DE19732926C2 - DNA-Sequenzen, kodierend einen Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokator, sowie Plasmide, Bakterien, Hefen und Pflanzen, enthaltend diesen Transporter - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen aus Pisum sativum (Erbse), Zea
mays (Mais) und Solanum tuberosum (Kartoffel), die die Kodierregion eines Glukose-6-
phosphat-Phosphat-Translokators enthält, deren Einführung in ein pflanzliches
Genom die Bildung und Weiterleitung von Kohlenstoffgrundgerüsten für Synthese
von Stärke und Aminosäuren/Proteinen und die Weiterleitung des assimilierten
Kohlenstoffs in transgenen Pflanzen verändert, Plasmide, Hefen und Bakterien
enthaltend diese DNA-Sequenzen, sowie transgene Pflanzen, bei denen durch
Einführung der DNA-Sequenzen Veränderungen der Aktivität des Glukose-6-
phosphat-Phosphat-Translokators und somit Änderungen im Stickstoff- und
Kohlenstoffstoffwechsel hervorgerufen werden. Weiterhin betrifft die Erfindung die
Nutzung der beschriebenen Sequenzen des Glukose-6-phosphat-Phosphat-
Translokators zur Identifizierung verwandter Translokatoren aus anderen dikotylen
und monokotylen Pflanzen durch Hybridisierung mit niedriger Stringenz oder
durch PCR-Techniken, sowie die Nutzung des Glukose-6-phosphat-Phosphat-
Translokators als Ziel ("Target") für Herbizide.
Die pflanzliche Photosynthese ist der größte Produktionsprozeß der Erde und der
einzige Prozeß, der den Gesamtvorrat an nutzbarer Energie auf unserem Planeten
vergrößert: mehr als 10 Milliarden Tonnen Kohlenstoff werden jährlich in
Kohlenhydrate oder andere organische Materie als Energie und letztlich als unsere
Nahrungsgrundlage gespeichert. Diese Energiemenge entspricht etwa 5% der aller
bekannten fossilen Energiequellen. Die Photosynthese ist damit die Grundlage allen
Lebens. Während dieses in den grünen Blättern stattfindenden Prozesses werden aus
dem atmosphärischen CO2, anorganischem Phosphat und Wasser mit Hilfe der im
Zuge der Lichtreaktion gebildeten Produkte, Adenosintriphosphat (ATP) und
Reduktionsäquivalente (NADPH2), ein Kohlenstoffgerüst mit 3 C-Atomen,
Triosephosphate, synthetisiert. Dieses Primärprodukt der CO2-Fixierung wird über
einen speziellen Translokator (Triosephosphat-Phosphat-Translokator; Flügge et al.,
1989, EMBO J. 8: 39-46; Flügge et al., 1991, Nature 353: 364-367) aus dem
Chloroplasten austransportiert und im Cytoplasma in einer Reihe von
aufeinanderfolgenden Reaktionen in Saccharose (Rohrzucker) überführt. Während
der Biosynthese von Saccharose wird das anorganische Phosphat wieder freigesetzt
und über den oben erwähnten Triosephosphat-Phosphat-Translokator in die
Chloroplasten zurücktransportiert. Hier wird aus dem Phosphat neuerlich ATP
gebildet, eine Reaktion, die von der lichtgetriebenen ATP-Synthase katalysiert wird.
Es ist ersichtlich, daß der von dem Triosephosphat-Phosphat-Translokator
katalysierte Export des fixierten Kohlenstoffs im Austausch mit anorganischem
Phosphat in essentieller Weise die beiden Kompartimente Chloroplast und
Cytoplasma verbindet. Tatsächlich hat eine Hemmung des Translokators erhebliche
Auswirkungen auf die Assimilat-Produktion (siehe unten).
Der beschriebene und in den Blättern (dem "Source"-Gewebe) stattfindende Prozeß
der Photoassimilat-Produktion dient in hohem Maße der Versorgung von nicht-
grünen Organen (dem "Sink"-Gewebe), wie Wurzel, Knolle und Frucht, also auch
den erntebaren Teilen der Pflanzen. In Kulturpflanzen wie Kartoffeln, Zuckerrüben
und Getreiden erfolgt der Transport von Kohlenhydraten von den "Source"- zu den
"Sink"-Geweben über die Siebröhren (das Phloem) ausschließlich in Form von
Saccharose. Die Saccharose wird anschließend aus dem Phloem in die Zellen des
"Sink"-Gewebes transportiert (Phloem-Entladung). Der Transport kann entweder
direkt d. h. symplastisch über zwischen dem Phloem und dem "Sink"-Gewebe
bestehende Verbindungen (Plasmodesmen) erfolgen oder aber apoplastisch, was
eine Entladung der Saccharose in die Zellwand und ihren erneuten Import in die
Zielzellen beinhaltet. Alternativ kann die Saccharose im Apoplasten von einer
zellwandspezifischen Invertase in Hexosen gespalten werden, die anschließend in
die Zellen des "Sink"-Gewebes transportiert werden. Erfolgt der Eintransport in
Form von Saccharose, wird diese im Cytoplasma der Zellen des "Sink"-Gewebes in
Hexosen gespalten (Glukose und Fruktose). Dies geschieht entweder über Invertasen
oder über die Saccharose-Synthase. Alle Spaltprodukte der Saccharose werden
letztendlich wieder in Hexosephosphate (Glukose-6-phosphat, Glukose-1-phosphat)
überführt.
In den meisten Pflanzen dient Glukose-6-phosphat dann als Substrat für die
Stärkesynthese, deren gesamte Reaktionsfolge im Innenraum (Stroma) der
Amyloplasten des "Sink"-Gewebes lokalisiert ist. Diese Organellen sind von zwei
Lipiddoppelschichtmembranen umschlossen, von denen die äußere Membran auf
Grund der Anwesenheit von porenbildenden Proteinen (Porinen) unspezifisch
permeabel ist für kleinere Moleküle. Ein solches Porin der äußeren Amyloplasten-
Hüllmembran konnte kürzlich von uns identifiziert und die Abfolge seiner das
Protein zusammensetzenden Aminosäurebausteine aufgeklärt werden (Fischer et al.,
1994, J. Biol. Chem., 269: 25754-25760). Die innere Hüllmembran ist dagegen die
eigentliche Permeabilitätsgrenze zwischen dem Cytoplasma und den Organellen und
ist, wie a priori jede Lipid-Doppelschicht, prinzipiell impermeabel für größere
geladene Moleküle wie z. B. Hexosephosphat.
Diese prinzipielle Undurchlässigkeit der inneren Amyloplasten-Hüllmembran für
größere hydrophile Moleküle wird durch die Anwesenheit spezifischer
Transportsysteme überbrückt. So müssen auch Hexosephosphate als
Ausgangsverbindung für die Biosynthese von Stärke über ein spezifisches
Transportprotein aus dem Cytoplasma in das Stroma der Amyloplasten transportiert
werden. Dieser Transport wird von einem amyloplastidären Hexosephosphat-
Phosphat-Translokator katalysiert, nicht jedoch von dem Triosephosphat-Phosphat-
Translokator oder dem kürzlich von uns beschriebenen Phosphoenolpyruvat-
Phosphat-Translokator (Borchert et al., 1989, FEBS Lett. 253: 183-186; Flügge und
Heldt, 1991, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol. 42: 129-144; Viola et al., 1991,
Planta 183: 202-208; Neuhaus et al., 1993, Biochem. J. 296: 495-501; Fischer et al., 1997,
Plant Cell 9, 453-462). Im Falle des Eintransportes von Glukose-6-phosphat wird
dieses in Glukose-1-phosphat umgesetzt, das dann über die ADP-Glukose-
Pyrophosphorylase (AGPase) in ADP-Glukose, dem Substrat für die Stärke-Synthase,
umgesetzt wird. Neuere Arbeiten haben gezeigt, daß im Endosperm einiger Getreide
(Gerste, Mais) die AGPase auch im Cytosol lokalisiert ist und der Eintransport der
Vorstufen für die Stärkebiosynthese über ADP-Glukose erfolgen kann (Denyer et al.,
1996, Plant Physiol. 112: 779-785).
Wie ausgeführt, besitzen die meisten Pflanzen ein Transportsystem für Glukose-6-
phosphat für die Versorgung der nicht-grünen Plastiden. Der Eintransport in die
Amyloplasten erfolgt über einen Gegentausch-Mechanismus, entweder im
Austausch mit anorganischem Phosphat, das im Zuge der Stärkesynthese freigesetzt
wird oder aber im Austausch mit Triosephosphat, das über den oxidativen
Pentosephosphat-Weg gebildet wird. Auch für diesen Reaktionsweg dienen
Hexosephosphate als Ausgangssubstrat. Der oxidative Pentosephosphat-Weg stellt
in den Plastiden Reduktionsäquivalente bereit, hauptsächlich für die dort
stattfindende Reduktion des aus dem Nitrat gebildeten Nitrits zum Ammonium, das
seinerseits in die Biosynthese von Aminosäuren/Proteinen abgeführt wird (Nitrat-
Assimilation). Es wird ersichtlich, daß der Hexosephosphat-Phosphat-Translokator
das entscheidende Verbindungsglied ist zwischen dem Cytosol der Zellen des nicht-
grünen Gewebes und den Plastiden als Kompartiment der Stärkesynthese und des
oxidativen Pentosephosphat-Weges. Es sei erwähnt, daß die Chloroplasten der
Schließzellen, ebenso wie die Plastiden der nicht-grünen Gewebe, auf die
Versorgung mit Glukose-6-phosphat als Vorstufe für die Stärkesynthese angewiesen
sind (Overlach et al., 1993, Plant Physiol. 101: 1201-1207). Das aus dem Stärkeabbau
resultierende Malat dient dann als hauptsächliches Gegenion für Kalium, dessen Ein-
und Ausstrom in die bzw. aus den Schließzellen die Schließbewegungen auslöst.
Wie aus den Ausführungen ersichtlich wird, sind Transporter - wie der
chloroplastidäre Triosephosphat-Phosphat-Translokator, der den Austransport des
fixierten Kohlenstoffs aus dem Chloroplasten katalysiert, der Saccharose-
Translokator, über den die Siebröhren mit der Transportform des Photoassimilates
Saccharose beladen werden und der Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokator der
Amyloplasten - in die Allokation des Photoassimilates von den "Source"- zu den
"Sink"-Organen an entscheidender Stelle eingebunden. Änderungen der Aktivität
eines spezifischen Membran-Transporters können große Auswirkungen auf die
Stoffwechselleistungen der Pflanzen haben. So konnte vor kurzem gezeigt werden,
daß die Effektivität der photosynthetischen Kohlenstoffreduktion (Lichtreaktion und
Calvin-Zyklus) ganz wesentlich durch die Aktivität des chloroplastidären
Triosephosphat-Phosphat-Translokators beeinflußt werden kann. Die Hemmung
dieses Transporters in planta über die Expression einer entsprechenden "anti-sense"
mRNA führt zu einem verminderten Export des primären Photoassimilates
(Triosephosphat, 3-Phosphoglycerat), das unter diesen Umständen innerhalb des
Chloroplasten abgeleitet wird in die Biosynthese von Stärke, die sich massiv anstaut
(Riesmeier et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6160-6164; Heineke et al., 1994,
Planta 193: 174-180). Dieses Translokatorprotein stellt demzufolge eine Engstelle im
Kohlenstoffstoffwechsel des "Source"-Gewebes dar. Auch die Reduktion der
Saccharose-Transport-Aktivität über eine "anti-sense"-Inhibierung des für den
Transport in die Siebröhren verantwortlichen Saccharose-Transporters (Riesmeier et
al., 1992, EMBO J. 11: 4705-4713) führt zu einem drastischem Phänotyp der Pflanzen:
sie sind wesentlich kleiner, die Blätter sind geschädigt und die Pflanzen bilden, im
Fall der Kartoffeln, kaum noch Knollen aus d. h. die Versorgung der "Sink"-Gewebe
mit Photoassimilaten ist stark reduziert (Riesmeier et al., 1994, EMBO J. 13: 1-7).
Wie ausgeführt, ist der Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokator die zentrale
Verbindungsstelle für die vom "Source"- zum "Sink"-Gewebe transportierten
Photoassimilate zwischen dem Cytosol der Zellen des heterotrophen Gewebes und
den nicht-grünen Plastiden als Ort der Stärkebiosynthese und des oxidativen
Pentosephosphat-Weges.
Gelänge es, diesen Translokator zu klonieren und mit Hilfe der erhaltenen Sequenz
die Aktivität des Translokators in Pflanzen zu verändern, eröffnete dies den Weg zu
Pflanzen mit einem veränderten Kohlenstoff/Stickstoff-Verhältnis. Dies bedeutet,
daß Pflanzen mit einem erhöhten Gehalt an Stärke, und damit einem erhöhten
Gehalt an Trockenmasse, erzeugt werden könnten. Wie Stark et al. (Science 258: 287-
292) 1992 gezeigt haben, konnte der Gehalt an Stärke in Kartoffelknollen über die
Überexpression einer ADP-Glucose-Pyrophosphorylase (AGPase), einem
amyloplastidären Enzym der Stärke-Biosynthese, erhöht werden. Für diese Versuche
wurde ein Enzym aus E. coli eingesetzt, das nicht der metabolischen Kontrolle über
den 3-Phosphoglycerat/Phosphat Quotienten unterliegt. Da die Menge an gebildeter
Stärke sich nicht absolut mit der Aktivitätssteigerung der AGPase korrelieren ließ, ist
anzunehmen, daß hier ein weiterer, vor der Reaktion der AGPase liegender, Schritt
limitierend wird. Zudem wurden diese Versuche an einer Kartoffelsorte
durchgeführt, die als wenig effektiver Stärkeproduzent gilt. Es erscheint möglich,
daß die Verfügbarkeit des Substrats für die AGPase, Hexosephosphate (Glukose-1-
phosphat bzw. Glukose-6-phosphat), den eigentlich limitierenden Schritt darstellt.
Dieses Substrat wird, wie ausgeführt, über Hexosephosphat-Phosphat-
Translokatoren in die Amyloplasten importiert und hier für die Reaktion der
AGPase und die Stärkesynthese zur Verfügung gestellt. Eine zellspezifische
Überexpression des Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokators eröffnet hier den
Weg zu einer Steigerung der Stärkesynthese, und damit des Stärkegehaltes und der
Trockenmasse. Ein solcher Effekt könnte damit selbst in Kartoffelsorten erreicht
werden, die als gute Stärkeproduzenten ausgewiesen sind. Eine Erhöhung des
Stärkegehaltes der Kartoffelknolle wäre sowohl für die stärkeverarbeitende Industrie
als auch für die Nahrungsmittel-Industrie von Bedeutung, da Kartoffeln mit einem
erhöhten Stärkegehalt während ihrer Prozessierung zu Chips, Pommes frites, Gebäck
etc. weniger Fett aufnehmen und daher zu kalorienärmeren Endprodukten führen.
Erfolgreiche Strategien wären mit hoher Wahrscheinlichkeit auch auf die Nutzung
anderer stärkespeichernder Pflanzen wie z. B. Mais, Weizen und Gerste übertragbar.
Gelänge es andererseits, Kartoffeln mit einer verminderten Aktivität des Glukose-6-
phosphat-Phosphat-Translokators zu erzeugen, könnten Lagerungsverluste, die über
das sog. "cold-sweetening" entstehen, vermieden werden. Kartoffeln werden, zur
Vermeidung der Auskeimung, bei tiefen Temperaturen (6-8°C) gelagert. Dies führt
jedoch zu dem unerwünschten Effekt der Akkumulation von löslichen Zuckern, dem
erwähnten "cold-sweetening". Die Bildung reduzierender Zucker ist, auf Grund der
auftretenden Maillard-Reaktion, ein äußerst negativer Parameter während der
weiteren Prozessierung der Kartoffeln wie der Herstellung von Chips etc. Die
Bildung löslicher Zucker - Hydrolyseprodukte der Stärke, die im extraplastidären
Kompartiment akkumulieren - könnte verhindert werden, indem der
Hexosephosphat-Phosphat-Translokator, der auch in den Austransport der aus dem
Stärkeabbau stammenden Produkte eingebunden ist, während der Lagerungsphase
der Kartoffeln ausgeschaltet werden könnte.
Die Adressierung der plastidären Translokatoren zu der inneren Hüllmembran der
Plastiden bedarf einer entsprechenden Präsequenz ("Targeting-Sequenz"), die das
anhängende reife Protein korrekt zu den Plastiden dirigiert (Übersichtsartikel hierzu:
Keegstra et al., 1989, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40: 471-501; Lubben et
al., 1988, Photosynth. Res. 17: 173-194; Flügge, 1990, J. Cell Sci. 96: 351-354). Neben
der für die "Plastiden-Adressierung" nötigen Präsequenz gibt es im reifen Teil (der
Teil des Proteins, der nach der Abspaltung der Präsequenz durch eine spezifische
Protease verbleibt) der Plastidenhüllmembran-Proteine noch weitere Informationen,
die für die spezifische Insertion der Proteine in die Membran verantwortlich sind
und einen Transport der Hüllmembranproteine über die Hüllmembran in das
Plastidenstroma oder, im Fall der Chloroplasten, die Thylakoidmembran verhindern
(Knight and Gray, 1995, Plant Cell 7: 1421-1432 bzw. eigene Untersuchungen: Brink
et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 20808-20815). Eigene Arbeiten zeigten ferner am
Beispiel eines mitochondrialen Carriers, des ADP/ATP-Transporters, daß dieses
Protein nicht oder nur mit einer sehr geringen Effizienz zu Plastiden dirigiert und
dort in die Hüllmembran eingebaut werden kann. Selbst ein Hybridprotein,
bestehend aus einer plastidären Präsequenz (die Information für die Plastiden-
Adressierung enthaltend) und diesem mitochondrialen Carrier, zeigte gegenüber
dem authentischen Protein einen kaum erhöhten Einbau in die Plastiden-
Hüllmembran (Silva-Filho et al., 1997, j. Biol. Chem. 272: 15264-15269;
unveröffentlichte Beobachtungen). Da für eine korrekte Insertion die Protein/Lipid-
Wechselwirkung von Bedeutung ist und sich die plastidäre Hüllmembran in ihrer
Lipidzusammensetzung grundlegend von der anderer Zellorganellen und auch der
Bakterien unterscheidet (Joyard et al., 1991, Eur. J. Biochem. 199: 489-509), ist es sehr
unwahrscheinlich, daß eine, wenn auch geringfügige, Insertion eines heterologen
Proteins, dann auch funktionell ist, d. h., daß ein Transporter aus anderen Systemen
überhaupt in einer seiner Funktion entsprechenden Konformation und Orientierung
in die Plastiden-Hüllmembran eingebaut werden kann.
Somit ist es nach gegenwärtigem Stand der Technik nicht möglich, mit Hilfe
bekannter Plastiden-"Targeting"-Sequenzen z. B. mitochondriale oder
prokaryontische Transporter funktionell in die innere Plastidenhüllmembran zu
integrieren. Beim gegenwärtigen Stand der Technik ist es erfolgversprechender, die
für die Konstruktion der oben geschilderten Pflanzen notwendige DNA-Sequenz
durch Klonierung des authentischen plastidären Hexosephosphat-Phosphat-
Translokators zu erhalten.
Obwohl auch dieses Transportsystem den Gegentransport von Hexosephosphat mit
anorganischen Phosphat katalysiert, ist seine Primärstruktur anzunehmenderweise
sehr unterschiedlich zu der des chloroplastidären Triosephosphat-Phosphat-
Translokators, da letzterer nur in photosynthetisch aktiven Geweben exprimiert wird
und in RNA-Hybridisierungsexperimenten mit dem chloroplastidären
Triosephosphat-Phosphat-Translokator als Sonde keine Signale in nicht-grünen
Geweben erhalten werden konnten (Flügge, 1995, J. Exp. Bot. 46: 1317-1323). Um die
Primärstruktur des amyloplastidären Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokators
zu ermitteln, mußte daher der bei Membranproteinen außerordentlich schwierige
Weg der biochemischen Charakterisierung, Reinigung und Isolation des
Transportproteins beschritten werden. Ausgehend von amyloplastidären
Hüllmembranen aus Mais-Endosperm gelang es, dieses Protein - über
chromatographische Methoden in Verbindung mit der funktionellen Rekonstitution
der erhaltenen Proteinfraktionen in künstliche Membranen zur Messung der
Transportaktivitäten - als eine Komponente der inneren Amyloplasten-
Hüllmembran mit einer molekularen Masse von ca. 31.000 Dalton zu identifizieren.
Der N-Terminus des Translokators erwies sich als chemisch modifiziert und somit
einer N-terminalen Proteinsequenzierung durch automatisierten Edman-Abbau
nicht zugänglich. Daher war es nötig, das Protein durch präparative SDS-
Polyacrylamidgelelektrophorese in ausreichender Menge zu isolieren und mit einer
Protease (Lys-C) enzymatisch zu spalten, um interne Peptidsequenzen zu ermitteln
(siehe Ausführungsbeispiel 1). Es konnten auf diese Weise folgende Peptidsequenzen
erhalten werden: (1) KTQVVPVQSEGAERLK; (2) KVAVSFTHIIK. Es gelang, mittels
der RACE-Methode (rapid amplification of cDNA ends) und unter Nutzung von
(nach dem erhaltenen Peptid 1 modellierten) synthetischen Oligonukleotiden, ein
spezifisches PCR-Fragment zu erhalten. Dies wurde als Sonde für die anschließende
Durchmusterung einer cDNA-Bibliothek (die angelegt wurde ausgehend von
polyA+-mRNA aus Mais-Endosperm) genutzt und es gelang, einen cDNA-Klon zu
isolieren, der die vollständige cDNA (1647 Basenpaare) für den amyloplastidären
Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokators enthielt (siehe Ausführungsbeispiel 2).
Da es sich gezeigt hatte, daß sich Proteine aus Monokotyledonen (wie Mais) nicht
oder nur sehr schlecht in Hefe oder in Dikotyledonen exprimieren lassen (eigene
unveröffentlichte Beobachtungen), wurde die cDNA aus Mais benutzt, um den
analogen cDNA-Klon aus nicht-grünen Geweben der dikotylen Pflanze Pisum
sativum (Erbse, 1609 Basenpaare) zu isolieren und das entsprechende Erbsen-Protein
dann in Hefe zur Bestimmung seiner Transportparameter zu exprimieren (siehe
Ausführungsbeispiele 3 und 4). Ferner konnte ein entsprechender partieller cDNA-
Klon aus der dikotylen Pflanze Solanum tuberosum (Kartoffel, 1449 Basenpaare)
isoliert werden.
Expressionsstudien mit verschiedenen Pflanzengeweben belegten, daß sich die
Transkripte für den Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokator ausschließlich in
heterotrophen, nicht jedoch in photosynthetisch aktiven Geweben nachweisen ließen
(eigene unveröffentlichte Beobachtungen). Der entsprechende Promotor des Gens
besitzt daher eine hohe "Sink"-Gewebespezifität.
Die vorliegende Erfindung stellt nun DNA-Sequenzen zur Verfügung, die aus einem
pflanzlichen Genom stammen und für einen plastidären Glukose-6-phosphat-
Phosphat-Translokator kodieren, wobei die in der Nukleotidabfolge enthaltene
Information bei Einführung und Expression in pflanzlichen Zellen zur Bildung einer
Ribonukleinsäure führt und über diese Ribonukleinsäure eine Glukose-6-phosphat-
Phosphat-Translokator Aktivität in die Zellen eingeführt werden kann oder eine
endogene Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokator Aktivität unterdrückt werden
kann. Gegenstand der Erfindung sind insbesondere die DNA-Sequenzen aus Pisum
sativum (Erbse) mit der Nukleotidabfolge Seq-ID No.: 1, eine DNA-Sequenz aus Zea
mays (Mais) mit der Nukleotidabfolge Seq-ID No.: 2 und eine DNA-Sequenz aus
Solanum tuberosum (Kartoffel) mit der Nukleotidabfolge Seq-ID No.: 3 (Fig. 1).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind DNA-Sequenzen, die mit den unter
Seq.-ID No. 1-3 genannten DNA-Sequenzen oder Teilen davon oder Derivaten, die
durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind,
hybridisieren und für ein plastidäres Protein kodieren, das die biologische Aktivität
eines Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokators besitzt.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der
erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder Teilen davon oder Derivaten, die durch
Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, zur
Transformation pro- und eukaryontischer Zellen. Um die Expression des Glukose-6-
phosphat-Phosphat-Translokators in transformierten Zellen zu gewährleisten, kann
die erfindungsgemäße DNA-Sequenz in Plasmide eingebracht werden und dabei mit
Steuerelementen für die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen
Zellen kombiniert werden (siehe Ausführungsbeispiele 3, 5). Derartige
Steuerelemente sind einerseits Transkriptions-Promotoren und andererseits
Transkriptions-Terminatoren: Mit den Plasmiden können eukaryontische Zellen
transformiert werden mit dem Ziel der Expression einer übersetzbaren
Botenribonuldeinsäure (RNA), die die Synthese eines plastidären Glukose-6-
phosphat-Phosphat-Translokatars in den transformierten Zellen erlaubt, oder mit
dem Ziel der Expression einer nicht übersetzbaren, invers orientierten ("anti-sense"),
Botenribonukleinsäure, die die Synthese des endogenen Glukose-6-phosphat-
Phosphat-Translokators verhindert. Zu diesem Zweck könnten auch kürzere
Fragmente der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz oder DNA-Sequenzen mit einem
relativ hohen Grad an Homologie (mehr als ca. 65% Homologie) verwendet werden.
Eine Repression kann auch über die Überexpression der homologen DNA erreicht
werden (Ko-Supression). Ebenso kann die Expression von endogenen Glukose-6-
phosphat-Phosphat-Translokatoren durch die Expression eines für diesen Zweck
konstruierten Ribozyms unter Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-
Sequenzen inhibiert werden; ferner über eine Insertionsmutagenese - oder, sobald
die entsprechende Technologie zur Verfügung steht, durch eine homologe
Rekombination ("knock-out"-Mutante). Durch eine gewebespezifische kontrollierte
Expression einer RNA entsprechend der erfindungsgemäßen Sequenz eines
pflanzlichen Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokators in den "Source"- bzw.
"Sink"-Geweben ist eine Veränderung des pflanzlichen Kohlenstoff und
Stickstoffmetabolismus möglich, deren wirtschaftliche Bedeutung darin liegt, daß
eine Verbesserung der Weiterleitung von Hexosephosphat in die Plastiden zu einer
Veränderung des Verhältnisses von Kohlenhydraten (Zucker, Stärke, org. Säuren)
und Stickstoffverbindungen (Aminosäuren, Proteine, evtl. Alkaloide) stattfindet. Es
können somit Pflanzen erzeugt werden, die einen erhöhten Stärkegehalt aufweisen
und/oder - im Fall z. B. der Kartoffel - verminderte Lagerungsverluste aufweisen.
Diese Modifikation steigert den ernährungsphysiologischen Wert von Pflanzen und
damit auch deren wirtschaftlichen Wert. Die jeweiligen Effekte ließen sich
möglicherweise noch steigern, falls die gewebespezifische Expression des Glukose-6-
phosphat-Phosphat-Translokators im Blatt bzw. in heterotrophen "Sink"-Gewebe mit
der weiterer Translokatoren/Enzyme des Kohlenstoff-/Stickstoff-Metabolismus
kombiniert würde (Simultane Expression mehrerer Zielproteine wie z. B. bei der
Erhöhung/Erniedrigung des Proteingehaltes, der Erhöhung/Erniedrigung des
Stärkegehaltes oder der Verminderung von Lagerungsverlusten der Kartoffel).
Weiterhin ermöglicht die heterologe Expression der beschriebenen Sequenz in
Spalthefen (Ausführungsbeispiele 3, 4 und Loddenkötter et al., 1993, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90: 2155-2159) Struktur-Funktionsstudien des Glukose-6-phosphat-
Phosphat-Translokators, die letztendlich zur Entwicklung eines spezifischen
Hemmstoffs für dieses Protein führen könnte; insbesondere ist hier an die
Herbizidentwicklung zu denken, da die Hemmung eines Proteins mit
Schlüsselfunktion im Stoffwechselgeschehen zwangsweise letal für die Pflanze wäre.
Ferner sind diese Struktur-Funktionsstudien Grundlage für eine gerichtete
Mutagenese der Substratbindungsstelle des Translokators, um die Substratspezifität
des Transporters gezielt zu verändern.
Es sind bereits Verfahren zur genetischen Modifikation dikotyler und monokotyler
Pflanzen bekannt (Gasser und Fraley, 1989, Science 244: 1293-1299; Potrykus, 1991,
Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 205-225). Zur Expression von
kodierenden Sequenzen in Pflanzen müssen diese mit transkriptionell
regulatorischen Elementen verknüpft werden. Solche Elemente, Promotoren
genannt, sind bekannt (u. a. Koster-Töpfer et al., 1989, Mol. Gen. Genet. 219: 390-396).
Ferner müssen die Kodierregionen mit einem Transkriptionsterminations-Signal
versehen werden, damit sie korrekt transkribiert werden können. Solche Elemente
sind ebenfalls beschrieben (Gielen et al., 1989, EMBO J. 8, 23-29). Der
transkriptionelle Startbereich kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig
bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Terminationsbereiche sind gegeneinander
beliebig austauschbar. Die DNA-Sequenz der Transkriptionsstart- und Terminations-
Regionen kann synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine
Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten. Zur
Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen sind eine große
Anzahl Klonierungsvektoren verfügbar, die ein Replikationssignal für E. coli und
einen Marker beinhalten, der eine Selektion der transformierten Zellen erlaubt.
Beispiele für Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13 mp-Serien, pACYC 184 usw. Je
nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanze können weitere DNA-
Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanze das Ti
oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig
jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti und Ri-Plasmid T-DNA als
Flankenbereich den einzuführenden Genen angefügt werden. Die Verwendung von
T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und
ausreichend beschrieben (Hoekema, in: The Binary Plant Vector System, Offset
drukkerij Kanters B-V. Ablasserdam, 1985, Chapter V; Fraley et al., Critic. Rev. Plant
Sci: 4: 1-46; An et al., 1985, EMBO J. 4: 277-287). Ist die eingeführte DNA einmal im
Genom integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den
Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält
normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen einen
Resistenz gegenüber Bioziden (wie Basta) oder Antibiotika (wie Kanamycin,
Bleomycin oder Hygromycin) verleiht. Der individuell eingeführte Marker wird
daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte
DNA fehlt, gestatten.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen neben der
Transformation mit Hilfe von Agrobakterien viele andere Techniken zur Verfügung.
Diese Techniken umfassen die Transformation von Protoplasten, die Mikroinjektion
von DNA, die Elektroporation sowie ballistische Methoden. Aus dem
transformierten Pflanzenmaterial können dann in einem geeigneten
Selektionsmedium ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen
können dann mit gängigen molekularbiologischen Methoden auf die Anwesenheit
der eingeführten DNA getestet werden. Diese Pflanzen können normal angezogen
werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere
Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden
Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen (oder Derivate oder Teile dieser Sequenz)
können auch in Plasmide eingebracht werden, die eine Mutagenese oder eine
Sequenzveränderung durch Rekombination von DNA-Sequenzen in
prokaryontischen oder eukaryontischen Systemen erlauben. Dadurch kann die
Spezifität des Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokators verändert werden z. B. in
Richtung einer herabgesetzten Affinität für 3-Phosphoglycerat, dem
Ausgangssubstrat für die Biosynthese von Aminosäuren.
Ebenso könnte eine Unempfindlichkeit des Glukose-6-phosphat-Phosphat-
Translokators für spezifische Herbizide erreicht werden: Mit Hilfe von
Standardverfahren (Sambrock et al., 1989, Molecular cloning: A laboratory manual, 2.
Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) können Basenaustausche
und/oder Basendeletionen vorgenommen und/oder synthetische oder natürliche
Sequenzen hinzugefügt werden. Für die Verbindung der DNA-Fragmente
untereinander können Adapter oder linker angesetzt werden. Ferner können
Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die nicht
benötigte DNA entfernen, eingesetzt werden. Dort wo Insertionen, Deletionen oder
Substitutionen wie z. B. Transitionen oder Transversionen in Frage kommen, können
in vitro-Mutagenese, "primerrepair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Als
Analysenmethode werden im allgemeinen eine Sequenzanalyse, eine
Restriktionsanalyse und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden wie
z. B. die Expression des modifizierten Proteins in Hefen und die Messung der
modifizierten Transporteigenschaften in artifiziellen Liposomen (siehe
Ausführungsbeispiel 4 und Loddenkötter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:
2155-2159; sowie Fischer et al., 1994, The Plant J. 5: 215-226) oder die Messung der
modifizierten Transporteigenschaften am in transgenen Pflanzen exprimierten
Protein mit Hilfe einer kürzlich von uns zu diesem Zweck entwickelten Methode
(Flügge und Weber, 1994, Planta, 194: 181-185) angewandt.
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen (oder Teile oder Derivate dieser
Sequenzen) können dazu genutzt werden, nach Standardverfahren (insbesondere
Hybridisierungs-Durchmusterung von cDNA-Bibliotheken mit niedriger Stringenz
unter Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder Teilen der DNA-
Sequenzen als Sonde oder die Erstellung von Sonden für stringente und niedrig
stringente Durchmusterungs-Strategien durch Ableitung von degenerierten
und/oder nicht degenerierten Primern aus der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz
für PCR-Experimente mit DNA oder cDNA aus anderen Pflanzen) aus dem Genom
von Pflanzen ähnliche Sequenzen zu isolieren, die für Proteine kodieren, die
ebenfalls Hexosephosphat, anorganisches Phosphat und Triosephosphat bzw. 3-
Phosphoglycerat und ähnliche C3-Körper, die am Kohlenstoff-Atom 3 eine
Phosphatgruppe tragen, transportieren. Insbesondere können die
erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen genutzt werden, die DNA-Sequenz des nahe
verwandten Glukose-1-phosphat-Phosphat-Translokators der Plastidenhüllmembran
zu identifizieren und zu isolieren (subtraktive Durchmusterungsverfahren einer
pflanzlichen cDNA-Bibliothek unter verschiedenen Stringenzbedingungen und mit
verschiedenen Bereichen der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen als Sonde).
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen (Seq.-ID No. 1 und 2) enthalten im
übersetzten Protein Bereiche, die in der Lage sind, das im Cytoplasma an Ribosomen
synthetisierte Protein spezifisch zu Plastiden zu dirigieren und das Auftreten des
Proteins in anderen Membransystemen der Zelle zu verhindern. Der Proteinbereich,
der das durch die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen kodierte Protein zu
Plastiden dirigiert, liegt innerhalb der ersten 70 Aminosäuren des Proteins, ist für die
Transportfunktion des Proteins nicht erforderlich und wird nach erfolgreicher
Insertion des Proteins in die Plastidenhüllmembran entfernt. Durch Austausch dieser
"Plastid-targeting"-Seqnenz gegen eine der bekannten "Targeting"-Sequenzen z. B. für
Mitochondrien ließe sich das Translokator-Protein in ein anderes Membransystem
eukaryontischer Zellen dirigieren und könnte dort möglicherweise die
Transporteigenschaften über die respektive Membran verändern. Ebenso könnten
die "Plastid-targeting"-Sequenz des Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokators
oder endogene Bereiche des reifen Proteins dazu genutzt werden, fremde Proteine
(z. B. bakterielle Transportproteine oder Transporter aus Hefen) in die Plastiden bzw.
in die Plastidenhüllmembran pflanzlicher Zellen zu dirigieren.
Zum besseren Verständnis der dieser Erfindung zugrundeliegenden Ausführungs
beispiele werden die wichtigsten eingesetzten Verfahren im folgenden erläutert.
Zur Klonierung wurden der Phage Lambda gt10 sowie das Phagemid pBluescript II
KS (pBSC) (Short et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16 : 7583-7600) verwendet.
Für die Transformation von Hefen wurde der Vektor pEVP11 (Russel und Nurse,
1986, Cell 45: 145-153) verwendet.
Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären
Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, 1990, Plant Sci. 66: 221-230) kloniert.
Für das pBluescriptKS (pBSC) Phagemid sowie für pEVP11- und pBinAR-Konstrukte
wurde der E. coli Stamm DH5α (Hanahan et al., 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580)
verwendet.
Die Transformation der pBinAR-Konstrukte in Tabakpflanzen wurde mit Hilfe des
Agrobacterium tumefaciens-Stammes C58C1, pGV2260 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res.
12: 8711-8720) durchgeführt.
Der Transfer der DNA in die Agrobakterien erfolgte durch direkte Transformation
nach der Methode von Höfgen und Willmitzer (1988, Nucl. Acids Res. 16: 9877). Die
Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birn
boim und Doly (1979, Nucl. Acids Res. 7: 1513-1523) isoliert und nach geeigneter
Restriktionsspaltung gelektrophoretisch auf Richtigkeit und Orientierung analysiert.
Pro Transformation wurden 15 kleine mit Schmirgelpapier und Skalpell verwundete
Blätter einer Tabak-Sterilkultur in 10 ml MS-Medium mit 2% Saccharose gelegt,
welches 100 µl einer unter strenger Selektion gewachsenen, transformierten Agro
bacterium tumefaciens-Übernachtkultur enthielt. Nach 15 minütigem leichtem
Schütteln wurden die Blätter auf MS-Medium mit 1,6% Glukose, 2 mg/l
Zeatinribose, 0,02 mg/l Naphthylessigsäure, 0,02 mg Giberellinsäure, 500 mg/l
Betabactyl®, 15 mg/l Hygromycin und 0,8% Bacto-Agar ausgelegt. Nach
einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3.000 Lux Beleuchtungsstärke wurde die
Betabactylkonzentration im Medium um die Hälfte reduziert.
Am 04.07.1997 bzw. am 28.07.1997 wurden bei der Deutschen Sammlung von
Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, folgende
Plasmide/Phagemide in Form von E. coli Stämmen, enthaltend diese
Plasmide/Phagemide, hinterlegt:
Plasmid | pBinAR-EW4 (DSM 11639) |
Plasmid | pEVP11-EW4 (DSM 11640) |
Phagemid | pBSC-MW13 (DSM 11665) |
Phagemid | pBSC-K18.2 (DSM 11666) |
Der Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokator wurde, ausgehend von einer Mais-
Endosperm-Membranfraktion, über eine Chromatographie an Hitrap Q Sepharose
und anschließend an Heparin Sepharose CL-6B gereinigt und über eine funktionelle
Rekonstitution der Proteinfraktionen in künstlichen Membranvesikeln identifiziert.
Es folgte die Darstellung des Proteins in präparativen SDS-Polyacrylamidgelen
(Laemmli, 1970, Nature 227: 680-685). Nach Detektion des Proteins durch Anfärbung
mit Coomassie-Brilliant Blue R-250 wurde die entsprechende Proteinbande aus dem
Gel ausgeschnitten und in der Gelmatrix mit der Endoprotease Lys-C gespalten
(Fresco, 1979, Anal. Biochem. 97: 382-386): Die resultierenden Peptide wurden aus
dem Gel eluiert und mittels HPLC aufgetrennt (Eckerskorn and Lottspeich, 1989,
Chromatographia, 28: 92-94). Die Aminosäuresequenz der gereinigten
Peptidfraktionen wurde durch automatisierten Edman-Abbau in der Gasphase
bestimmt (Eckerskorn et al., 1988, Eur. J. Biochem. 176: 509-519). Aus der
Aminosäuresequenz von einem der beiden Peptide (Peptid 1) wurden zwei
degenerierte Oligonukleotidsequenzen, kodierend diese Aminosäuresequenz,
abgeleitet und das betreffende Oligonukleotid durch in vitro DNA-Synthese
hergestellt.
Aus Maiskörnern, ca. 10 Tage nach der Bestäubung geerntet, wurde das Endosperm
präpariert. Hieraus wurde poly-A+-RNA isoliert und ausgehend hiervon eine cDNA-
Bibliothek im Vektor Lambda gt10 angelegt (Huynh et al. Construction and
screening cDNA libraries in λgt10 and λgt11. In: DNA Cloning (Vol. I), 1985, Glover,
D. M. (Hrsg.) IRL Press, Oxford).
Zum anderen wurde die isolierte RNA für eine RT-Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
(RACE; Schaefer, B. C. (1995) Anal. Biochem. 227, 255-273) eingesetzt. Als Primer für
die erste RACE Reaktion wurden das erste spezifische Oligonukleotid in
Kombination mit einen "anchor(dT)15" Primer benutzt. Die erhaltenen Produkte
wurden einer zweiten PCR unterzogen, wobei hier die jeweiligen "nested" Primer
eingesetzt wurden. Es konnte ein spezifisches PCR-Fragment (1200 bp) erhalten
werden.
Ca. 300.000 Klone der cDNA-Bibliothek wurden mit diesem PCR-Fragment sondiert
(siehe Ausführungsbeispiel 1). Positiv reagierende Klone wurden nach
Standardverfahren gereinigt und nach Präparation der amplifizierten Phagen-DNA
aus den gereinigten Plaques wurde durch EcoRI-Restriktionsverdau die Insertion
kodierend für den Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokator erhalten und durch
Southern-Blot Analyse, mit dem oben erwähnten PCR-Fragment als Sonde,
verifiziert. Nach Umklonierung der Insertionen der Phagen-DNA in das Phagemid
pBluescript (pBSC) wurden die Klone durch Bestimmung der DNA-Sequenz
analysiert (Dideoxymethode: Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-
5467) und aus dieser DNA-Sequenz die Primärstruktur des Glukose-6-phosphat-
Phosphat-Translokators abgeleitet (Klon pBSC-MW13). Die Sequenz der beiden
Peptide konnte in der Gesamtsequenz des Translokators wiedergefunden werden.
Die cDNA aus Mais wurde anschließend benutzt, um die entsprechenden cDNA
Klone aus nicht-grünen Geweben der dikotylen Pflanze Pisum sativum (Erbse) und
Solanum tuberosum (Kartoffel) zu isolieren.
Für die Expression des Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokators in Hefe wurde
zuerst mittels PCR mit einem Oligonukleotid, welches an der Schnittstelle von
Präsequenz und reifem Protein liegt (plus zusätzlicher BamHI-Schnittstelle), das
entsprechende Fragment hergestellt. Dieses wurde dann BamHI-HindIII geschnitten
und anschließend in den entsprechend geschnittenen Vektor pQE30 (Diagen, Hilden)
kloniert. Der Vektor pQE-EW4, enthaltend die Insertion kodierend für den Glukose-
6-phosphat-Phosphat-Translokator, wurde dann mit EcoRI linearisiert und die
resultierenden Überhänge mit Hilfe des Enzyms T4-DNA Polymerase geglättet. Das
so erhaltene Fragment wurde in den Hefe-Expressionsvektor pEVP11, der mit BamHI
linearisiert und dessen Enden mit T4-DNA Polymerase geglättet wurden, eingesetzt
und nach Amplifikation des Konstrukts in E. coli in durch LiCl/PEG kompetent
gemachte (Ito et al., 1983, J. Bact. 153: 163-168) Leucinsynthese-defiziente S. pombe
Zellen transformiert. Transformanten wurden durch Selektion auf Minimalmedium
ohne Leucin selektiert, da das pEVP11-EW4 Konstrukt den Hefezellen die Fähigkeit
zum Wachstum auf leucinfreiem Medium verleiht.
Mit dem pEVP11-EW4 Plasmid transformierte Hefezellen wurden in
Minimalmedium bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm von 1.0 angezogen und
durch Zentrifugation bei 3.000 × g für 5 min geerntet. Anschließend wurden die
Zellen durch kräftiges Schütteln mit 1/2 vol (bezogen auf die Zellen) Glasperlen
aufgebrochen und Glasperlen und Zellbruchstücke durch Zentrifugation (600 g für
1 min) abgetrennt. Der Überstand wurde auf eine Konzentration von 3%
(Gewicht/Volumen) Dodecylmaltosid eingestellt und zur Isolierung und
anschließenden Rekonstitution des Translokators in künstliche Membranen
(Liposomen) benutzt (Fischer et al., 1997, Plant Cell, 9: 453-462). Die resultierenden
Proteoliposomen wurden anschließend in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die
Liposomen wurden zuvor durch Beschallen von Sojabohnen-Phospholipid
(20 mg/ml) für 10 min bei 4°C in Gegenwart von 200 mM Tricine-NaOH (pH 7,6),
40 mM Phosphat (bzw. 3-Phosphoglycerat, Phosphoenolpyruvat, Glukose-6-
phosphat) und 60 mM Kaliumglukonat hergestellt. Nach dem Auftauen der
Proteoliposomen und erneutem Beschallen der Suspension mit 10 Pulsen à 1 s
wurden die Proteoliposomen vom umgebendem Medium durch
Größenausschlußchromatographie auf Sephadex G-25, das zuvor mit 10 mM Tricine-
NaOH (pH 7,6), 100 mM Natriumglukonat und 50 mM Kaliumglukonat equilibriert
worden war, abgetrennt. Die eluierten Proteoliposomen wurden für die Messung der
Transportaktivität eingesetzt. Der Transport wurde durch Abtrennung der
Liposomen über eine Dowex AG1X8 Säule nach verschiedenen Zeiten beendet
(Flügge und Weber, 1994, Planta 194: 181-185).
Die Transportaktivität der Transformante (SP-EW4) wurde mit der von
Transformanten verglichen, die lediglich mit dem Vektor pEVP11 ohne die EW4-
Insertion transformiert worden waren. Es zeigte sich, daß die Transportaktivität in
der pEVP-EW4 Transformante 1-2 Größenordnungen höher war als in der Kontroll-
Transformante.
Es konnte dann gezeigt werden (siehe Tabelle 1), daß das rekombinante
Translokatorprotein die ihm zugeschriebene Substrattransport-Spezifität zeigt: Der
Translokator transportiert - im Austausch mit anorganischem Phosphat -
hauptsächlich die Substrate Glukose-6-phosphat und Triosephosphat. 3-
Phosphoglycerat wird ebenfalls als Substrat akzeptiert, allerdings mit geringerer
Effizienz. Phosphoenolpyruvat wird nur sehr schlecht transportiert, für Glukose-1-
phosphat und Fruktose-6-phosphat konnte keine Transportaktivität beobachtet
werden. Gemäß der strengen Gegentauschfunktion des Translokators ist eine
Transportaktivität nur in Gegenwart eines austauschbaren Substrates zu beobachten.
Werden die Liposomen nur mit Kaliumglukonat vorbeladen, ist keine oder nur eine
sehr geringe Transportaktivität nachzuweisen.
Aus dem Phagemid pBlueseript-EW4 (pBSC-EW4), der als Insertion die cDNA für
den Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokator aus Erbse enthielt (siehe
Ausführungsbeispiel 2) wurde die Insertion durch Restriktionsverdau mit SalI und
SmaI isoliert und in den Vektor pBinAR (Höfgen and Wilimitzer, 1990, Pl nt Sci. 66:
221-230) der zuvor mit den Enzymen SmaI und SalI geschnitten worden war,
gerichtet kloniert. Nach Amplifikation des resultierenden Konstrukts pBinAR-EW4
in E. coli wurden das Konstrukt in Agrobakterien transformiert und diese dann zur
Infektion von Blattsegmenten von Tabak und Kartoffel eingesetzt.
Die erhaltenen Transformanten wurden mit Hilfe von Southern-Blot Analysen auf
die Präsenz des intakten, nicht rearrangierten chimären Gens untersucht. Mit Hilfe
der "Gesamtblatt-Rekonstitutionsmethode" (Flügge und Weber, 1994, Planta 194: 181-
185) wurde die Hexosephosphat-Transportaktivität im Vergleich zu
Kontrolltransformanten (transformiert mit Vektor pBinAR ohne Insertion)
untersucht, ebenso das C/N-Verhältnis, Photosyntheserate, Stärkegehalt und
Wachstum.
Der rekombinante Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokator bzw. zum Vergleich
der rekombinante Triosephosphat-Phosphat-Translokator wurden aus
transformierten Hefezellen gereinigt und in Liposomen rekonstituiert, die mit den
angegebenen Substraten vorbeladen worden waren. Die Transportaktivitäten
wurden gemessen wie von Flügge (Biochim. Biophys. Acta, 1992, 1110: 112-118)
beschrieben und sind in Prozent der Aktivität angegeben, die mit Phosphat
vorbeladenen Liposomen gemessen wurden. Die Standard-Abweichungen sind in
Klammern aufgeführt. Die 100% Transportaktivitäten (µMol/mg Protein pro
Minute) waren 1.2 (rekombinanter Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokator) und
0.85 (rekombinanter Triosephosphat-Phosphat-Translokator aus Spinat-
Chloroplasten); n. b., nicht bestimmt. *, Daten von Fischer et al., 1997, Plant Cell, 9:
453-462.
Claims (20)
1. DNA-Sequenzen, die die Kodierregion eines Glukose-6-phosphat-Phosphat-
Translokators enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß diese DNA-Sequenzen eine
der in Fig. 1 dargestellten Nukleotidabfolgen aufweisen (Seq-ID No.: 1 bis 3), wobei
Fig. 1 Bestandteil des Anspruches ist.
2. DNA-Sequenzen, die mit den DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1, oder Teilen
davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen
Sequenzen abgeleitet sind, hybridisieren und für ein plastidäres Protein kodieren,
das die biologische Aktivität eines Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokators
besitzt.
3. Plasmide und/oder Phagemide enthaltend DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1
oder 2.
4. Plasmid pEVP11-EW4 gemäß Anspruch 3, hinterlegt unter der DSM-Nummer
DSM 11640 als E. coli Stamm DH5α pEVP11-EW4 enthaltend dieses Plasmid.
5. Plasmid pBinAR-EW4 gemäß Anspruch 3, hinterlegt unter der DSM-Nummer
DSM 11639 als E. coli Stamm DH5α pBinAR-EW4 enthaltend dieses Plasmid.
6. Phagemid pBSC-MW13 gemäß Anspruch 3, hinterlegt unter der DSM-Nummer
DSM 11665 als E. coli Stamm DH5α pBSC-MW13 enthaltend dieses Phagemid.
7. Phagemid pBSC-K18.2 gemäß Anspruch 3, hinterlegt unter der DSM-Nummer
DSM 11666 als E. coli Stamm DH5α pBSC-K18.2 enthaltend dieses Phagemid.
8. Bakterien, enthaltend DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2 oder
Plasmide/Phagemide gemäß den Ansprüchen 3 bis 7.
9. Hefen, enthaltend DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2 oder Plasmide
gemäß den Ansprüchen 3 und 4.
10. Pflanzenzellen enthaltend Plasmide gemäß den Ansprüchen 3 und 5.
11. Transformierte Pflanzenzellen und aus diesen regenerierte transgene Pflanzen
enthaltend DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei diese Sequenzen als
Bestandteil eines rekombinaten DNA-Moleküls in die Pflanzenzellen eingeführt
wurde.
12. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Einführung in
pro- oder eukaryontische Zellen, wobei diese Sequenzen gegebenenfalls mit
Steuerelementen, die die Transkription und Translation in den Zellen gewährleisten,
verknüpft sind und zur Expression einer translatierbaren mRNA, die die Synthese
eines Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokators bewirkt, führen.
13. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Identifizierung
von Insertionsmutanten, zur homologen Rekombination oder zur Expression einer
nicht translatierbaren RNA, die mittels eines "anti-sense"-Effektes, eine Kosupression
oder einer Ribozymaktivität die Synthese eines oder mehrerer endogener Glukose-6-
phosphat-Translokatoren in den Zellen verhindert.
14. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Veränderung
des Kohlenstoff-/Stickstoff-Verhältnisses in Blättern bzw. in heterotrophen Geweben
insbesondere zur Erhöhung bzw. Erniedrigung des Stärkegehaltes und zur
Erhöhung bzw. Erniedrigung des Proteingehaltes.
15. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Erniedrigung
der Bildung von Zuckern während der Stärkemobilisierung.
16. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Isolierung von
DNA-Sequenzen, die für ein Polypeptid kodieren, das die biologische Aktivität eines
Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokators besitzt.
17. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2, die als "targeting"-
Sequenzen dienen, um mit Hilfe dieser Sequenzen prokaryontische oder
eukaryontische Proteine, insbesondere Enzyme oder Proteine, die den aktiven oder
passiven Transport von Metaboliten über Membranen katalysieren, in die
Plastidenhüllmembran, in das Plastidenstroma oder in die Thylakoide zu dirigieren.
18. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei diese
Sequenzen eine kodierende Region enthalten, die für ein reifes Protein mit der
biologischen Aktivität eines Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokators kodieren,
zur Kombination mit "targeting"-Sequenzen für andere Zellkompartimente oder
zelluläre Membransysteme, wodurch das reife Protein in andere Kompartimente
oder Membransysteme dirigiert wird.
19. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Identifizierung
von Substanzen, die eine inhibierende Wirkung auf den Transport von
Hexosephosphaten, Phosphat, 3-Phosphoglycerat, Triosephosphaten und anderen
C3- und C6-Körpern, die am C-Atom 3 bzw. am C-Atom 6 eine Phosphatgruppe
tragen, über die innere Plastidenhüllmembran haben.
20. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Isolierung
entsprechender genomischer Klone, insbesondere die Nutzung der entsprechenden
Promotorbereiche oder von Promotorteilbereichen zur gewebespezifischen
Expression von Genen in heterotrophen Geweben.
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DE1997132926 DE19732926C2 (de) | 1997-07-31 | 1997-07-31 | DNA-Sequenzen, kodierend einen Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokator, sowie Plasmide, Bakterien, Hefen und Pflanzen, enthaltend diesen Transporter |
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DE1997132926 DE19732926C2 (de) | 1997-07-31 | 1997-07-31 | DNA-Sequenzen, kodierend einen Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokator, sowie Plasmide, Bakterien, Hefen und Pflanzen, enthaltend diesen Transporter |
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BRPI0409406A (pt) * | 2003-04-15 | 2006-04-18 | Basf Plant Science Gmbh | célula vegetal transformada, planta, semente produzida por uma planta transformada, métodos de produzir uma planta transformada e de induzir a toleráncia e/ou resistência aumentadas à tensão ambiental em comparação com uma planta do tipo selvagem não transformada correspondente em uma célula vegetal, cassete de expressão vegetal, molécula de ácido nucleico isolado, polipeptìdeo isolado, e anticorpo |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19600357C1 (de) * | 1996-01-08 | 1997-02-13 | Fluegge Ulf Ingo Prof Dr | DNA-Sequenz kodierend einen Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator, Plasmide, Bakterien, Hefen und Pflanzen enthaltend diesen Transporter |
-
1997
- 1997-07-31 DE DE1997132926 patent/DE19732926C2/de not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19600357C1 (de) * | 1996-01-08 | 1997-02-13 | Fluegge Ulf Ingo Prof Dr | DNA-Sequenz kodierend einen Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator, Plasmide, Bakterien, Hefen und Pflanzen enthaltend diesen Transporter |
Non-Patent Citations (8)
Title |
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CA 119:5010p * |
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Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE19732926A1 (de) | 1999-02-04 |
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