DE19732926A1 - DNA-Sequenzen kodierend einen Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokator, Plasmide, Bakterien, Hefen und Pflanzen enthaltend diesen Transporter - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen aus Pisum sativum (Erbse), Zea mays (Mais) und Solanum tuberosum (Kartoffel), die die Kodierregion eines Glukose-6- phosphat-Phosphat-Translokators enthält, deren Einführung in ein pflanzliches Genom die Bildung und Weiterleitung von Kohlenstoffgrundgerüsten für Synthese von Stärke und Aminosäuren/Proteinen und die Weiterleitung des assimilierten Kohlenstoffs in transgenen Pflanzen verändert, Plasmide, Hefen und Bakterien enthaltend diese DNA-Sequenzen, sowie transgene Pflanzen, bei denen durch Einführung der DNA-Sequenzen Veränderungen der Aktivität des Glukose-6- phosphat-Phosphat-Translokators und somit Änderungen im Stickstoff- und Kohlenstoffstoffwechsel hervorgerufen werden. Weiterhin betrifft die Erfindung die Nutzung der beschriebenen Sequenzen des Glukose-6-phosphat-Phosphat- Translokators zur Identifizierung verwandter Translokatoren aus anderen dikotylen und monokotylen Pflanzen durch Hybridisierung mit niedriger Stringenz oder durch PCR-Techniken, sowie die Nutzung des Glukose-6-phosphat-Phosphat- Translokators als Ziel ("Target") für Herbizide.

Die pflanzliche Photosynthese ist der größte Produktionsprozeß der Erde und der einzige Prozeß, der den Gesamtvorrat an nutzbarer Energie auf unserem Planeten vergrößert: mehr als 10 Milliarden Tonnen Kohlenstoff werden jährlich in Kohlenhydrate oder andere organische Materie als Energie und letztlich als unsere Nahrungsgrundlage gespeichert. Diese Energiemenge entspricht etwa 5% der aller bekannten fossilen Energiequellen. Die Photosynthese ist damit die Grundlage allen Lebens. Während dieses in den grünen Blättern stattfindenden Prozesses werden aus dem atmosphärischen CO₂, anorganischem Phosphat und Wasser mit Hilfe der im Zuge der Lichtreaktion gebildeten Produkte, Adenosintriphosphat (ATP) und Reduktionsäquivalente (NADPH₂), ein Kohlenstoffgerüst mit 3 C-Atomen, Triosephosphate, synthetisiert. Dieses Primärprodukt der CO₂-Fixierung wird über einen speziellen Translokator (Triosephosphat-Phosphat-Translokator; Flügge et al., 1989, EMBO J. 8: 39-46; Flügge et al., 1991, Nature 353: 364-367) aus dem Chloroplasten austransportiert und im Cytoplasma in einer Reihe von aufeinanderfolgenden Reaktionen in Saccharose (Rohrzucker) überführt. Während der Biosynthese von Saccharose wird das anorganische Phosphat wieder freigesetzt und über den oben erwähnten Triosephosphat-Phosphat-Translokator in die Chloroplasten zurücktransportiert. Hier wird aus dem Phosphat neuerlich ATP gebildet, eine Reaktion, die von der lichtgetriebenen ATP-Synthase katalysiert wird.

Es ist ersichtlich, daß der von dem Triosephosphat-Phosphat-Translokator katalysierte Export des fixierten Kohlenstoffs im Austausch mit anorganischem Phosphat in essentieller Weise die beiden Kompartimente Chloroplast und Cytoplasma verbindet. Tatsächlich hat eine Hemmung des Translokators erhebliche Auswirkungen auf die Assimilat-Produktion (siehe unten).

Der beschriebene und in den Blättern (dem "Source"-Gewebe) stattfindende Prozeß der Photoassimilat-Produktion dient in hohem Maße der Versorgung von nicht­ grünen Organen (dem "Sink"-Gewebe), wie Wurzel, Knolle und Frucht, also auch den erntebaren Teilen der Pflanzen. In Kulturpflanzen wie Kartoffeln, Zuckerrüben und Getreiden erfolgt der Transport von Kohlenhydraten von den "Source"- zu den "Sink"-Geweben über die Siebröhren (das Phloem) ausschließlich in Form von Saccharose. Die Saccharose wird anschließend aus dem Phloem in die Zellen des "Sink"-Gewebes transportiert (Phloem-Entladung). Der Transport kann entweder direkt d. h. symplastisch über zwischen dem Phloem und dem "Sink"-Gewebe bestehende Verbindungen (Plasmodesmen) erfolgen oder aber apoplastisch, was eine Entladung der Saccharose in die Zellwand und ihren erneuten Import in die Zielzellen beinhaltet. Alternativ kann die Saccharose im Apoplasten von einer zellwandspezifischen Invertase in Hexosen gespalten werden, die anschließend in die Zellen des "Sink"-Gewebes transportiert werden. Erfolgt der Eintransport in Form von Saccharose, wird diese im Cytoplasma der Zellen des "Sink"-Gewebes in Hexosen gespalten (Glukose und Fruktose). Dies geschieht entweder über Invertasen oder über die Saccharose-Synthase. Alle Spaltprodukte der Saccharose werden letztendlich wieder in Hexosephosphate (Glukose-6-phosphat, Glukose-1-phosphat) überführt.

In den meisten Pflanzen dient Glukose-6-phosphat dann als Substrat für die Stärkesynthese, deren gesamte Reaktionsfolge im Innenraum (Stroma) der Amyloplasten des "Sink"-Gewebes lokalisiert ist. Diese Organellen sind von zwei Lipiddoppelschichtmembranen umschlossen, von denen die äußere Membran auf Grund der Anwesenheit von porenbildenden Proteinen (Porinen) unspezifisch permeabel ist für kleinere Moleküle. Ein solches Porin der äußeren Amyloplasten- Hüllmembran konnte kürzlich von uns identifiziert und die Abfolge seiner das Protein zusammensetzenden Aminosäurebausteine aufgeklärt werden (Fischer et al., 1994, J. Biol. Chem., 269: 25754-25760). Die innere Hüllmembran ist dagegen die eigentliche Permeabilitätsgrenze zwischen dem Cytoplasma und den Organellen und ist, wie a priori jede Lipid-Doppelschicht, prinzipiell impermeabel für größere geladene Moleküle wie z. B. Hexosephosphat.

Diese prinzipielle Undurchlässigkeit der inneren Amyloplasten-Hüllmembran für größere hydrophile Moleküle wird durch die Anwesenheit spezifischer Transportsysteme überbrückt. So müssen auch Hexosephosphate als Ausgangsverbindung für die Biosynthese von Stärke über ein spezifisches Transportprotein aus dem Cytoplasma in das Stroma der Amyloplasten transportiert werden. Dieser Transport wird von einem amyloplastidären Hexosephosphat- Phosphat-Translokator katalysiert, nicht jedoch von dem Triosephosphat-Phosphat- Translokator oder dem kürzlich von uns beschriebenen Phosphoenolpyruvat- Phosphat-Translokator (Borchert et al., 1989, FEBS Lett. 253: 183-186; Flügge und Heidt, 1991, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol. 42: 129-144; Viola et al., 1991, Planta 183: 202-208; Neuhaus et al., 1993, Biochem. J. 296: 495-501; Fischer et al., 1997, Plant Cell 9, 453-462). Im Falle des Eintransportes von Glukose-6-phosphat wird dieses in Glukose-1-phosphat umgesetzt, das dann über die ADP-Glukose- Pyrophosphorylase (AGPase) in ADP-Glukose, dem Substrat für die Stärke-Synthase, umgesetzt wird. Neuere Arbeiten haben gezeigt, daß im Endosperm einiger Getreide (Gerste, Mais) die AGPase auch im Cytosol lokalisiert ist und der Eintransport der Vorstufen für die Stärkebiosynthese über ADP-Glukose erfolgen kann (Denyer et al., 1996, Plant Physiol. 112: 779-785).

Wie ausgeführt, besitzen die meisten Pflanzen ein Transportsystem für Glukose-6- phosphat für die Versorgung der nicht-grünen Plastiden. Der Eintransport in die Amyloplasten erfolgt über einen Gegentausch-Mechanismus, entweder im Austausch mit anorganischem Phosphat, das im Zuge der Stärkesynthese freigesetzt wird oder aber im Austausch mit Triosephosphat, das über den oxidativen Pentosephosphat-Weg gebildet wird. Auch für diesen Reaktionsweg dienen Hexosephosphate als Ausgangssubstrat. Der oxidative Pentosephosphat-Weg stellt in den Plastiden Reduktionsäquivalente bereit, hauptsächlich für die dort stattfindende Reduktion des aus dem Nitrat gebildeten Nitrits zum Ammonium, das seinerseits in die Biosynthese von Aminosäuren/Proteinen abgeführt wird (Nitrat- Assimilation). Es wird ersichtlich, daß der Hexosephosphat-Phosphat-Translokator das entscheidende Verbindungsglied ist zwischen dem Cytosol der Zellen des nicht- grünen Gewebes und den Plastiden als Kompartiment der Stärkesynthese und des oxidativen Pentosephosphat-Weges. Es sei erwähnt, daß die Chloroplasten der Schließzellen, ebenso wie die Plastiden der nicht-grünen Gewebe, auf die Versorgung mit Glukose-6-phosphat als Vorstufe für die Stärkesynthese angewiesen sind (Overlach et al., 1993, Plant Physiol. 101: 1201-1207). Das aus dem Stärkeabbau resultierende Malat dient dann als hauptsächliches Gegenion für Kalium, dessen Ein- und Ausstrom in die bzw. aus den Schließzellen die Schließbewegungen auslöst.

Wie aus den Ausführungen ersichtlich wird, sind Transporter - wie der chioroplastidäre Triosephosphat-Phosphat-Translokator, der den Austransport des fixierten Kohlenstoffs aus dem Chloroplasten katalysiert, der Saccharose- Translokator, über den die Siebröhren mit der Transportform des Photoassimilates Saccharose beladen werden und der Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokator der Amyloplasten - in die Allokation des Photoassimilates von den "Source"- zu den "Sink"-Organen an entscheidender Stelle eingebunden. Änderungen der Aktivität eines spezifischen Membran-Transporters können große Auswirkungen auf die Stoffwechselleistungen der Pflanzen haben. So konnte vor kurzem gezeigt werden, daß die Effektivität der photosynthetischen Kohlenstoffreduktion (Lichtreaktion und Calvin-Zyklus) ganz wesentlich durch die Aktivität des chloroplastidären Triosephosphat-Phosphat-Translokators beeinflußt werden kann. Die Hemmung dieses Transporters in planta über die Expression einer entsprechenden "anti-sense" mRNA führt zu einem verminderten Export des primären Photoassimilates (Triosephosphat, 3-Phosphoglycerat), das unter diesen Umständen innerhalb des Chloroplasten abgeleitet wird in die Biosynthese von Stärke, die sich massiv anstaut (Riesmeier et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6160-6164; Heineke et al., 1994, Planta 193: 174-180). Dieses Translokatorprotein stellt demzufolge eine Engstelle im Kohlenstoffstoffwechsel des "Source"-Gewebes dar. Auch die Reduktion der Saccharose-Transport-Aktivität über eine "anti-sense"-Inhibierung des für den Transport in die Siebröhren verantwortlichen Saccharose-Transporters (Riesmeier et al., 1992, EMBO J. 11: 4705-4713) führt zu einem drastischem Phänotyp der Pflanzen: sie sind wesentlich kleiner, die Blätter sind geschädigt und die Pflanzen bilden, im Fall der Kartoffeln, kaum noch Knollen aus d. h. die Versorgung der "Sink"-Gewebe mit Photoassimilaten ist stark reduziert (Riesmeier et al., 1994, EMBO J. 13: 1-7).

Wie ausgeführt, ist der Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokator die zentrale Verbindungsstelle für die vom "Source"- zum "Sink"-Gewebe transportierten Photoassimilate zwischen dem Cytosol der Zellen des heterotrophen Gewebes und den nicht-grünen Plastiden als Ort der Stärkebiosynthese und des oxidativen Pentosephosphat-Weges.

Gelänge es, diesen Translokator zu klonieren und mit Hilfe der erhaltenen Sequenz die Aktivität des Translokators in Pflanzen zu verändern, eröffnete dies den Weg zu Pflanzen mit einem veränderten Kohlenstoff/Stickstoff-Verhältnis. Dies bedeutet, daß Pflanzen mit einem erhöhten Gehalt an Stärke, und damit einem erhöhten Gehalt an Trockenmasse, erzeugt werden könnten. Wie Stark et al. (Science 258: 287-­ 292) 1992 gezeigt haben, konnte der Gehalt an Stärke in Kartoffelknollen über die Überexpression einer ADP-Glucose-Pyrophosphorylase (AGPase), einem amyloplastidären Enzym der Stärke-Biosynthese, erhöht werden. Für diese Versuche wurde ein Enzym aus E. coli eingesetzt, das nicht der metabolischen Kontrolle über den 3-Phosphoglycerat/Phosphat Quotienten unterliegt. Da die Menge an gebildeter Stärke sich nicht absolut mit der Aktivitätssteigerung der AGPase korrelieren ließ, ist anzunehmen, daß hier ein weiterer, vor der Reaktion der AGPase liegender, Schritt limitierend wird. Zudem wurden diese Versuche an einer Kartoffelsorte durchgeführt, die als wenig effektiver Stärkeproduzent gilt. Es erscheint möglich, daß die Verfügbarkeit des Substrats für die AGPase, Hexosephosphate (Glukose-1- phosphat bzw. Glukose-6-phosphat), den eigentlich limitierenden Schritt darstellt. Dieses Substrat wird, wie ausgeführt, über Hexosephosphat-Phosphat- Translokatoren in die Amyloplasten importiert und hier für die Reaktion der AGPase und die Stärkesynthese zur Verfügung gestellt. Eine zellspezifische Überexpression des Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokators eröffnet hier den Weg zu einer Steigerung der Stärkesynthese, und damit des Stärkegehaltes und der Trockenmasse. Ein solcher Effekt könnte damit selbst in Kartoffelsorten erreicht werden, die als gute Stärkeproduzenten ausgewiesen sind. Eine Erhöhung des Stärkegehaltes der Kartoffelknolle wäre sowohl für die stärkeverarbeitende Industrie als auch für die Nahrungsmittel-Industrie von Bedeutung, da Kartoffeln mit einem erhöhten Stärkegehalt während ihrer Prozessierung zu Chips, Pommes frites, Gebäck etc. weniger Fett aufnehmen und daher zu kalorienärmeren Endprodukten führen. Erfolgreiche Strategien wären mit hoher Wahrscheinlichkeit auch auf die Nutzung anderer stärkespeichernder Pflanzen wie z. B. Mais, Weizen und Gerste übertragbar. Gelänge es andererseits, Kartoffeln mit einer verminderten Aktivität des Glukose-6- phosphat-Phosphat-Translokators zu erzeugen, könnten Lagerungsverluste, die über das sog. "cold-sweetening" entstehen, vermieden werden. Kartoffeln werden, zur Vermeidung der Auskeimung, bei tiefen Temperaturen (6-8°C) gelagert. Dies führt jedoch zu dem unerwünschten Effekt der Akkumulation von löslichen Zuckern, dem erwähnten "cold-sweetening". Die Bildung reduzierender Zucker ist, auf Grund der auftretenden Maillard-Reaktion, ein äußerst negativer Parameter während der weiteren Prozessierung der Kartoffeln wie der Herstellung von Chips etc. Die Bildung löslicher Zucker-Hydrolyseprodukte der Stärke, die im extraplastidären Kompartiment akkumulieren - könnte verhindert werden, indem der Hexosephosphat-Phosphat-Translokator, der auch in den Austransport der aus dem Stärkeabbau stammenden Produkte eingebunden ist, während der Lagerungsphase der Kartoffeln ausgeschaltet werden könnte.

Die Adressierung der plastidären Translokatoren zu der inneren Hüllmembran der Plastiden bedarf einer entsprechenden Präsequenz ("Targeting-Sequenz"), die das anhängende reife Protein korrekt zu den Plastiden dirigiert (Übersichtsartikel hierzu: Keegstra et al., 1989, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40: 471-501; Lubben et al., 1988, Photosynth. Res. 17: 173-194; Flügge, 1990, J. Cell Sci. 96: 351-354). Neben der für die "Plastiden-Adressierung" nötigen Präsequenz gibt es im reifen Teil (der Teil des Proteins, der nach der Abspaltung der Präsequenz durch eine spezifische Protease verbleibt) der Plastidenhüllmembran-Proteine noch weitere Informationen, die für die spezifische Insertion der Proteine in die Membran verantwortlich sind und einen Transport der Hüllmembranproteine über die Hüllmembran in das Plastidenstroma oder, im Fall der Chloroplasten, die Thylakoidmembran verhindern (Knight and Gray, 1995, Plant Cell 7: 1421-1432 bzw. eigene Untersuchungen: Brink et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 20808-20815). Eigene Arbeiten zeigten ferner am Beispiel eines mitochondrialen Carriers, des ADP/ATP-Transporters, daß dieses Protein nicht oder nur mit einer sehr geringen Effizienz zu Plastiden dirigiert und dort in die Hüllmembran eingebaut werden kann. Selbst ein Hybridprotein, bestehend aus einer plastidären Präsequenz (die Information für die Plastiden- Adressierung enthaltend) und diesem mitochondrialen Carrier, zeigte gegenüber dem authentischen Protein einen kaum erhöhten Einbau in die Plastiden- Hüllmembran (Silva-Filho et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 15264-15269; unveröffentlichte Beobachtungen). Da für eine korrekte Insertion die Protein/Lipid- Wechselwirkung von Bedeutung ist und sich die plastidäre Hüllmembran in ihrer Lipidzusammensetzung grundlegend von der anderer Zellorganellen und auch der Bakterien unterscheidet (Joyard et al., 1991, Eur. J. Biochem. 199: 489-509), ist es sehr unwahrscheinlich, daß eine, wenn auch geringfügige, Insertion eines heterologen Proteins, dann auch funktionell ist, d. h., daß ein Transporter aus anderen Systemen überhaupt in einer seiner Funktion entsprechenden Konformation und Orientierung in die Plastiden-Hüllmembran eingebaut werden kann.

Somit ist es nach gegenwärtigem Stand der Technik nicht möglich, mit Hilfe bekannter Plastiden-"Targeting"-Sequenzen z. B. mitochondriale oder prokaryontische Transporter funktionell in die innere Plastidenhüllmembran zu integrieren. Beim gegenwärtigen Stand der Technik ist es erfolgversprechender, die für die Konstruktion der oben geschilderten Pflanzen notwendige DNA-Sequenz durch Klonierung des authentischen plastidären Hexosephosphat-Phosphat- Translokators zu erhalten.

Obwohl auch dieses Transportsystem den Gegentransport von Hexosephosphat mit anorganischen Phosphat katalysiert, ist seine Primärstruktur anzunehmenderweise sehr unterschiedlich zu der des chloroplastidären Triosephosphat-Phosphat- Translokators, da letzterer nur in photosynthetisch aktiven Geweben exprimiert wird und in RNA-Hybridisierungsexperimenten mit dem chloroplastidären Triosephosphat-Phosphat-Translokator als Sonde keine Signale in nicht-grünen Geweben erhalten werden konnten (Flügge, 1995, J. Exp. Bot. 46: 1317-1323). Um die Primärstruktur des amyloplastidären Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokators zu ermitteln, mußte daher der bei Membranproteinen außerordentlich schwierige Weg der biochemischen Charakterisierung, Reinigung und Isolation des Transportproteins beschritten werden. Ausgehend von amyloplastidären Hüllmembranen aus Mais-Endosperm gelang es, dieses Protein - über chromatographische Methoden in Verbindung mit der funktionellen Rekonstitution der erhaltenen Proteinfraktionen in künstliche Membranen zur Messung der Transportaktivitäten - als eine Komponente der inneren Amyloplasten- Hüllmembran mit einer molekularen Masse von ca. 31.000 Dalton zu identifizieren. Der N-Terminus des Translokators erwies sich als chemisch modifiziert und somit einer N-terminalen Proteinsequenzierung durch automatisierten Edman-Abbau nicht zugänglich. Daher war es nötig, das Protein durch präparative SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese in ausreichender Menge zu isolieren und mit einer Protease (Lys-C) enzymatisch zu spalten, um interne Peptidsequenzen zu ermitteln (siehe Ausführungsbeispiel 1). Es konnten auf diese Weise folgende Peptidsequenzen erhalten werden: (1) KTQVVPVQSEGAERLK; (2) KVAVSFTHIIK. Es gelang, mittels der RACE-Methode (rapid amplification of cDNA ends) und unter Nutzung von (nach dem erhaltenen Peptid 1 modellierten) synthetischen Oligonukleotiden, ein spezifisches PCR-Fragment zu erhalten. Dies wurde als Sonde für die anschließende Durchmusterung einer cDNA-Bibliothek (die angelegt wurde ausgehend von polyA⁺-mRNA aus Mais-Endosperm) genutzt und es gelang, einen cDNA-Klon zu isolieren, der die vollständige cDNA (1647 Basenpaare) für den amyloplastidären Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokators enthielt (siehe Ausführungsbeispiel 2). Da es sich gezeigt hatte, daß sich Proteine aus Monokotyledonen (wie Mais) nicht oder nur sehr schlecht in Hefe oder in Dikotyledonen exprimieren lassen (eigene unveröffentlichte Beobachtungen), wurde die cDNA aus Mais benutzt, um den analogen cDNA-Klon aus nicht-grünen Geweben der dikotylen Pflanze Pisum sativum (Erbse, 1609 Basenpaare) zu isolieren und das entsprechende Erbsen-Protein dann in Hefe zur Bestimmung seiner Transportparameter zu exprimieren (siehe Ausführungsbeispiele 3 und 4). Ferner konnte ein entsprechender partieller cDNA- Klon aus der dikotylen Pflanze Solanum tuberosum (Kartoffel, 1450 Basenpaare) isoliert werden.

Expressionsstudien mit verschiedenen Pflanzengeweben belegten, daß sich die Transkripte für den Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokator ausschließlich in heterotrophen, nicht jedoch in photosynthetisch aktiven Geweben nachweisen ließen (eigene unveröffentlichte Beobachtungen). Der entsprechende Promotor des Gens besitzt daher eine hohe "Sink"-Gewebespezifität.

Die vorliegende Erfindung stellt nun DNA-Sequenzen zur Verfügung, die aus einem pflanzlichen Genom stammen und für einen plastidären Glukose-6-phosphat- Phosphat-Translokator kodieren, wobei die in der Nukleotidabfolge enthaltene Information bei Einführung und Expression in pflanzlichen Zellen zur Bildung einer Ribonukleinsäure führt und über diese Ribonukleinsäure eine Glukose-6-phosphat- Phosphat-Translokator Aktivität in die Zellen eingeführt werden kann oder eine endogene Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokator Aktivität unterdrückt werden kann. Gegenstand der Erfindung sind insbesondere die DNA-Sequenzen aus Pisum sativum (Erbse) mit der folgenden Nukleotidabfolge (Seq-ID No.: 1):

und eine DNA-Sequenz aus Solanum tuberosum (Kartoffel) mit der folgenden Nukleotidabfolge (Seq-ID No.: 3):

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind DNA-Sequenzen, die mit den unter Seq.-ID No. 1-3 genannten DNA-Sequenzen oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, hybridisieren und für ein plastidäres Protein kodieren, das die biologische Aktivität eines Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokators besitzt.

Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, zur Transformation pro- und eukaryontischer Zellen. Um die Expression des Glukose-6- phosphat-Phosphat-Translokators in transformierten Zellen zu gewährleisten, kann die erfindungsgemäße DNA-Sequenz in Plasmide eingebracht werden und dabei mit Steuerelementen für die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen kombiniert werden (siehe Ausführungsbeispiele 3, 5). Derartige Steuerelemente sind einerseits Transkriptions-Promotoren und andererseits Transkriptions-Terminatoren. Mit den Plasmiden können eukaryontische Zellen transformiert werden mit dem Ziel der Expression einer übersetzbaren Botenribonukleinsäure (RNA), die die Synthese eines plastidären Glukose-6- phosphat-Phosphat-Translokators in den transformierten Zellen erlaubt, oder mit dem Ziel der Expression einer nicht übersetzbaren, invers orientierten ("anti-sense"), Botenribonukleinsäure, die die Synthese des endogenen Glukose-6-phosphat- Phosphat-Translokators verhindert. Zu diesem Zweck könnten auch kürzere Fragmente der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz oder DNA-Sequenzen mit einem relativ hohen Grad an Homologie (mehr als ca. 65% Homologie) verwendet werden. Eine Repression kann auch über die Überexpression der homologen DNA erreicht werden (Ko-Supression). Ebenso kann die Expression von endogenen Glukose-6- phosphat-Phosphat-Translokatoren durch die Expression eines für diesen Zweck konstruierten Ribozyms unter Verwendung der erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen inhibiert werden; ferner über eine Insertionsmutagenese - oder, sobald die entsprechende Technologie zur Verfügung steht, durch eine homologe Rekombination ("knock-out"-Mutante). Durch eine gewebespezifische kontrollierte Expression einer RNA entsprechend der erfindungsgemäßen Sequenz eines pflanzlichen Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokators in den "Source"- bzw. "Sink"-Geweben ist eine Veränderung des pflanzlichen Kohlenstoff- und Stickstoffmetabolismus möglich, deren wirtschaftliche Bedeutung darin liegt, daß eine Verbesserung der Weiterleitung von Hexosephosphat in die Plastiden zu einer Veränderung des Verhältnisses von Kohlenhydraten (Zucker, Stärke, org. Säuren) und Stickstoffverbindungen (Aminosäuren, Proteine, evtl. Alkaloide) stattfindet. Es können somit Pflanzen erzeugt werden, die einen erhöhten Stärkegehalt aufweisen und/oder - im Fall z. B. der Kartoffel - verminderte Lagerungsverluste aufweisen.

Diese Modifikation steigert den ernährungsphysiologischen Wert von Pflanzen und damit auch deren wirtschaftlichen Wert. Die jeweiligen Effekte ließen sich möglicherweise noch steigern, falls die gewebespezifische Expression des Glukose-6- phosphat-Phosphat-Translokators im Blatt bzw. in heterotrophen "Sink"-Gewebe mit der weiterer Translokatoren/Enzyme des Kohlenstoff-/Stickstoff-Metabolismus kombiniert würde (Simultane Expression mehrerer Zielproteine wie z. B. bei der Erhöhung/Erniedrigung des Proteingehaltes, der Erhöhung/Erniedrigung des Stärkegehaltes oder der Verminderung von Lagerungsverlusten der Kartoffel).

Weiterhin ermöglicht die heterologe Expression der beschriebenen Sequenz in Spalthefen (Ausführungsbeispiele 3, 4 und Loddenkötter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2155-2159) Struktur-Funktionsstudien des Glukose-6-phosphat- Phosphat-Translokators, die letztendlich zur Entwicklung eines spezifischen Hemmstoffs für dieses Protein führen könnte; insbesondere ist hier an die Herbizidentwicklung zu denken, da die Hemmung eines Proteins mit Schlüsselfunktion im Stoffwechselgeschehen zwangsweise letal für die Pflanze wäre. Ferner sind diese Struktur-Funktionsstudien Grundlage für eine gerichtete Mutagenese der Substratbindungsstelle des Translokators, um die Substratspezifität des Transporters gezielt zu verändern.

Es sind bereits Verfahren zur genetischen Modifikation dikotyler und monokotyler Pflanzen bekannt (Gasser und Fraley, 1989, Science 244: 1293-1299; Potrykus, 1991, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 205-225). Zur Expression von kodierenden Sequenzen in Pflanzen müssen diese mit transkriptionell regulatorischen Elementen verknüpft werden. Solche Elemente, Promotoren genannt, sind bekannt (u. a. Koster-Töpfer et al., 1989, Mol. Gen. Genet. 219: 390-396). Ferner müssen die Kodierregionen mit einem Transkriptionsterminations-Signal versehen werden, damit sie korrekt transkribiert werden können. Solche Elemente sind ebenfalls beschrieben (Gielen et al., 1989, EMBO J. 8, 23-29). Der transkriptionelle Startbereich kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar. Die DNA-Sequenz der Transkriptionsstart- und Terminations- Regionen kann synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten. Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen sind eine große Anzahl Klonierungsvektoren verfügbar, die ein Replikationssignal für E. coli und einen Marker beinhalten, der eine Selektion der transformierten Zellen erlaubt. Beispiele für Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13 mp-Serien, pACYC 184 usw. Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanze können weitere DNA- Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanze das Ti oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti und Ri-Plasmid T-DNA als Flankenbereich den einzuführenden Genen angefügt werden. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend beschrieben (Hoekema, in: The Binary Plant Vector System, Offset­ drukkerij Kanters B-V. Ablasserdam, 1985, Chapter V; Fraley et al., Critic. Rev. Plant Sci. 4: 1-46; An et al., 1985, EMBO J. 4: 277-287). Ist die eingeführte DNA einmal im Genom integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen einen Resistenz gegenüber Bioziden (wie Basta) oder Antibiotika (wie Kanamycin, Bleomycin oder Hygromycin) verleiht. Der individuell eingeführte Marker wird daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten.

Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen neben der Transformation mit Hilfe von Agrobakterien viele andere Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation von Protoplasten, die Mikroinjektion von DNA, die Elektroporation sowie ballistische Methoden. Aus dem transformierten Pflanzenmaterial können dann in einem geeigneten Selektionsmedium ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann mit gängigen molekularbiologischen Methoden auf die Anwesenheit der eingeführten DNA getestet werden. Diese Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen (oder Derivate oder Teile dieser Sequenz) können auch in Plasmide eingebracht werden, die eine Mutagenese oder eine Sequenzveränderung durch Rekombination von DNA-Sequenzen in prokaryontischen oder eukaryontischen Systemen erlauben. Dadurch kann die Spezifität des Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokators verändert werden z. B. in Richtung einer herabgesetzten Affinität für 3-Phosphoglycerat, dem Ausgangssubstrat für die Biosynthese von Aminosäuren.

Ebenso könnte eine Unempfindlichkeit des Glukose-6-phosphat-Phosphat- Translokators für spezifische Herbizide erreicht werden. Mit Hilfe von Standardverfahren (Sambrock et al., 1989, Molecular cloning: A laboratory manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) können Basenaustausche und/oder Basendeletionen vorgenommen und/oder synthetische oder natürliche Sequenzen hinzugefügt werden. Für die Verbindung der DNA-Fragmente untereinander können Adapter oder linker angesetzt werden. Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die nicht benötigte DNA entfernen, eingesetzt werden. Dort wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z. B. Transitionen oder Transversionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primerrepair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Als Analysenmethode werden im allgemeinen eine Sequenzanalyse, eine Restriktionsanalyse und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden wie z. B. die Expression des modifizierten Proteins in Hefen und die Messung der modifizierten Transporteigenschaften in artifiziellen Liposomen (siehe Ausführungsbeispiel 4 und Loddenkötter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2155-2159;. sowie Fischer et al., 1994, The Plant J. 5: 215-226) oder die Messung der modifizierten Transporteigenschaften am in transgenen Pflanzen exprimierten Protein mit Hilfe einer kürzlich von uns zu diesem Zweck entwickelten Methode (Flügge und Weber, 1994, Planta, 194: 181-185) angewandt.

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen (oder Teile oder Derivate dieser Sequenzen) können dazu genutzt werden, nach Standardverfahren (insbesondere Hybridisierungs-Durchmusterung von cDNA-Bibliotheken mit niedriger Stringenz unter Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder Teilen der DNA- Sequenzen als Sonde oder die Erstellung von Sonden für stringente und niedrig stringente Durchmusterungs-Strategien durch Ableitung von degenerierten und/oder nicht degenerierten Primern aus der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz für PCR-Experimente mit DNA oder cDNA aus anderen Pflanzen) aus dem Genom von Pflanzen ähnliche Sequenzen zu isolieren, die für Proteine kodieren, die ebenfalls Hexosephosphat, anorganisches Phosphat und Triosephosphat bzw. 3- Phosphoglycerat und ähnliche C3-Körper, die am Kohlenstoff-Atom 3 eine Phosphatgruppe tragen, transportieren. Insbesondere können die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen genutzt werden, die DNA-Sequenz des nahe verwandten Glukose-1-phosphat-Phosphat-Translokators der Plastidenhüllmembran zu identifizieren und zu isolieren (subtraktive Durchmusterungsverfahren einer pflanzlichen cDNA-Bibliothek unter verschiedenen Stringenzbedingungen und mit verschiedenen Bereichen der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen als Sonde).

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen (Seq.-ID No. 1 und 2) enthalten im übersetzten Protein Bereiche, die in der Lage sind, das im Cytoplasma an Ribosomen synthetisierte Protein spezifisch zu Plastiden zu dirigieren und das Auftreten des Proteins in anderen Membransystemen der Zelle zu verhindern. Der Proteinbereich, der das durch die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen kodierte Protein zu Plastiden dirigiert, liegt innerhalb der ersten 70 Aminosäuren des Proteins, ist für die Transportfunktion des Proteins nicht erforderlich und wird nach erfolgreicher Insertion des Proteins in die Plastidenhüllmembran entfernt. Durch Austausch dieser "Plastid-targeting"-Sequenz gegen eine der bekannten "Targeting"-Sequenzen z. B. für Mitochondrien ließe sich das Translokator-Protein in ein anderes Membransystem eukaryontischer Zellen dirigieren und könnte dort möglicherweise die Transporteigenschaften über die respektive Membran verändern. Ebenso könnten die "Plastid-targeting"-Sequenz des Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokators oder endogene Bereiche des reifen Proteins dazu genutzt werden, fremde Proteine (z. B. bakterielle Transportproteine oder Transporter aus Hefen) in die Plastiden bzw. in die Plastidenhüllmembran pflanzlicher Zellen zu dirigieren.

Zum besseren Verständnis der dieser Erfindung zugrundeliegenden Ausführungs­ beispiele werden die wichtigsten eingesetzten Verfahren im folgenden erläutert.

1. Klonierungsverfahren

Zur Klonierung wurden der Phage Lambda gt10 sowie das Phagemid pBluescript II KS (pBSC) (Short et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16: 7583-7600) verwendet.

Für die Transformation von Hefen wurde der Vektor pEVP11 (Russel und Nurse, 1986, Cell 45: 145-153) verwendet.

Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, 1990, Plant Sci. 66: 221-230) kloniert.

2. Bakterien- und Hefestämme

Für das pBluescriptKS (pBSC) Phagemid sowie für pEVP11- und pBinAR-Konstrukte wurde der E. coli Stamm DH5α (Hanahan et al., 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) verwendet.

Die Transformation der pBinAR-Konstrukte in Tabakpflanzen wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes C58C1, pGV2260 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res. 12: 8711-8720) durchgeführt.

3. Transformation von Agrobacterium tumefaciens

Der Transfer der DNA in die Agrobakterien erfolgte durch direkte Transformation nach der Methode von Höfgen und Willmitzer (1988, Nucl. Acids Res. 16: 9877). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birn­ boim und Doly (1979, Nucl. Acids Res. 7: 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelektrophoretisch auf Richtigkeit und Orientierung analysiert.

4. Pflanzentransformation

Pro Transformation wurden 15 kleine mit Schmirgelpapier und Skalpell verwundete Blätter einer Tabak-Sterilkultur in 10 ml MS-Medium mit 2% Saccharose gelegt, welches 100 µl einer unter strenger Selektion gewachsenen, transformierten Agro­ bacterium tumefaciens-Übernachtkultur enthielt. Nach 15 minütigem leichtem Schütteln wurden die Blätter auf MS-Medium mit 1,6% Glukose, 2 mg/l Zeatinribose, 0,02 mg/l Naphthylessigsäure, 0,02 mg Giberellinsäure, 500 mg/l Betabactyl®, 15 mg/l Hygromycin und 0,8% Bacto-Agar ausgelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3.000 Lux Beleuchtungsstärke wurde die Betabactylkonzentration im Medium um die Hälfte reduziert.

Hinterlegungen

Am 04.07.1997 bzw. am 28.07.1997 wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, folgende Plasmide/Phagemide in Form von E. coli Stämmen, enthaltend diese Plasmide/Phagemide, hinterlegt:

Ausführungsbeispiel 1 Isolation des Glukese-6-phosphat-Phosphat-Translokators, Gewinnung von Peptidfragmenten dieses Translokators und Erstellung von Sonden für die Hybridisationsdurchmusterung von cDNA Bibliotheken

Der Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokator wurde, ausgehend von einer Mais- Endosperm-Membranfraktion, über eine Chromatographie an Hitrap Q Sepharose und anschließend an Heparin-Sepharose CL-6B gereinigt und über eine funktionelle Rekonstitution der Proteinfraktionen in künstlichen Membranvesikeln identifiziert. Es folgte die Darstellung des Proteins in präparativen SDS-Polyacrylamidgelen (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-685). Nach Detektion des Proteins durch Anfärbung mit Coomassie-Briffiant Blue R-250 wurde die entsprechende Proteinbande aus dem Gel ausgeschnitten und in der Gelmatrix mit der Endoprotease Lys-C gespalten (Fresco, 1979, Anal. Biochem. 97: 382-386). Die resultierenden Peptide wurden aus dem Gel eluiert und mittels HPLC aufgetrennt (Eckerskorn and Lottspeich, 1989, Chromatographia, 28: 92-94). Die Aminosäuresequenz der gereinigten Peptidfraktionen wurde durch automatisierten Edman-Abbau in der Gasphase bestimmt (Eckerskorn et al., 1988, Eur. J. Biochem. 176: 509-519). Aus der Aminosäuresequenz von einem der beiden Peptide (Peptid 1) wurden zwei degenerierte Oligonukleotidsequenzen, kodierend diese Aminosäuresequenz, abgeleitet und das betreffende Oligonukleotid durch in vitro DNA-Synthese hergestellt.

Ausführungsbeispiel 2 Klonierung des Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokators aus Mais-Endosperm und Erbsen-Wurzeln

Aus Maiskörnern, ca. 10 Tage nach der Bestäubung geerntet, wurde das Endosperm präpariert. Hieraus wurde poly-A⁺-RNA isoliert und ausgehend hiervon eine cDNA- Bibliothek im Vektor Lambda gt10 angelegt (Huynh et al. Construction and screening cDNA libraries in γgt10 and γgt11. In: DNA Cloning (Vol. I), 1985, Glover, D.M. (Hrsg.) IRL Press, Oxford).

Zum anderen wurde die isolierte RNA für eine RT-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (RACE; Schaefer, B.C. (1995) Anal. Biochem. 227, 255-273) eingesetzt. Als Primer für die erste RACE Reaktion wurden das erste spezifische Oligonukleotid in Kombination mit einen "anchor(dT)15" Primer benutzt. Die erhaltenen Produkte wurden einer zweiten PCR unterzogen, wobei hier die jeweiligen "nested" Primer eingesetzt wurden. Es konnte ein spezifisches PCR-Fragment (1200 bp) erhalten werden.

Ca. 300.000 Klone der cDNA-Bibliothek wurden mit diesem PCR-Fragment sondiert (siehe Ausführungsbeispiel 1). Positiv reagierende Klone wurden nach Standardverfahren gereinigt und nach Präparation der amplifizierten Phagen-DNA aus den gereinigten Plaques wurde durch EcoRI-Restriktionsverdau die Insertion kodierend für den Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokator erhalten und durch Southern-Blot Analyse, mit dem oben erwähnten PCR-Fragment als Sonde, verifiziert. Nach Umklonierung der Insertionen der Phagen-DNA in das Phagemid pBluescript (pBSC) wurden die Klone durch Bestimmung der DNA-Sequenz analysiert (Dideoxymethode: Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-­ 5467) und aus dieser DNA-Sequenz die Primärstruktur des Glukose-6-phosphat- Phosphat-Translokators abgeleitet (Klon pBSC-MW13). Die Sequenz der beiden Peptide konnte in der Gesamtsequenz des Translokators wiedergefunden werden.

Die cDNA aus Mais wurde anschließend benutzt, um die entsprechenden cDNA Klone aus nicht-grünen Geweben der dikotylen Pflanze Pisum sativum (Erbse) und Solanum tuberosum (Kartoffel) zu isolieren.

Ausführungsbeispiel 3 Expression des Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokators aus Erbse in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe

Für die Expression des Glukose-6phosphat-Phosphat-Translokators in Hefe wurde zuerst mittels PCR mit einem Oligonukleotid, welches an der Schnittstelle von Präsequenz und reifem Protein liegt (plus zusätzlicher BamHI-Schnittstelle), das entsprechende Fragment hergestellt. Dieses wurde dann BamHI-HindIII geschnitten und anschließend in den entsprechend geschnittenen Vektor pQE30 (Diagen, Hilden) kloniert. Der Vektor pQE-EW4, enthaltend die Insertion kodierend für den Glukose- 6-phosphat-Phosphat-Translokator, wurde dann mit EcoRI linearisiert und die resultierenden Überhänge mit Hilfe des Enzyms T4-DNA Polymerase geglättet. Das so erhaltene Fragment wurde in den Hefe-Expressionsvektor pEVP11, der mit BamHI linearisiert und dessen Enden mit T4-DNA Polymerase geglättet wurden, eingesetzt und nach Amplifikation des Konstrukts in E. coli in durch LiCl/PEG kompetent gemachte (Ito et al., 1983, J. Bact. 153: 163-168) Leucinsynthese-defiziente S. pombe Zellen transformiert. Transformanten wurden durch Selektion auf Minimalmedium ohne Leucin selektiert, da das pEVP11-EW4 Konstrukt den Hefezellen die Fähigkeit zum Wachstum auf leucinfreiem Medium verleiht.

Ausführungsbeispiel 4 Messung der Glukose-6-phosphat-Transportaktivität in rekombinaten Hefelinien

Mit dem pEVP11-EW4 Plasmid transformierte Hefezellen wurden in Minimalmedium bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm von 1.0 angezogen und durch Zentrifugation bei 3.000 × g für 5 min geerntet. Anschließend wurden die Zellen durch kräftiges Schütteln mit 1/2 vol (bezogen auf die Zellen) Glasperlen aufgebrochen und Glasperlen und Zellbruchstücke durch Zentrifugation (600 g für 1 min) abgetrennt. Der Überstand wurde auf eine Konzentration von 3% (Gewicht/Volumen) Dodecylmaltosid eingestellt und zur Isolierung und anschließenden Rekonstitution des Translokators in künstliche Membranen (Liposomen) benutzt (Fischer et al., 1997, Plant Cell, 9: 453-462). Die resultierenden Proteoliposomen wurden anschließend in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Liposomen wurden zuvor durch Beschallen von Sojabohnen-Phospholipid (20 mg/ml) für 10 min bei 4°C in Gegenwart von 200 mM Tricine-NaOH (pH 7,6), 40 mM Phosphat (bzw. 3-Phosphoglycerat, Phosphoenolpyruvat, Glukose-6- phosphat) und 60 mM Kaliumglukonat hergestellt. Nach dem Auftauen der Proteoliposomen und erneutem Beschallen der Suspension mit 10 Pulsen à 1 s wurden die Proteoliposomen vom umgebendem Medium durch Größenausschlußchromatographie auf Sephadex G-25, das zuvor mit 10 mM Tricine- NaOH (pH 7,6), 100 mM Natriumglukonat und 50 mM Kaliumglukonat equilibriert worden war, abgetrennt. Die eluierten Proteoliposomen wurden für die Messung der Transportaktivität eingesetzt. Der Transport wurde durch Abtrennung der Liposomen über eine Dowex AG1X8 Säule nach verschiedenen Zeiten beendet (Flügge und Weber, 1994, Planta 194: 181-185).

Die Transportaktivität der Transformante (SP-EW4) wurde mit der von Transformanten verglichen, die lediglich mit dem Vektor pEVP11 ohne die EW4- Insertion transformiert worden waren. Es zeigte sich, daß die Transportaktivität in der pEVP-EW4 Transformante 1-2 Größenordnungen höher war als in der Kontroll- Transformante.

Es konnte dann gezeigt werden (siehe Tabelle 1), daß das rekombinante Translokatorprotein die ihren zugeschriebene Substrattransport-Spezifität zeigt: Der Translokator transportiert - im Austausch mit anorganischem Phosphat - hauptsächlich die Substrate Glukose-6-phosphat und Triosephosphat. 3- Phosphoglycerat wird ebenfalls als Substrat akzeptiert, allerdings mit geringerer Effizienz. Phosphoenolpyruvat wird nur sehr schlecht transportiert, für Glukose-1- phosphat und Fruktose-6-phosphat konnte keine Transportaktivität beobachtet werden. Gemäß der strengen Gegentauschfunktion des Translokators ist eine Transportaktivität nur in Gegenwart eines austauschbaren Substrates zu beobachten. Werden die Liposomen nur mit Kaliumglukonat vorbeladen, ist keine oder nur eine sehr geringe Transportaktivität nachzuweisen.

Ausführungsbeispiel 5 Transformation von Pflanzen mit einer Konstruktion zur Überexpression der Kodierregion des Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokators

Aus dem Phagemid pBluescript-EW4 (pBSC-EW4), der als Insertion die cDNA für den Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokator aus Erbse enthielt (siehe Ausführungsbeispiel 2) wurde die Insertion durch Restriktionsverdau mit SalI und SmaI isoliert und in den Vektor pBinAR (Höfgen and Willmitzer, 1990, Plant Sci. 66: 221-230) der zuvor mit den Enzymen SmaI und SalI geschnitten worden war, gerichtet kloniert. Nach Amplifikation des resultierenden Konstrukts pBinAR-EW4 in E. coli wurden das Konstrukt in Agrobakterien transformiert und diese dann zur Infektion von Blattsegmenten von Tabak und Kartoffel eingesetzt.

Die erhaltenen Transformanten wurden mit Hilfe von Southern-Blot Analysen auf die Präsenz des intakten, nicht rearrangierten chimären Gens untersucht. Mit Hilfe der "Gesamtblatt-Rekonstitutionsmethode" (Flügge und Weber, 1994, Planta 194: 181-­ 185) wurde die Hexosephosphat-Transportaktivität im Vergleich zu Kontrolltransformanten (transformiert mit Vektor pBinAR ohne Insertion) untersucht, ebenso das C/N-Verhältnis, Photosyntheserate, Stärkegehalt und Wachstum.

Claims (23)

1. DNA-Sequenzen, die die Kodierregion eines Glukose-6-phosphat-Phosphat- Translokators enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß diese DNA-Sequenzen die folgenden Nukleotidabfolgen aufweisen (Seq-ID No.: 1 bis 3):

2. DNA-Sequenzen, die mit den DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1, oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, hybridisieren und für ein plastidäres Protein kodieren, das die biologische Aktivität eines Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokators besitzt.

3. Plasmide enthaltend DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2, oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind.

4. Plasmid pEVP11-EW4 hinterlegt unter der DSM-Nummer DSM 11640 als E. coli Stamm DH5α pEVP11-EW4 enthaltend dieses Plasmid.

5. Plasmid pBinAR-EW4 hinterlegt unter der DSM-Nummer DSM 11639 als E. coli Stamm DH5α pBinAR-EW4 enthaltend dieses Plasmid.

6. Phagemid pBSC-MW13 hinterlegt unter der DSM-Nummer DSM 11665 als E. coli Stamm DH5α pBSC-MW13 enthaltend dieses Phagemid.

7. Phagemid pBSC-K18.2 hinterlegt unter der DSM-Nummer DSM 11666 als E. coli Stamm DHSα pBSC-K18.2 enthaltend dieses Phagemid.

8. Bakterien, enthaltend DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2, oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind.

9. Hefen, enthaltend DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2, oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind.

10. Bakterien enthaltend Plasmide/Phagemide gemäß den Ansprüchen 3 bis 8.

11. Hefen enthaltend Plasmide gemäß den Ansprüchen 3 und 4.

12. Pflanzenzellen enthaltend Plasmide gemäß den Ansprüchen 3 und 5.

13. Transformierte Pflanzenzellen und aus diesen regenerierte transgene Pflanzen enthaltend DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei diese Sequenzen als Bestandteil eines rekombinaten DNA-Moleküls in die Pflanzenzellen eingeführt wurde.

14. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2, oder Teilen oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, zur Einführung in pro- oder eukaryontische Zellen, wobei diese Sequenzen gegebenenfalls mit Steuerelementen, die die Transkription und Translation in den Zellen gewährleisten, verknüpft sind und zur Expression einer translatierbaren mRNA, die die Synthese eines Glukose-6-phosphat-Phosphat- Translokators bewirkt, führen.

15. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2, oder Teilen oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, zur Identifizierung von Insertionsmutanten, zur homologen Rekombination oder zur Expression einer nicht translatierbaren RNA, die mittels eines "anti-sense"-Effektes, eine Kosupression oder einer Ribozymaktivität die Synthese eines oder mehrerer endogener Glukose-6-phosphat-Translokatoren in den Zellen verhindert.

16. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2, oder Teilen oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, zur Veränderung des Kohlenstoff-/Stickstoff-Verhältnisses in Blättern bzw. in heterotrophen Geweben insbesondere zur Erhöhung bzw. Erniedrigung des Stärkegehaltes und zur Erhöhung bzw. Erniedrigung des Proteingehaltes.

17. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2, oder Teilen oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, zur Erniedrigung der Bildung von Zuckern während der Stärkemobilisierung.

18. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2, oder Teilen oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, zur Herstellung von DNA-Sequenzen, die für einen pflanzlichen plastidären Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokator mit einer veränderten Spezifität, insbesondere für Glukose-1-phosphat und 2-Phosphoglycerat, kodieren.

19. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2, oder Teilen oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, zur Isolierung von DNA-Sequenzen, die für ein Polypeptid kodieren, das die biologische Aktivität eines Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokators besitzt.

20. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2, oder Teilen davon, die als "targeting"-Sequenzen dienen, um mit Hilfe dieser Sequenzen prokaryontische oder eukaryontische Proteine, insbesondere Enzyme oder Proteine, die den aktiven oder passiven Transport von Metaboliten über Membranen katalysieren, in die Plastidenhüllmembran, in das Plastidenstroma oder in die Thylakoide zu dirigieren.

21. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2, oder Teilen oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, wobei diese Sequenzen eine kodierende Region enthalten, die für ein reifes Protein mit der biologischen Aktivität eines Glukose-6-phosphat-Phosphat- Translokators kodieren, zur Kombination mit "targeting"-Sequenzen für andere Zellkompartimente oder zelluläre Membransysteme, wodurch das reife Protein in andere Kompartimente oder Membransysteme dirigiert wird.

22. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2, oder Teilen oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, zur Identifizierung von Substanzen, die eine inhibierende Wirkung auf den Transport von Hexosephosphaten, Phosphat, 3-Phosphoglycerat, Triosephosphaten und anderen C3- und C6-Körpern, die am C-Atom 3 bzw. am C- Atom 6 eine Phosphatgruppe tragen, über die innere Plastidenhüllmembran haben.

23. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2, oder Teilen oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, zur Isolierung entsprechender genomischer Klone, insbesondere die Nutzung der entsprechenden Promotorbereiche oder von Promotorteilbereichen zur gewebespezifischen Expression von Genen in heterotrophen Geweben.