GAA 1076 Ala Gl i Lis Pro Asn Tir Pro Pro Glu Lis Gin Ile Glu Glu Leu Glu 310 315 320 GAA GCA AGA AGA GAA TTG CAA CTT GAG CTT GAG AAA GGC ATT ACC CTT 1124 Glu Ala Arg Arg Glu Leu Gin Leu Glu Leu Glu Lis Gl i Ile Tre Leu 325 330 335 340 GAT GAG TTG CGG AAA ACG ATT ACA AAA GGG GAG ATA AAA ACT AAG GTG 1172 Asp Glu Leu Arg Lis Tre Ila Tre Lis Gli Glu Ile Lis Tre Lis Vai 345 350 355 GAA AAG CAC CTG AAA AGA AGT TCT TTT GCC GTT GAA AGA ATC CAA AGA 1220 Glu Lis His Leu Lis Arg Ser Ser Fen Ala Vai Glu Arg Ile Gin Arg 360 365 370 AAG AAG AGA GAC TTT GGG CAT CTT ATT AAT AAG TAT ACT TCC AGT CCT 1268 Lis Lis Arg Asp Fen Gli His Leu Ile Asn Lis Tir Tre Ser Ser Pro 375 380 385 GCA GTA CAA GTA CAA AAG GTC TTG GAA GAA CCA CCA GCC TTA TCT AAA 1316 Ala Vai Gin Vai Gin i-ji s Vai Leu Glu Glu Pro Pre Ala Leu Ser Lis 390 395 400 ATT AAC CTG TAT GCC AAG GAG AAG GAG GAG CAG ATT GAT GAT CCG ATC 1364 Ile Lis Leu Tir Ala Lis Glu Lis Glu Glu Gin Ile Asp Asp Pre Ile 405 410 415 420 CTA AAT AAA AAG ATC TTT AAG GTC GAT GAT GGG GAG CTA CTG GTA CTG 1412 Leu Asn Lis Lis Ile Fen Lis Vai Asp Asp Gli Glu Leu Leu Vai Leu 87 425 430 435 GTA GCA AAG TCC TCT GGG AAG ACA AAA GTA CAT CTA GCT ACA GAT CTG 1460 Vai Ala Lis Ser Ser Gli Lis Tre Lis Vai His Leu Ala Tre Asp Leu 440 445 450 AAT CAG CCA ATT ACT CTT CAC TGG GCA TTA TCC AAA AGT CCT GGA GAG 1508 Asn Gin Pro Ile Tre Leu Eis Trp Ala Leu Ser Lis Ser Pro Gli Glu 455 460 465 TGG ATG GTA CCA CCT TC A AAG ATA TTG CCT CCT GGG TCA ATT ATT TTA 1556 Trp Met Vai Pro Pro Ser Ser Ile Leu Pro Pro Gli Ser Ile Ile Leu 470 475 480 GAC AAG GCT GCC GAA ACA CCT TTT TCA ccc AGT TCT TCT GAT GGT CTA 1604 Asp Lis Ala Ala Glu Tre Pro Fen Ser Ala Ser Ser Ser Asp Gli Leu 485 490 495 500 ACT TCT AAG GTA CAA TCT TTG GAT ATA GTA ATT GAA GAT GGC AAT TTT 1652 Tre Ser Lis Vai Gin Ser Leu Asp Ile Vai Ile Glu Asp Gli Asn Fen 505 510 515 GTG GGG ATG CCA TTT GTT CTT TTG TCT GGT GAA AAA TGG ATT AAG AAC 1700 Vai Gli Met Pro Fen Vai Leu Leu Ser Gli Glu Lis Trp Ile Lis Asn 520 525 530 GAA GGG TCG GAT TTC TAT GTT GGC TTC AGT GCT GCA TCC AAA TTA GCA 1748 Gin Gli Ser Asp Fen Tir Vai Gli Fen Ser Ala Ala Ser Lis Leu Ala 535 540 545 CTC AAG GCT GCT GGG GAT GGC AGT GGA ACT GCA AAG TCT TTA CTG GAT 1796 Leu Lis Ala Ala Gli Asp Gli Ser Gli Tre Ala Lis Ser Leu Leu Asp 550 555 560 AAA ATA GCA GAT ATG GAA AGT GAG GCT CAG AAG TCA TTT ATG CAC CGG 1844

Lis Ile Ala Asp Met alu Ser Glu Ala Gin Lis Ser Fen Met His Arg 565 570 575 580 TTT AAT ATT GCA GCT GAC TTG ATA GAA GAT GCC ACT AGT GCT GGT GAA 1892 Fen Asn Ile Ala Ala Asp Leu Ile Glu Asp Ala Tre Ser Ala Gli Glu 585 590 595 88 CTT GGT TTT CGT GGA ATT CTT GTA TGG ATG AGG TTC ATG GCT ACA AGG Leu Gli Fen Ala Gli Ile Leu Vai Trp Met Arg Fen Met Ala Tre Arg 1940 600 605 610 CAA CTG ATA TGG AAC AAA AAC TAT AAC GTA AAA CCA CGT GAA ATA AGC 1988 Gin Leu Ile Trp Asn Lis Asn Tir Asn Vai Lis Pro Arg Glu Ile Ser 615 620 625 AAG GCT CAG GAC AGA CTT ACA GAC TTG TTG CAG AAT GCT TTC ACC AGT 2036 Lis Ala Gin Asp Arg Leu Tre Asp Leu Leu Gin Asn Ala Fen Tre Ser 630 635 640 CAC CCT CAG TAC CGT GAA ATT TTG CGG ATG ATT ATG TGA ACT GTT GGA 2084 His Pro Gin Tir Arg Glu Ile Leu Arg Met Ile Met ser Tre Vai Gli 645 650 655 660 CGT GGA GGT GAA GGG GAT GTA GGA CAG CGA ATT AGG GAT GAA ATT TTG 2132 Arg Gli Gli Glu Gli Asp Vai Gli Gin Arg Ile Arg Asp Glu Ile Leu 665 670 675 GTC ATC CAG AGG AAC AAT GAC TGC AAG GGT GGT ATG ATG CAA GAA TGG 2180 Vai X1 e Gin Arg Asn Asn Asp Cis Lis Gli Gli Met Met Gin Glu Trp 680 685 690 CAT CAG AAA TTG CAT AAT AAT ACT AGT CCT GAT GAT GTT GTG ATC TGT 2228 His Gin Lis Leu His Asn Asn Tre Ser Pro Asp Asp Vai Vai Ile Cis 695 700 705 CAG GCA TTA ATT GAC TAC ATC AAG AGT GAT TTT GAT CTT GGT GTT TAT 2276 Gin Ala Leu Ile Asp Tir Ile Lis Ser Asp Fen Asp Leu Gli Vai Tir 710 715 720 TGG AAA ACC CTG AAT GAG AAC GGA ATA ACA AAA GAG CGT CTT TTG AGT 2324 Trp Lis Tre Leu Asn Glu Asn Gli Ile Tre Lis Glu Arg Leu Leu Ser 725 730 735 740 TAT GAC CGT GCT ATC CAT TCT GAA CCA .AAT AGA GGA GAT CAA AAG 2372 Tir Asp Arg Ala Ile His Ser Glu Pro Asn Fen Arg Gli Asp Gin Lis 745 750 755 GGT GGT CTT TTG CGT GAT TTA GGT CAC TAT ATG AGA ACA TTG AAG GCA 2420 Gli Gli Leu Leu Arg Asp Leu Gli His Tir Met Arg Tre Leu Lis Ala 89 760 765 770 GTT CAT TCA GGT GCA GAT CTT GAG TCT GCT ATT GCA AAC TGC ATG GGC 2468 Vai His Ser Gli Ala Asp Leu Glu Ser Ala Ile Ala Asn Cis Met Gli 775 780 785 TAC AAA ACT GAG GGA GAA GGC TTT ATG GTT GGA GTC CAG ATA AAT CCT 2516 Tir Lis Tre Glu Gli Glu Gli Fen Met Vai Gli Vai Gin Ile Asn Pro 790 795 800 GTA TCA GGC TTG CCA TCT GGC TTT CAG GAC CTC CTC CAT TTT GTC TTA 2564 Vai Ser Gli Leu Pro Ser Gli Fen Gin Asp Leu Leu His Fen Vai Leu 805 810 820 825 GAC CAT GTG GAA GAT AAA AAT GTG GAA ACT CTT CTT GAG AGA TTG CTA 2612 Asp His Vai Glu Asp Lis Asn Vai Glu Tre Leu Leu Glu Arg Leu Leu 625 830 835 GAG GCT CGT GAS GAG CTT AGG CCC TTG CTT CTC AAA CCA AAC AAC CGT 2660 Glu Ala Arg Glu Glu Leu Arg Pro Leu Leu Leu Lis Pro Asn Asn Arg 840 845 850 CTA AAG GAT CAA CTG TTT TTG GAC ATA GCA CTT GAT TCT ACA GTT AGA 2708 Leu Lis Asp Leu Leu Fen Leu Asp Ile Ala Leu Asp Ser Tre Vai Arg 855 860 865 ACA GCA GTA GAA AGG GGA TAT GAA GAA TTG AAC AAC GCT AAT CCT GAG 2756 Tre Ala Vai Glu Arg Gli Tir Glu Glu Leu Asn Asa Ala Asn Pro Glu 870 875 880 AAA ATC ATG TAC TTC ATC TCC CTC GTT CTT GAA AAT CTC GCA CTC TCT 2804 Lis Ile Met Tir Fen Ile Ser Leu Vai Leu Glu Asn Leu Ala Leu Ser 885 890 895 900 GTG GAC GAT AAT GAA GAT CTT GTT TAT TGC TTG AAG GGA TGG AAT CAA 2852 Vai Asp Asp Asp Glu Asp Leu Vai Tir Cis Leu Lis Gli Trp Asn Gin 905 910 915 GCT CTT TCA ATG TCC AAT GGT OOG GAC AAC CAT TGG GCT TTA TTT GCA 2900 Ala Leu Ser Met Ser Asn Gli Gli Asp Asn His Trp Ala Leu Fen Ala 920 925 930 90 AAA GCT GTG CTT GAC AGA ACC CGT CTT GCA CTT GCA AGC AAG GCA GAG Lis Ala Vai Leu Asp Arg Tre Arg Lsu Ala L©u Ala Ser Lis Ala Glu 2948 935 940 945 TGG TAC CAT CAC TTA TTG CAG CCA TCT GCC GAA TAT CTA GGA TCA Ai A 2996 Trp Tir His His Leu Leu Gin Pro Ser Ala Glu Tir Leu Gli Ser Ile 950 955 960 CTT GGG GTG GAC CAA TGG GCT TTG AAC ATA TTT ACT GAA GAA ATT ATA 3044 Leu Gli Vai Asp Gin Trp Ala Leu Asn Ile Fen Tre Glu Glu Ile Ile 965 970 975 980 CGT GGA TCA GCA GCT TCA TTA TCC TCT CTT CTT AAT AGA CTC GAT 3092 Arg Ala Gli Ser Ala Ala Ser Leu Ser Ser Leu Leu Asn Arg Leu Asp 985 990 995 CCC GTG CTT CGG AAA ACT GCA AAT CTA GGA AGT TGG CAG ATT ATC AGT 3140 Pro Vai Leu Arg Lis Tre Ala Asn Leu Gli Ser Trp Gin Ile Ile Ser 1000 1005 1010 CCA Qrjiip GAA GCC £»rprp GGA TAT GTe Qrprp GAG IpipQ CTT TCA 3188 Pro Vai Glu Ala Vai Gli Tir Vai Vai Vai Vai Asp Glu Leu Leu Ser 1015 1020 1025 GTT CAG AAT GAA ATC TAC GAG AAG CCC ACG ATC TTA GTA GCA AAA TCT 3236 Vai Gin Asn Glu Ile Tir Glu Lis Pro Tre Ile Leu Vai Ala Lis Ser 1030 1035 1040 GTT AAA GGA GAG GAG GAA ATT CCT GAT GGT GCT GTT GCC CTG ATA ACA 3284 Vai Lis Gli Glu Glu Glu Ile Pro Asp Gli Ala Vai Ala Leu Ile Tre 1045 1050 1055 1060 CCA GAC ATG CCA GAT GTT CTT TCA CAT GTT TCT GTT CGA GCT AGA AAT 3332 Pro Asp Met Pro Asp Vai Leu Ser His Vai Ser Vai Arg Ala Arg Asn 1065 1070 1075 GGG AAG GTT TGC TTT GCT ACA TGC TTT GAT CCC AAT ATA TTG GCT GAC 3380 Gli Lis Vai Cis Fen Ala Tre Cis Fen Asp Pro Asn Ile Leu Ala Asp 1080 1085 1090 CTC CAA GCA AAG GAA GGA AGG ATT TTG CTC TTA AAG CCT ACA CCT TCA 3428 91

Leu Gin Alei Lis Glu Gli Arg Ile Leu Leu Leu Lis Pro Tre Pro Ser 1095 1100 1105 GAC ATA ATC TAT AGT GAG GTG AAT GAG ATT GAG CTC CAA AGT TCA AGT 3476 Asp Ile Ile Tir Ser Glu Vai Asn Gla Ile Glu Leu Gin Ser Ser Ser 1110 1115 1120 AAC rrirri/·’* A A \J GTA GAA GCT GAA ACT TCA GCA ACA CTT ASA TTG GTG AAA AAG 3524 Asn Leu Vai Glu Ala Glu Tre Ser Ala Tre Leu Arg Leu Vai Lis Lis 1125 1130 1135 1140 CAA TTT GGT GGT TGT TAC GCA ATA TCA GCA GAT GAA TTC ACA AGT GAA 3572 Gin Fen GLi Gli Cis Tir Ala Ile Ser Ala Asp Glu Fen Tre Ser Glu 1145 1150 1X55 ATG GTT GGA GCT AAA TCA CGT AAT ATT GCA TAT CTG AAA GGA AAA GTG 3620 Met Vai Gli Ala Lis Ser Arg Asn Ile Ala Tir Leu Lis Gli Lis Vai 1160 1165 1110 CCT TCC TCG GTG GGA ATT CCT ACG TCA GTA GCT CTT CCA TTT GGA GTC 3668 Pro Ser Ser Vai Gli Ile Pro Tre Ser Vai Ala Leu Pro Fen Gli Vai 1175 1180 1185 ΪΤΤ GAG AAA GTA CTT TCA GAC GAC ATA AAT CAG GGA GTG GCA AAA GAG 3716 Fen Glu Lis Vai Leu Ser Asp Asp Asp Asn Gin Gli Vai Ala Lis Glu 1190 1195 1200 TTG CAA ATT CTG ATG AAA AAA CTA TCT GAA GGA GAC TTC AGC GCT CTT 3764 Leu Gin Ile Leu Met Lis Lis Leu Ser Glu Gli Asp Fen Ser Ala Leu 1205 1210 1215 1220 GGT GAA ATT CGC ACA ACG GTT TTA GAT CTT TCA GCA CCA GCT CAA TTG 3812 Gli Glu Ile Arg Tre Tre Vai Leu Asp Leu Ser Ala pro Ala Gin Leu 1225 1230 1235 GTC AAA GAG CTG AAG GAG AAG ATG CAG GGT tct' GGC ATG CCT TGG ! CCT 3860 Vai Lis Glu Leu Lis Glu Lis Met Gin Gli Ser Gli Met Pro Trp Pro 1240 1245 1250 GGT GAT GAA GGT CCA AAG CGG TGG GAA CAA GCA TGG ATG GCC ATA AAA 3908 92

Gli Asp Glu Gli Pro Lis Arg Trp Glu Gin Ala Trp Met Ala Ile Lis 1255 1260 1255 AAG GTG TGG GCT TCA AAA TGG AAT GAG AGA GCA TAC TTC AGC ACA AGG 3956 Lis Vai Trp Ala Ser Lis Trp Asn Glu Arg Ala Tir Fen Ser Tre Arg 1270 1275 1280 AAG GTG AAA CTG GAT CAT GAC TAT CTG TGC ATG GCT GTC CTT GTT CAA 4004 Lis Vai Lis Leu Asp His Asp Tir Leu Cis Met Alei Vai Leu Vai Gin 1265 1290 1295 1300 GAA ATA ATA AAT GCT GAT TAT GCA TTT GTC ATT CAC ACA ACC AAC CCA 4052 Glu ile lie Asn Ala Asp Tir Ala Fen Vai Ile His Tre Tre Asn Pro 1305 1310 1315 TCT TCC GGA GAC GAC TCA GAA ATA TAT GCC GAG GTG GTC AGG GGC CTT 4100 Ser ser Gli Asp Asp Ser Glu Ile Tir Ala Glu Vai Vai Arg Gli Leu 1320 1325 1330 GGG GAA AC A CTT GTT GGA GCT TAT CCA GGA CGT GCT TTG AGT TTT ATC 4148 Gli Glu Tre Leu Vai Gli Ala Tir Pro Gli Arg Ala Leu Ser Fen Ile 1335 1340 1345 TGC AAG AAA AAG GAT CTC AAC TCT CCT CAA GTG TTA GGT TAC CCA AGC 4196 Cis Lis Lis Lis Asp Leu Asn Ser Pro Gin Vai Leu Gli Tir Pro Ser 1350 1355 1360 AAA CCG ATC GGC CTT TTC ATA AAA AGA TCT ATC ATC TTC CGA TCT GAT 4244 Lis Pro Ile Gli Leu Fen Ile Lis Arg Ser Ile Ile Fen Arg Ser Asp 1365 1370 1375 1380 TCC AAT GGG GAA GAT TTG GAA GGT TAT GCC GGT GCT GGC CTC TAC GAC 4292 Ser Asn Gli Glu Asp Leu Glu Gli Tir Ala Gli Ala Gli Leu Tir Asp 1385 1390 1395 AGT GTA CCA ATG GAT GAG GAG GAA AAA GTT GTA ATT GAT TAC TCT TCC 4340 Ser Vai Pro Met Asp Glu Glu Glu Lis Vai Vai Ile Asp Tir Ser Ser 1400 1405 1410 GAC CCA TTG ATA ACT GAT GGT AAC TTC CGC CAG ACA ATe CTG TCC AAC 4388 Asp Pro Leu Ile Tre Asp Gli Asn Fen Arg Gin Tre Ile Leu Ser Asn 1415 1420 1425 93 ATT GCT CGT GCT GGA CAT GCT ATC GAG GAG CTA TAT GGC TCT CCT CAA 4436

Ile Ala Arg Ala Gli His Ala Ile Glu Glu Leu Tir Gli Ser Pro Gin 1430 1435 1440 GAC ATT GAG GGT GTA GTG AGG GAT GGA AAG ATT TAT GTC GTT CAG ACA 4484

Asp Ile Glu Gli Vai Vai Arg Asp Gli Lis Ile Tir Vai Vai Gin Tre 1445 1450 1455 1460 AGA CCA CAG ATG T GATTATATTC TCGTTGTATG TTGTTCAGAG AAGACCACAG 4537 Arg Pro Gin Met ATGTGATCAT ATTCTCATTG TATCAGATCT GTGACCACTT ACCTGATACC TCCCATGAAG 4597 TTACCTGTAT GATTATACGT GATCCAAAGC CATCACATCA TGTTCACCTT CAGCTATTGG 4657 AGGAGAAGTG AGAAGTAGGAATTGCAATAT GAGGAATAAT AAGAAAAACT TTGTAAAAGC 4717 TAAATTAGCT GGGTATGATATAGGGAGAAA TGTGTAAACA TTGTACTATA TATAGTATAT 4777 ACACACGCAT TATGTATTGCATTATQCACT GAATAATATC GCAGCATCAA AGAAGAAATC 4837 CTTTGGGTGG TTTCAAAAA 4856 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1464 aminoãcidos (B) TIPO: Aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

Met Ser Asn Ser Leu Gli Asn Asn Leu Leu Tir Gin Gli Fen Leu Tre 15 10 15

Ser Tre Vai Leu Glu His Lis Ser Arg Ile Ser Pro Pro Cis Vai Gli 20 25 30

Gli Asn Ser Leu Fen Gin Gin Gin Vai Ile Ser Lis Ser Pro Leu Ser 35 40 45

Tre Glu Fen Arg Gli Asn Arg Leu Lis Vai Gin Lis Lis Lis Ile Pro 50 55 60 94

Met Glu Lis Lis Arg Ala Fen Ser Ser Ser Pro His Ala Vai Leu Tre 65 70 75 80

Tre Asp Tre Ser Ser Glu Leu Ala Glu Lis Fen Ser Leu Gli Gli Asn 85 90 95

Ile Glu Leu Gin Vai Asp Vai Arg Pro Pro Tre Ser Gli Asp Vai Ser 100 105 110

Fen Vai Asp Fen Gin Vai Tre Asn Gli Ser Asp Lis Leu Fen Leu His 115 120 125

Trp Gli Ala Vai Lis Fen Gli Lis Glu Tre Trp Ser Leu Pro Asn Asp 130 35 140

Arg Pro Asp Gli Tre Lis Vai Tir Lis Asn Lis Ala Leu Arg Tre Pro 145 150 155 160

Fen Vai Lis Ser Gli Ser Asn Ser Ile Leu Arg Leu Glu Ile Arg Asp 165 170 175

Tre Ala Ile Glu Ala Ile GluFen Leu Ile Tir Asp Glu Ala His Asp 180 185 190

Lis Trp Ile Lis Asn Asn Gli Gli Asn Fen Arg Vai Lis Leu Ser Arg 195 200 205

Lis Glu Ile Arg Gli Pro Asp Vai Ser Vai Pro Glu Glu Leu Vai Gin 210 215 220

Ile Gin Ser Tir Leu Arg Trp Glu Arg Lis Gli Lis Gin Asn Tir Pro 225 230 235 240

Pro Glu Lis Glu Lis Glu Glu Tir Glu Ala Ala Arg Tre Vai Leu Gin 245 250 255

Glu Glu Ile Ala Arg Gli Ala Ser Ile Gin Asp Ile Arg Ala Arg Leu 260 265 270

Tre Lis Tre Asn Asp Lis Ser Gin Ser Lis Glu Glu Pro Leu His Vai 275 280 285 95

Tre Lis Ser Asp Ile Pro Asp Asp Leu Ala Gin Ala Gin Ala Tir Ile 290 295 300

Arg Trp Glu Lis Ala Gli Lis Pro Asn Tir Pro Pro Glu Lis Gin Ile 305 310 315 320

Glu Glu Leu Glu Glu Ala Arg Arg Glu Leu Gin Leu Glu Leu Glu Lis 325 330 335

Gli He Tre Leu Asp Glu Leu Arg Lis Tre Ile Tre Lis Gli Glu lie 340 345 350 Lis Tre Lis Vai Glu Lis His Leu Lis Arg Ser Ser Fen Ala Vai Glu 355 360 365 Arg Ile Gin Arg Lis Lis Arg Asp Fen Gli His Leu Ile Asn Lis Tir 370 375 380 Tre Ser Ser Pro Ala Vai Gin Vai Gin Lis Vai Leu Glu Glu Pro Pro 385 390 395 400 Ala Leu Ser Lis Ile Lis Leu Tir Ala Lis Glu Lis Glu Glu Gin Ile 405 410 415 Asp Asp Pro Ile Leu Asn Lis Lis Ile Fen Lis Vai Asp Asp Gli Glu 420 425 430 Leu Leu vai Leu Vai Ala Lis Ser Ser Gli Lis Tre Lis Vai His Leu 435 440 445 Ala Tre Asp Leu Asn Gin Pro Ile Tre Leu His Trp Ala Leu Ser Lis 450 455 460

Ser Pro Gli Glu Trp Met Vai Pro Pro Ser Ser Ile Leu Pro Pro Gli 465 470 475 480

Ser Ile Ile Leu Asp Lis Ala Ala Glu Tre Pro Fen Ser Ala Ser Ser 485 490 495

Ser Asp Gli Leu Tre Ser Lis Vai Gin Ser Leu Asp Ile Vai Ile Glu 500 505 510 96

Asp Gli Asn Fen Vai Gli Met Pro Fen Vai Leu Leu Ser Gli Glu Lis 515 520 525 Trp Ile Lis Asn Gin Gli Ser Asp Fen Tir Vai Gli Fen Ser Ala Ala 530 535 540 Ser Lis Leu Ala Leu Lis Ala Ala Gli Asp Gli Ser Gli Tre Ala Lis 545 550 555 560 Ser Leu Leu Asp Lis Ile Ala Asp Met Glu Ser Glu Ala Gin Lis Ser 565 570 575 Fen Met His Arg Fen Asn Ile Ala Ala Asp Leu Ile Glu Asp Ala Tre 580 585 590 Ser Ala Gli Glu Leu Gli Fen Ala Gli Ile Leu Vai Trp Met Arg Fen 595 600 605

Met Ala Tre Arg Gin Leu Ile Trp Asn Lis Asn Tir Asn Vai Lis Pro 610 615 620 Arg Glu Ile Ser Lis Ala Gin Asp Arg Leu Tre Asp Leu Leu Gin Asn 625 630 635 640 Ala Fen Tre Ser His Pro Gin Tir Arg Glu Ile Leu Arg Met Ile Met 645 650 655 Ser Tre Vai Gli Arg Gli Gli Glu Gli Asp Vai Gli Gin Arg Ile Arg 660 665 670 Asp Glu Ile Leu Vai Ile Gin Arg Asn Asn Asp Cis Lis Gli Gli Met 675 680 685 Met Gin Glu Trp His Gin Lis Leu His Asn Asn Tre Ser Pro Asp Asp 690 695 700

Vai Vai Ile Cis Gin Ala Leu Ile Asp Tir Ile Lis Ser Asp Fen Asp 705 710 715 720

Leu Gli Vai Tir Trp Lis Tre Leu Asn Glu Asn Gli Ile Tre Lis Glu 725 730 735 97

Arg Leu Leu Ser Tir Asp Arg Ala Ile His Ser Glu Pro Asn Fen Arg 740 745 750 Gli Asp Gin Lis Gli Gli Leu Leu Arg Asp Leu Gli His Tir Met Arg 755 760 765 Tre Leu Lis Ala Vai His Ser Gli Ala Asp Leu Glu Ser Ala Ile Ala 770 775 780 Asn Cis Met Gli Tir Lis Tre Glu Gli Glu Gli Fen Met Vai Gli Vai 785 790 795 800

Gin Ile Asn Pro Vai Ser Gli Leu Pro Ser Gli Fen Gin Asp Leu Leu 805 810 815

His Fen Vai Leu Asp His Vai Glu Asp Lis Asn Vai Glu Tre Leu Leu 820 825 830

Glu Arg Leu Leu Glu Ala Ala Glu Glu Leu Arg Pro Leu Leu Leu Lis 835 840 845 Pro Asn Asn Arg Leu Lis Asp Leu Leu Fen Leu Asp Ile Ala Leu Asp 850 855 860 Ser Tre Vai Arg Tre Ala Vai Glu Arg Gli Tir Glu Glu Leu Asn Asn 865 870 875 880 Ala Asn Pro Glu Lis Ile Met Tir Fen He Ser Leu Vai Leu Glu Asn 885 890 895

Leu Ala Leu Ser Vai Asp Asp Asn Glu Asp Leu Vai Tir Cis Leu Lis 900 905 910

Gli Trp Asn Gin Ala Leu Ser Met Ser Asn Gli Gli Asp Asn His Trp 915 920 925

Ala Leu Fen Ala Lis Ala Vai Leu Asp Arg Tre Arg Leu Ala Leu Ala 930 935 940 Ser Lis Ala Glu Trp Tir His His Leu Leu Gin Pro Ser Ala Glu Tir 98 945 950 955 960

Leu Gli Ser Ile Leu Glí Vai Asp Gin Trp Ala Leu Asn Ile Fen Tre

Glu Glu Ile 965 970 975 Ile Arg Ala Gli Ser Ala Ala Ser Leu Ser Ser Leu Leu 980 985 990 Asn Arg Leu Asp Pro Vai Leu Arg Lis Tre Ala Asn Leu Gli Ser Trp 995 1000 1005 Gin Ile Ile Ser Pro Vai Glu Ala Vai Gli Tir Vai Vai Vai Vai Asp 1010 1015 1020 Glu Leu Leu Ser Vai Gin Asn Glu Ile Tir Glu Lis Pro Tre Ile Leu 1025 1030 1035 1040 Vai Ala Lis Ser Vai Lis Gli Glu Glu Glu Ile Pro Asp Gli Ala Vai 1045 1050 1055 Ala Leu Ile Tre Pro Asp Met Pro Asp Vai Leu Ser His Vai Ser Vai 1060 1065 1070 Arg Ala Arg Asn Gli Lis Vai Cis Fen Ala Tre Cis Fen Asp Pro Asn 1075 1080 1085

Ile Leu Ala Asp Leu Gin Ala Lis Glu Gli Arg Ile Leu Leu Leu Lis 1090 1095 1100 Pro Tre Pro Ser Asp Ile Ile Tir Ser Glu Vai Asn Glu Ile Glu Leu 1105 1110 1115 1120 Gin Ser Ser Ser Asn Leu Vai Glu Ala Glu Tre ser Ala Tre Leu Arg 1125 1130 1135 Leu Vai Lis Lis Gin Fen Gli Gli Cis Tir Ala Ile Ser Ala Asp Glu 1140 1145 1150

Fen Tre Ser Glu Met Vai Gli Ala Lis Ser Arg Asn Ile Ala Tir Leu 1155 1160 1165 99

Lis Gli Lis Vai Pro Ser Ser Vai Gli Ile Pro Tre Ser Vai Ala Leu 1170 1175 1180

Pro Fen Gli Vai Fen Glu Lis Vai Leu Ser Asp Asp Ile Αεη Gin Gli 1185 1190 1195 1200

Vai Ala Lis Glu Leu Gin Ile Leu Met Lis Lis Leu Ser Glu Gli Asp 1205 1210 1215

Fen Ser Ala Leu Gli Glu Ile Arg Tre Tre Vai Leu Asp Leu Ser Ala 1220 1225 1230

Pro Ala Gin Leu Vai Lis Glu Leu Lis Glu Lis Met Gin Gli Ser Gli 1235 1240 1245

Met Pro Trp Pro Gli Asp Glu Gli Pro Lis Arg Trp Glu Gin Ala Trp 1250 1255 1260

Met Ala Ile Lis Lis Vai Trp Ala Ser Lis Trp Asn Glu Arg Ala Tir 1265 1270 1275 1290

Fen Ser Tre Arg Lis Vai Lis Leu Asp His Asp Tir Leu Cis Met Ala 1285 1290 1295

Vai Leu Vai Gin Glu Ile Ile Asn Ala Asp Tir Ala Fen Vai Ile His 1300 1305 1310

Tre Tre Asn Pro Ser Ser Gli Asp Asp Ser Glu Ile Tir Ala Glu Vai 1315 1320 1325

Vai Arg Gli Leu Gli Glu Tre Leu Vai Gli Ala Tir Pro Gli Arg Ala 1330 1335 1340

Leu Ser Fen Ile Cis Lis Lis Lis Asp Leu Asn Ser Pro Gin Vai Leu 1345 1350 1355 1360

Gli Tir Pro Ser Lis Pro Ile Gli Leu Fen Ile Lis Arg Ser Ile Ile 1365 1370 1375

Fen Arg Ser Asp Ser Asn Gli Glu Asp Leu Glu Gli Tir Ala Gli Ala 1380 1385 1390 100

Gli Leu Tír Asp Ser Vai Pro Met Asp Glu Glu Glu Lis Vai Vai Ile 1395 1400 1405

Asp Tir Ser Ser Asp Pro Leu Ile Tre Asp Gli Asa Fen Arg Gin Tre 1410 1415 1420

Ile Leu Ser Asn Ile Ala Arg Ala Gli His Ala Ile Glu Glu Leu Tir 1425 1430 1435 1440

Gli Ser Pro Gin Asp Ile Glu Gli Vai Vai Arg Asp Gli Lis Ile Tir 1445 1450 1455

Vai Vai Gin Tre Arg Pro Gin Met 1460 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1918 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Solanum tuberosum (B) ESTIRPE: C.V. Desiree (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1. .1555 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3: GCA GAG TGG TAC CAT CAC TTA TTG CAG CCA TCT GCC GAA TAT CTA GGA 48

Ala Glu Trp Tir His His Leu Leu Gin Pro Ser Ala Glu Tir Leu Gli 101 1 5 10 15 TCA ATA CTT GGG GTG GAC CAA TGG GCT TTG AAC ATA TTT ACT GAA GAA 96 Ser Ile Leu Gli Vai Asp Gin Trp Ala Leu Asn Ile Fen Tre Glu Glu 20 25 30 ATT ATA CGT GCT GGA TCA GCA GCT TCA TTA TCC TCT CTT CTT AAT AGA 144 Ile Ile Arg Ala Gli Ser Ala Ala Ser Leu Ser Ser Leu Leu Asn Arg 35 40 45 CTC GAT CCC GTG CTT CGG AAA ACT GCA AAT CTA GGA AGT TGA CAG ATT 192 Leu Asp Pro Vai Leu Arg Lis Tre Ala Asn Leu Gli Ser Trp Gin Ile 50 55 60 ATC AGT CCA GTT GAA GCC /"i mm Qji i GGA TAT GTT GTC GTT GTG GAT GAG TTG 240 Ile Ser Pro Vai Glu Ala Val Gli Tir Val Val Val Val Asp Glu Leu 65 70 75 80 CTT TCA GTT CAG AAT GAA ATC TAC GAG AAG CCC ACG ATC TTA GTA GCA 288 Leu Ser Vai Gin Asn Glu Ile Tir Glu Lis Pro Tre Ile Leu Val Ala 85 90 95 AAA TCT GTT AAA GGA GAG GAG GAA ATT CCT GAT GGT GCT GTT GCC CTG 336 Lis Ser Vai Lis Gli Glu Glu Glu Ile Pro Asp Gli Ala Val Ala Leu 100 105 110 ATA ACA GCA GAG ATG CCA GAT GTT CTT TCA CAT GTT TCT GTT CGA GCT 384 Ile Tre Pro Asp Met Pro Asp Val Leu Ser His Val Ser Val Arg Ala 115 120 125 AGA AAT GGG AAG GTT TGC TTT GCT ACA TGC TTT GAT CCC AAT ATA TGT 432 Arg Asn Gli Lis Vai Cis Fen Ala Tre Cis Fen Asp Pro Asn Ile Leu 130 135 140 GCT GAC CTC CAA GCA AAG GAA GGA AGG ATT TTG CTC TTA AAG CCT ACA 480 Ala Asp Leu Gin Ala LÍS Glu Gli Arg Ile Leu Leu Leu Lis Pro Tre 145 150 155 160 CCT TCA GAC ATA ATC TAT AGT GAG GTG AAT GAG ATT GAG CTC CAA AGT 528 Pro Ser Asp Ile Ile Tir Ser Glu Val Asn Glu Ile Glu Leu Gin Ser 165 170 175 102 576 TCA AGT AAC TTG GTA GAA GCT GAA Ser Ser Asn Leu Vai Glu Ala Glu ISO AAA AAG CAA GGT GGT TGT TAC Lis Lis Gin Fen Gli Gli Cis Tir 195 200 AGT GAA ATG GTT GGA GCT AAA TCA Ser Glu Met Vai Gli Ala Lis Ser 210 215 AAA GTG CCT TCC TCG GTG GGA ATT Lis Vai pro Ser Ser Vai Gli Ile 225 230 GGA GTC TTT GAG AAA GTA CTT TCA Gli Vai Fen Glu Lis Vai Leu Ser 245 AAA GAG TTG CAA ATT CTG ACA AAA L i s Glu Leu Gin Ile Leu Tre Lis 260 GCT CTT GGT GAA ATT GGC ACA ACG Ala Leu Gli Glu Ile Arg Tre Tre 275 280 CAA TTG GTC AAA GAG CTG AAG GAG Gin Leu Vai Lis Glu Leu Lis Glu 290 295 ACT TCA GCA ACA CTT AGA TTG GTG Tre Ser Ala Tre Leu Arg Leu Vai 185 190 GCA ATA TCA GCA GAT GAA TTC ACA Ala Ile Ser Ala Asp Glu Fen Tre 205 CGT AAT ATT GCA TAT CTG AAA GGA Arg Asn Ile Ala Tir Leu Lis Gli 220 CCT ACG TCA GTA GCT CTT CCA TTT Pro Tre Ser Vai Ala Leu Pro Fen 235 240 GAC GAC ATA AAT CAG GGA GTG GCA Asp Asp Ile Asn Gin Gli Vai Ala 250 255 AAA CTA TCT GAA GGA GAC TTT AGC Lis Leu Ser Glu Gli Asp Fen Ser 265 270 GTT TTA GAT CTT TCG ACA CCA GCT Vai Leu Asp Leu Ser Tre Pro Ala 285 AAG ATG CAG GGT TCT GGC ATG CCT Lis Met Gin Gli Ser Gli Met Pro 300 624 672 720 768 816 864 912 TGG CCT GGTGAT GAA GGT CCA AAG CGG TGG GAA CAA GCA TGG ATG GCC 960

Trp Pro Gli Asp Glu Gli Pro Lis Arg Trp Glu Gin Ala Trp Met Ala 305 310 315 320 ATA AAA AAG GTG TGG GCT TCA AAA TGG AAT GAG AGA GCA TAC TTC AGC 1008

Ile Lis Lis Vai Trp Ala Ser Lis Trp Asn Glu Arg Ala Tir Fen Ser 325 330 335 103 1056 ACA AGG AAG GTG AAA CTG GAT CAT GAC TAT CTG TGC ATG GCT GTC CTT Tre Arg Lis Vai LÍS Leu Asp His Asp Tir Leu Cis Met Ala Vai Leu 340 345 350 GTT CAA GAA ATA ATA AAT GCT GAT TAT GCA TTT GTC ATT CAC ACA ACC 1104 Vai Gin Glu Ile Ile Asn Ala Asp Tir Ala Fen Vai I le H x s Tre Tre 355 360 355 AAC CCA TCT TCC GGA GAC GAC TCA GAA ATA TAT GCC GAG GTG GTC AGG 1152 Asn Pro Ser Ser Gli Asp Asp Ser Glu Ile Tir Ala Glu Vai Vai Arg 370 375 380 GGC CTT GGG GAA ACA CTT GTT GGA GCT TAT CCA GGA CGT CGT TTG AGT 1200 Gli Leu Gli Glu Tre Leu Vai G1 i Ala Tir Pro Gli Arg Ala Leu Ser 385 390 395 400 TTT ATC TGC AAG AAA AAG GAT CTC AAC TCT CCT CAA GTG TTA GGT TAC 1248 Fen Ile Cis Lis Lis Lis Asp Leu Asn Ser Pro Gin Vai Leu Gli Tir 405 410 415 CCA AGC AAA CCG ATC GGC CTT TTC ATA AAA AGA TCT ATC ATC TTC CGA 1296 Pro Ser Lis Pro Ile Gli Leu Fen Ile Lis Arg Ser Ile Ile Fen Arg 420 425 430 TCT GAT TCC AAT GGG GAA GAT TTG GAA GGT TAT GCC GGT GCT GGC CTC 1344 Ser Asp Ser Asn Gli Glu Asp Leu Glu Gli Tir Ala Gli Ala Gli Leu 435 440 445 TAC GAC AGT GTA CCA ATG GAT GAG GAG GAA AAA GTT GTA ATT GAT TAC 1392 Tir Asp Ser Vai Pro Met Asp Glu Glu Glu Lis Vai Vai Ile Asp Tir 450 455 460 TCT TCC GAC CCA TTG ATA ACT GAT GGT AAC TTC CGC CAG ACA ATC CTG 1440 Ser Ser Asp Pro Leu Ile Tre Asp Gli Asn Pen Arg Gin Tre Ile Leu 465 4 70 475 480 TCC AAC ATT GCT CGA GCT GGA CAT GCT ATC GAG GAG CTA TAT GGC TCT 1488 Ser Asn Ile Ala Arg Ala Gli His Ala Ile Glu Glu Leu Tir Gli Ser 485 490 495 CCT CAA GAC ATT GAG GGT GTA GTG AGG GAT GGA AAG ATT TAT GTC GTT 1536 104

Pro Gin Asp Ile Glu Gli Vai Vai Arg Asp Gli Lis rle Tir Vai Vai 500 505 510 CAG ACA AGA CCA CAG ATG T GATTATATTC TCGTrGTATG TTGTTCAGAG 1585

Gin Tre Arg Pro Gin Met 515 AAGACCACAG ATGTGATCAT ATTCTCATTG TATCAGATCT GTGACCACTT ACCTGATACC 1645 TCCCATGAAG TTACCTGTAT GATTATACGT GATCCAAAGC CATCACATCA TGTTCACCTT 1705 CAGCTATTGG AGGAGAAGTG AGAAGTAGGA ATTGCAATAT GAGGAATAAT AAGAAAAACT 1765 TTGTAAAAGC TAAATTAGCT GGGTATGATA TAGGGAGAAA TGTGTAAACA TTGTACTATA 1825 TATAGTATAT ACACACGCAT TATGTATTGC ATTATGCACT GAATAATATC GCAGCATCAA 1885 AGAAGAAATC CTTTGGGTGG TTTCAAAAAA AAA 1918 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 518 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4:

Ala Glu Trp Tir His His Leu Leu Gin Pro ser Ala Glu Tir Leu Gli 15 10 15

Ser Ile Leu Gli Vai Asp Gin Trp Ala Leu Asn Ile Fen Tre Glu Glu 20 25 30

Ile Ile Arg Ala Gli Ser Ala Ala Ser Leu Ser Ser Leu Leu Asn Arg 35 40 45

Leu Asp Pro Vai Leu Arg Lis Tre Ala Asn Leu Gli Ser Trp Gin Ile 105 50 55 60

Ile Ser Pro Vai Glu Ala Vai Gli Tir Vai Vai Vai Vai Asp Glu Leu 65 70 75 80 Leu Ser Vai Gin Asn Glu Ile Tir Glu Lis Pro Tre Ile Leu Vai Ala 85 90 95 Lis Ser Vai Lis Gli Glu Glu Glu Ile Pro Asp Gli Ala Vai Ala Leu 100 105 110 Ile Tre Pro Asp Met Pro Asp Vai Leu Ser His Vai Ser Vai Arg Ala 115 120 125 Arg Asn Gli Lis Vai Cis Fen Ala Tre Cis Fen Asp Pro Asn Ile Leu 130 135 140 Ala Asp Leu Gin Ala Lis Glu Gli Arg Ile Leu Leu Leu Lis Pro Tre 145 150 155 160

Pro Ser Asp Ile Ile Tir Ser Glu Vai Asn Glu Ile Glu Leu Gin Ser 165 170 175

Ser Ser Asn Leu Vai Glu Ala Glu Tre Ser Ala Tre Leu Arg Leu Vai 180 185 190 Lis Lis Gin Fen Gli Gli Cis Tir Ala Ile Ser Ala Asp Glu Fen Tre 195 200 205 Ser Glu Met Vai Gli Ala Lis Ser Arg Asn Ile Ala Tir Leu Lis Gli 210 215 220 Lis Vai Pro Ser Ser Vai Gli Ile Pro Tre Ser Vai Ala Leu Pro Fen 225 230 235 240 Gli Vai Fen Glu Lis Vai Leu Ser Asp Asp Ile Asn Gin Gli Vai Ala 245 250 255 Lis Glu Leu Gin Ile Leu Tre Lis Lis Leu Ser Glu Gli Asp Fen Ser 260 265 270

Ala Leu Gli Glu Ile Arg Tre Tre Vai Leu Asp Leu Ser Tre Pro Ala 106 275 280 285

Gin Leu Vai Lis Glu Leu Lis Glu Lis Met Gin Gli Ser Gli Met Pro 290 295 300 Trp Pro Gli Asp Glu Gli Pro Lis Arg Trp Glu Gin Ala Trp Met Ala 305 310 315 320 Ile Lis Lis Vai Trp Ala Ser Lis Trp Asn Glu Arg Ala Tir Fen Ser 325 330 335 Tre Arg Lis Vai Lis Leu Asp His Asp Tir Leu Cis Met Ala Vai Leu 340 345 350

Vai Gin Glu Ile Ile Asn Ala Asp Tir Ala Fen Vai Ile His Tre Tre 355 360 365 Asn Pro Ser Ser Gli Asp Asp Ser Glu Ile Tir Ala Glu Vai Vai Arg 370 375 380 Gli Leu Gli Glu Tre Leu Vai Gli Ala Tir Pro Gli Arg Ala Leu Ser 385 390 395 400 Fen Ile Cis Lis Lis Lis Asp Leu Asn Ser Pro Gin Vai Leu Gli Tir 405 410 415 Pro Ser Lis Pro Ile Gli Leu Fen Ile Lis Arg Ser Ile Ile Fen Arg 420 425 430

Ser Asp Ser Asn Gli Glu Asp Leu Glu Gli Tir Ala Gli Ala Gli Leu 435 440 445

Tir Asp Ser Vai Pro Met Asp Glu Glu Glu Lis Vai Vai Ile Asp Tir 450 455 460 Ser Ser Asp Pro Leu Ile Tre Asp Gli Asn Fen Arg Gin Tre Ile Leu 465 470 475 480

Ser Asn Ile Ala Arg Ala Gli His Ala Ile Glu Glu Leu Tir Gli Ser

Pro Gin Asp 485 490 495 Ile Glu Gli Vai Vai Arg Asp Gli Lis Ile Tir Vai Vai 107 500 505 510

Gin Tre Arg Pro Gin Met 515 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2307 pares de bases (B) TIPO: nucleôtido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) SENTIDO INVERSO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: milho Zea (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO:33..1943 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5: TAGTGGATCC ( CCCCGGGCTG CAGGGAATTC GG CAC GAG CTT GAG GGG CTA TTG 53 His Glu Leu Glu Gli Leu Leu 1 5 GAA GCT CGA GTT GAA CTG CGC CCT TTG CTT CTT GAT TCG CGT GAA CGC 101 Glu Ala Arg Vai Glu Leu Arg Pro Leu Leu Leu Asp Ser Arg Glu Arg 10 15 20 ATG AAA GAT CTT ATA TTT TTG GAC ATT GCT CTT GAT TCT ACC TTC AGG 149 Met Lis Asp Leu Ile Fen Leu Asp Ile Ala Leu Asp Ser Tre Fen Arg 25 30 35 ACA GCA ATT GAA AGG TCA TAT GAG GAG CTG AAT GAT GCA GCC CCA GAG 197 Tre Ala Ile Glu Arg Ser Tir Glu Glu Leu Asn Asp Ala Ala Pro Glu 40 45 50 55 AAA ATA ATG TAC TTC ATC AGT CTT GTC CTT GAA FAT CTT GCG CTT TCA 245 Lis Ile Met Tir Fen Ile Ser Leu Vai Leu Glu Asn Leu Ala Leu Ser 60 65 70 ATT GAC GAC AAT GAA GAC ATC CTG TAT TGT TTA AAG GGA TGG AAC CAA 293 Ile Asp Asp Asn Glu Asp Ile Leu Tir Cis Leu Lis Gli Trp Asn Gin 75 80 85 GCC TTG GAA ATG GCT AAG CAA AAA GAC GAC CAA TGG GCG CTC TAT GCT 341 108

Ala Leu Glu Met Ala Lis Gin Lis Asp Asp Gin Trp Ala Leu Tir Ala 90 95 100 AAA GCA TTT CTT GAC AGA AAC AGA CTT GCC CTT GCG AGC AAG GGA GAA 389 Lis Ala Fen Leu Asp Arg Asn Arg Leu Ala Leu Ala Ser Lis Gli Glu 105 110 115 CAA TAC CAT AAT ATG ATG CAG CCC TCT GCT GAG TAT CTT GGC TCG TTA 437 Gin Tir His Asn Met Met Gin Pro Ser Ala Glu Tir Leu Gli Ser Leu 120 125 130 135 CTC AGC ATA GAC CAA TGG GCA GTC AAT ATC TTC ACA GAA GAA ATT ATA 485 Leu Ser Ile Asp Gin Trp Ala Vai Asn Ile Fen Tre Glu Glu Ile Ile 140 145 150 CGC GGT GGA TCA GCT GCT ACT CTG TCT GCT CTT CTG AAC CGA TTT GAT 533 Arg Gli Gli Ser Ala Ala Tre Leu Ser Ala Leu Leu Asn Arg Fen Asp 155 160 165 CCT GTT TTA AGG AAT GTT GCT CAC CTC GGA AGT TGG CAG GTT ATA AGC 581 Pro Vai Leu Arg Asn Vai Ala His Leu Gli Ser Trp Gin Vai Ile Ser 170 175 180 CCG GTT GAA GTA TCA GGT TAT GTG GTT GTG GTT GAT GAG TTA CTT GCT 629 Pro Vai Glu Vai Ser Gli Tir Vai Vai Vai Vai Asp Glu Leu Leu Ala 185 190 195 GTC CAG AAC AAA TCT TAT GAT AAA CCA ACC ATC CTT GTG GCA AAG AGT 677 Vai Gin Asn Lis Ser Tir Asp Lis Pro Tre Ile Leu Vai Ala Lis Ser 200 205 210 215 GTC AAG GGA GAG GAA GAA ATA CCA GAT GGA GTA GTT GGT GTA ATT ACA 725 Vai Lis Gli Glu Glu Glu Ile Pro Asp Gli Vai Vai Gli Vai Ile Tre 220 225 230 CCT GAT ATG CCA GAT GTT CTG TCT CAT GTG TCA GTC CGA GCA AGG AAT 773 Pro Asp Met Pro Asp Vai Leu Ser His Vai Ser Vai Arg Ala Arg Asn 235 240 245 AGC AAG GTA CTG TTT GCG ACC TGT TTT GAC CAC ACC ACT CTA TCT GAA 821 Ser Lis Vai Leu Fen Ala Tre Cis Fen Asp His Tre Tre Leu Ser Glu 250 255 260 CTT GAA GGA TAT GAT CAG AAA CTG TTT TCC TTC AAG CCT ACT TCT GCA 869 Leu Glu Gli Tir Asp Gin Lis Leu Fen Ser Fen Lis Pro Tre Ser Ala 265 270 275 GAT ATA ACC TAT AGG GAG ATC ACA GAG AGT GAA CTT CAG CAA TCA AGT 917 Asp Ile Tre Tir Arg Glu Ile Tre Glu Ser Glu Leu Gin Gin Ser Ser 280 285 290 295 TCT CCA AAT GCA GAA GTT GGC CAT GCA GTA CCA TCT ATT TCA TTG GCC 965 Ser Pro Asn Ala Glu Vai Gli His Ala Vai Pro Ser Ile Ser Leu Ala 300 305 310 AAG AAG AAA TTT CTT GGA AAA TAT GCA ATA TCA GCC GAA GAA TTC TCT 1013 Lis Lis Lis Fen Leu Gli Lis Tir Ala Ile Ser Ala Glu Glu Fen Ser 315 320 325 GAG GAA ATG GTT GGG GCC AAG TCT CGG AAT ATA GCA TAC CTC AAA GGA 1061 Glu Glu Met Vai Gli Ala Lis Ser Arg Asn Ile Ala Tir Leu Lis Gli 330 335 340 109 AAA GTA CCT TCA TGG GTC GGT GTC CCA ACG TCA GTT GCG ATA CCA TTT 1109 Lis Vai Pro Ser Trp Vai Gli Vai Pro Tre Ser Vai Ala Ile Pro Fen 345 350 355 GGC ACT TTT GAG AAG GTT TTG TCA GAT GGG CTT AAT AAG GAA GTA GCA 1157 Gli Tre Fen Glu Lis Vai Leu Ser Asp Gli Leu Asn Lis Glu Vai Ala 360 365 370 375 CAG AGC ATA GAG AAG CTT AAG ATC AGA CTT GCC CAA GAA GAT TTT AGT 1205 Gin Ser Ile Glu Lis Leu Lis Ile Arg Leu Ala Gin Glu Asp Fen Ser 380 385 390 GCT CTA GGT GAA ATA AGA AAA GTC GTC CTT AAT CTT ACT GCT CCT ATG 1253 Ala Leu Gli Glu Ile Arg Lis Vai Vai Leu Asn Leu Tre Ala Pro Met 395 400 405 CAA TTG GTT AAT GAG CTG AAG GAG AGG ATG CTA GGC TCT GGA ATG CCC 1301 Gin Leu Vai Asn Glu Leu Lis Glu Arg Met Leu Gli Ser Gli Met Pro 410 415 420 TGG CCT GGT GAT GAA GGA GAC AAG CGT TGG GAG CAA GCA TGG ATG GCT 1349 Trp Pro Gli Asp Glu Gli Asp Lis Arg Trp Glu Gin Ala Trp Met Ala 425 430 435 ATT AAA AAG GTT TGG GCA TCA AAA TGG AAC GAA AGA GCA TAT TTT AGC 1397 Ile Lis Lis Vai Trp Ala Ser Lis Trp Asn Glu Arg Ala Tir Fen Ser 440 445 450 455 ACA CGC AAG GTG AAA CTT GAT CAT GAG TAC CTT TCG ATG GCT GTT CTC 1445 Tre Arg Lis Vai Lis Leu Asp His Glu Tir Leu Ser Met Ala Vai Leu 460 465 470 GTG CAA GAA GTT GTG AAT GCA GAT TAT GCT TTT GTC ATT CAT ACC ACA 1493 Vai Gin Glu Vai Vai Asn Ala Asp Tir Ala Fen Vai Ile His Tre Tre 475 480 485 AAC CCA TCG TCT GGA GAT TCT TCT GAG ATA TAT GCT GAA GTG GTG AAA 1541 Asn Pro Ser Ser Gli Asp Ser Ser Glu Ile Tir Ala Glu Vai Vai Lis 490 495 500 GGG CTT GGC GAG ACC CTC GTG GGA GCC TAT CCT GGT CGT GCT ATG AGC 1589 Gli Leu Gli Glu Tre Leu Vai Gli Ala Tir Pro Gli Arg Ala Met Ser 505 510 515 TTT GTT TGC AAA AAA GAT GAC CTT GAC TCT CCC AAG TTA CTT GGT TAC 1637 Fen Vai Cis Lis Lis Asp Asp Leu Asp Ser Pro Lis Leu Leu Gli Tir 520 525 53 0 535 CCA AGC AAG CCA ATT GGT CTC TTC ATA AGG CAA TCA ATC ATC TTC CGT 1685 Pro Ser Lis Pro Ile Gli Leu Fen Ile Arg Gin Ser Ile Ile Fen Arg 540 545 550 TCC GAC TCC AAC GGT GAG GAC CTG GP GGT TAT GCT GGA GCA GGA TTA 1733 Ser Asp Ser Asn Gli Glu Asp Leu Glu Gli Tir Ala Gli Ala G1 i Leu 555 560 565 TAT GAT AGT GTA CCG ATG GAT GAG GAG GAT GAG GTT GTA CTT GAT TAT 1781 Tir Asp Ser Vai Pro Met Asp Glu Glu Asp Glu Vai Vai Leu Asp Tir 570 575 580 110 ACA ACT GAC CCT CTT ATA GTA GAC CGT GGA TTC CGA AGC TCA ATC CTC Tre Tre Asp Pro Leu Ile Vai Asp Arg Gli Fen Arg Ser Ser lie Leu 585 590 595 TC A AGC ATA GCA CGG GCT GGC CAT GCC ATC GAG GAG CTA TAT GGT TCT Ser Ser Ile Ala Arg Ala Gli His Ala Ile Glu Glu Leu Tir Gli Ser 600 605 610 615 CCT CAG GAC GTC GAG GGA GTA GTG AAG GAT GGA AAA ATC TAT GTA GTC Pro Gin Αερ Vai Glu Gli Vai Vai Lis Asp Gli Lis Ile Tir Vai Vai 620 525 630 CAG ACA AGA CCA CAG ATG TAGTATGTAT GCATCTATTA GACAGCTCAA Gin Tre Arg Pro Gin Met 1829 535 TAAGCACTGT TGTACGCTTG TATGGTTGGG ACATATGGGCGTTATGGCAT GTATAGTTGT 2033 ATGCCTAGAT GTACAACACG TGTACTCGTA TATATATATA TAAATGCTGA AACAAGCATT 2093 GGTCCTGTAC TGTAGTTTCT ACATTTCATT GTCACCAATA ATTAAGTGTA CTCCTATGGC 2153 TGGGAGTCTA TGAAAATGGA CGTGTTGACT TATTGGGTAA TAAATAATTT ATATATAAAA 2213 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA CTCGAGGGGG 2273 GGCCGGTCCC AATTCGCCTA TAGTGAGTCG TATA 2307 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 6: (í) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 637 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGIa: linear (ii) TIPO de molécula: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6 : His Glu Leu Glu Gli Leu Leu Glu Ala Arg Vai Glu Leu Arg Pro Leu 1 5 10 15 Leu Leu Asp Ser Arg Glu Arg Met Lis Asp Leu Ile Fen Leu Asp Ile 20 25 30 Ala Leu Asp Ser Tre Fen Arg Tre Ala Ile Glu Arg Ser Tir Glu Glu 35 40 45 Leu Asn Asp Ala Ala Pro Glu Lis Ile Met Tir Fen Ile Ser Leu Vai 50 55 60 Leu Glu Asn Leu Ala Leu Ser Ile Asp Asp Asn Glu Asp Ile Leu Tir 65 70 75 80 Cis Leu Lis Gli Trp Asn Gin Ala Leu Glu Met Ala Lis Gin Lis Asp 85 90 95 Asp Gin Trp Ala Leu Tir Ala L Alei Fen Leu Asp Arg Asn Arg Leu 100 105 110 111 ζτι

dxx SJT XSS eiV dxx Χ«Λ sxq sxq ail BTV X 9Γ\Ι dxx BXV uxo ηχο dxx οετ 52T QZT βχν STq dsv TIO ηχο dsv TIO OXd dxx caa qaw tio xaS TIO naq qsw SIT OIT 50T βχν ηχο sxq naq ηχο usv ΙΒΛ naq UID qaw oxa BIV a xi naq usv naq cot see 068 58ε Ι®Λ IBA sxq 6xV 3TI ηχο TIO naq BIV xss usa dsv ηχο uxo BIV naq 08ε 5Δε ΟΔε ÊXV 311 sxq naq sxq ηχο θχΐ xss uxo BIV XBA niD sxq usv naq Tio S9£ 09ε 55ε dsv xss nsq IBA sxq ηχο usa sxx TIO usa OXd 3X1 BIV XBA XSS axx ose 5τε οτε oxa ΓΒΛ TIO ΙΒΛ dxx XSS oxa ΙΒΛ sxq tio sxq naq xxi BXV sil usv see οεε 528 βχν XSS STl HTV TIO Χ®Λ qaw ηχο ηχο xsg uad ηχο ηχο BXV xss 311 02ε 5ΐε οιε soe BIV XTI stq TIO naq U3á STT sxq sxq BIV naq X3S STI XSS oxa IBA οοε 562 062 BIV STH Tio ΙΒΛ ηχο BXV usv OXd xss xss xaS uxo UXO naq ηχο xas 582 082 5Δ2 ηχο SXX SII ηχο βχν χχχ 3XX 3X1 dsv BXV XSS sxx OXd 3xq uaa X3S οτε 590 092 U3d naq sxq «IS dsv ΧΤΙ TIO ηχο naq nTO xaS naq axx sxj, sth dsv SS2 052 SfZ U3d siD SXX «IV uaa naq ΙΒΛ siq xss usv βχν ^"j-y βχν ΙΒΛ XSS iba 0T2 5εε οεε 522 STH xsS nsq ΤΒΛ dsv oxa 33W dsv OXd SXX 311 XBA TIO IBA IBA TIO οεε 512 012 dsv OXd sil ηχο ηχο ηχο TIO sxq Xba xss sxq BXV χΒΑ naq 311 axx 5οε 002 561 oxa sxq dsv xxx xas sxq usv UXO XBA BXV naq naq ητο dsv IBA iba 06T S8T 081 T^A XBA XTX ΤΙΘ xss ΙΒΛ ηχο ΧΒΛ OXd xag 3X1 XBA UXO αχχ xag TIO S LT 0ΔΙ S9T naq STH ETV Τ*Λ xisv βχν naq XBA oxa dsv usd βχν USV naq naq BIV 091 551 051 STI xss naq 3¾ Βχν BJV XSS TIO Tio ÊXV STI aXl ηχο ηχο SXi uaa 311 0 TI 5ει οει usv XBA eiV dxx UIO dsv 0IX XSS naq naq xaS TIO naq ΛΤΧ ηχο BXV S2T 021 SII XSS O 2ã uis qaw dSW usv STH XXX ηχο ntô TIO sxq X9S BIV naq BIV 435 440 445

Asn Glu Arg Ala Tir Fen Ser Tre Arg Lis Vai Lis Leu Asp His Glu 450 455 460 Tir Leu Ser Met Ala Vai Leu Vai Gin Glu Vai Vai Asn Ala Asp Tir 465 470 475 480 Ais Fen Vai Ile His Tre Tre Asn Pro Ser Ser Gli Asp Ser Ser Glu 485 490 495 lie Tir Ala Glu Vai Vai Lis Gli Leu Gl 1 Glu Tre Leu Vai Gli Ala 500 505 510 Tir Pro Gli Arg Ala Met Ser Fen Vai Cis Lis Lis Asp Asp Leu Asp 515 520 525 Ser Pro Lis Leu Leu Gli Tir Pro Ser Lis Pro Ile Gli Leu Fen Ile 530 535 540 Arg Gin Ser Ile Ile Fen Arg Ser Asp Ser Asn Gli Glu Asp Leu Glu 545 550 555 560 Gli Tir Ala Gli Ala Gli Leu Tir Asp Ser Vai Pro Met Asp Glu Glu 565 570 575 Asp Glu Vai Vai Leu Asp Tir Tre Tre Asp Pro Leu Ile Vai Asp Arg 580 585 590 Gli Fen Arg Ser Ser Ile Leu Ser Ser Ile Ala Arg Ala Gli His Alâ. 595 600 605 Ile Glu Glu Leu Tir Gli Ser Pro Gin Asp Vai Glu Gli Vai Vai Lis 610 615 620 Asp Gli Lis Ile Tir Vai Vai Gin Tre Arg Pro Gin Met 625 630 635 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 4329 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ií} TIPO DE MOLÉCULA : ADNc a ARNm

(iii} HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) DE SENTIDO INVERSO: NÃO 113 (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: milho Zea (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO:2. .4009 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7: C CCA GAT GGC ACG ACA GTG TAC AAG AAC AGG GCT CTC AGG ACA CCT 46 Pro Asp Gli Tre Tre Vai Tir Lis Asn Arg Ala Leu Arg Tre Pro 1 5 10 15 TTT GTA AAG TCA GGT GAT AAC TCC ACT CTA AGG ATT GAG ATA GAT GAT 94 Fen val Lis Ser Gli Asp Asn Ser Tre Leu Arg Ile Glu Ile Asp Asp 20 25 30 CCT GGG GTG CAC GCC ATT GAG TTC CTC ATC TTT GAC GAG ACA CAG AAC 142 Pro Gli Val His Ala Ile Glu Fen Leu Ile Fen Asp Glu Tre Gin Asn 35 40 45 AAA TGG TTT AAA AAC AAT GGC CAG AAT TTT CAG GTT CAG TTC CAG TCG 190 Lis Trp Fen Lis Asn Asn Gli Gin Asn Fen Gin Val Gin Fen Gin Ser 50 55 60 AGC CGC CAT CAG GGT ACT GGT GCA TCT GGT GCC TCC TCT TCT GCT ACT 238 Ser Arg HiS Gin Gli Tre Gli Ala Ser Gli Ala Ser Ser Ser Ala Tre 65 70 75 TCT ACC TTG GTG CCA GAG GAT CTT GTG CAG ATC CAA GCT TAC CTT CGG 286 Ser Tre Leu Val Pro Glu Asp Leu Val Gin Ile Gin Ala Tir Leu Arg 80 85 90 95 TGG GAA AGA AGG GGA AAG CAG TCA TAC ACA CCA GAG CAA GAA AAG GAG 334 Trp Glu Arg Arg Gli LiS Gin Ser Tir Tre pro Glu Gin Glu Lis Glu 100 105 110 GAG TAT GAA GCT GCA CGA GCT GAG TTA ATA GAG GAA GTA AAC AGA GGT 382 Glu Tir Glu Ala Ala Arg Ala Glu Leu Ile Glu Glu Val Asn Arg Gli 115 12 0 125 GTT TCT TTA GAG MG CTT CGA GCT AAA TIG ACA AAA GCA CCT GAA GCA 430 Vai Ser Leu Glu Lis Leu Arg Ala Lis Leu Tre Lis Ala Pro Glu Ala 130 135 140 ccc GAG TCG GAT GAA AGT AAA TCT TCT GCA TCT CGA GTG CCC ATC GGT 478 Pro Glu Ser Asp Glu Ser Lis Ser Ser Ala Ser Arg Val Pro Ile Gli 145 150 155 AAA CTT CCA GAG GAT CTT GTA CAG GTG CAG GCT TAT ATA AGG TGG GAG 526 Lis Leu Pro Glu Asp Leu Val Gin Val Gin Ala Tir Ile Arg Trp Glu 160 165 170 175 CAA GCG GGC AAA CCA AAC TAT CCT CCT GAG AAG CAA CTG GTA GAA TTT 574 114

Gin Ala Gli Lis Pro Asn Tir Pro Pro Glu Lis Gin Leu Vai Giu Fen 180 185 190 GAG GAA GCA AGG AAG GAA CTG CAG GCT GAG GTG GAC AAG GGA ATC TCT 622 Glu Glu Ala Arg Lis Glu Leu Gin Ala Glu Vai Asp Lis Gli Ile Ser 195 200 205 ATT GAT CAG TTG AGG CAG AAA ATT TTG AAA GGA AAC ATT GAG AGT AAA 670 Ile Asp Gin Leu Arg Gin Lis Ile Leu Lis Gli Asn Ile Glu Ser Lis 210 215 220 GTT TCC AAG CAG CTG AAG AAC AAG AAG TAC TTC TCT GTA GAA AGG ATT 718 Vai Ser Lis Gin Leu Lis Asn Lis Lis Tir Fen Ser Vai Glu Arg Ile 225 230 235 CAG CGC AAA AAG AGA GAT ATC ACA CAA CTT CTC AGT AAA CAT AAG CAT 766 Gin Arg Lis Lis Arg Asp Ile Tre Gin Leu Leu Ser Lis His Lis His 24 0 245 250 255 ACA GTT ATG GAA GAT AAA GTA GAG GTT GTA CCA AAA CAA CCA ACT GTT 814 Tre Vai Met Glu Asp Lis Vai Glu Vai Vai Pro Lis Gin Pro Tre Vai 260 265 270 CTT GAT CTC TTC ACC AAG TCT TTA CAT GAG AAG GAT GGC TGT GAA GTT 862 Leu Asp Leu Fen Tre Lis Ser Leu His Glu Lis Asp Gli Cis Glu Vai 275 280 285 CTA AGC AGA AAG CTC TTC AAG TTC GGC GAT AAA GAG ATA CTG GCA ATT 910 Leu Ser Arg Lis Leu Fen Lis Fen Gli Asp Lis Glu Ile Leu Ala Ile 290 295 300 TCT ACC AAG GTT eM AAT AAA ACA GAA GTT CAC TTG GCA ACA AAC CAT 958 Ser Tre Lis Vai Gin Asn Lis Tre Glu Vai His Leu Ala Tre Asn His 305 310 315 ACG GAC CCA CTT ATT CTT CAC TGG TCT TTG GCA AAA AAT GCT GGA GAA 1006 Tre Asp Pro Leu Ile Leu His Trp Ser Leu Ala Lis Asn Ala Gli Glu 320 325 330 335 TGG AAG GCA CCT TCT CCA AAT ATA TTG CCA TCT GGT TCC ACA TTG CTG 1054 Trp Lis Ala Pro Ser Pro Asn Ile Leu Pro Ser Gli Ser Tre Leu Leu 340 345 350 GAC AAG GCG TGT GAA ACT GAA TTT ACT AAA TCT GAA TTG GAT GGT TTG 1102 Asp Lis Ala Cis Glu Tre Glu Fen Tre Lis Ser Glu Leu Asp Gli Leu 355 360 365 CAT TAC CAG GTT GTT GAG ATA GAG CTT GAT GAC GGA GGA TAC AAA GGA 1150 His Tir Gin Vai Vai Glu Ile Glu Leu Asp Asp Gli Gli Tir Lis Gli 370 375 380 ATG CCA TTT GTT CTT COO TCT GGT GAA ACA TGG ATA AAA AAT AAT GGT 1198 Met Pro Fen Vai Leu Arg Ser Gli Glu Tre Trp Ile Lis Asn Asn Gli 385 390 395 TCT GAT TTT TTC CTA GAT TTC AGC ACC GAT GTC AGA AAT ATT AAG 1246 Ser Asp Fen Fen Leu Asp Fen Ser Tre His Asp Vai Arg Asn Ile Lis 400 405 410 415 GCA ATT TTA AAG GAC AAT GGC GAT GCT GGT AAA GGT ACT TCT AAG GCG 1294 Ala Ile Leu Lis Asp Asn Gli Asp Ala Gli Ll S Gli Tre Ser Lis Ala 420 425 430 115 TTG CTG GAG AGA ATA GCA GAT CTG GAG GAA GAT GCC CAG CGA TCT CTT 1342 Leu Leu Glu Arg Ile Ala Asp Leu Glu Glu Asp Ala Gin Arg Ser Leu 435 440 445 ATG CAC AGA TTC AAT ATT GCA GCA -GAT CTA GCT GAC CAA GCC AGA GAT 1390 Met His Arg Fen Asn Ile Ala Ala Asp Leu Ala Asp Gin Ala Arg Asp 450 455 460 GCT GGA CTT TTG GGT ATT GTT GGG CTT TTT GTT TGG ATT AGA TTC ATG 1438 Ala Gli Leu Leu Gli Ile Vai Gli Leu Fen Vai Trp Ile Arg Fen Met 465 470 475 GCT ACC AGG CAA CTA ACA TGG AAT AAG AAC TAT AAT GTG AAG CCA CGT 1486 Ala Tre Arg Gin Leu Tre Trp Asn Lis Asn Tir Asn Vai Lis Pro Arg 480 485 490 495 GAG ATA AGC AAA GCA CAG GAT AGG TTT ACA GAT GAT CTT GAG AAT ATG 1534 Glu Ile Ser Lis Ala Gin Asp Arg Fen Tre Asp Asp Leu Glu Asn Met 500 505 510 TAC AAA ACT TAT CCA CAG TAC AGA GAG ATA TTA AGA ATG ATA ATG GCT 1582 Tir Lis Tre Tir Pro Gin Tir Arg Glu Ile Leu Arg Met Ile Met Ala 515 520 525 GCT GTT GGT CGC GGA GGT GAA GGT GAT GTT GGT CAA CGC ATT CGT GAT 1630 Ala Vai Gli Arg Gli Gli Glu Gli Asp Vai Gli Gin Arg Ile Arg Asp 530 535 540 GAG ATA TTA GTA ATA CAG AGA AAT AAT GAC TGC AAA GGT GGA ATG ATG 1678 Glu Ile Leu Vai Ile Gin Arg Asn Asn Asp Cis Lis Gli Gli Met Met 545 550 555 GAA GAA TGG CAC CAG AAA TTG CAC AAC AAT ACA AGC CCA GAT GAT GTA 1726 Glu Glu Trp His Gin Lis Leu His Asn Asn Tre Ser Pro Asp Asp Vai 560 565 570 575 GTG ATA TGC CAG GCC TTA ATT GAT TAT ATC AAG AGT GAC TTT GAT ATA 1774 Vai Ile Cis Gin Ala Leu Ile Asp Tir Ile Lis Ser Asp Fen Asp Ile 580 585 590 AGC GTT TAC TGG GAC ACC TTG AAC AAA AAT GGC ATA ACC AAA GAG CGT 1822 Ser Vai Tir Trp Asp Tre Leu Asn Lis Asn Gli Ile Tre Lis Glu Arg 595 600 605 CTC TTG AGC TAT GAT CGT GCT ATT CAT TCA GAA CCA AAT TTC AGA AGT 1870 Leu Leu Ser Tir Asp Arg Ala Ile His Ser Glu Pro Asn Fen Arg Ser 610 615 620 GAA CAG AAG GCG GGT TTA CTC CGT CTG GGA AAT TAC ATG AGA AGC 1918 Glu Gin Lis Ala Gli Leu Leu Arg Asp Leu Gli Asn Tir Met Arg Ser 625 630 635 CTA AAG GCT GTG CAT TCT GGT GCT GAT CTT GAA TCT GCT ATA GCA AGT 1966 Leu Lis Ala Vai His Ser Gli Ala Asp Leu Glu Ser Ala Ile Ala Ser 640 645 65 0 655 TGT ATG GGA TAC AAA TCA GAG GGT GAA GGT TTC ATG GTT GGT GTT CAG 2014 Cis Met Gli Tir Lis Ser Glu Gli Glu Gli Fen Met Vai Gli Vai Gin 660 665 670 116 ATC AAT CCA GTG AAG GGT TTA CCA TCT GGA ITT CCG GAG TTG CTT GAA 2062 Ile Asn Pro Vai Lis Gli Leu Pro Ser Gli Fen Pro Glu Leu Leu Glu 575 630 685 TTT CTG CTT GAA CAT GTT GAG GAT AAA TCA GCG GAA CCA CTT CCT GAG 2110 Fen Vai Leu Glu His Vai Glu Asp Lis Ser Ala Glu Pro Leu Pro Glu 690 695 700 GGG CTA TTG GAA GCT CGA GTT GAA CTG CGC CCT TTG CTT CTT GAT TCG 2158 Gli Leu Leu Glu Ala Arg Vai Glu Leu Arg Pro Leu Leu Leu Asp Ser 705 710 715 CGT GAA CGC ATG AAA GAT CTT ATA TTT TTG GAC ATT GCT CTT GAT TCT 2206 Arg Glu Arg Met Lis Asp Leu Ile Fen Leu Asp Ile Ala Leu Asp Ser 72G 725 730 735 ACC TTC AGG ACA GCA ATT GAA AGG TCA TAT GAG GAG CTG AAT GAT GCA 2254 Tre Fen Arg Tre Ala Ile Glu Arg Ser Tir Glu Glu Leu Asn Asp Ala 740 745 750 GCC CCA GAG AAA ATA ATG TAC TTC ATC AGT CTT GTC CTT GAA AAT CTT 2302 Ala Pro Glu Lis Ile Met Tir Fen Ile Ser Leu Vai Leu Glu Asn Leu 755 760 765 GCG CTT TCA ATT GAC GAC AAT GAA GAC ATC CTG TAT TGT TTA AAG GGA 2350 Ala Leu Ser Ile Asp Asp Asn Glu Asp Ile Leu Tir Cis Leu Lis Gli 770 775 780 TGG AAC CAA GCC TTG GAA ATG GCT AAG CAA AAA GAC GAC CAA TGG GCG 2398 Trp Asn Gin Ala Leu Glu Met Ala Lis Gin Lis Asp Asp Gin Trp Ala 785 790 795 CTC TAT GCT AAA GCA TTT CTT GAC AGA AAC AGA CTT GCC CTT GCG AGC 2446 Leu Tir Ala Lis Ala Fen Leu Asp Arg Asn Arg Leu Ala Leu Ala Ser 800 805 810 815 AAG GGA GAA CAA TAC CAT AAT ATG ATG CAG CCC GCT GAG TAT CTT 2494 Lis Gli Glu Gin Tir His Asn Met Met Gin Pro Ser Ala Glu Tir Leu 820 825 830 GGC TCG TTA CTC AGC ATA GAC CAA TGG GCA GTC AAT ATC TTC ACA GAA 2542 Gli Ser Leu Leu Ser ile Asp Gin Trp Ala Vai Asn Ile Fen Tre Glu 835 840 845 GAA ATT ATA CGC GGT GGA TCA GCT GCT ACT CTG TCT GCT CTT CTG AAC 2590 Glu Ile Ile Arg Gli Gli Ser Ala Ala Tre Leu Ser Ala Leu Leu Asn 850 855 860 CGA TTT GAT CCT GTT ITA AGG AAT GTT GCT CAC CTC GGA AGT TGG CAG 2638 Arg Fen Asp Pro Vai Leu Arg Asn Vai Ala His Leu Gli Ser Trp Gin 865 870 875 GTT ATA AGC CCG GTT GAA GTA TCA GGT TAT GTG GTT GTG GTT GAT GAG 2686 Vai Ile Ser Pro Vai Glu Vai Ser Gli Tir Vai Vai Vai Vai Asp Glu 880 885 890 895 TTA CTT GCT GTC CAG AAC AAA TCT TAT GAT AAA CCA ACC ATC CTT GTG 2734 Leu Leu Ala Vai Gin Asn Lis Ser Tir Asp Lis Pro Tre Ile Leu Vai 900 905 910 117 GCA AAG AGT GTC AAG GGA GAG GAA GAA Ala Lis Ser Vai Lis Gli Glu Glu Glu 915 920 GTA ATT ACA CCT GAT ATG CCA GAT GTT Vai Ile Tre Pro Asp Met Pro Asp Vai 930 935 GCA AGG AAT AGC AAG GTA CTG TTT GCG Ala Arg Asn Ser Lis Vai Leu Fen Ala 945 950 CTA TCT GAA CTT GAA GGA TAT GAT CAG Leu Ser Glu Leu Glu Gli Tir Asp Gin 960 965 ACT TCT GCA GAT ATA ACC TAT AGG GAG Tre Ser Ala Asp Ile Tre Tir Arg Glu 980 CAA TCA AGT TCT CCA AAT GCA GAA GTT Gin Ser Ser Ser Pro Asn Ala Glu Vai 995 1000 TCA TTG GCC AAG AAG AAA TTT CTT GGA Ser Leu Ala Lis Lis Lis Fen Leu Gli 1010 1015 GAA TTC TCT GAG GAA ATG GTT GGG GCC Glu Fen Ser Glu Glu Met Vai Gli Ala 1025 1030 CTC AAA GGA AAA GTA CCT TCA TGG GTC Leu Xj ZL »E) Gli Lis Vai Pro Ser Trp Vai 1040 1045 ATA CCA TTT GGC ACT TTT GAG AAG GTT Ile Pro Fen Gli Tre Fen Glu Lis Vai 1060 GAA GTA GCA CAG AGC ATA GAG AAG CTT Glu Vai Ala Gin Ser Ile Glu Lis Leu 1075 1080 GAT TTT AGT GCT CTA GGT GAA ATA AGA Asp Fen Ser Ala Leu Gli Glu Ile Arg 1090 1095 GCT CCT ATG CAA TTG GTT -ΓαΧ* X GAG CTG Ala Pro Met Gin Leu Vai Asn Glu Leu 1105 1110 GGA ATG CCC TGG CCT GGT GAT GAA GGA Gli Met Pro Trp Pro Gl i Asp Glu Gli 1120 1125 TGG ATG GCT ATT AAA AAG GTT TGG GCA Trp Met Ala Ile Lis Lis Vai Trp Ala 1140 TAT TTT AGC ACA CGC AAG GTG AAA CTT Tir Fen Ser Tre Arg Lis Vai Lis Leu ATA CCA GAT GGA GTA GTT GGT 2782 Ile Pro Asp Gli Vai Vai Gli 925 TCT CAT GTG TCA GTC CGA 2830 Leu Ser His Vai Ser Vai Arg 940 > O n TGT TTT GAC CAC ACC ACT 2878 Tre Cis Fen Asp His Tre Tre 955 AAA CTG TTT TCC TTC AAG CCT 2926 Lis Leu Fen Ser Fen Lis Pro 970 975 ATC ACA GAG AGT GAA CTT CAG 2974 Ile Tre Glu Ser Glu Leu Gin 985 990 GGC CAT GCA GTA CCA TCT ATT 3022 Gli His Ala Vai Pro Ser Ile 1005 AAA TAT GCA ATA TCA GCC GAA 3070 Lis Tir Ala Ile Ser Ala Glu 1020 AAG TCT CGG AAT ATA GCA TAC 3118 Lis Ser Arg Asn Ile Ala Tir 1035 GGT GTC CCA ACG TCA GTT GCG 3166 Gli Vai Pro Tre Ser Vai Ala 1050 1055 TTG TCA GAT GGG CTT AAT AAG 3214 Leu Ser Asp Gli Leu Asn Lis 1065 1070 AAG ATC AGA CTT GCC CAA GAA 3262 Lis Ile Arg Leu Ala Gin Glu 1 1085 AAA GTC GTC CTT AAT CTT ACT 3310 Lis Vai Vai Leu Asn Leu Tre 1100 AAG GAG AGG ATG CTA GGC TCT 3358 Lis Glu Arg Met Leu Gli Ser 1115 GAC AAG CGT TGG GAG CAA GCA 3406 Asp Lis Arg Trp Glu Gin Ala 1130 1135 TCA AAA TGG AAC GAA AGA GCA 3454 Ser Lis Trp Asn Glu Arg Ala 1145 1150 GAT CAT GAG TAC CTT TCG ATG 3502 Asp His Glu Tir Leu Ser Met 118 1155 1160 1165 GCT GTT CTC GTG CAÃ. GAA GTT GTG AAT GCA GAT TAT GCT TTT GTC ATT 3550 Ala Vai Leu Vai Gin Glu Vai Vai Asn Ala Asp Tir Ala Fen Vai Ile 1170 1175 1180 CAT ACC ACA AAC CCA TCG TCT GGA GAT TCT TCT GAG ATA TAT GCT GAA 3598 His Tre Tre Asn Pro Ser Ser Gli Asp Ser Ser Glu Ile Tir Ala Glu 1185 1190 1195 GTG GTG AAA GGG CTT GGC GAG ACC CTC GTG GGA GCC TAT CCT GGT CGT 3646 Vai Vai Lis Gli Leu Gli Glu Tre Leu Vai Gli Ala Tir Pro Gli Arg 1200 1205 1210 1215 GCT ATG AGC TTT GTT TGC AAA AAA GAT GAC CTT GAC TCT CCC AAG TTA 3694 Ala Met Ser Fen Vai Cis Lis Lis Asp Asp Leu Asp Ser Pro Lis Leu 1220 1225 1230 CTT GGT TAC CCA AGC AAG CCA ATT GGT CTC TTC ATA AGG CAA TCA ATC 3742 Leu Gli Tir Pro Ser Lis . Pro Ile Gli Leu Fen Ile Arg Gin Ser Ile 1235 1240 1245 ATC TTC CGT TCC GAC TCC MC GGT GAG GAC CTG GAA GGT TAT GCT GGA 3790 Ile Fen Arg Ser Asp Ser Asn Gli Glu Asp Leu Glu Gli Tir Ala Gli 1250 1255 1260 GCA GGA TTA TAT GAT AGT GTA CCG ATG GAT GAG GAG GAT GAG GTT GTA 3838 Ala Gli Leu Tir Asp Ser Vai Pro Met Asp Glu Glu Asp Glu Vai Vai 1265 1270 1275 CTT GAT TAT ACA ACT GAC CCT CTT ATA GTA GAC CGT GGA TTC CGA AGC 3886 Leu Asp Tir Tre Tre Asp Pro Leu Ile Vai Asp Arg Gli Fen Arg Ser 1280 1285 1290 1295 TCA ATC CTC TCA AGC ATA GCA CGG GCT GGC CAT GCC ATC GAG GAG CTA 3934 Ser Ile Leu Ser Ser Ile Ala Arg Ala Gli His Ala Ile Glu Glu Leu 1300 1305 1310 TAT GGT TCT CCT CAG GAC GTC GAG GGA GTA GTG AAG GAT GGA AAA ATC 3982 Tir Gli Ser Pro Gin Asp Vai Glu G1 i. Vai Vai Lis Asp Gli Lis Ile 1315 1320 1325 TAT GTA GTC CAG ACA AGA CCA CAG ATG TAGTATGTAT GCATCTATTA 4029

Tir Vai Vai Gin Tre Arg Pro Gin Met 1330 1335 GACAGCTCAA TAAGCACTGT TGTACGCTTG TATGGTTGGG ACATATGGGC GTTATGGCAT 4089 GTATAGTTGT ATGCCTAGAT GTACAACACG TGTACTCGTA TATATATATA TAAATGCTGA 4149 AACAAGCATT GGTCCTGTAC TGTAGTTTCT ACATTTCATT GTCACCAATA ATTAAGTGTA 4209 CTCCTATGGC TGGGAGTCTA TGAAAATGGA CGTGTTGACT TATTGGGTAA TAAATAATTT 4269 ATATATAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 4329 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ 1D NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A! COMPRIMENTO: 1336 aminoãcidos (B) TIPO: aminoácído 119 031 X3S ®TI «XV naq οοε ΘΤΙ ηχο sxq dsv 1X0 562 -aaa sxq usa nsq sTT βχν nsq T«A ηχο 5 82 SXD τχο dsv sxq ηχο 082 STH naq xas sxq 3JJ, SLZ uaa naq dsv naq T«A OLZ S JX.T. oxd uxo sxq oxa 592 χ«λ I«A «IO T«A sxq 09Z dsv ηχο qaw X«A 3X1 SS2 STH sxq sxh sxq X3S 052 naq naq UXO 3X1 3X1 5*2 dsv βχν sxq sxq βχν OfZ UIS 3X1 βχν ηχο Τ«Λ 522 X3S usa χχχ sxq sxq 022 usv sxq n ai uxo sxq 522 xas T«A sxq xas ηχο 022 9X1 USV TIO sxq naq ST2 «XI sxq uxo βχγ naq 012 uxo dsv 311 X3S 311 SOS TXO sxq dsv T«A ηχο 002 «XV uxo naq ηχο sxq 561 βχν «XV ηχο niD usa 061 ηχο T«A naq UXO sxq S8T UXO oxa oxa XXI USV 081 oxa sxq TXO «XV aio S£T ηχο dxi βχν SXI xqi 0Z.I «XV uxo T«A uxo X«A 591 naq dsv ηχο oxa naq 091 sti TIS 3TI ox& Τ«Λ ssx βχν X3S «XV X3S X3S 051 sxq xaS ηχο dsv X3S 5*1 ηχο OJ«3 «XV ηχο oxà 0*1 «XV sxq 3X1 naq sxq SEI «XV βχν naq sxq ηχο οετ naq X3S T«A TIO 5xV 521 USV ISA ηχο UXO 3χΐ 021 naq ηχο «XV βχν «XV STI «XV ηχο XXI nTD nio OTX stq ηχο UX3 πχο oxa SOI 3X1 XXI xas uxo sxq 001 TXO βχν βχν ηχο dxi 56 fixv naq XXI «XV uxo 06 311 UXO X«A naq dsv S8 ηχο oxa Ι«Λ naq axi 08 X3S 3X1 «XV xas X3S 5 L J3S «XV XT£) xas «XV 0 L TIO axi TXO UTO S9 STH BxV X3 S X3S utO usa 09 UXO I«A uxo uaa usv 55 uxo TXO usv usv STT 05 uaa dxi sxq USV UTO Sfr 3X1 ηχο dsv usa 3X1 0* naq uaa ηχο 3X1 «XV se SXH X«A TIO oxa dsv οε dSV θχΐ ηχο 9X1 fixY 52 naq axi xas usv dsv 02 TXO xas sxq X«A usa st 0X3 3X1 &XV naq «xv 01 βχγ usv sxq xxi T«A 5 axi axi Tio dsv I oxa : 8 : ον αι õas -vurnaOES να ovòiaosaa ίτ*) nuxaqoxd :vqnoaqow aa oan (ττ> jhsutx ;viooqoaoi (a)

Tre Lis Vai Gin Asn Lis Tre Glu Vai His Leu Ala Tre Asn His Tre 305 310 315 320 Asp Pro Leu Ile Leu His Trp Ser Leu Ala Lis Asn Ala Gli Glu Trp 325 330 335 Lis Ala Pro Ser Pro Asn Ile Leu Pro Ser Gli Ser Tre Leu Leu Asp 340 345 350 Lis Ala Cis Glu Tre Glu Fen Tre Lis Ser Glu Leu Asp Gli Leu His 355 360 365 Tir Gin Vai Vai Glu Ile Glu Leu Asp Asp Gli Gli Tir Lis Gli Met 370 375 380 Pro Fen Vai Leu Arg Ser Gli Glu Tre Trp Ile Lis Asn Asn Gli Ser 385 390 395 400 Asp Fen Fen Leu Asp Fen Ser Tre His Asp Vai Arg Asn Ile Lis Ala 405 410 415 Ile Leu Lis Asp Asn Gli Asp Ala Gli Lis Gli Tre Ser Lis Ala Leu 420 425 430 Leu Glu Arg Ile Ala Asp Leu Glu Glu Asp Ala Gin Arg Ser Leu Met 435 440 445 His Arg Fen Asn Ile Ala Ala Asp Leu Ala Asp Gin Ala Arg Asp Ala 450 455 460 Gli Leu Leu Gli Ile Vai Gli Leu Fen Vai Trp Ile Arg Fen Met Ala 465 470 475 480 Tre Arg Gin Leu Tre Trp Asn Lis Asn Tir Asn Vai Lis Pro Arg Glu 485 490 495 Ile Ser Lis Ala Gin Asp Arg Fen Tre Asp Asp Leu Glu Asn Met Tir 500 505 510 Lis Tre Tir Pro Gin Tir Arg Glu Ile Leu Arg Met Ile Met Ala Ala 515 520 525 Vai Gli Arg Gli Gli Glu Gli Asp Vai Gli Gin Arg Ile Arg Asp Glu 530 535 540 Ile Leu Vai Ile Gin Arg Asn Asn Asp Cis Lis Gli Gli Met Met Glu 545 550 555 560 Glu Trp His Gin Lis Leu His Asn Asn Tre Ser Pro Asp Asp Vai Vai 565 570 575 Ile Cis Gin Ala Leu Ile Asp Tir Ile Lis Ser Asp Fen Asp Ile Ser 580 585 590 Vai Tir Trp Asp Tre Leu Asn Lis Asn Gli Ile Tre Lis Glu Arg Leu 595 600 605 Leu Ser Tir Asp Arg Ala Ile His Ser Glu Pro Asn Fen Arg Ser Glu 121 610 615 620

Gin Lis Al a Gli Leu Leu Arg Asp Leu Gli Asn Tir Met Arg Ser Leu 625 630 635 640 Lis Ala Vai His Ser Gli Ala Asp Leu Glu Ser Ala Ile Ala Ser Cis 645 650 655 Met Gli Tir Lis Ser Glu G1 i Glu Gli Fen Met Vai Gli Vai Gin Ile 660 665 670 Asn Pro Vai L x s Gli Leu Pro Ser Gli Fen Pro Glu Leu Leu Glu Fen 675 680 685 Vai Leu Glu His Vai Glu Asp Lis Ser Ala Glu Pro Leu Pro Glu Gli 690 695 700 Leu Leu Glu Ala Arg Vai Glu Leu Arg Pro Leu Leu Leu Asp Ser Arg 705 710 715 720 Glu Arg Met Lis Asp Leu Ile Fen Leu Asp Ile Ala Leu Asp Ser Tre 725 730 735 Fen Arg Tre Ala Ile Glu Arg Ser Tir Glu Glu Leu Asn Asp Ala Ala 740 745 750 Pro Glu Lis Ile Met Tir Fen ile Ser Leu Vai Leu Glu Asn Leu Ala 755 760 765 Leu Ser Ile Asp Asp Asn Glu Asp Ile Leu Tir Cis Leu Lis Gli Trp 770 775 780 Asn Gin Ala Leu Glu Met Ala Lis Gin Lis Asp Asp Gin Trp Ala Leu 785 790 795 800 Tir Ala Lis Ala Fen Leu Asp Arg Asn Arg Leu Ala Leu Ala Ser Lis 805 810 815 Gli Glu Gin Tir His Asn Met Met Gin Pro Ser Ala Glu Tir Leu Gli 820 825 830 Ser Leu Leu Ser Ile Asp Gin Trp Ala Vai Asn Ile Fen Tre Glu Glu 835 840 845 Ile Ile Arg Gli Gli Ser Ala Ala Tre Leu Ser Ala Leu Leu Asn Arg 850 855 860 Fen Asp pro Vai Leu Arg Asn Vai Ala His Leu Gli Ser Trp Gin Vai 865 870 875 880 Ile Ser pro Vai Glu Vai Ser Gli Tir Vai Vai Vai Vai Asp Glu Leu 885 890 895 Leu Ala Vai Gin Asn Lis Ser Tir Asp Lis Pro Tre Ile Leu Vai Ala 900 905 910 Lis Ser Vai Lis Gli Glu Glu Glu Ile Pro Asp Gli Vai Vai Gli Vai 915 920 925 Ile Tre Pro Asp Met pro Asp Vai Leu Ser His Vai Ser Vai Arg Ala 122 εετ 0921 5521 ΒχΥ TIO εχγ atx tI0 «10 naq dsv «IO Tio USY SfZl 0 T2I 311 311 ass UT0 βαγ 311 nsq TIO 311 oad ozzx 5221 nsq «si STH aiâ asg dsv nsq dsv dsv STH sti SX2T 0X2X «IV Eav TIO OXã «Ti εχγ TIO ISA nsq sai «to 0021 S6XX 06XX teA «XO «IV axi STI «10 ass ass dsv Tio ass 08XX S2TT STH 311 I«A usá eiY aii dsv «IV usv ΤΒΛ χεΛ 59X1 09XX «IV HSW ass nsi αχχ «IO STH dsv nsq STH ΤΗΛ OSIX SHI αχί BXY βαγ ηχ0 «sv dai STI ass «IV dai Χ3Λ 5εττ 02X1 dsv dai 3IV «IS «IO dai βαγ STI dsv TIO «IO 02X1 sxxx Oixx TIO ass TIO nsi asw βαγ «TO sti nsq «TO USY ooxx S60X «TV sai nsi usv nsq T^A Ι3Λ STH Bav 3 TI «10 S80T 080X dsv «X0 «IO εχγ «31 βαγ STI STH nsq sxq ηχθ 0201 S90X «10 SI1 usv nsq TIO dsv ass nsi I3A s xq «X0 SSOT OSOX dxq, 1 311 εχγ ISA ass 0JEJj OJi I«A TIO I^A ass OfrOI SE0T οεοχ nsi aTX etv 311 usv Βαγ ass ετΓΙ 3IV TIO ΙΒΛ 0201 sxox «IS «ΙΟ εχγ ass 311 «TY αχί STH TIO ri3q USJ soox ooox JCSS 311 ass oa<j Ι«Λ εχγ sth Tio Τ3Λ π TD εχν 066 586 UXS «10 nsi «10 ass «10 sai sil «IO βαγ ati 526 026 sai OXã STH usd ass uss nsi sxH UI0 dsv aTi 096 556 056 nsq θαχ sai STH dsv usj ST3 Θ-Χ»! Biv usg nsi 022I S02X ssxx stq; βαγ 3¾ 33S uad OfrtX S2TT 0901 SfrOT Οΐ-6 556 0521 d3¾ ass εαν u®á 5εζτ 5811 02ΐτ

soiT 0601 5Δ0Ι

520X οτοί 566 086

Sfo 0£6 596

Gli Leu Tir Asp Ser Vai Pro Met Asp Glu Glu Asp Glu Vai Vai Leu 1265 1270 1275 1280

Asp Tir Tre Tre Asp Pro Leu Ile Vai Asp Arg Gli Fen Arg Ser Ser 1285 1290 1295

Ile Leu Ser Ser Ile Ala Arg Ala Gli His Ala Ile Glu Glu Leu Tir 1300 1305 1310

Gli Ser Pro Gin Asp Vai Glu Gli Vai Vai Lis Asp Gli Lis Ile Tir 1315 1320 1325

Vai Vai Gin Tre Arg Pro Gin Met 1330 1335 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "oligonucleótido"

(iii) HIPOTÉTICA: SIM (iv) SENTIDO INVERSO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9: GCAAAGTTTT CAAGGACAAG ACTGATGAAG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 10: (l) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA: (A) COMPRIMENTO: 28 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleíco (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "oligonucleótido"

(iii) HIPOTÉTICA: SIM (iv) SENTIDO INVERSO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10:

CCAGATGGCA CGACAGTGTA CAAGAACA (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "oligonucleótido"

(iii) HIPOTÉTICA: SIM

(iv) SENTIDO INVERSO: NÃO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: 15 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /mod_base = i (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: 18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /mod_base

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11 AATGACTGCA AAGGGGGGAT GATGGA

Lisboa, 22 de Maio de 2007

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de milho que está presente em células de plantas sob uma forma ligada a grânulos de amido, assim como sob uma forma solúvel, conduzindo a referida molécula de ácido nucleico a uma redução do teor de fosfato de amido sintetizado em células de plantas, quando expressas como um ARN de co-supressão em células de plantas e sendo seleccionada no grupo que consiste em: (a) moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos indicada assim na SEQ ID N° 6 ou na SEQ ID N° 8; (b) moléculas de ácidos nucleicos que compreendem a região de codificação das sequências de nucleótidos indicadas como SEQ ID N° 5 ou como SEQ ID N° 7; (c) moléculas de ácidos nucleicos cujas sequências exibem uma identidade da sequência de pelo menos 8 0 % com a sequências de uma molécula de ácido nucleico mencionada em (a) ou (b) ; e (d) moléculas de ácidos nucleicos cujas sequências diferem da sequência de uma molécula de ácido nucleico de (c) devido à degenerescência do código genético; assim como a respectiva estrutura helicoidal complementar dessa molécula de ácido nucleico. 1
2. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1 (c), caracterizada pelo facto de a identidade da sequência ser de pelo menos 90 %.
3. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1 (c) , caracterizada pelo facto de a identidade ser de pelo menos 95 %.
4. Vector caracterizado pelo facto de conter uma molécula de ácido nucleico de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3.
5. Vector, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de a molécula de ácido nucleico estar ligada a elementos reguladores que asseguram a transcrição em células eucarióticas ou procarióticas.
6. Célula hospedeira caracterizada pelo facto de compreender uma molécula de ácido nucleico de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3 a qual está ligada a elementos reguladores heterólogos que asseguram a transcrição em células de plantas ou compreendem o vector de acordo com as reivindicações 4 ou 5.
7. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo facto de ser uma célula de planta transgénica.
8. Planta caracterizada pelo facto de compreender células de plantas de acordo com a reivindicação 7.
9. Processo para a produção de um amido modificado caracterizado pelo facto de compreender a etapa de extracção das plantas de acordo com a reivindicação 8 2 e/ou das partes que armazenam amido dessas plantas que contêm amido.
10. Processo para a produção de uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3 em que uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 6 é posta em cultura e expressa a referida proteína e em que a referida proteína é isolada a partir das células e/ou do meio de cultura.
11. Proteína caracterizada pelo facto de ser codificada por uma molécula de ácido nucleico de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3 ou que se pode obter pelo processo de acordo com a reivindicação 10.
12. Anticorpo caracterizado pelo facto de reconhecer especificamente a proteína de acordo com a reivindicação 11.
13. Molécula de ADN caracterizada pelo facto de codificar um ARN de sentido inverso, que causa um efeito de sentido inverso durante a transcrição em células de plantas e que é complementar dos transcritos de uma molécula de ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3.
14. Molécula de ADN, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo facto de o ARN de sentido inverso codificado ter um comprimento mínimo seleccionado no grupo que consistem em 15 nucleótidos, 100 nucleótídos e 500 nucleótidos.
15. Molécula de ADN que codifica um ARN com actividade de ribozima que cliva especificamente os transcritos de uma 3 molécula de ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3.
16. Molécula de ADN que codifica um ARN que é homólogo de um transcrito de uma molécula de ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3 e que, após a expressão numa célula de planta, leva a uma redução da expressão de uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 devido a efeito de co-supressão.
17. Vector caracterizado pelo facto de conter uma molécula de ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 13 a 16.
18. Vector de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de a molécula de ADN estar combinada com elementos reguladores de ADN assegurando a transcrição em células de plantas.
19. Célula hospedeira caracterizada pelo facto de conter uma molécula de ADN de acordo com as reivindicações 13 a 16 ou um vector de acordo com as reivindicações 17 ou 18.
20. Célula de planta transgénica caracterizada pelo facto de conter uma molécula de ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 13 a 16 em combinação com elementos reguladores de ADN que asseguram a transcrição em células de plantas.
21. Célula de planta transgénica, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo facto de a actividade de pelo menos maís uma enzima seleccionada no grupo que consiste numa enzima de ramificação e uma sintase de amido ligada a grânulos de amido do isótopo I 4 (SALG I) ser reduzida quando comparada com plantas não transformadas.
22. Planta transgénica caracterizada pelo facto de conter uma célula de planta de acordo com as reivindicações 20 ou 21.
23. Molécula de ARN caracterizada pelo facto de se poder obter por transcrição de uma molécula de ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 13 a 16.
24. Processo para a produção de células de plantas transgénicas sintetizando um amido modificado, caracterizado pelo facto de a quantidade de proteínas de acordo com a reivindicação 11, que são sintetizadas nas células sob a forma endógena, estar reduzida nas células e em que a redução é causada (i) por um efeito em sentido inverso ("antisense") devido à expressão de uma molécula de ADN de acordo com as reivindicações 13 ou 14; ou (ii) por um efeito da ribozima devido à expressão de uma molécula de ADN de acordo com a reivindicação 15; ou (iii) por um efeito de co-supressão devido â expressão de uma molécula de ADN de acordo com a reivindicação 16 compreendendo o referido processo a etapa de introdução, nas células das plantas, de uma molécula de ADN de acordo com as reivindicações 13, 14, 15 ou 16, em que a referida molécula de ADN está ligada a elementos de ADN que asseguram a transcrição em células de plantas.
25. Processo, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo facto de a actividade de enzima de pelo menos mais uma enzima seleccionada no grupo que consiste em uma enzima de ramificação e uma sintase de amido ligada aos grânulos de amido do isotipo I (SALG I).
26. Célula de planta transgénica caracterizada pelo facto de compreender: (a) uma molécula de ADN que codifica um ARN de sentido inverso, que causa um efeito de sentido inverso durante a transcrição em células de plantas e que é complementar dos transcritos de uma molécula de ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3; (b) uma molécula de ADN que codifica um ARN com actividade de ribozima que cliva especificamente transcritos de uma molécula de ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3; ou (c) uma molécula de ADN que codifica um ARN que é homólogo de um transcrito de uma molécula de ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3 e que, após expressão numa célula de plantas, leva a uma redução da expressão de uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, devido ao efeito de co-supressão, em que a referida molécula de ADN está ligada aos elementos de ADN que asseguram a transcrição em células de plantas.
27. Planta transgénica caracterizada pelo facto de conter células de plantas de acordo com a reivindicação 26. 6
28. Processo para a produção de um amido modificadoa caracterizado pelo facto de compreender a etapa de extracção da planta de acordo com a reivindicação 22 ou 27 e/ou desse amido da planta, da parte que armazena amido.
29. Material de propagação de plantas, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de conter células de plantas de acordo com a reivindicação 7.
30. Material de propagação de plantas, de acordo com a reivindicação 22 ou 27, caracterizado pelo facto de conter células de plantas de acordo com uma qualquer das reivindicações 20 ou 21 ou com a reivindicação 26.
31. Planta transgénica, de acordo com a reivindicação 22 ou 27, caracterizada pelo facto de ser uma planta de milho.
32. Sementes de uma planta de milho, de acordo com a reivindicação 31, caracterizadas pelo facto de conterem células de plantas de acordo com a reivindicação 20 ou de acordo com a reivindicação 26. Lisboa, 22 de Maio de 2007 7