DE10208133A1

DE10208133A1 - Transgene Futterpflanzen mit erhöhtem Blattstärkegehalt

Info

Publication number: DE10208133A1
Application number: DE10208133A
Authority: DE
Inventors: Claus Frohberg; Martin Leube; Isabel Ruempler
Original assignee: Planttec Biotechnologie GmbH Forschung and Entwicklung
Current assignee: Bayer Bioscience GmbH
Priority date: 2002-02-26
Filing date: 2002-02-26
Publication date: 2003-09-11
Also published as: US20030217386A1; AU2003210328A8; WO2003072791A2; AU2003210328A1; WO2003072791A3

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Herstellung transgener Futterpflanzen, die genetisch modifiziert sind, wobei die genetische Modifikation zur Verringerung der Aktivität eines R1-Proteins im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyp-Pflanzen führt. Solche transgenen Futterpflanzen zeichnen sich dadurch aus, daß sie einen wesentlich erhöhten Gehalt an Blattstärke aufweisen im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung transgener Futterpflanzenzellen bzw. Futterpflanzen, die genetisch modifiziert sind, wobei die genetische Modifikation in den Zellen bzw. Pflanzen zur Verringerung der Aktivität eines R1-Proteins im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyp- Pflanzenzellen bzw. Pflanzen führt. Nach diesem Verfahren hergestellte Pflanzen synthetisieren eine modifizierte Blattstärke, wobei der Gehalt der Stärke in den Blättern der Pflanzen um bis zu 1000% über dem nicht genetisch modifizierter Wildtyp-Pflanzen liegt. Diese Stärke ist weiterhin vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, daß sie einen verringerten Phosphat-Gehalt aufweist. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung transgene Futterpflanzenzellen sowie Futterpflanzen mit einer im Vergleich zu Wildtyp- Pflanzen(zellen) verringerten Aktivität eines R1-Proteins.
Unter Futterpflanzen werden in erster Linie die kleeartigen Futterpflanzen (= Futterleguminosen) sowie die Futtergräser gezählt. Beide unterscheiden sich von den meisten wichtigen Kulturpflanzen dadurch, daß nicht in erster Linie Vermehrungsorgane wie Samen, Früchte oder Knollen, sondern die gesamte oberirdische Pflanzenmasse das angestrebte Ernteprodukt darstellen. Zu den Futterleguminosen zählen die Kleearten (wie z. B. die Trifolium-, Medicago- und Lotusformen), die Wickenarten (wie Vicia und Coronilla), weiterhin Esparsette (Onobrychis) und Serradella (Ornithopus). Zu den Futtergräsern werden u. a. die Weidel-, Rispen-, Liesch-, und Hafergräser, Knauel- und Straußgras, sowie die Schwingelarten gezählt.
Die Anforderungen an Futterpflanzen liegen in einer Verbesserung des Futterwertes. Dieser komplexe Begriff umfaßt neben der Aufnahmefähigkeit auch die Bereiche Verdaulichkeit und den Gehalt an wertgebenden Inhaltsstoffen.
Futterpflanzen können nur über das Tier sinnvoll verwertet werden. Von einer verbesserten Futterqualität des Grünfutters, das in frischer oder silierter Form gegeben wird, erhofft sich die Landwirtschaft neben einer besseren Verwertung des verfütterten Materials auch eine bessere Deckung des Energiebedarfs in der Viehfütterung. Hier sind jedoch die Unterschiede zwischen Wiederkäuern und Nicht-Wiederkäuern zu berücksichtigen. Die Deckung des Energiebedarfs bei Rindern kann nur teilweise durch Zulage von Konzentraten erfolgen, weil die spezifischen Verdauungsabläufe bei Wiederkäuern einen Mindestanteil an strukturiertem Rauhfutter erfordern. Futterpflanzen sollten deshalb einen hohen verwertbaren Energiegehalt haben und eine sehr gute Aufnahme garantieren. Der hohe Energiebedarf ist zur Verdaulichkeit proportional. Die Aufnahme hängt von der Passiergeschwindigkeit durch den Darm ab.
Futterpflanzen, vor allem Futterleguminosen wie Trifolium repens und Lolium perenne, sind sehr proteinhaltig, aber enthalten nur einen geringen Anteil an nicht-löslichen Kohlenhydraten (NSC). Dies hat zur Folge, daß ein Großteil des produzierten Ammoniums nicht verstoffwechselt werden kann, sondern, um eine Vergiftung zu vermeiden, zur Leber transportiert, in Harnsäure umgewandelt und dann ausgeschieden wird. Dies führt zu einem Stickstoff-Verlust und gleichzeitig zu hohen Ausscheidungsmengen an Ammoniak.
Von einem erhöhten Blattstärkegehalt verspricht sich die Tierzüchtung ein verbessertes Kohlenstoff/Stickstoff-Verhältnis (C/N), folglich eine bessere Verdaulichkeit und Energieaufnahme und letztlich eine höhere Fleisch-/bzw. Milchproduktion, verbunden mit geringeren Ammoniak-Ausscheidungen.
Ritte et al. (Plant J. 21 (2000), 387-391) konnten zeigen, daß das R1-Protein aus Solanum tuberosum in Kartoffelpflanzen reversibel an Stärkekörner bindet, wobei die Stärke der Bindung an das Stärkekorn abhängt vom metabolischen Status der Pflanze. In stärkekorngebundener Form liegt das Protein in Kartoffelpflanzen vornehmlich in Blättern vor, die im Dunkeln gehalten wurden. Nach Beleuchtung der Blätter liegt das Protein dagegen hauptsächlich in der löslichen, nicht an das Stärkekorn gebundenen Form vor.
Bei Untersuchungen transgener Kartoffeln zeigte sich, daß eine Reduktion der Expression des R1-Gens zu einem Anstieg des Stärkegehalts in den Blättern der Kartoffelpflanzen führte. Damit verbunden ist ein Anstieg des Trockengewichtes um 50-90%. Ähnliche Ergebnisse erbrachten Untersuchungen von Blättern transgener Tabakpflanzen, bei denen das R1-Gen mittels antisense-Suppression unterdrückt war (Lorberth et al., Nature Biotechnology 16 (1998), 473-477).
Bisher konnte jedoch noch kein Nachweis der Erhöhung des Stärkegehaltes in Futterpflanzen gezeigt werden, zudem fehlten die entsprechenden Gensequenzen.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem transgene Futterpflanzen hergestellt werden können, die besser an die Bedürfnisse der Landwirtschaft angepaßt sind, insbesondere dahingehend, daß sie einen höheren verwertbaren Energiegehalt haben.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen bezeichneten Ausführungsformen gelöst.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Futterpflanze, die im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen einen erhöhten Blattstärkegehalt aufweist, wobei

a) eine Zelle einer Futterpflanze genetisch modifiziert wird durch die Einführung eines fremden Nucleinsäuremoleküls, dessen Vorhandensein oder Expression zu einer Verringerung der Aktivität eines endogen in der Pflanze vorkommenden R1- Proteins führt;
b) aus der gemäß Schritt (a) hergestellten Zelle eine Pflanze regeneriert wird; und
c) ausgehend von der gemäß Schritt (b) erzeugten Pflanze gegebenenfalls weitere Pflanzen erzeugt werden.

Der Begriff "transgen" bedeutet in diesem Zusammenhang, daß die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Pflanzen aufgrund einer genetischen Modifikation, insbesondere der Einführung eines fremden Nucleinsäuremoleküls, in ihrer genetischen Information von entsprechenden nicht genetisch modifizierten Pflanzenzellen abweichen und unterschieden werden können. Der Begriff bedeutet insbesondere, daß die Zellen dieser Pflanzen ein fremdes Nucleinsäuremolekül aufweisen, das natürlicherweise in entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyp- Pflanzen nicht vorkommt oder an einem Ort im Genom der Zellen vorliegt, an dem es natürlicherweise nicht vorliegt. Der Begriff "Wildtyp-Pflanze" bedeutet dabei, daß es sich um eine Pflanze derselben Spezies handelt, die jedoch keine entsprechende genetische Modifikation aufweist, insbesondere keine genetische Modifikation im Zusammenhang mit dem R1-Gen. "Fremdes" Nucleinsäuremolekül bedeutet dabei, daß das Nucleinsäuremolekül heterolog ist in Bezug auf die Spezies, zu der die Pflanzen gehören, in deren Zellen das Nucleinsäuremolekül eingeführt wird, oder daß, wenn das Nucleinsäuremolekül homolog zu dieser Pflanzenspezies ist, es in einem genetischen Zusammenhang vorliegt, in dem es natürlicherweise in den Pflanzenzellen nicht vorkommt. D. h. es liegt an einem anderen Ort im Genom der Pflanzenzelle vor und/oder es ist mit Sequenzen verknüpft, mit denen es natürlicherweise in den Pflanzenzellen nicht verknüpft ist. Ob eine Pflanze bzw. Pflanzenzelle transgen ist, kann mittels dem Fachmann geläufigen Methoden festgestellt werden, z. B. durch Southern Blot Analyse.
Unter dem Begriff "Futterpflanzen" werden im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung Pflanzen verstanden, welche mit dem Ziel der Verwertung als Tierfutter angebaut werden.
Bei den "Futterpflanzen" kann es sich um monocotyledone als auch um dicotyledone Futterpflanzen handeln. Insbesondere werden unter "Futterpflanzen" sogenannte Futterleguminosen verstanden. Dies sind Pflanzen, die der Überordnung der Fabanae, insbesondere den Fabales (= Leguminosae) angehören. Bevorzugt sind hier Pflanzen der Familie der Fabaceae. Besonders bevorzugt sind Kleearten, z. B. Pflanzen der Gattung Trifolium, wie z. B. T. repens, T. pratense, T. hybridum oder T. incarnatum. Weiterhin besonders bevorzugt sind Luzerne (Medicago sativa), Lotusformen, z. B. Lotus corniculatus; Esparsette (Onobrychis viciifolia), Serradella (Ornithopus sativus), Lupine, z. B. Lupinus angustifolius oder Lupinus luteus, und Wickenarten, wie z. B. Vicia-Arten (beispielsweise Vicia faba) oder Coronilla-Arten.
Unter Futterpflanzen werden weiterhin Futtergräser verstanden. Dies sind Pflanzen der Ordnung Poales, insbesondere solche der Familie der Poaceae. Bevorzugt sind hierbei Pflanzen der Gattung Lolium (z. B. Lolium perenne), Poa (z. B. P. pratensis, P. palustris, P. longifolia), Phleum (z. B. P. nodusum, P. pratense), Dactylis (z. B. D. glomerata), Agrostis (z. B. A. tennuis, A. stolonifera), Festuca (z. B. F. pratensis, F. rubra), Bromus (z. B. Bromus molli) und Hafergräser (Avena spec.).
Der Begriff "erhöhter Blattstärkegehalt" bedeutet, daß die Menge an in den Blättern gebildeter Stärke deutlich über der in Blättern entsprechender Wildtyp-Pflanzen liegt. Der Blattstärkegehalt der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Futterpflanzen ist um mindestens 10-50%, vorzugsweise um mindestens 50-100%, insbesondere um 100-500% und ganz besonders bevorzugt um mindestens 500-1000% erhöht im Vergleich zu dem Blattstärkegehalt in entsprechenden Wildtyp-Pflanzen. Der Stärkegehalt im Blatt wird dabei vorzugsweise gemessen in nmol/g Trockengewicht. Verfahren zur Bestimmung des Blattstärkegehaltes sind dem Fachmann bekannt und sind z. B. beschrieben in den nachfolgenden Beispielen.
Der Begriff "genetisch modifiziert" bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, daß die Pflanzenzelle durch Einführung eines fremden Nucleinsäuremoleküls in ihrer genetischen Information im Vergleich zu entsprechenden Zellen einer Wildtyp- Pflanze verändert ist und daß das Vorhandensein und/oder die Expression des fremden Nucleinsäuremoleküls zu einer phänotypischen Veränderung in der aus dieser Pflanzenzelle regenerierten Pflanze führt. Phänotypische Veränderung bedeutet dabei vorzugsweise eine meßbare Veränderung einer oder mehreren Funktionen der Zellen und/oder der Pflanze. Beispielsweise zeigen genetisch modifizierte erfindungsgemäße Pflanzenzellen eine Verringerung der Aktivität eines endogen in der Pflanzenzelle vorkommenden R1-Proteins im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch- modifizierten Pflanzenzellen von Wildtyp-Pflanzen.
Der Begriff "Verringerung der Aktivität" bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Verringerung der Expression endogener Gene, die R1-Proteine codieren, und/oder eine Verringerung der Menge an R1-Protein in den Zellen und/oder eine Verringerung der biologischen Aktivität der R1-Proteine in den Zellen.
Eine "Verringerung der Expression" bedeutet dabei, daß die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Pflanzen bzw. die Zellen dieser Pflanzen weniger Transkripte aufweisen, die ein R1-Protein codieren, als entsprechende Wildtyp- Pflanzenzellen. Eine "Verringerung der Expression" kann beispielsweise bestimmt werden durch Messung der Menge an R1-Proteinen codierenden Transkripten, z. B. durch Northern-Blot-Analyse oder RT-PCR. Eine Verringerung bedeutet dabei vorzugsweise eine Verringerung der Menge an Transkripten im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Zellen um mindestens 50%, insbesondere um mindestens 70%, bevorzugt um mindestens 85% und besonders bevorzugt um mindestens 95%. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt die Verringerung 100%, d. h. die Expression von R1-Genen in den Pflanzen(zellen) ist total reprimiert und es wird überhaupt kein R1-Protein in den Zellen synthetisiert.
Eine "Verringerung der Menge" an R1-Protein bedeutet, daß der Gehalt an R1-Protein in den Pflanzen bzw. in den Zellen der Pflanzen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, geringer ist als in entsprechenden Wildtyp-Pflanzen bzw. Wildtyp-Pflanzenzellen. Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an R1-Protein sind dem Fachmann bekannt.
So kann die Verringerung der Menge an R1-Proteinen beispielsweise bestimmt werden durch Western-Blot-Analyse. Eine Verringerung bedeutet dabei vorzugsweise eine Verringerung der Menge an R1-Proteinen im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyp-Pflanzen bzw. Zellen um mindestens 50%, insbesondere um mindestens 70%, bevorzugt um mindestens 85%, besonders bevorzugt um mindestens 95% und ganz besonders bevorzugt um 100%.
Unter dem Begriff "R1-Gen" wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine Nucleinsäuresequenz (z. B. RNA oder DNA, beispielsweise cDNA oder genomische DNA) verstanden, die ein "R1-Protein" codiert. Unter dem Begriff "R1-Protein" versteht man im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung Proteine, die beispielsweise in Lorberth et al. (Nature Biotech. 16 (1998), 473-477) sowie in den internationalen Patentanmeldungen WO 98/27212, WO 00/77229 und WO 00/28052 beschrieben worden sind und die bestimmten Merkmale aufweisen. Wichtige Merkmale von R1-Proteinen sind

a) ihre Lokalisation in den Plastiden (wie Chloroplasten, Amyloplasten) pflanzlicher Zellen;
b) ihre Eigenschaften, in den Plastiden zum Teil in freier Form und zum Teil in Stärkekorn-gebundener Form vorzuliegen;
c) ihre Fähigkeit, den Grad der Phosphorylierung der Stärke in Pflanzen zu beeinflussen, und zwar insofern, als daß eine Erhöhung der Aktivität des R1- Proteins in Pflanzen zu einer Erhöhung des Phosphatgehaltes der in den Pflanzen synthetisierten Stärke führt und als daß eine Verringerung der Aktivität des R1- Proteins in Pflanzen zu einer Verringerung des Phosphatgehalts der in den Pflanzen synthetisierten Stärke führt. Der Phosphatgehalt bezieht sich dabei auf den C-6-Phosphatgehalt. Er wird vorzugsweise angegeben als nmol/mg trockene Blattstärke. Er kann bestimmt werden wie beschrieben in dem nachfolgenden Beispielteil; und
d) ihre Fähigkeit, wenn sie in E. coli-Zellen zur Expression gebracht werden, zu einer Phosphorylierung des bakteriellen Glycogens zu führen. Diese Fähigkeit kann beispielsweise wie in der WO 98/27212 beschrieben getestet werden.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem R1-Protein vorzugsweise ein Protein verstanden, das die oben angegebenen Eigenschaften hat und codiert wird von einem Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz, die mit der codierenden Region der in SEQ ID NO: 7 bzw. deren komplementären Strang hybridisiert. Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet in diesem Zusammenhang eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben sind. Derartige hybridisierende Nucleinsäuremoleküle können z. B. aus genomischen oder aus cDNA-Bibliotheken von Pflanzen isoliert werden.
Die Identifizierung und Isolierung derartiger Nucleinsäuremoleküle kann dabei unter Verwendung der unter SEQ ID NO: 7 angegebenen Nucleinsäuremoleküle oder Teile dieser Moleküle bzw. der reversen Komplemente dieser Moleküle erfolgen, z. B. mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe z. B. Sambrook und Russel, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3, Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001), Cold Spring Harbor, NY).
Als Hybridisierungsprobe können z. B. Nucleinsäuremoleküle verwendet werden, die exakt die oder im wesentlichen die unter SEQ ID NO: 7 angegebene Sequenz oder Teile dieser Sequenz aufweisen. Bei den als Hybridisierungsprobe verwendeten DNA- Fragmenten kann es sich auch um synthetische DNA-Fragmente handeln, die mit Hilfe der gängigen DNA-Synthesetechniken hergestellt wurden und deren Sequenz im wesentlichen mit der in SEQ ID NO: 7 angegebenen Nucleinsäuresequenz übereinstimmt.
"Hybridisierung" bedeutet vorzugsweise, daß zwischen den in Frage kommenden Molekülen eine Homologie, d. h. eine Sequenzidentität, von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 90% und ganz besonders bevorzugt von mindestens 95% vorliegt.
Der Homologiegrad wird dabei dadurch bestimmt, daß die entsprechende Nucleotidsequenz mit der in SEQ ID NO: 7 dargestellten codierenden Region verglichen wird. Wenn die zu vergleichenden Sequenzen nicht dieselbe Länge haben, so bezieht sich der Grad der Homologie vorzugsweise auf den Prozentanteil der Nucleotide in der kürzeren Sequenz, die identisch sind mit Nucleotiden in der längeren Sequenz. Die Homologie kann nach herkömmlichen Methoden bestimmt werden, insbesondere unter Verwendung von Computerprogrammen, wie z. B. das DNASTAR-Programm mit der Clustal W-Analyse. Dieses Programm ist erhältlich bei DNASTAR, Inc. 1228 South Park Street, Madison, WI 53715 oder bei DNASTAR, Ltd., Abacus House, West Ealing, London W13 OAS UK (support@dnastar.com), und ist zugänglich über den EMBL- Server.
Wird die Clustal-Analysemethode zur Bestimmung der Homologie verwendet, insbesondere zur Bestimmung, ob eine Sequenz, z. B. zu 80%, identisch ist zu einer Referenzsequenz, so sind die Einstellungen vorzugsweise die folgenden: Matrix: blosum 30; Open gap penalty: 10,0; Extend gap penalty: 5,0; Delay divergent: 40; Gap separation distance 8.
Die Herstellung der Pflanzenzellen mit verringerter R1-Aktivität gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann durch verschiedene, dem Fachmann bekannte Verfahren erzielt werden, z. B. durch solche, die zu einer Inhibierung der Expression endogener Gene führen, die ein R1-Protein codieren. Hierzu zählen beispielsweise die Expression einer entsprechenden antisense-RNA, die Bereitstellung von Molekülen oder Vektoren, die einen Cosuppresssionseffekt vermitteln, die Expression eines entsprechend konstruierten Ribozyms, das spezifisch Transkripte spaltet, die ein R1- Protein codieren, oder die sogenannte "in-vivo-Mutagenese".
Ferner kann die Verringerung der R1-Aktivität in den Pflanzenzellen auch durch die simultane Expression von sense und antisense RNA-Molekülen des jeweiligen zu reprimierenden Zielgens, vorzugsweise des R1-Gens, hervorgerufen werden. Darüber hinaus ist bekannt, daß in planta die Bildung von doppelsträngigen RNA-Molekülen von Promotorsequenzen in trans zu einer Methylierung und einer transkriptionellen Inaktivierung homologer Kopien dieses Promotors führen kann (Mette et al., EMBO J. 19 (2000), 5194-5201).
Ferner ist zur Erzielung eines antisense- oder eines Cosuppressions-Effektes auch die Verwendung von Introns, d. h. von nicht-codierenden Bereichen von Genen, die R1- Proteine codieren, denkbar. Die Verwendung von Intron-Sequenzen zur Inhibierung der Genexpression von Genen, die Proteine der Stärkebiosynthese codieren, wurde beispielsweise beschrieben in den internationalen Patentanmeldungen WO 97/04112, WO 97/04113, WO 98/37213 und WO 98/37214.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das besagte fremde Nucleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

a) DNA-Molekülen, die mindestens eine antisense-RNA codieren, welche eine Verringerung der Expression von endogenen Genen bewirkt, die R1-Proteine codieren;
b) DNA-Molekülen, die über einen Cosuppressionseffekt zur Verringerung der Expression von endogenen Genen führen, die R1-Proteine codieren;
c) DNA-Molekülen, die mindestens ein Ribozym codieren, das spezifisch Transkripte von endogenen Genen spaltet, die R1-Proteine codieren;
d) Nucleinsäuremoleküle, die im Fall von in vivo-Mutagenese zu einer Mutation oder einer Insertion einer heterologen Sequenz in endogenen, R1-Proteine codierenden Genen führen, wobei die Mutation oder Insertion zu einer Verringerung der Expression von R1-Proteine codierenden Genen führt, oder zu einer Verringerung der Synthese von R1-Proteinen; und
e) DNA-Molekülen, die simultan mindestens eine antisense-RNA und mindestens eine sense-RNA codieren, wobei besagte antisense-RNA und besagte sense- RNA ein doppelsträngiges RNA-Molekül ausbilden, das eine Verringerung der Expression von endogenen Genen bewirkt, die R1-Proteine codieren.

Dem Fachmann ist bekannt, wie er einen antisense- oder einen Cosuppressions-Effekt erzielen kann. Das Verfahren der antisense-Inhibierung ist beispielsweise beschrieben in Krol et al. (Nature 333 (1988), 866-869), Krol et al. (Gene 72 (1988), 45-50), Mol et al. (FEBS Letters 268 (1990), 369-379), Smith et al. (Plant Mol. Biol. 14 (1990), 369-379) und Sheehy et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8805-8809). Das Verfahren der Cosuppressions-Inhibierung wurde beispielsweise beschrieben in Jorgensen (Trends Biotechnol. 8 (1990), 340-344), Niebel et al. (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 91-103), Flavell et al. (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 43-46), Palaqui und Vaucheret (Plant. Mol. Biol. 29 (1995), 149-159), Vaucheret et al. (Mol. Gen. Genet. 248 (1995), 311-317) und in de Borne et al. (Mol. Gen. Genet. 243 (1994), 613-621). Auch die Expression von Ribozymen zur Verringerung der Aktivität von bestimmten Enzymen in Zellen ist dem Fachmann bekannt und ist beispielsweise beschrieben in EP- B1 0321 201. Die Expression von Ribozymen in pflanzlichen Zellen wurden z. B. beschrieben in Feyter et al. (Mol. Gen. Genet. 250 (1996), 329-338).
Ferner kann die Verringerung der R1-Aktivität in den Pflanzenzellen wie oben erwähnt auch durch die sogenannte "in vivo-Mutagenese" erreicht werden, bei der durch Transformation von Zellen ein hybrides RNA-DNA-Oligonucleotid ("Chimeroplast") in Zellen eingeführt wird (Kipp et al., Poster Session beim "5^th international Congress of Plant Molecular Biology", 21-27. September 1997, Singapur; Dixon und Arntzen, Meeting report zu "Metabolic Engineering in Transgenic Plants", Keystone Symposia, Copper Mountain, CO, USA, TIBTECH 15 (1997), 441-447; internationale Patentanmeldung WO 95/15972; Kren et al., Hepatology 25 (1997), 1462-1468; Cole-Strauss et al., Science 273 (1996), 1386-1389).
Ein Teil der DNA-Komponente des RNA-DNA-Oligonucleotides ist homolog zu einer Nucleinsäuresequenz eines endogenen R1-Gens, weist jedoch im Vergleich zur Nucleinsäuresequenz eines endogenen R1-Gens eine Mutation auf oder enthält eine heterologe Region, die von den homologen Regionen umschlossen ist. Durch Basenpaarung der homologen Regionen des RNA-DNA-Oligonucleotids und des endogenen Nucleinsäuremoleküls, gefolgt von homologer Rekombination, kann die in der DNA-Komponente des RNA-DNA-Oligonucleotids enthaltene Mutation oder heterologe Region in das Genom einer Pflanzenzelle übertragen werden. Die Mutation wird so gewählt, daß sie bei Expression der entsprechenden Sequenz zu einer Verringerung der Aktivität eines R1-Proteins führt, d. h. vorzugsweise zu einer Verringerung der Expression des Gens, zu einer Verringerung der Synthese eines R1- Proteins oder zur Verringerung der biologischen Aktivität eines R1-Proteins, z. B. aufgrund der Expression von inaktiven Proteinen, insbesondere von dominant negativen Mutanten.
Ferner kann die Verringerung der R1-Aktivität in den Pflanzenzellen auch durch die simultane Expression von sense- und antisense-RNA-Molekülen des zu reprimierenden Zielgens, d. h. des R1-Gens, hervorgerufen werden. Dies kann beispielsweise durch die Verwendung von chimären Konstrukten erreicht werden, die "inverted repeats" des zu reprimierenden Zielgens oder Teilen des Zielgens enthalten. Hierbei codieren die chimären Konstrukte für sense- und antisense-RNA-Moleküle des Zielgens. Sense- und antisense-RNA werden in planta gleichzeitig als ein RNA-Molekül synthetisiert, wobei sense- und antisense-RNA durch einen Spacer voneinander getrennt sein können und ein doppelsträngiges RNA-Molekül bilden. Es konnte gezeigt werden, daß die Einführung von inverted-repeat-DNA-Konstrukten in das Genom von Pflanzen eine sehr effiziente Methode ist, um die zu den inverted-repeat-DNA-Konstrukten korrespondierenden Gene zu reprimieren (Waterhouse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998), 13959-13964; Wang und Waterhouse, Plant Mol. Biol. 43 (2000), 67-82; Singh et al., Biochemical Society Transactions 28, Teil 6 (2000), 925-927; Liu et al., Biochemical Society Transactions 28, Teil 6 (2000), 927-929); Smith et al., Nature 407 (2000), 319-320; internationale Patentanmeldung WO 99/53050). Sense- und antisense-Sequenzen des Zielgens bzw. der Zielgene können auch getrennt voneinander mittels gleicher oder unterschiedlicher Promotoren exprimiert werden (Nap et al., 6^th International Congress of Plant Molecular Biology, Quebec, 18.-24. Juni, 2000; Poster 57-27, Vortrag Session 57). Die Verringerung der R1-Aktivität in den Pflanzenzellen kann somit auch durch die Erzeugung doppelsträngiger RNA-Moleküle von R1-Genen erreicht werden. Vorzugsweise werden hierzu "inverted repeats" von DNA-Molekülen von R1-Genen oder -cDNAs in das Genom von Pflanzen eingeführt, wobei die zu transkribierenden DNA- Moleküle (R1-Gen oder -cDNA oder Fragmente davon) unter Kontrolle eines Promoters stehen, der die Expression besagter DNA-Moleküle steuert.
Darüber hinaus ist bekannt, daß die Bildung von doppelsträngigen RNA-Molekülen von Promotor-DNA-Molekülen in Pflanzen in trans zu einer Methylierung und einer transkriptionellen Inaktivierung homologer Kopien dieser Promotoren führen kann, die im folgenden als Zielpromotoren bezeichnet werden (Mette et al., EMBO J. 19 (2000), 5194-5201). Über die Inaktivierung des Zielpromotors ist es somit möglich, die Genexpression eines bestimmten Zielgens (z. B. des R1-Gens), das natürlicherweise unter der Kontrolle dieses Zielpromotors steht, zu verringern. D. h., die DNA-Moleküle, die die Zielpromotoren der zu reprimierenden Gene (Zielgene) umfassen, werden in diesem Fall, im Gegensatz zur ursprünglichen Funktion von Promotoren in Pflanzen, nicht als Steuerelemente zur Expression von Genen oder cDNAs, sondern selbst als transkribierbare DNA-Moleküle verwendet.
Zur Erzeugung der doppelsträngigen Zielpromotor-RNA-Moleküle in planta, die dort als RNA-Haarnadel-Moleküle (RNA hairpin) vorliegen können, werden vorzugsweise Konstrukte verwendet, die "inverted repeats" der Zielpromotor-DNA-Moleküle enthalten, wobei die Zielpromotor-DNA-Moleküle unter Kontrolle eines Promotors stehen, der die Genexpression besagter Zielpromotor-DNA-Moleküle steuert. Anschließend werden diese Konstrukte in das Genom von Pflanzen eingeführt. Die Expression der "inverted repeats" besagter Zielpromotor-DNA-Moleküle führt in planta zur Bildung doppelsträngiger Zielpromotor-RNA-Moleküle (Mette et al., EMBO J. 19 (2000), 5194-5201), durch die der Zielpromotor inaktiviert werden kann.
Die Promotorbereiche der R1-Gene aus den entsprechenden Pflanzenspezies können mittels Durchmusterung von entsprechenden genomischen DNA-Bibliotheken isoliert und charakterisiert werden. Bekannte cDNA oder genomische Fragmente der R1-Gene können dabei als homologe Sonden verwendet werden. Die Herstellung und Durchmusterung von genomischen DNA-Bibliotheken ist dem Fachmann bekannt und in Sambrook und Russell (Molecular Cloning, 3. Ausgabe (2001), Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY) beschrieben.
Ferner ist dem Fachmann bekannt, daß er die Verringerung der Aktivität eines oder mehrerer R1-Proteine durch die Expression von nicht-funktionellen Derivaten, insbesondere trans-dominanten Mutanten solcher Proteine, und/oder durch die Expression von Antagonisten/Inhibitoren solcher Proteine erreichen kann. Antagonisten/Inhibitoren solcher Proteine umfassen beispielsweise Antikörper, Antikörperfragmente oder Moleküle mit ähnlichen Bindungseigenschaften. Beispielsweise wurde ein cytoplasmatischer scFv-Antikörper eingesetzt, um die Aktivität des Phytochrom A-Proteins in gentechnisch veränderten Tabakpflanzen zu modulieren (Owen, Bio/Technology 10 (1992), 790-794; Review: Franken et al., Current Opinion in Biotechnology 8 (1997), 411-416; Whitelam, Trends Plant Sci. 1 (1996), 268-272).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das endogen in der Futterpflanze vorkommende, ein R1-Protein codierende Gen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

1. Nucleinsäuremolekülen, die die codierende Region der unter Seq ID NO: 1 angegebenen Nucleotidsequenz oder die codierende Region der in dem Plasmid DSM 14707 enthaltenen Insertion umfassen;
2. Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die unter Seq ID NO: 2 angegebene oder die von der Insertion des Plasmids DSM 14707 codierte Aminosäuresequenz umfaßt;
3. Nucleinsäuremolekülen, deren Sequenz zu den unter (a1) oder (b1) genannten Nucleinsäuremolekülen zu mindestens 90% homolog ist;
4. Nucleinsäuremolekülen, deren Sequenz aufgrund des genetischen Codes degeneriert ist im Vergleich zu den Sequenzen der unter (a1), (b1) oder (c1) genannten Nucleinsäuremoleküle; und
5. Teilen oder Fragmenten der unter a1) bis d1) genannten Nucleinsäuremoleküle, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fragmenten mit mindestens 25, 50, 100 bp Länge, bevorzugt mit einer Länge von mindestens 250 bp, besonders bevorzugt mit einer Länge von mindestens 500 bp.

In einer solchen Ausführungsform ist die in dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugte Pflanze vorzugsweise eine Pflanze der Gattung Trifolium, besonders bevorzugt der Spezies Trifolium repens. Ferner wird in einer solchen Ausführungsform vorzugsweise als fremdes Nucleinsäuremolekül ein Nucleinsäuremolekül eingesetzt, das ein wie vorangehend unter (a1) bis (d1) definiertes Nucleinsäuremolekül ist, ein Teil eines solchen Nucleinsäuremoleküls, das lang genug ist, um den gewünschten Effekt zu erzielen, oder ein Nucleinsäuremolekül, das zu einem solchen Nucleinsäuremolekül oder Teil davon komplementär ist.
Die unter SEQ ID NO: 1 angegebene Sequenz stammt aus Trifolium repens und stellt eine partielle cDNA Sequenz dar, die ein R1-Protein codiert. Der angegebene codierende Bereich weist eine Homologie von 75% zu dem in SEQ ID NO: 7 angegebenen codierenden Bereich auf, der das R1-Protein aus Kartoffel codiert.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das endogen in der Futterpflanze vorkommende, ein R1-Protein codierende Gen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

1. Nucleinsäuremolekülen, die die codierende Region der unter Seq ID NO: 3 angegebenen Nucleotidsequenz oder die codierende Region der in dem Plasmid DSM 14633 enthaltenen Insertion umfassen;
2. Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein mit der unter Seq ID NO: 4 angegebene oder die von der Insertion des Plasmids DSM 14633 codierte Aminosäuresequenz umfaßt;
3. Nucleinsäuremolekülen, deren Sequenz zu den unter (a2) oder (b2) genannten Nucleinsäuremolekülen zu mindestens 90% homolog ist;
4. Nucleinsäuremolekülen, deren Sequenz aufgrund des genetischen Codes degeneriert ist im Vergleich zu den Sequenzen der unter (a2), (b2) oder (c2) genannten Nucleinsäuremoleküle; und
5. Teilen oder Fragmenten der unter a2) bis d2) genannten Nucleinsäuremoleküle, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fragmenten mit mindestens 25, 50, 100 bp Länge, bevorzugt mit einer Länge von mindestens 250 bp, besonders bevorzugt mit einer Länge von mindestens 500 bp.

In einer solchen Ausführungsform ist die in dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugte Pflanze vorzugsweise eine Pflanze der Gattung Medicago, besonders bevorzugt eine Pflanze der Spezies Medicago sativa. Ferner wird in einer solchen Ausführungsform vorzugsweise als fremdes Nucleinsäuremolekül ein Nucleinsäuremolekül eingesetzt, das ein wie vorangehend unter (a2) bis (d2) definiertes Nucleinsäuremolekül ist, ein Teil eines solchen Nucleinsäuremoleküls, das lang genug ist, um den gewünschten Effekt zu erzielen, oder ein Nucleinsäuremolekül, das zu einem solchen Nucleinsäuremolekül oder Teil davon komplementär ist.
Die unter SEQ ID NO: 3 angegebene Sequenz stammt aus Medicago sativa und stellt eine partielle cDNA Sequenz dar, die ein R1-Protein codiert. Der angegebene codierende Bereich weist eine Homologie von 76% zu dem in SEQ ID NO: 7 angegebenen codierenden Bereich auf, der das R1-Protein aus Kartoffel codiert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das endogen in der Futterpflanze vorkommende, ein R1-Protein codierende Gen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

1. Nucleinsäuremolekülen, die die codierende Region der unter Seq ID NO: 5 angegebenen Nucleotidsequenz oder die codierende Region der in dem Plasmid DSM 14635 enthaltenen Insertion umfassen;
2. Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die unter Seq ID NO: 6 angegebene oder die von der Insertion des Plasmids DSM 14635 codierte Aminosäuresequenz umfaßt;
3. Nucleinsäuremolekülen, deren Sequenz zu den unter (a3) oder (b3) genannten Nucleinsäuremolekülen zu mindestens 90% homolog ist;
4. Nucleinsäuremolekülen, deren Sequenz aufgrund des genetischen Codes degeneriert ist im Vergleich zu den Sequenzen der unter (a3), (b3) oder (c3) genannten Nucleinsäuremoleküle; und
5. Teilen oder Fragmenten der unter a3) bis d3) genannten Nucleinsäuren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fragmenten mit mindestens 25, 50, 100 bp Länge, bevorzugt mit einer Länge von mindestens 250 bp, besonders bevorzugt mit einer Länge von mindestens 500 bp.

In einer solchen Ausführungsform ist die in dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugte Futterpflanze vorzugsweise eine Futterpflanze der Gattung Lolium, besonders bevorzugt der Spezies Lolium perenne. Ferner wird in einer solchen Ausführungsform vorzugsweise als fremdes Nucleinsäuremolekül ein Nucleinsäuremolekül eingesetzt, das ein wie vorangehend unter (a3) bis (d3) definiertes Nucleinsäuremolekül ist, ein Teil eines solchen Nucleinsäuremoleküls, das lang genug ist, um den gewünschten Effekt zu erzielen, oder ein Nucleinsäuremolekül, das zu einem solchen Nucleinsäuremolekül oder Teil davon komplementär ist.
Die unter SEQ ID NO: 5 angegebene Sequenz stammt aus Lolium perenne und stellt eine partielle cDNA Sequenz dar, die ein R1-Protein codiert. Der angegebene codierende Bereich weist eine Homologie von 75% zu dem in SEQ ID NO: 7 dargestellten codierenden Bereich auf, der das R1-Protein aus Kartoffel codiert.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten transgenen Futterpflanzen, die im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen einen erhöhten Blattstärkegehalt aufweisen. Der Blattstärkegehalt der erfindungsgemäßen Futterpflanzen ist um mindestens 10-50%, vorzugsweise um mindestens 50-100%, insbesondere um mindestens 100-500% und ganz besonders bevorzugt um mindestens 500-1000% erhöht im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp- Pflanzen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Futterpflanzen ferner dadurch gekennzeichnet, daß die in ihnen synthetisierte Blattstärke im Vergleich zu Blattstärke aus entsprechenden Wildtyp-Pflanzen einen verringerten Phosphatgehalt aufweist. Der Ausdruck "verringerter Phosphatgehalt" bedeutet dabei, daß der Phosphatgehalt im Vergleich zu dem der Blattstärke aus entsprechenden Wildtyp- Pflanzen um mindestens 25%, besonders bevorzugt um mindestens 50% und ganz besonders bevorzugt um mindestens 100% verringert ist. Der Phosphatgehalt der Blattstärke kann dabei nach dem Fachmann bekannten Methoden bestimmt werden. Vorzugsweise wird er wie in dem nachfolgenden Beispielteil beschrieben bestimmt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Zellen einer erfindungsgemäßen Futterpflanze, wobei die Zellen transgen sind und genetisch modifiziert sind durch Einführung eines fremden Nucleinsäuremoleküls, dessen Vorhandensein oder Expression zu einer Verringerung der Aktivität eines endogen in der Futterpflanze vorkommenden R1- Proteins führt.
Im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen transgenen Futterpflanzen und Pflanzenzellen gilt hinsichtlich der bevorzugten Ausführungsformen dasselbe, was bereits im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren oben ausgeführt wurde.
Für die Einführung des fremden Nucleinsäuremoleküls gemäß Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung der DNA mittels des biolistischen Ansatzes sowie weitere Möglichkeiten.
Die Verwendung der Agrobakterien-vermittelten Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend beschrieben worden, z. B. in EP 120 516; Hoekema, in: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam (1985), Kapitel V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci. 4, 1-46 und in An et al., EMBO J. 4 (1985), 277-287. Für die Transformation von Kartoffel, siehe z. B. Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 29-33).
Auch die Transformation monokotyler Pflanzen mittels Agrobakterium basierender Vektoren wurde beschrieben (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hier et al., Plant J. 6 (1994) 271-282; Deng et al., Science in China 33 (1990), 28-34; Wilmink et al., Plant Cell Reports 11 (1992), 76-80; May et al., Bio/Technology 13 (1995), 486-492; Conner und Domisse, Int. J. Plant Sci. 153 (1992), 550-555; Ritchie et al., Transgenic Res. 2 (1993), 252-265). Ein alternatives System zur Transformation von monokotylen Pflanzen ist die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes (Wan und Lemaux, Plant Physiol. 104 (1994), 37-48; Vasil et al., Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558; Ritala et al., Plant Mol. Biol. 24 (1994), 317-325; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79 (1990), 625-631), die Protoplastentransformation, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen oder die Einbringung von DNA mittels Glasfasern. Insbesondere die Transformation von Mais wird in der Literatur mehrfach beschrieben (vgl. z. B. WO 95/06128, EP 0 513 849, EP 0 465 875, EP 0 292 435; Fromm et al., Biotechnology 8 (1990), 833-844; Gordon-Kamm et al., Plant Cel) 2 (1990), 603-618; Koziel et al., Biotechnology 11 (1993), 194-200; Moroc et al., Theor. Appl. Genet. 80 (1990), 721-726). Auch die erfolgreiche Transformation anderer Getreidearten wurde bereits beschrieben, z. B. für Gerste (Wan und Lemaux, s. o.; Ritala et al., s. o.; Krens et al., Nature 296 (1982), 72-74) und für Weizen (Nehra et al., Plant J. 5 (1994), 285-297; Altpeter et al., Mol. Breeding 6 (2000), 519-528).
Die Regeneration der genetisch modifizierten Zelle in eine Pflanze gemäß Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann nach dem Fachmann geläufigen und im Stand der Technik bekannten Methoden erfolgen.
Wenn für die Erziehlung des gewünschten Effekts, d. h. die Verringerung der Aktivität des R1-Proteins, die Expression des fremden Nucleinsäuremoleküls in den Pflanzenzellen notwendig ist, so kommt dafür jeder in pflanzlichen Zellen aktive Promotor in Frage. Der Promotor kann dabei so gewählt sein, daß die Expression in den Pflanzen konstitutiv erfolgt oder nur in einem bestimmten Gewebe, zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung oder zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt. In Bezug auf die Pflanze kann der Promotor homolog oder heterolog sein. Sinnvolle Promotoren sind z. B. der Promotor der 35S RNA des Blumenkohl Mosaik Virus, der Ubiquitin-Promotor aus Mais und der Actin-Promotor für eine konstitutive Expression oder ein Promotor, der eine Expression lediglich in photosynthetisch aktiven Geweben sicherstellt, z. B. der ST-LS1-Promotor (Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451), der Ca/b-Promotor (s. beispielsweise US 5656496; US 5639952; Bansal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 3654-3658) und der Rubisco SSU-Promotor (s. beispielsweise US 5034322 oder US 4962028) sowie induzierbare Promotoren.
Ferner kann in dem fremden Nucleinsäuremolekül eine Terminationssequenz vorhanden sein, die der korrekten Beendigung der Transkription dient sowie der Addition eines Poly- A-Schwanzes an das Transkript, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (vgl. z. B. Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) und sind beliebig austauschbar.
Die Erzeugung weiterer Pflanzen gemäß Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann nach jeder dafür geeigneten Methode erfolgen, z. B. durch vegetative Vermehrung (beispielsweise über Stecklinge, Knollen oder über Kalluskultur und Regeneration ganzer Pflanzen) oder durch sexuelle Vermehrung. Die sexuelle Vermehrung findet dabei vorzugsweise kontrolliert statt, d. h. es werden ausgewählte Pflanzen mit bestimmten Eigenschaften miteinander gekreuzt und vermehrt. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die durch derartige Vermehrung erhältlichen Pflanzen.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Vermehrungsmaterial der erfindungsgemäßen Futterpflanzen enthaltend die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen. Der Begriff "Vermehrungsmaterial" umfaßt im Sinne der vorliegenden Erfindung jene Bestandteile der Pflanze, die zur Erzeugung von Nachkommen auf vegetativem oder generativem Weg geeignet sind. Für die vegetative Vermehrung eignen sich beispielsweise Stecklinge, Kalluskulturen oder Rhizome. Anderes Vermehrungsmaterial umfaßt beispielsweise Früchte, Samen, Sämlinge, Protoplasten, Zellkulturen etc. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Vermehrungsmaterial um Samen.
Des weiteren umfaßt die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von Nucleinsäuremoleküle, die ein R1-Protein codieren, oder von Teilen davon zur Verringerung der Aktivität eines R1-Proteins in Futterpflanzen, sowie die Verwendung solcher Nucleinsäuremoleküle zur Herstellung von transgenen Futterpflanzen, die im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen einen erhöhten Gehalt an Blattstärke aufweisen.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremoleküle codierend ein R1-Protein aus Pflanzen der Gattung Trifolium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

a) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die in SEQ ID NO: 2 dargestellte Aminosäuresequenz umfaßt;
b) Nucleinsäuremolekülen, die die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Nucleotidsequenz der codierenden Region umfassen;
c) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die Aminosäuresequenz umfaßt, die von der Insertion des Plasmids DSM 14707 codiert wird;
d) Nucleinsäuremoleküle, die die ein R1-Protein aus Trifolium repens codierende Region der Insertion des Plasmids DSM 14707 umfassen;
e) Nucleinsäuremoleküle, deren Sequenz zu der Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls nach (a), (b), (c) und/oder (d) zu mindestens 85%, vorzugsweise zu mindestens 90%, bevorzugt zu mindestens 95%, besonders bevorzugt zu mindestens 97% und ganz besonders bevorzugt zu mindestens 99% identisch ist und die ein R1-Protein aus einer Pflanze der Gattung Trifolium codieren; und
f) Nucleinsäuremolekülen, deren Nucleotidsequenz von der Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls nach (e) aufgrund der Degeneration des genetischen Codes abweicht.

Die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Nucleinsäuresequenz ist eine partielle cDNA-Sequenz, die einen Teil der codierenden Region für ein R1-Protein aus Trifolium repens umfaßt. Ein Plasmid enthaltend diese cDNA-Sequenz wurde hinterlegt als DSM 14707. Mit Hilfe dieser Sequenz bzw. dieses Moleküls ist es dem Fachmann nun möglich, homologe Sequenzen aus anderen Trifolium-Sorten zu isolieren. Dies kann beispielsweise mit Hilfe konventioneller Methoden, wie dem Durchmustern von cDNA- oder genomischen Banken mit geeigneten Hybridisierungsproben, erfolgen. Auf diese Weise ist es beispielsweise möglich, Nucleinsäuremoleküle zu identifizieren und isolieren, die mit der unter SEQ ID NO: 1 angegebenen Sequenz hybridisieren und zu mindestens 85% identisch sind und die ein R1-Protein aus Trifolium codieren.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können prinzipiell ein R1-Protein aus jeder beliebigen Pflanze der Gattung Trifolium codieren, vorzugsweise codieren sie ein R1-Protein aus Trifolium repens.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremoleküle codierend ein R1-Protein aus Pflanzen der Gattung Medicago ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

a) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die in SEQ ID NO: 4 dargestellte Aminosäuresequenz umfaßt;
b) Nucleinsäuremolekülen, die die in SEQ ID NO: 3 dargestellte Nucleotidsequenz der codierenden Region umfassen;
c) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die Aminosäuresequenz umfaßt, die von der Insertion des Plasmids DSM 14633 codiert wird;
d) Nucleinsäuremoleküle, die die ein R1-Protein aus Medicago sativa codierende Region der Insertion des Plasmids DSM 14633 umfassen;
e) Nucleinsäuremoleküle, deren Sequenz zu der Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls nach (a), (b), (c) und/oder (d) zu mindestens 80%, vorzugsweise zu mindestens 85%, bevorzugt zu mindestens 90%, besonders bevorzugt zu mindestens 95% und ganz besonders bevorzugt zu mindestens 99% identisch ist und die ein R1-Protein aus einer Pflanze der Gattung Medicago codieren; und
f) Nucleinsäuremolekülen, deren Nucleotidsequenz von der Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls nach (e) aufgrund der Degeneration des genetischen Codes abweicht.

Die in SEQ ID NO: 3 dargestellte Nucleinsäuresequenz ist eine partielle cDNA-Sequenz, die einen Teil der codierenden Region für ein R1-Protein aus Medicago sativa umfaßt. Ein Plasmid enthaltend diese cDNA-Sequenz wurde hinterlegt als DSM 14633. Mit Hilfe dieser Sequenz bzw. dieses Moleküls ist es dem Fachmann nun möglich, homologe Sequenzen aus anderen Medicago-Arten oder -Sorten zu isolieren. Dies kann beispielsweise mit Hilfe konventioneller Methoden, wie dem Durchmustern von cDNA- oder genomischen Banken mit geeigneten Hybridisierungsproben, erfolgen. Auf diese Weise ist es beispielsweise möglich, Nucleinsäuremoleküle zu identifizieren und zu isolieren, die mit der unter SEQ ID NO: 3 angegebenen Sequenz hybridisieren und zumindestens 80% identisch sind und die ein R1-Protein aus Medicago codieren.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können prinzipiell ein R1-Protein aus jeder beliebigen Pflanze der Gattung Medicago codieren, vorzugsweise codieren sie ein R1-Protein aus Medicago sativa.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremoleküle codierend ein R1-Protein aus Pflanzen der Gattung Lolium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

a) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die in SEQ ID NO: 6 dargestellte Aminosäuresequenz umfaßt;
b) Nucleinsäuremolekülen, die die in SEQ ID NO: 5 dargestellte Nucleotidsequenz der codierenden Region umfassen;
c) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die Aminosäuresequenz umfaßt, die von der Insertion des Plasmids DSM 14635 codiert wird;
d) Nucleinsäuremoleküle, die die ein R1-Protein aus Lolium perenne codierende Region der Insertion des Plasmids DSM 14635 umfassen;
e) Nucleinsäuremoleküle, deren Sequenz zu der Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls nach (a), (b), (c) und/oder (d) zu mindestens 90%, vorzugsweise zu mindestens 95%, bevorzugt zu mindestens 97% und besonders bevorzugt zu mindestens 99% identisch ist und die ein R1-Protein aus einer Pflanze der Gattung Lolium codieren; und
f) Nucleinsäuremolekülen, deren Nucleotidsequenz von der Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls nach (e) aufgrund der Degeneration des genetischen Codes abweicht.

Die in SEQ ID NO: 5 dargestellte Nucleinsäuresequenz ist eine partielle cDNA-Sequenz, die einen Teil der codierenden Region für ein R1-Protein aus Lolium perenne umfaßt. Ein Plasmid enthaltend diese DNA-Sequenz wurde hinterlegt als DSM 14635. Mit Hilfe dieser Sequenz bzw. dieses Moleküls ist es dem Fachmann nun möglich, homologe Sequenzen aus anderen Lolium-Arten oder -Sorten zu isolieren. Dies kann beispielsweise mit Hilfe konventioneller Methoden, wie dem Durchmustern von cDNA oder genomischen Banken mit geeigneten Hybridisierungsproben erfolgen. Auf diese Weise ist es beispielsweise möglich, Nucleinsäuremoleküle zu identifizieren und isolieren, die mit der unter SEQ ID NO: 5 angegebenen Sequenz hybridisieren und zu mindestens 90% identisch sind und die ein R1-Protein aus Lolium codieren.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können prinzipiell ein R1-Protein aus jeder beliebigen Pflanze der Gattung Lolium codieren, vorzugsweise codieren sie ein R1- Protein aus Lolium perenne.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können beliebige Nucleinsäuremoleküle sein, insbesondere DNA- oder RNA-Moleküle, beispielsweise cDNA, genomische DNA, mRNA etc. Sie können natürlich vorkommende Moleküle sein, oder durch gentechnische oder chemische Syntheseverfahren hergestellte Moleküle. Sie können einzelsträngige Moleküle sein, die entweder den codierenden oder den nicht-codierenden Strang enthalten, oder doppelsträngige Moleküle.
Weiterhin betrifft die Erfindung Vektoren, insbesondere Plasmide, Cosmide, Viren, Bacteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren, die die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in den Vektoren enthaltenen Nucleinsäuremoleküle in sense Orientierung verknüpft mit regulatorischen Elementen, die die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen gewährleisten. Der Begriff "Expression" kann dabei Transkription als auch Transkription und Translation bedeuten.
Die Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in prokaryontischen Zellen, z. B. in Escherichia coli, ermöglicht beispielsweise eine genauere Charakterisierung der biologischen Aktivitäten der codierten Proteine. Darüber hinaus ist es möglich, mittels gängiger molekularbiologischer Techniken (siehe z. B. Sambrook und Russell, a. a. O.) verschiedenartige Mutationen in die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle einzuführen, wodurch es zur Synthese von Proteinen mit eventuell veränderten biologischen Eigenschaften kommt. Möglich ist die Erzeugung von Deletionsmutanten, bei denen durch fortschreitende Deletionen vom 5'- oder vom 3'- Ende der codierenden DNA-Sequenz Nucleinsäuremoleküle erzeugt werden, die zur Synthese entsprechend verkürzter Proteine führen. Möglich ist auch die Einführung von Punktmutationen. Die gentechnische Manipulation in prokaryontischen Zellen können nach dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen (vgl. Sambrook und Russell, a. a. O.). Regulatorische Sequenzen zur Expression in prokaryontischen Organismen, z. B. E. coli, und in eukaryontischen Organismen sind ausreichend in der Literatur beschrieben, insbesondere solche zur Expression in Hefe, wie z. B. Saccharomyces cerevisiae. Eine Übersicht verschiedener Systeme zur Expression für Proteine in verschiedenen Wirtsorganismen findet man z. B. in Methods in Enzymology 153 (1987), 383-516 und in Bitter et al. (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544).
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Wirtszellen, insbesondere prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen, die mit einem oben beschriebenen Nucleinsäuremolekül oder einem Vektor transformiert wurden, sowie Zellen, die von derartigen Wirtszellen abstammen und die beschriebenen Nucleinsäuremoleküle oder Vektoren enthalten. Die Wirtszellen können Bakterien- (z. B. E. coli) oder Pilzzellen (z. B. Hefe, insbesondere S. cerevisiae), sowie pflanzliche oder tierische Zellen sein. Der Begriff "transformiert" bedeutet dabei, daß die erfindungsgemäßen Zellen mit einem erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül genetisch modifiziert sind insofern, als sie zusätzlich zu ihrem natürlichen Genom mindestens ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül enthalten. Dieses kann in der Zelle frei, gegebenenfalls als selbstreplizierendes Molekül, vorliegen oder es kann stabil in das Genom der Wirtszelle integriert vorliegen. Vorzugsweise sind die Wirtszellen pflanzliche Zellen.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung eines R1-Proteins, bei dem erfindungsgemäße Wirtszellen unter Bedingungen kultiviert werden, die die Expression des Proteins erlauben, und das Protein aus der Kultur, d. h. aus den Zellen und/oder dem Kulturmedium gewonnen wird.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines R1-Proteins, aus Pflanzen der Gattung Trifolium, Medicago oder Lolium, wobei das Protein in einem in-vitro-Transkriptions- und Translationssystem unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls hergestellt wird. Solche Systeme sind dem Fachmann geläufig.
Die Erfindung betrifft auch Proteine, die durch die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codiert werden, oder die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhältlich sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Antikörper, die spezifisch ein erfindungsgemäßes Protein erkennen. Diese können z. B. monoclonale oder polyclonale Antikörper sein. Es können auch Fragmente von Antikörpern sein, die spezifisch erfindungsgemäße Proteine erkennen. Methoden zur Herstellung derartiger Antikörper bzw. Fragmente sind dem Fachmann geläufig.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere auch transgene Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder Vektoren enthalten. Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen Zellen dadurch gekennzeichnet, daß das eingeführte erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül stabil in das Genom integriert ist und unter der Kontrolle eines in pflanzlichen Zellen aktiven Promotors, vorzugsweise eines in Bezug auf das Nucleinsäuremolekül heterologen Promotors, steht.
Für die Expression eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls in pflanzlichen Zellen stehen eine Vielzahl von Promotoren zur Verfügung. Im Prinzip kann jeder in den für die Transformation gewählten Pflanzen funktionale Promotor verwendet werden. Der Promotor kann homolog oder heterolog in Bezug auf die verwendete Pflanzenspezies sein. Geeignet ist beispielsweise der 35S-Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (Odell et al., Nature 313 (1985), 810-812), der eine konstitutive Expression in allen Geweben einer Pflanze gewährleistet, und das in der WO 94/01571 beschriebene Promotorkonstrukt. Ein anderes Beispiel sind die Promotoren der Polyubiquitingene aus Mais. Es können jedoch auch Promotoren verwendet werden, die nur zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt aktiviert werden (siehe beispielsweise WO 93/07279). Von besonderem Interesse können hierbei Promotoren von heat-shock- Proteinen sein, die eine einfache Induktion erlauben. Ferner können die Promotoren verwendet werden, die in einem bestimmten Gewebe der Pflanze zu einer Expression nachgeschalteter Sequenzen führen (siehe z. B. Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2245-2251), beispielsweise der ST-LS1-Promotor, der lediglich in photosynthetisch aktivem Gewebe aktiv ist (Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947). Zu erwähnen sind ferner Promotoren, die in den stärkespeichernden Organen von zu transformierenden Pflanzen aktiv sind. Dies sind z. B. bei Mais die Maiskörner, während es bei der Kartoffel die Knollen sind. Zur Überexpression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in der Kartoffel kann beispielsweise der knollenspezifische B33-Promotor (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) verwendet werden. Samenspezifische Promotoren sind bereits für verschiedene Pflanzenspezies beschrieben worden. So z. B. der USP-Promotor aus Vicia faba, der eine samenspezifische Expression in V. faba und anderen Pflanzen gewährleistet (Fiedler et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Bäumlein et al., Mol Gen. Genet. 225 (1991), 459-467). In Mais gewährleisten beispielsweise Promotoren der Zein-Gene eine spezifische Expression im Endosperm der Maiskörner (Pedersen et al., Cell 29 (1982), 1015-1026; Quattrocchio et al., Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93).
Möglich ist somit die Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in pflanzlichen Zellen.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzenzellen, umfassend die Einführung eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls oder Vektors in Pflanzenzellen. Verschiedene Pflanzentransformationssysteme stehen dabei dem Fachmann zur Verfügung und wurden bereits oben erwähnt.
Bei der Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in Pflanzen besteht grundsätzlich die Möglichkeit, daß das synthetisierte Protein in jedem beliebigen Kompartiment der pflanzlichen Zelle lokalisiert sein kann. Um die Lokalisation in einem bestimmten Kompartiment zu erreichen, muß die codierende Region gegebenenfalls mit DNA-Sequenzen verknüpft werden, die die Lokalisierung in dem jeweiligen Kompartiment gewährleisten. Derartige Sequenzen sind bekannt (siehe beispielsweise Braun, EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald, Plant J. 1 (1991), 95-106; Rocha-Sosa, EMBO J. 8 (1989), 23-29). Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch transgene Pflanzenzellen, die mit einem oder mehreren erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül(en) transformiert wurden, sowie transgene Pflanzenzellen, die von derartig transformierten Zellen abstammen. Derartige Zellen enthalten ein oder mehrere erfindungsgemäße(s) Nucleinsäuremolekül(e), wobei diese(s) vorzugsweise mit regulatorischen DNA- Elementen verknüpft ist/sind, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten, insbesondere mit einem Promotor. Der Promotor ist dabei vorzugsweise heterolog in Bezug auf das Nucleinsäuremolekül. Derartige Zellen lassen sich von natürlicherweise vorkommenden Pflanzenzellen dadurch unterscheiden, daß sie zusätzlich zu möglicherweise endogen auftretenden Kopien mindestens ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül enthalten.
Die transgenen Pflanzenzellen können nach dem Fachmann bekannten Techniken zu ganzen Pflanzen regeneriert werden. Die durch Regeneration der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen erhältlichen Pflanzen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Ferner sind Gegenstand der Erfindung Pflanzen, die die oben beschriebenen transgenen Pflanzenzellen enthalten. Bei den transgenen Pflanzen kann es sich prinzipiell um Pflanzen jeder beliebigen Pflanzenspezies handeln, d. h. sowohl monkotyle als auch dikotyle Pflanzen, vorzugsweise Futterpflanzen, wie vorne definiert. Die Erfindung betrifft ebenfalls Vermehrungsmaterial und Ernteprodukte der erfindungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Früchte, Samen, oberirdische Teile, z. B. Blätter, Stengel etc.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder Teile davon können in einem vorangehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren zur Erzeugung von Futterpflanzen mit einem erhöhten Blattstärkegehalt eingesetzt werden, bevorzugt zur Erzeugung von Pflanzen der Gattung Trifolium, Medicago bzw. Lolium.
Darüberhinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle zur Identifizierung ähnlicher Moleküle, die ebenfalls ein R1-Protein codieren. Dies kann durch dem Fachmann geläufige Techniken erfolgen, beispielsweise durch Hybridisierung, Durchmustern von Genbanken, Amplifizierung mittels geeigneter Primer in einer Polymerasekettenreaktion etc.

Hinterlegungen

Folgende im Rahmen der vorliegenden Erfindung hergestellten und/oder verwendeten Plasmide wurden bei der als internationale Hinterlegungsstelle anerkannten Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, entsprechend den Anforderungen des Budapester Vertrages für die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke der Patentierung hinterlegt (Hinterlegungsnummer; Hinterlegungsdatum):
Plasmid IR 116-156 (DSM 14707) (17. Dezember 2001)
Plasmid IR 102-123 (DSM 14635) (16. November 2001)
Plasmid CF 19-49 (DSM 14633) (16. November 2001)
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung des Vektors piMs_R1 (Medicago sativa).
A: CaMV 35S Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus, Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294
A1: Partielle R1 cDNA (~1.9 kBp) aus Medicago sativa (antisense Orientierung)
A2: Terminator des Octopin Synthase Gens aus Agrobacterium tumefaciens, Gielen et al., EMBO J. 3, (1984) 835-846.
B: Nopalin Synthase Promotor aus Agrobacterium tumefaciens, Bevan et al., Nucl. Acids Res. 11 (1983), 369-385
B1: hph-Gen, Becker, Nucl. Acids Res. 18 (1990), 203
B2: Terminator des Nopalin Synthase Gens, Bevan et al., Nucl. Acids Res. 11 (1983), 369-385
LB: T-DNA Left Border, Gielen et al. (loc. cit.)
RB: T-DNA Right Border, Gielen et al. (loc. cit.)
KanR: nptIII-Gen, Trieu-Cout & Courvalin (1983) Gene 23: 331-341
Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung des Vektors piTr_R1 (Trifolium repens).
A: rbc-S Promotor aus Arabidopsis thaliana, De Almeida et al., Mol. Gen. Genet. 218 (1989), 78-86
A1: Partielles R1 Gen (~1.1 kBp) aus Trifolium repens (antisense Orientierung)
A2: nos Terminator, Depicker et al., J. Appl. Genet. 1 (1982), 561-573
B: CaMV 35S Promotor, Franck et al. (loc. cit.)
B1: bar-Gen, Thompson et al., EMBO J. 6 (1987), 2519-2523
B2: CaMV 35S Terminator, Topfer et al., Nuc. Acids Res. 15 (1987), 5890
LB: T-DNA Left Border, Gielen et al. (loc. cit.)
RB: T-DNA Right Border, Gielen et al. (loc. cit.)
KanR: nptIII-Gen, Trieu-Cout & Courvalin, Gene 23 (1983), 331-341
Fig. 3 zeigt eine schematische Darstellung des Vektors piLp_R1 (Lolium perenne).
A: CaMV 35S Promotor, Franck et al. (loc. cit.)
A1: Partielles R1-Fragment (1.07 kBp) aus Lolium perenne (antisense Orientierung)
A2: nos Terminator, Depicker et al. (loc. cit.)
B: Ubiquitin Promotor und erstes Intron aus Mais, Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18 (1992), 675-689
B1: nptII-Gen, Garfinkel et al., Cell 27 (1981), 143-153
B2: CaMV 35S Terminator (loc. cit.)
LB: T-DNA Left Border (loc. cit.)
RB: T-DNA Right Border (loc. cit.)
KanR: nptIII-Gen (loc. cit.)
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Clonierung von partiellen cDNA-Sequenzen des R1-Proteins aus Lolium perenne, Trifolium repens und Medicago sativa

Die Clonierung der partiellen cDNA-Sequenzen des R1-Proteins aus Lolium perenne und Trifolium repens erfolgte per PCR. (a) Nucleotidsequenzen der verwendeten Primer für die PCR- bzw. RT-PCR R1-1: TACACCTGATATGCCAGATGTTC (SEQ ID NO: 9)
R1-2: GGCCAYGGCATRCCAGA (Y = C, T; R = A, G) (SEQ ID NO: 10)
Tr R1: AAGCCCGGGCAAGGAGGGTGAGGATATTGATGACA (SEQ ID NO: 11)
Ms R1-2: CTACTCACGTTTGATTTGAAGTTGC (SEQ ID NO: 12)
oligodT2: GAGAGACTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT (SEQ ID NO: 13)
Zm_R1-F3: GAGTGAACTTCAGCAATCAAGTTCTC (SEQ ID NO: 14)
ms = Medicago sativum
Tr = Trifolium repens
Zm_R1-F3 = Oligonucleotid, dessen Sequenz von R1 aus Mais abgeleitet wurde

(b) Isolierung eines genomischen Fragmentes der DNA des R1-Gens aus Trifolium repens

Folgende Primer-Kombinationen wurden zunächst dafür verwendet, um Teile der genomischen Sequenz des R1-Gens von Trifolium repens zu amplifizieren:
PCR Bedingungen:
Kit: Platinum Taq Polymerase High Fidelity (Gibco)
Ca. 50 ng DNA von T. repens
400 µM Primer R1-1 und 400 µM Primer R1-2
Endkonzentration 4 mM MgCl₂/200 µM dNTP's
2 min 94°C Denaturierung

30 Zyklen:

20 sec 94°C Denaturierung

30 sec 55°C Hybridisierung

1 min 70°C Elongation
Das Plasmid IR 93-123 enthält das genomische Fragment des R1-Gens von Trifolium repens ("blunt end" Clonierung des PCR-Amplifikats nach Standardmethoden) in pBluescript SK (Stratagene), geöffnet mit EcoRV.

(c) Clonierung eines partiellen cDNA-Fragmentes codierend für das R1-Protein aus Trifolium repens

Anhand der Sequenzinformation von IR93-123 wurde ein spezifischer Primer (TrR1) synthetisiert. Zur Amplifizierung des cDNA-Fragmentes mittels RT-PCR wurden folgende zwei Primer-Kombinationen verwendet:
RT-PCR-Bedingungen:
Kit: One Step RT-PCR Kit von Qiagen
Ca. 200 ng Gesamt-RNA aus Blättern von T. repens
500 nM Primer TrR1 und 500 nM Primer Ms R1-2
Endkonzentration 5 mM MgCl₂/200 µM dNTP's
30 min 55°C RT Reaktion
15 min 95°C Taq Aktivierung

30 Zyklen:

15 sec 94°C Denaturierung

30 sec 60°C Hybridisierung

1,5 min 72°C Elongation, final 10 min 72°C
Das Plasmid IR 116-156 enthält ein 1,1 kb langes cDNA-Fragment von R1 aus Trifolium repens (T/A Clonierung in pCR2.1 (Invitrogen), nach Herstellerangaben). Die Sequenz der cDNA-Insertion ist angegeben in SEQ ID NO: 1. Zur Herstellung des Plasmids piTr_R1 wurde das ca. 1,07 kB Smal/Xbal-Fragment aus dem Plasmid IR 116-156 in den Vektor pi-TR hinter den rbc_S-Promotor (in antisense Orientierung) nach Standardverfahren cloniert.

(d) Clonierung eines partiellen cDNA-Fragments codierend für das R1-Protein aus Lolium perenne

Zur Amplifikation des cDNA-Fragmentes mittels RT-PCR wurde folgende Primer- Kombination verwendet:
RT-PCR-Bedingungen
Kit: One Step RT-PCR Kit von Qiagen
ca. 200 ng Gesamt-RNA aus Blättern von L. perenne
500 nM Primer R1-1 und 500 nM Primer Oligo dT2
Endkonzentration 5 mM MgCl₂/200 µM dNTP's
30 min 55°C RT Reaktion
15 min 95°C Taq Aktivierung

5 Zyklen:

15 sec 94°C Denaturierung

1.30 min 72°C Elongation

25 Zyklen:

15 sec 94°C Denaturierung

30 sec 60°C Hybridisierung

1,5 min 72°C Elongation, final 10 min 72°C
PCR-Bedingungen für die Reamplifizierung:
Kit: Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Gibco)
50 ng PCR-Fragment von RT-PCR
500 nM Primer Zm_R1-F3 und 500 nM Primer Oligo dT2
Endkonzentration 5 mM MgSO₄/200 µM dNTP's
2 min 94°C Taq Aktivierung

30 Zyklen:

15 sec 94°C Denaturierung

30 sec 60°C Hybridisierung

1,5 min 68°C Elongation, final 10 min 72°C
Das Plasmid IR 102-123 enthält ein 1.2 kb cDNA-Fragment von R1 aus L. perenne ("blunt end" Clonierung nach Standardmethoden in pBluescript SK⁺ (Stratagene) geöffnet mit EcoRV. Die Sequenz der cDNA-Insertion ist dargestellt in SEQ ID NO: 5. Zur Herstellung des Plasmids piLp_R1 wurde das ca. 1,1 kB Xhol-Fragment aus dem Plasmid IR 102-123 in den Vektor pi-Lp hinter den CaMV 35S-Promoter (in antisense Orientierung) nach Standardverfahren cloniert.

(e) Isolierung einer partiellen cDNA für das R1-Protein aus Medicago sativa

Zur Durchmusterung einer λZAPII cDNA-Bibliothek von Medicago sativa wurden 5 × 10⁵ rekombinante Phagen nach Herstellerangaben (Stratagene) plattiert. Die Phagen-DNA wurde auf Hybond N Filter (Amersham) transferiert und mittels eines UV-Stratalinkers (Stratagene) an diese fixiert. Die Prähybridisierung erfolgte für 4 Stunden bei 42°C (Puffer: 5 × SSC, 0,5% BSA, 5 × Denhardt, 1% SDS, 40 mM Phosphatpuffer, pH 7,2, 100 mg/l Heringssperma-DNA, 25% Formamid) und anschließend bei der gleichen Temperatur für 14 Stunden hybridisiert. Als radioaktiv markierte Sonde (Random Primed DNA Labeling Kit, Boehringer Mannheim nach Herstellerangaben) diente das vollständige cDNA Fragment codierend das R1-Protein aus Kartoffel (siehe SEQ ID NO: 7). Nach der Hybridisierung wurden die Filter 3 × für 20 Minuten mit 3 × SSC, 0,5% SDS bei 50°C gewaschen und für 14 Stunden autoradiographiert. Die 6 am stärksten hybridisierenden Plaques wurden mittels dreimaliger Wiederholung der Durchmusterung vereinzelt und die Phagen zur "in vivo excision" nach Herstellerangaben verwendet (Stratagene). Plasmid-DNA aus resultierenden Bakterienkolonien wurde nach Standardverfahren (Sambrook und Russell, 2000, a. a. O.) isoliert und einer DNA-Sequenzanalyse unterzogen. Einer der Clone (pMs_R1.3) enthielt ein ca. 1,85 kb langes cDNA-Fragment mit der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz.

(f) Herstellung eines Vektors zur antisense Inhibition des R1-Proteins in Medicago sativa

Zur antisense Inhibition wurde das vollständige cDNA-Fragment aus dem Plasmid pMs_R1.3 mittels der Restriktionsenzyme Asp718 I und Smal herausgeschnitten und in den Vektor pBinAR-Hyg (CaMV 35S/ocs-Terminator Kassette als EcoRI-HindIII Fragment in pBIB-Hyg; Becker et al., Nucl. Acids Res. 18 (1990), 203) ligiert. Das resultierende Plasmid piMs_R1 ist in Fig. 1 schematisch dargestellt.

Beispiel 2

Transformation von Pflanzen

Die Transformation von Trifolium repens mit dem Vektor piTr_R1 erfolgte nach der von Larkin et al. (Transgenic Research 5 (1996), 325-335) beschriebenen Methode.
Zur Transformation mittels Agrobacterium tumefaciens (enthaltend Plasmid piTr_R1) wurden Kotyledonen des Cultivars Haifa verwendet. Zur Selektion der Transformanden wurde dem B5PB Medium Phosphinotricin in einer Konzentration von 5 mg/l beigemengt.
Die Transformation von Medicago sativa mit dem Vektor piMs_R1 erfolgte nach der von Trinh et al. (Plant Cell Reports 17 (1998), 345-355) beschriebenen Methode.
Zur Transformation mittels Agrobacterium tumefaciens (Stamm GV2260, enthaltend Plasmid piMs_R1) wurden Blattsegmente von Medicago sativa Subspezies falcata (L.) Pl.564263 verwendet.
Die Suppression der Agrobacterien nach Co-Kultivierung erfolgte mittels Zugabe von Ticarpen (500 mg/l) zu dem SHMab Medium. Zur Selektion der Transformanden wurde dem Medium Hygromycin in einer Konzentration von 10 mg/l beigemengt.
Die Transformation von Lolium repens mit dem Vektor piLp_R1 erfolgte nach der von Altpeter et al. (Molecular BBreeding 6 (2000), 519-528) beschriebenen Methode.
Zur Transformation wurde Kallusmaterial aus unreifen Embryonen des Cultivars L6 verwendet, welches zuvor fünf Wochen lang subkultiviert wurde.
Die Selektion der Transformanden erfolgte durch Kultivierung des mit dem Plasmid piLp_R1 "beschossenen" Kallusmaterials für eine Dauer von zwei Wochen auf Regenerationsmedium beinhaltend Paramomycin in einer Konzentration von 100 mg/l.

Beispiel 3

Bestimmung des Stärkegehaltes aus Blattmaterial

(a) Probenvorbereitung

Entfernung der löslichen Zucker durch ethanolische Extraktion

Ca. 1 g frisches Blattmaterial von den gemäß Beispiel 2 hergestellten transgenen Pflanzen wurde gefriergetrocknet, gewogen und anschließend mit der Retsch-Kugelmühle zu einem feinen Pulver homogenisiert. Ca. 50 mg pulverisiertes Blattmaterial (Doppelbestimmung) wurden eingewogen, mit 1 ml 80% Ethanol versetzt, stark geschüttelt und die homogene Dispersion 1 h bei 80°C im Wasserbad inkubiert. Nach Abkühlen auf ca. 40°C wurde die Dispersion 5 min bei 3000 U/min (Minifuge RF, Heraeus) zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Das Blattmaterial wurde noch 2 mal mit je 1 ml 80% Ethanol versetzt und je 20 min bei 80°C im Wasserbad inkubiert. Nach Abkühlen und Zentrifugieren (s. o.) wurden die Überstände jeweils verworfen.

(b) Stärkebestimmung in Mikrotiterplatte/Spectramax bei 340 nm

Stärke Lebensmittelanalytik UV-Test, Boehringer Mannheim, Best. Nr.: 207748 (Amyloglucosidase, Stärkemesspuffer, Glucose-6- phosphatdehydrogenase)
Das zuckerfreie Blattmaterial wird mit 400 Mikrolitern 0,2 N KOH versetzt und durch starkes Schütteln homogenisiert. Das Homogenat wird 1 h bei 95°C im Wasserbad inkubiert. Nach dem Abkühlen werden 75 µl 1 M Essigsäure dazugegeben und gründlich gemischt. Es wird 10 min bei 4000 U/min zentrifugiert. 25 bzw. 50 µl Überstand werden in eine Mikrotiterplatte zu 50 µl Amyloglucosidase (Boehringer Mannheim) sowie 25 bzw. 50 µl Millipore Wasser gegeben und bei 56°C 1 h verdaut. In eine weitere Mikrotiterplatte werden 196 µl Stärkemesspuffer (Boehringer Mannheim) vorgelegt. Dazu werden 4 (bis 20) µl des abgekühlten Stärkeverdaus pipettiert. Das Verhältnis kann je nach Glucosekonzentration bis auf 40 µl Verdau + 160 µl Stärkemesspuffer angehoben werden.
Messung:
Schütteln, Pre-read
+ 2 µl Glucose-6-phosphatdehydrogenase
(Boehringer Mannheim)
Inkubation: 30 min bei 37°C, messen

(c) Die Berechnung des Stärkegehaltes erfolgte wie nachstehend angegeben

Messvol. (200 µl) × Extraktionsvol. (4750 µl) × Amyloglucosidase- Verdauvol. (200 µl) × ΔOD/ε × 1000 × Probemessvol. (4 µl. . .40 µl) × Probeverdauvol. (50 µl) × Einwaage (g) × d(1) = Konzentration (µmol/g TG) ε = 6,3 l × mmol^-1 × cm^-1 (molarer Extinktionskoeffizient von NADH bei 340 nm)
TG = Trockengewicht
Aus den ermittelten Gewichten vor und nach dem Gefriertrocknen sowie der molaren Masse von Glucose (162,1 g/mol - Anhydrid) wurde die Konzentration in mg Glucose/g Frischgewicht errechnet. Beispiel 4 Blattstärkeextraktion Reagenzien

Extraktionspuffer pH 7,3: 50 mM Na-MOPS MOPS = (3-[N-Morpholino]propanesulfonic acid) 2 mM EDTA 0,5 mM beta-Mercaptoethanol

SDS 2% (Serva) Ethanol 80 Aceton

Stärkeextraktion

Die Blätter der Pflanzen werden im Waring Blender mit Extraktionspuffer (8 ml pro Gramm Frischgewicht) ca. drei Minuten auf höchster Stufe zerkleinert. Anschließend wird erst durch ein Küchensieb und dann durch einen 125 µ Filter filtriert. Die Feststoffe werden erneut mit Extraktionspuffer (2 ml pro Gramm Frischgewicht) im Waring Blender homogenisiert und erneut filtriert. Die Feststoffe werden nach der zweiten Extraktion verworfen. Die Filtrate werden in einem Zentrifugenbecher vereinigt und 15 min bei 5.500 × g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Pellet wird in 2% SDS aufgenommen (8 ml pro Gramm Frischgewicht). Die Suspension wird unter vorsichtigem Rühren durch einen 30 µ Filter filtriert (Stärke geht durch den Filter) und anschließend 15 min bei 5.500 × g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Pellet wird drei mal mit Wasser (8 ml pro Gramm Frischgewicht) gewaschen (resuspendiert und zentrifugiert wie oben beschrieben), die Überstände werden jeweils verworfen. Das Pellet wird wiederum in Wasser (8 ml pro Gramm Frischgewicht) aufgenommen und nochmals durch einen 30 µ Filter filtriert, möglichst ohne zu rühren.
Anschließend wird 15 min bei 5.500 × g zentrifugiert und das Pellet zwei mal in 80% Ethanol und einmal mit Aceton (je 0,5 ml pro Gramm Frischgewicht) gewaschen (resuspendiert und zentrifugiert wie oben beschrieben).
Nach einem letzten Waschen mit Wasser (0,5 ml pro Gramm Frischgewicht) wird das Pellet (Blattstärke) mindestens 24 h in der Lyophylle getrocknet.

Phosphatbestimmung

Reagenzien

0,7 N HCl:
2,9 ml 37%ige HCl/50 ml
Puffer:

9 ml 1 M Imidazollösung pH 7,2

225 µl 1 M MgCl₂

60 µl 0,5 M EDTA

150 µl 80 mM NADP

20,565 ml Millipore Wasser

30,0 ml

Enzym:
Glucose-6-phosphatdehydrogenase (von Leuconostoc-mesenteroides) Roche, Best. Nr.: 165875, 1000 U/1 ml, 1 : 4 mit Puffer verdünnen

Probenvorbereitung

100 mg Blattstärke (genau gewogen) werden in ein 2 ml Safe-Look Eppendorfgefäß eingewogen und mit 500 µl 0,7 N HCl versetzt. Bei der Einwaage wird gleichzeitig an weiteren 100 mg Blattstärke der Wassergehalt mittels Heizwaage bestimmt.
Es wird stark gevortext und anschließend erfolgt die saure Hydrolyse für 4 Std. bei 95°C unter Schütteln. Nach dem Abkühlen wird 20 min bei 13000 U/min zentrifugiert. Der gesamte Überstand wird in ein Spin Module Size 100 (Q. BIOgene) überführt und durch kurzes zentrifugieren filtriert.
140 µl Hydrolysat werden mit 1260 µl Puffer im Eppendorfgefäß gemischt und je 700 µl werden in zwei Quarzküvetten (Referenz- und Messküvette) gefüllt. Die enzymatische Bestimmung von Glucose-6-Phosphat wird durch Zugabe von 6 µl Enzym in die Messküvette gestartet. Die Messung (Zunahme an NADPH) erfolgt bei 340 nm am UVIKON (Kontron). Berechnung

SEQUENCE LISTING

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Futterpflanze, die im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen einen erhöhten Blattstärkegehalt aufweist, wobei

a) eine Zelle einer Futterpflanze genetisch modifiziert wird durch die Einführung eines fremden Nucleinsäuremoleküls, dessen Vorhandensein oder Expression zu einer Verringerung der Aktivität eines endogen in der Pflanzenzelle vorkommenden R1-Proteins führt;

b) aus der gemäß Schritt (a) hergestellten Zellen eine Pflanze regeneriert wird; und

c) ausgehend von der gemäß Schritt (b) erzeugten Pflanze gegebenenfalls weitere Pflanzen erzeugt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das fremde Nucleinsäuremolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus

a) DNA-Molekülen, die mindestens eine antisense-RNA codieren, welche eine Verringerung der Expression von endogenen Genen bewirkt, die R1- Proteine codieren;

b) DNA-Molekülen, die über einen Cosuppressionseffekt zu Verringerung der Expression von endogenen Genen führen, die R1-Proteine codieren;

c) DNA-Molekülen, die mindestens eine Ribozym codieren, das spezifisch Transkripte von endogenen Genen spaltet, die R1-Proteine codieren;

d) Nucleinsäuremoleküle, die im Fall von in vivo-Mutagenese zu einer Mutation oder einer Insertion einer heterologen Sequenz in endogenen, R1-Proteinen codierenden Genen führen, wobei die Mutation oder Insertion einer Verringerung der Expression von R1-Proteinen codierenden Genen führt, oder zu einer Verringerung der Synthese von aktiven R1-Proteinen; und

e) DNA-Molekülen, die simultan mindestens eine antisense-RNA und mindestens eine sense-RNA codieren, wobei besagte antisense-RNA und besagte sense-RNA ein doppelsträngiges RNA-Molekül ausbilden, das eine Verringerung der Expression von endogenen Genen bewirkt, die R1- Proteine codieren.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Verringerung der Aktivität des R1- Proteins eine Verringerung der Menge an R1-Protein im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Zellen um mindestens 50% bedeutet.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Futterpflanze eine Pflanze aus der Gattung Trifolium ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Futterpflanze eine Pflanze aus der Gattung Medicago ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Futterpflanze eine Pflanze aus der Gattung Lolium ist.

7. Transgene Futterpflanze, die erhältlich ist durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und die erhöhten Blattstärkegehalt aufweist.

8. Transgene Pflanzenzelle, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie von einer transgenen Futterpflanze nach Anspruch 7 stammt und genetisch modifiziert ist mit einem fremden Nucleinsäuremolekül wie in Anspruch 1 oder 2 definiert.

9. Vermehrungsmaterial von transgenen Futterpflanzen nach Anspruch 7, enthaltend transgene Pflanzenzellen nach Anspruch 8.

10. Verwendung von Nucleinsäuremolekülen, die ein R1-Protein codieren, oder von Teilen davon zur Verringerung der Aktivität eines R1-Proteins in Futterpflanzen.

11. Nucleinsäuremolekül codierend ein R1-Protein aus einer Pflanze der Gattung Trifolium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

a) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die unter SEQ ID NO: 2 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt;

b) Nucleinsäuremolekülen, die die unter SEQ ID NO: 1 angegebene codierende Region umfassen;

c) Nucleinsäruemolekülen, die ein Protein codieren, das die Aminosäuresequenz umfaßt, die von der Insertion in Plasmid DSM 14707 codiert wird;

d) Nucleinsäuremoleküle, die die in der Insertion des Plasmids DSM 14707 enthaltene codierende Region für ein R1-Protein umfassen;

e) Nucleinsäuremolekülen, deren Sequenz zu der Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls nach (a), (b) oder (c) und/oder (d) zumindestens 85% identisch ist und die ein R1-Protein aus einer Pflanze der Gattung Trifolium codieren; und

f) Nucleinsäuremolekülen, deren Sequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von der Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls nach (e) abweicht.

12. Vektor enthaltend ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 11.

13. Vektor nach Anspruch 12, wobei das Nucleinsäuremolekül in sense-Orientierung mit regulatorischen Sequenzen verknüpft ist, die die Transkription in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen gewährleisten.

14. Wirtszelle, die genetisch modifiziert ist mit einem Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 11 oder mit einem Vektor nach Anspruch 12 oder 13.

15. Wirtszelle nach Anspruch 14, die eine pflanzliche Zelle ist.

16. Transgene Pflanzen enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 15.

17. Protein codiert durch ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 11.

18. Antikörper, der spezifisch ein Protein nach Anspruch 17 erkennt.

19. Nucleinsäuremolekül codierend ein R1-Protein aus einer Pflanze der Gattung Medicago ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

a) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die unter SED ID NO: 4 angegebene Aminosäuresequenz umfassen;

b) Nucleinsäuremolekülen, die die unter SEQ ID NO: 3 angegebene codierende Region umfassen;

c) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die Aminosäuresequenz umfaßt, die von der Insertion in Plasmid DSM 14633 codiert wird;

d) Nucleinsäuremoleküle, die die in der Insertion des Plasmid DSM 14633 enthaltene codierende Region für ein R1-Protein umfassen;

e) Nucleinsäuremolekülen, deren Sequenz zu der Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls nach (a), (b), (c) und/oder (d) zumindestens 90% identisch und die ein R1-Protein aus einer Pflanze der Gattung Medicago codieren; und

f) Nucleinsäuremolekülen, deren Sequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von der Sequenz eins Nucleinsäuremoleküls nach (e) abweicht.

20. Vektor enthaltend ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 19.

21. Vektor nach Anspruch 20, wobei das Nucleinsäuremolekül in sense-Ordnung mit regulatorischen Sequenzen verknüpft ist, die die Transkription in prokaryontischen oder eurkaryontischen Zellen gewährleisten.

22. Wirtszellen, die genetisch modifiziert ist mit einem Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 19 oder mit einem Vektor nach Anspruch 20 oder 21.

23. Wirtszelle nach Anspruch 22, die eine pflanzliche Wirtszelle ist.

24. Transgene Pflanzen enthaltend Wirtszellen nach Anspruch 23.

25. Protein codiert durch ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 19.

26. Antikörper, der spezifisch ein Protein nach Anspruch 25 erkennt.

27. Nucleinsäuremolekül codierend ein R1-Protein aus einer Pflanze der Gattung Lolium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

a) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die unter SEQ ID NO: 6 angegebene Aminosäuresequenz umfassen;

b) Nucleinsäuremolekülen, die die unter SEQ ID NO: 5 angegebene codierende Region umfaßt;

c) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die Aminosäuresequenz umfaßt, die von der Insertion in Plasmid DSM 14635 codiert wird;

d) Nucleinsäuremoleküle, die die in der Insertion des Plasmids DSM 14635 enthaltene codierende Region für ein R1-Protein umfassen;

e) Nucleinsäuremolekülen, deren Sequenz zu der Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls nach (a), (b), (c) und/oder (d) zu mindestens 92% identisch ist und die ein R1-Protein aus einer Pflanze der Gattung Lolium codieren; und

28. Vektor enthaltend ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 27.

29. Vektor nach Anspruch 28, wobei das Nucleinsäuremolekül in sense-Orientierung mit regulatorischen Sequenzen verknüpft ist, die die Transkription in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen gewährleisten.

30. Wirtszelle, die genetisch modifiziert ist mit einem Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 27 oder mit einem Vektor nach Anspruch 28 oder 29.

31. Wirtszelle nach Anspruch 30, die eine pflanzliche Zelle ist.

32. Transgene Pflanze, enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 31.

33. Protein codiert durch ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 27.

34. Antikörper, der spezifisch ein Protein nach Anspruch 33 erkennt.

35. Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls nach Anspruch 11, 19 oder 27 zur Identifizierung von ähnlichen Nucleinsäuremolekülen, die ein R1-Protein codieren.