EP1322772A1

EP1322772A1 - Isomalt produzierende transgene pflanze

Info

Publication number: EP1322772A1
Application number: EP01954033A
Authority: EP
Inventors: Markwart Kunz; Ralf Mattes; Mohammad Munir; Manfred Vogel
Original assignee: Suedzucker AG
Current assignee: Suedzucker AG
Priority date: 2000-09-20
Filing date: 2001-07-12
Publication date: 2003-07-02
Also published as: AU2001276398B2; AU7639801A; JP2004522420A; US20040064851A1; CA2421618A1; DE10047286A1; WO2002027003A1; DE10047286B4; IL154819A0; ZA200302195B

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine transgene Pflanze, die Isomaltulose erzeugen kann, eine transgene Pflanze, die 6-O-α-D-Glucopyranosyl-D-sorbit erzeugen kann, eine transgene Pflanze, die 1-O-α-D-Glucopyranosyl-D-mannit erzeugen kann, eine transgene Pflanze, die ein Gemisch aus 1,6-GPS und 1,1-GPM erzeugen kann, Vermehrungs- und Erntematerial dieser Pflanzen sowie Verfahren zur Erzeugung dieser transgenen Pflanzen.

Description

Iso alt produzierende transgene Pflanze

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine transgene Pflanze, die Isomaltulose erzeugen kann, eine transgene Pflanze, die 6-O-α-D-Glucopyranosyl-D- sorbit (im Folgenden 1,6-GPS) erzeugen kann, eine transgene Pflanze, die 1-O-α-D-Glucopyranosyl-D- mannit (im Folgenden 1,1-GP ) erzeugen kann, eine transgene Pflanze, die ein Gemisch aus 1,6-GPS und 1,1-GPM erzeugen kann, Vermehrungs- und Erntematerial dieser Pflanzen sowie Verfahren zur Erzeugung dieser transgenen Pflanzen.

Aus der DE 44 14 185 Cl sind Saccharose-Isomerasen (z.B. aus den Mikroorganismen Protaminobacter rubrum und Erwinia rhapontici) bekannt, die die glycosidische Bindung zwischen den Monosacchari- deinheiten von Saccharose isomerisieren und dadurch die Umwandlung von Saccharose zu Isomaltulose und Trehalulose katalysieren können. In dieser Druckschrift werden die die Saccharose-Isomerase codierenden DNA-Sequenzen sowie damit transformierte Zellen beschrieben.

Auch Verfahren zur Herstellung von Palatinit® (auch Isomalt oder hydrierte Isomaltulose genannt) , einem nahezu äquimolarem Gemisch aus 1,6-GPS und 1,1-GPM, sowie seiner Einzelkomponenten 1,1-GPM und 1,6-GPS aus Saccharose sind bekannt, die eine enzy- matische Umwandlung von Saccharose zu Isomaltulose und anschließend eine chemische Hydrierung der erhaltenen Isomaltulose zu den beiden Stereoisomeren 1,6-GPS und 1,1-GPM umfassen. So offenbart Schiweck (alimenta 19 (1980) , 5-16) ein Verfahren zur Gewin- nung von Palatinit®, wobei das Verfahren die enzy- matische Umsetzung von Saccharose zu Isomaltulose und die anschließende Hydrierung der isolierten Isomaltulose an Raney-Nickel-Katalysatoren umfasst. Dabei erfolgt die Umwandlung von Saccharose zu Iso- maltulose mittels des Mikroorganismus Protaminobac- ter rubrum und die auf diesem Weg gewonnene Isomaltulose wird in Gegenwart von Raney-Nickel-Katalysatoren durch Hydrierung zu 1,6-GPS und 1,1-GPM umgewandelt und anschließend mittels Verdampfungs- und Kühlungskristallisationsverfahren angereichert.

In der EP 0 625 578 Bl werden Verfahren zur Gewinnung von 1,1-GPM und 1,6-GPS enthaltenden Zuckeralkoholgemischen beschrieben, bei denen zunächst Saccharose enzymatisch in ein Isomaltulose- und Treha- lulose-haltiges Gemisch umgewandelt und das dabei erhaltene Produkt katalytisch zu einem 1,1-GPM, 1,6-GPS und 1-O-α-D-Glucopyranosyl-D-sorbit (1,1-GPS) enthaltenden Gemisch hydriert wird.

In der DE 195 23 008 AI wird ein Verfahren zur Her- Stellung von Gemischen aus 1,1-GPM und 1,6-GPS offenbart, das die Hydrierung von Isomaltulose bei Drücken von unter 50 Atmosphären unter Verwendung von Ruthenium, Nickel oder deren Mischungen enthaltenden Katalysatoren umfasst. In der DE 197 01 439 AI werden Verfahren zur Hydrierung von Isomaltulose mittels eines trägergebundenen Nickelkatalysators offenbart, wobei Gemische aus 1,6-GPS und 1,1-GPM erhalten werden.

Die DE 197 05 664 AI offenbart Verfahren zur Herstellung von 1,6-GPS- oder 1,1-GPM- angereicherten Gemischen aus hydrierter Isomaltulose. Ein in dieser Druckschrift beschriebenes Verfahren umfasst die Herstellung 1,6-GPS- und/oder 1, 1-GPM-ange- reicherter Gemische ^' aus hydrierter Isomaltulose oder aus hydrierter Isomaltulose enthaltenden Gemischen. Mittels Aufkonzentrierung einer 1,6-GPS- angereicherten Mutterlauge unter bestimmten Bedingungen und Kühlungskristallisation kann unter Ver- wendung dieses Verfahrens 1,6-GPS in reiner Form hergestellt werden.

Aus der deutschen Patentanmeldung DE 199 63 126.3 ist eine Sorbit-Dehydrogenase aus einem Mikroorganismus der Gattung Gluconobacter bekannt, mit deren Hilfe Isomaltulose gezielt zu 1, 6-GPS' umgewandelt werden kann.

Schließlich ist aus einem Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas eine Mannit-Dehydrogenase isoliert worden (Brünker et al . , Biochimica et Biophysica Acta, 1351 (1997), 157-167), die Isomaltulose zu 1,1-GPM umwandeln kann.

Die Verfahren nach dem Stand der Technik werden hinsichtlich der Gewinnung von Palatinit®, seiner Einzelbestandteile und Vorstufen vor allem aus den folgenden Gründen als nachteilig angesehen. Erstens ist es bei nahezu allen Verfahren .zur Herstellung der genannten Stoffe erforderlich, zunächst Saccharose als Ausgangsstoff mittels physikalisch-chemischer Verfahren aus zum Beispiel Zuckerrüben zu isolieren und für die nachfolgenden Verfahrensschritte aufzureinigen . Zweitens umfasst dann die weitere Aufarbeitung von Saccharose zu 1,6-GPS und/oder 1,1-GPM weitere komplizierte Verfahrensabfolgen, wobei verschiedene physikalische, chemische und/oder biologische Verfahren in verschiedenen Reaktoren zum Einsatz kommen müssen. Um gezielt 1,6-GPS aus Saccharose zu gewinnen, sind beispielsweise mindestens zwei separate enzyma- tische Umsetzungen erforderlich, in deren Verlauf im Allgemeinen aufwändige Aufreinigungsschritte durchgeführt werden müssen. Ähnliches gilt für die Herstellung von 1,1-GPM und Isomalt. So müssen unter anderem zur Gewinnung von 1,1-GPM aus Saccharose mindestens eine enzymatische Umsetzung, eine chemische Hydrierung unter Verwendung von Katalysatoren, speziellen Hydrierreaktoren und technischem Wasserstoff sowie nachfolgende Trennschritte zur Isolierung von 1,1-GPM aus dem zuvor erhaltenen Gemisch aus 1,1-GPM und 1,6-GPS durchgeführt werden.

Ein erheblicher Nachteil der im Stand der Technik bekannten Verfahren besteht also in der Notwendigkeit, unter einem erheblichen technischen Aufwand mehrere Verfahrensschritte durchzuführen. Da die dabei gewonnenen Produkte zur Verwendung in der Le- bens ittelindustrie bestimmt sind, müssen die Verfahrensgänge darüber hinaus so ausgewählt werden, dass keine toxischen Substanzen, z.B. aus den Katalysatoren, in die Endprodukte gelangen. Dazu sind weitere Aufreinigungsschritte erforderlich, die häufig dazu führen, dass die Ausbeuten an Endprodukten nicht zufriedenstellend sind.

Das der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegende technische Problem besteht also darin, Verfahren und Mittel zu deren Durchführung bereit zu stellen, die eine einfache, kostengünstige und selektive Gewinnung von Isomaltulose und ihren Hydrierprodukten, insbesondere von 1,6-GPS, von 1,1-GPM oder von diese umfassenden Gemischen erlauben.

Die vorliegende Erfindung löst dieses technische Problem durch Bereitstellung transgener Pflanzen, insbesondere transgener Kartoffeln oder transgener- Zuckerrüben, die in mindestens einer ihrer Zellen aus in der Pflanze gebildeter Saccharose Isomaltulose erzeugen können. Insbesondere betrifft die Erfindung eine vorstehend skizzierte Pflanze, die neben ihrer Fähigkeit, aus in ihr gebildeter Saccharose Isomaltulose zu erzeugen überdies die Fä- higkeit besitzt, aus dieser Isomaltulose 1,6-GPS und/oder 1,1-GPM zu erzeugen. Eine derartige Pflanze stellt in überraschender und vorteilhafter Weise ein in vivo System zur Erzeugung von. Palati- nit®, seiner Einzelkomponenten, sowie des Vorläu- fers Isomaltulose bereit, welches am Ort der Entstehung des Eduktes, also der Saccharose, eine unmittelbare Erzeugung der gewünschten Endprodukte erlaubt. Aufwändige Isolier-, Aufreinigungs- und/oder Hydrierverfahren werden hier vermieden. Zudem kommen keinerlei toxische Substanzen zum Einsatz . Die Erfindung löst das ihr zugrunde liegende Problem auch durch die Bereitstellung von Verfahren zur Herstellung der vorgenannten Pflanzen.

Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft also eine transgene Pflanze, insbesondere eine transgene Zuckerrübe oder Kartoffel, die in der Lage ist, in mindestens einer ihrer Zellen aus Saccharose Isomaltulose zu erzeugen. Eine derartige Pflanze stellt einen wertvollen Roh- stoff für die Herstellung von Palatinit® bereit, welches zum Beispiel nach Isolierung der Isomaltulose aus der Pflanze durch chemische Hydrierung erhalten werden kann, wobei selbstverständlich auch von 1 : 1-Verhältnis von 1,1-GPM zu 1,6-GPS abwei- chende Mischungen von 1,1-GPM zu 1,6-GPS hergestellt werden können. Eine derartige Pflanze kann auch zum Ausgangspunkt weiterer gentechnischer Manipulationen gemacht werden, die letztendlich zur Herstellung eines vollständigen Stoffwechselweges von Saccharose zu Palatinit® oder seiner Einzelkomponenten führt .

Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter einer transgenen Pflanze, die aus in der Pflanze gebildeter Saccharose Isomaltulose erzeugen kann, eine Pflanze verstanden, die eine stabil integrierte und in ihr exprimierbare Nucleotidsequenz enthält, die die Aktivität einer Saccharose-Isomerase codiert. Eine Saccharose-Isomerase katalysiert die Isomeri- sierung von Saccharose zu Isomaltulose, wobei die αl->ß2 glykosidische Bindung zwischen Glucose und Fructose in der Saccharose in eine andere glykosidische Bindung, insbesondere in eine αl->ß6 Bindung überführt wird. Erfindungsgemäß geeignete Nucleo- tidsequenzen, die die Aktivität einer Saccharose- Isomerase codieren, sind unter anderem aus Mikroorganismen der Gattung Protaminobacter, Erwinia, Ser- ratia, Leuconostoc, Pseudomonas, Agrobacterium oder Klebsieila bekannt. Die DE 44 14 185 Cl offenbart die Isolierung und Clonierung von Saccharose- Isomerase codierenden Nucleotidsequenzen aus den Mikroorganismen Protaminobacter rubrum und Erwinia rhapontici, wobei das genannte Dokument hinsichtlich der Beschreibung und Bereitstellung der DNA- Sequenzen vollständig in den Offenbarungsgehalt der vorliegenden Lehre mit einbezogen wird und wobei für diese DNA-Sequenzen im erfindungsgemäßen Kon- text Schutz begehrt wird.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine transgene Pflanze, insbesondere eine transgene Zuckerrübe oder Kartoffel, die in mindestens einer ihrer Zel- len aus Saccharose Isomaltulose und aus der so gebildeten Isomaltulose 1, 6-GPS erzeugen kann.

Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter einer transgenen Pflanze, die aus der gebildeten Isomaltulose 1,6-GPS erzeugen kann, eine Pflanze verstan- den, die eine stabil integrierte und in ihr expri- mierbare Nucleotidsequenz enthält, die die Aktivität einer Saccharose-Isomerase codiert, und somit aus Saccharose Isomaltulose erzeugen kann, und die außerdem eine stabil integrierte und exprimierbare Nucleotidsequenz enthält, die die Aktivität einer Sorbit-Dehydrogenase codiert. Eine Sorbit-Dehydro- genase-Aktivität reduziert Isomaltulose spezifisch zu 1,6-GPS. In der deutschen Patentanmeldung DE 199 63 126.3 ist eine erfindungsgemäß geeignete Sorbit-Dehydrogenase aus dem Mikroorganismus Gluco- nobacter suboxidans offenbart, wobei das genannte Dokument hinsichtlich der Beschreibung und Bereitstellung der DNA-Sequenz vollständig in den Offenbarungsgehalt der vorliegenden Lehre mit einbezogen wird und wobei für diese DNA-Sequenz im erfindungsgemäßen Kontext Schutz begehrt wird.

Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine transgene Pflanze, insbesondere eine transgene Zuckerrübe oder Kartoffel, die in mindestens einer ihrer Zellen aus der in der Pflanze gebildeten Saccharose Isomaltulose und aus der so gebildeten Isomaltulose 1,1-GPM erzeugen kann.

Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter einer trangenen Pflanze, die aus der gebildeten Isomaltulose 1,1-GPM erzeugen kann, eine Pflanze verstan- den, die eine stabil integrierte und in ihr expri- mierbare Nucleotidsequenz enthält, die die Aktivität einer Saccharose-Isomerase codiert, und somit aus Saccharose Isomaltulose bilden kann, und die außerdem eine stabil integrierte und exprimierbare Nucleotidsequenz enthält, die die Aktivität einer Mannit-Dehydrogenase codiert. Eine Mannit-Dehydro- genase Aktivität reduziert Isomaltulose spezifisch zu 1,1-GPM. Brünker et al . beschreiben in Biochi- mica et Biophysica Acta, 1351 (1997), 157-167, eine er indungsgemäß geeignete Mannit-Dehydrogenase aus dem Mikroorganismus Pseudomonas fluorescens DSM 50106, wobei das genannte Dokument hinsichtlich der Beschreibung und Bereitstellung der DNA-Sequenz vollständig in den Offenbarungsgehalt der vorliegenden Lehre mit einbezogen wird und wobei für diese DNA-Sequenz im erfindungsgemäßen Kontext Schutz begehrt wird.

Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft eine transgene Pflanze, insbesondere eine transgene Zuckerrübe oder Kartoffel, die in mindestens einer ihrer Zellen aus der in der Pflanze gebildeten Saccharose Isomaltulose und aus der so gebildeten Isomaltulose ein Gemisch aus 1,6-GPS und 1,1-GPM erzeugen kann, zum Beispiel ein 1:1 Gemisch.

Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter einer transgenen Pflanze, die aus der gebildeten Isomaltulose 1,6-GPS und 1,1-GPM erzeugen kann, eine Pflanze verstanden, die eine stabil integrierte und in ihr exprimierbare Nucleotidsequenz enthält, die die Aktivität einer Saccharose-Isomerase codiert, und somit aus Saccharose Isomaltulose bilden kann und die außerdem entweder eine stabil integrierte und exprimierbare Nucleotidsequenz, die die Aktivität einer Sorbit-Dehydrogenase codiert, und eine stabil integrierte und exprimierbare Nucleo- tidsequenz enthält, die die Aktivität einer Mannit- Dehydrogenase codiert, oder eine stabil integrierte und exprimierbare Nucleotidsequenz enthält, die die Aktivität einer unspezifisch hydrierenden Polyolde- hydrogenase codiert.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine transgene Pflanze, insbeson- dere eine Zuckerrübe oder Kartoffel, die in mindestens einer ihrer Zellen eine stabil integrierte und exprimierbare Nucleotidsequenz enthält, die die Aktivität einer Sorbit-Dehydrogenase codiert.

In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine transgene Pflanze, insbesondere eine Zuckerrübe, bereit, die in mindestens einer ihrer Zellen eine stabil integrierte und exprimierbare Nucleotidsequenz enthält, die die Ak- tivität einer Mannit-Dehydrogenase codiert. Die beiden vorgenannten Pflanzen sind vorteilhaft insofern, als dass sie die Bereitstellung der Enzyme Sorbit-Dehydrogenase und Mannit-Dehydrogenase erlauben. Überdies können die genannten Pflanzen als Ausgangsmaterial für die Herstellung von transgenen Pflanzen dienen, die aus Saccharose Palatinit® erzeugen, wobei in die genannten Pflanzen Saccharose- Isomerase codierenden Nucleotidsequenzen eingeführt werden müssen.

Bei den transgenen Pflanzen kann es sich um Pflanzen der verschiedensten Arten, Gattungen, Familien, Ordnungen und Klassen handeln, das heißt sowohl _ .onocotyle als auch dicotyle Pflanzen, ebenso wie Algen, Moose, Farne oder Gymnospermae . Transgene Pflanzen können auch Kalli, Pflanzenzellkulturen, sowie Teile, Organe, Gewebe, Ernte- oder Vermehrungsmaterialien davon umfassen.

Die Erfindung sieht insbesondere vor, dass die transgene Pflanze eine Nutzpflanze ist, insbeson- dere eine Nutzpflanze, die in ihrem Speicherorgan

Saccharose produzieren kann, wie zum Beispiel Zuckerrohr oder Zuckerrübe. Die Erfindung betrifft ebenfalls Vermehrungsmaterialien und Ernteprodukte der erfindungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Blüten, Früchte, Speicherorgane, Rüben, Stengel, Sa- men, Knollen, Wurzeln, Blätter, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge etc.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "in mindestens einer ihrer Zellen", , dass eine transgene Pflanze mindestens eine Zelle, vorzugsweise jedoch eine Vielzahl von Zellen enthält/enthalten, die eine oder mehrere stabil integrierte Nucleotidsequenzen enthalten, die die Aktivität einer Saccharose-Isomerase und/oder die Aktivität einer Sorbit-Dehydrogenase und/oder die Ak- tivität einer Mannit-Dehydrogenase codieren. Bei den Zellen handelt es sich vorzugsweise um Zellen, in denen Saccharose gebildet oder gespeichert wird. Im Falle einer transgenen Zuckerrübe handelt es sich also bevorzugt um Zellen des Zuckerrübenspei- cherorgans, das heißt um Zellen der Rübe, während es sich im Falle einer transgenen Kartoffel bevorzugt um Zellen der Knolle handelt.

Die Nucleotidsequenz kann vorzugsweise im Zellkern aber auch im Piastidengenom oder im mitochondrialen Genom integriert sein, und zwar vorzugsweise so, dass sie stabil in die nächste Generation vererbt wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch transgene Zellen, die die vorstehend genannten Nuc- leotidsequenzen enthalten, sowie transgene Pflanzen, die von derartigen Zellen abstammen. Derartige Zellen lassen sich von natürlicherweise vorkommenden Zellen dadurch unterscheiden, dass sie jeweils eine oder mehrere der vorstehend genannten codierenden Nucleotidsequenzen enthalten, die na- türlicherweise in diesen Zellen nicht vorkommen, oder dass die vorstehend genannten codierenden Nucleotidsequenzen an einem Ort des Genoms integriert sind, an dem -sie natürlicherweise nicht vorkommen, oder dass die vorstehend genannten codierenden Nuc- leotidsequenzen in einer anderen als der natürlichen Kopiezahl vorliegen. Zudem unterscheiden sich die vorstehend beschriebenen Pflanzen durch die erfindungsgemäß bewirkten Stoffwechselaktivitäten und die Expression der genannten Enzyme. Die Erfindung stellt in vorteilhafter Weise derartige Pflanzen bereit, wobei deren Wüchsigkeit, Phänotyp und/oder Kulturbedingungen denen einer Wildtyppflanze vollständig gleichen.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung be- deutet der Ausdruck "stabil integrierte und exprimierbare Nucleotidsequenz", dass eine Nucleotidsequenz mit Nucleinsäure-Elementen verknüpft ist, die eine stabile Integration dieser Nucleotidsequenz in das Genom einer Pflanze gestatten, so dass die in- tegrierte Nucleotidsequenz gemeinsam mit den natürlicherweise vorhandenen Genombestandteilen der Pflanzenzelle repliziert wird, sowie mit regulatorischen DNA-Elementen verknüpft ist, die die Transkription der Nucleotidsequenz und die an- schließende Expression des von der Nucleotidsequenz codierten Produktes gewährleisten. Zur Expression der vorstehend genannten Nucleotidsequenz in pflanzlichen Zellen, insbesondere in sense-Orientierung, werden die codierenden Bereiche dieser Nucleotidsequenzen in bevorzugter Ausfüh- rungsform mit regulatorischen Elementen verknüpft. 'Dazu zählen insbesondere Promotoren, die die Transkription in Pflanzenzellen gewährleisten. Zur Expression der vorstehend genannten Nucleotidsequenzen kommen prinzipiell sowohl homologe als auch heterologe Promotoren in Betracht. Es kann sich dabei um Promotoren handeln, die eine konstitutive Expression bewirken oder um Promotoren, die nur in einem bestimmten Gewebe, zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung oder nur zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt aktiv sind. Außerdem werden die vorstehend genannten Nucleotidsequenzen in bevorzugter Ausführungsform mit einer Terminationssequenz verknüpft, wodurch eine korrekte Transkriptions-Beendigung und eine Anlagerung eines Poly-A-Schwanzes an das Transkript bewirkt werden. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (Gielen et al . , EMBO J., 8 (1989) , 23-29) .

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegen- den Erfindung wird die Expression der die enzymati- schen Aktivitäten codierenden Nucleotidsequenzen dadurch erreicht, dass diese Nucleotidsequenzen unter der Kontrolle gewebe- oder organspezifischer, insbesondere speicherorganspezifischer Promotoren, in mindestens einer Pflanzenzelle exprimiert werden. Gewebespezifische Promotoren zur Expression der die enzymatischen Aktivitäten codierenden Nucleotidsequenzen in Samengewebe sind zum Beispiel der Vici- lin-Promotor aus Pisum sativum (Newbigin et al . , Pla.nta, 180 (1990), 461-470). In einer weiteren be- vorzügten Ausführungsform sieht die Erfindung vor, zur Expression der vorstehend genannten Nucleotidsequenzen in der Epidermis und dem Parenchy von sogenannten Sink-Organen beispielsweise den Arabi- dopsis-Promotor AtAAPl (Expression in Endosperm und während früher Embrionalentwicklung) oder AtAAP2 (Expression in Phloem des Funiculus) (Hirner et al., Plant J. , 14 (1998), 535-544) zu verwenden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, die die enzymatischen Aktivitäten codierenden Nucleotidsequenzen in den Pflanzenorganen zu exprimieren, die große Mengen an Saccharose speichern. Dazu zählen beispielsweise die Rübe der Zuckerrübe, der Stamm vom Zuckerrohr oder die Knolle der AGPase-antisense-Linie 93 der Kartoffel, der sogenannten „Saccharosekartoffel" (Müller-Röber et al., Mol. Gen. Genet . , 224 (1990), 136-146). Die Expression der die enzymatischen Aktivitäten codierenden Nucleotidsequenzen in solchen Organen kann beispielsweise erreicht werden, indem der B33- Promotor des B33-Gens aus Kartoffeln verwendet wird (Rocha-Sosa et al . , EMBO J., 8 (1988), 23-29).

In weiteren Ausführungsformen der Erfindung kann vorgesehen sein, konstitutiv exprimierende Promoto- ren wie den CaMV 35S-Promotor, den geleitzellenspe- zifischen rolC-Promotor aus Agrobacterium oder den Enhanced PMA4-Promotor (Morian et al . , Plant J. , 19 (1999), 31-41) einzusetzen.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung transgene Pflanzen, in denen die die enzy- matischen Aktivitäten codierenden Nucleotidsequenzen im Leseraster an eine Signalsequenz fusioniert sind, welche ein Signalpeptid zur Aufnahme der die enzymatischen Aktivitäten aufweisenden Genprodukte in das endoplasmatische Reticulum einer eukaryon- tischen Zelle codiert. Die Erfindung sieht also vor, dass die Nucleotidsequenzen mit Signalsequenzen versehen werden können, die eine Lokalisation der Genprodukte in bestimmten Kompartimenten der Zelle erlauben. So kommen insbesondere Signalse- quenzen in Betracht, die Signalpeptide codieren, welche zur Aufnahme von Proteinen in das endoplasmatische Reticulum führen und die sich dadurch nachweisen lassen, dass sie zwar in den Vorläuferproteinen, nicht jedoch in prozessierten, reifen Proteinen nachweisbar sind. Bekanntermaßen werden nämlich die Signalpeptide während der Aufnahme in das endoplasmatische Reticulum proteolytisch entfernt. So kann in einer Ausführungsform der Erfindung vorgesehen sein, ein Signalpeptid wie zum Bei- spiel die verkürzte N-terminale Sequenz des Protei- nase-inhibitors PI II aus Kartoffel (Keil et al., Nucl. Acids Res . , 14 (1986), 5641-5650; Schaewen et al., EMBO Journal, 9 (1990), 3033-3044) zu verwenden, wodurch eine Aufnahme des Genprodukts in das endoplasmatische Retikulum mit anschließender Sekretion in den apoplastischen Raum erreicht wird. Selbstverständlich können erfindungsgemäß auch andere Signalsequenzen verwendet werden. In einer weiteren Ausführungsform sieht die Erfindung vor, dass die die enzymatischen Aktivitäten codierenden Nucleotidsequenzen an eine Signalsequenz fusioniert sind, welche ein Signalpeptid zur Aufnahme ins endoplasmatische Reticulum einer euka- ryontischen Zelle, insbesondere einer Pflanzenzelle, und zur Weiterleitung in die Vakuole codiert. Eine vakuoläre Lokalisation der Genprodukte ist besonders vorteilhaft. Erfindungsgemäß können beispielsweise Signalpeptide zur vakuolären Lokalisation von Lektin aus Gerste verwendet werden (Raikhel und Lerner, Dev. Genet . , 12 (1991), 255- 260) , 43 Aminosäuren im aminoterminalen Bereich des reifen Phytohämaglutinins der Bohne codierende Sig- nalsequenzen (Tague et al . , Plant Cell, 2 (1990), 533-546) und Signalsequenzen aus einem Patatingen aus Kartoffel.

Erfindungsgemäß ist besonders bevorzugt, zur Lokalisation der Genprodukte in der Vakuole eine Sig- nalsequenz des Patatin-B33-Gens_,-zu verwenden, insbesondere eine Signalsequenz, die die 23 aminoterminalen Aminosäuren des Propeptids codiert (Rosahl et al., Mol. Gen. Genet., 203 (1986), 214-220), das heißt also die Nucleotide 736 bis 804.. Diese Se- quenz lässt sich sowohl als Fragment aus genomischer DNA der Kartoffel als auch aus der cDNA des B33-Gens gewinnen. Die Fusion der erweiterten B33- Signalsequenz mit den codierenden Nucleotidsequenzen führt zur Aufnahme von deren Genprodukten in die Vakuole.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die die enzymati- schen Aktivitäten codierenden Nucleotidsequenzen nicht mit einer Signalsequenz fusioniert sind, so dass die exprimierten Genprodukte im . Cytosol verbleiben.

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung der vorgenannten transgenen Pflanzen, umfassend die Transformation einer oder mehrerer Pflanzenzellen mit einem Vektor, insbesondere einem Plasmid, der/ das eine oder mehrere Nucleotidse- quenz (en) ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer die Aktivität einer Saccharose-Isomerase codierenden Nucleotidsequenz, einer die Aktivität einer Sorbit-Dehydrogenase codierenden Nucleotidsequenz und einer die Aktivität einer Mannit-Dehy- drogenase codierenden Nucleotidsequenz enthält, die Integration der in diesem Vektor oder Plasmid enthaltenen codierenden Nucleotidsequenz (en) in das Genom der transformierten Zelle (n) , gegebenenfalls unter Einschluss von dessen/deren Signalsequenzen und/oder regulatorischen Elementen und die Regeneration der Pflanzenzelle (n) zu intakten, fruchtbaren transformierten Pflanzen, die Sorbit-Dehydrogenase, Mannit-Dehydrogenase und/oder Saccharose- Isomerase erzeugen.

Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Verfahren zur Verfügung. Bei vielen Verfahren ist es erforderlich, dass die einzuführenden Nucleotidsequenzen in Clonierungs- und oder Expressionsvektoren vorlie- gen. Bei Vektoren handelt es sich prinzipiell um Plasmide, Cosmide, Viren, Bacteriophagen, Shuttle- Vektoren und andere in der Gentechnik üblichen Vek- toren. Vektoren können noch andere Funktionseinheiten besitzen, die den Vektor in einem Wirtsorganismus stabilisieren und/oder dessen Replikation ermöglichen. Vektoren können auch regulatorische Ele- mente enthalten, mit denen die enthaltene Nucleotidsequenz funktioneil verbunden ist und die die Expression der Nucleotidsequenz in einem Wirtsorganismus gestatten. Derartige regulatorische Einheiten können Promotoren, Enhancer, Operatoren und/ oder Transkriptionsterminationssignale sein. Vektoren- enthalten darüber hinaus häufig Marker-Gene, die eine Selektion der sie enthaltenden Wirtsorganismen erlauben, wie zum Beispiel Antibiotika- Resistenzgene .

Verfahren zur Einführung von DNA in Pflanzenzellen umfassen Transformationen pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefa- ciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Protoplastenfusion, die Mikroin- jektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten. Bei den Verfahren der Mikroinjektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden an sich keine speziellen An- forderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide, wie zum Beispiel pUC- Derivate verwendet werden. Wenn aus derartig transformierten Zellen jedoch ganze Pflanzen regeneriert werden sollen, sollte ein selektierbarer Marker vorhanden sein.

In Abhängigkeit von dem verwendeten Verfahren zur Einführung codierender Nucleotidsequenzen in die Pflanzenzellen kann es erforderlich sein, dass der Vektor weitere DNA-Sequenzen enthält. Werden beispielsweise das Ti- oder Ri-Plasmid zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet, ist es erforder- lieh, dass zumindest die rechte Bordersequenz, häufig jedoch die rechte und die linke Bordersequenz der Ti- und Ri-Plasmid-T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden ist. Bei Verwendung von Agrobacterium zur Transformation muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide cloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären- Vektor oder in einen binären Vektor. Auf Grund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, können intermediäre Vektoren durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid von Agro- bacterien integriert werden. Diese enthalten außerdem die für den Transfer der T-DNA erforderliche vir-Region. Intermediäre Vektoren können sich nicht in Agrobacterien replizieren. Mittels eines Hel- ferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden. Im Gegensatz dazu können sich binäre Vektoren sowohl in E. coli als auch in Agrobacterien replizieren. Sie enthalten ein Gen für einen Selektionsmarker und einen Linker oder Polylinker-, der von der rechten und linken T-DNA-Borderregion eingerahmt wird. Binäre Vektoren lassen sich direkt in Agrobacterien transformieren (Holsters et al . , Mol. Gen. Genet., 163 (1978), 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobacterium soll ein Plasmid, welches eine vir- Region trägt, enthalten. Dieser vir-Bereich ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Das auf diese Weise transformierte Agrobacterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist unter anderem beschrieben in EP-A-120 516; Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerej Kanters. B. V., Alblasserdam (1985), Kapitel V; Fralej et al . , Crit. Rev. Plant. Sei., 4,1-46, und An et al . , EMBO J., 4 (1985), 277-287). Um DNA in die Pflanzenzelle zu transferieren, können Pflanzenexplantate mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizo- genes cokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial, wie zum Beispiel Blattstücken, Stengelabschnitten, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder in Suspension kultivierten Pflanzenzellen, können dann in einem geeigneten Medium, das Anti- biotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthält, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Transformation von Rübenzellen mittels Agrobacterium tumefaciens ist in EP 0 517 833 Bl offenbart.

Andere Möglichkeiten zur Einführung von Fremd-DNA unter Verwendung des biolistischen Verfahrens oder mittels Protoplastentransformation sind unter anderem in Willmitzer, L., Transgenic plants, In: Bio- technology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (Hersg. H. J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler) Band 2 (1993), 627-659, VCH Weinheim New York Basel Cambridge, offenbart. Alternative Systeme zur Transformation von monocotylen Pflanzen sind die elektrisch oder chemisch induzierte DNA-Aufnahme in Protoplasten, die Elektroporation von partiell per- meabilisierten Zellen, die Makroinjektion von DNA in Blütenstände, die Mikroinjektion von DNA in Mik- rosporen und Pro-Embryonen, die DNA-Aufnahme durch keimende Pollen und die DNA-Aufnahme in Embryonen durch Quellung (Potrykos, Physiol. Plant (1990), 269-273) . Neuere Untersuchungen weisen darauf hin, dass auch monocotyle Pflanzen mit Hilfe von Vekto- ren auf der Basis von Agrobacterium transformiert werden können (Chan et al . , Plant Mol. Biol., 22 (1993), 491-506; Hiei et al . , Plant J., 6 (1994), 271-282; Bytebier et al., Proc. Natl . Acad. Sei. USA, 84 (1987), 5345-5349; Raineri et al., Bio/Technology, 8 (1990), 33-38; Gould et al . , Plant. Physiol., 95 (1991), 426-434; Mooney et al . , Plant, Cell Tiss. & Org . Cult., 25 (1991), 209-218; Li et al., Plant Mol. Biol., 20 (1992), 1037-1048). Für verschiedene Getreidearten sind einige der vor- stehend genannten Transformationssysteme etabliert worden, wie zum Beispiel die Elektroporation von Geweben, die Transformation von Protoplasten und der DNA-Transfer durch Partikelbeschuss in^' regenerierbare Gewebe und Zellen (Jahne et al . , Euphyti- ca, 85 (1995), 35-44). Die Transformation von Weizen ist von Maheshwari et al . , Critical Reviews in Plant Science, 14(2) (1995), 149-178, und die Transformation von Mais ist von Brettschneider et al., Theor. Appl . Genet., 94 (1997), 737-748, und Ishida- et al . , Nature Biotechnology, 14 • (1996), 745-750, beschrieben worden.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Figuren und Beispiele erläutert. Die Figuren zeigen:

Figur 1 eine Restriktionskarte des ^■ Plasmids pHWG279.1, das ein etwa 1,7 kb großes

Hindlll-Fragment mit der Saccharose- Isomerase codierenden Sequenz (smuA*) im Vektor pBR322 enthält,

Figur 2 eine Restriktionskarte des Plasmids pHWG469, das das native Gen der Sorbit- Dehydrogenase (sdh) aus Gluconobacter suboxidans im Vektor pBR322 enthält.

Beispiel 1 :

Herstellung von Vektoren, die eine Saccharose- Isomerase codierende Nucleotidsequenz enthalten

Es wurde eine Reihe von Konstrukten hergestellt, die in einem binären Vektor jeweils einen in Pflanzen exprimierbaren Promotor, jeweils die Saccharose-Isomerase codierende Nucleotidsequenz aus Pro- taminobacter rubrum und jeweils das Polyadenylie- rungssignal der T-DNA-Octopin-Synthase (Gielen et al . , 1984) enthielten. Die codierende Nucleotidsequenz wurde entweder mit der Signalsequenz des Pa- tatin-Gens der Kartoffel (Rosahl et al . , Mol. Gen. Genet., 203 (1986), 214-220) fusioniert, die eine vakuoläre Lokalisation des Genprodukts bewirkt, oder ohne eine vakuoläre Target-Sequenz verwendet, um eine Expression im Cytosol der jeweiligen Pflanzenzelle zu erreichen. Als Promotor wurden sowohl der CaMV 35 S-Promotor als auch der Promotor des Patatin-Gens B33 der Kartoffel (Rocha-Sosa et al . , EMBO J., 8 (1989), 23-29) verwendet, mit dem sich eine organspezifische Expression in der Knolle der Kartoffel und in der Speicherrübe der Zuckerrübe erreichen lässt. Im Fall der Kartoffel wurde der binäre Vektor pBinB33-Hyg (Becker, Nucl . Acids Res., 18 (1990), 203) verwendet, der bereits den B33-Promotor und das Polyadenylierungssignal enthält und außerdem das Hyg-Resistenzgen als Marker enthält. Im Fall der Zuckerrübe wurde der binäre Vektor pGA492 (An, Plant Physiol., 81 (1986), 86- 91) verwendet, der ein Kanamycin-Resistenzgen besitzt. Mit den erhaltenen Plasmiden wurden Agrobak- terien transformiert. Die transformierten Agrobak- terien wurden entweder zur Transformation der Kartoffel oder der Zuckerrübe verwendet. Im Folgenden wird die Konstruktion des Plasmids UL8-19 beschrieben, bei dem die Saccharose-Isomerase codierende Sequenz am 5' -Ende „in frame" mit dem Signalpeptid des Patatin-Gens und am 3' -Ende mit dem Polyadenylierungssignal der Octopin-Synthase der T-DNA fusioniert ist und unter der Kontrolle des B33- Promotors steht .

Ein ca. 1,7 kb Hindlll-Fragment (enthaltend die Saccharose-Isomerase codierende Sequenz) des in Figur 1 dargestellten Plasmids pHWG279,l (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Mattes, Universität Stuttgart) , das das native Gen der Saccharose-Isomerase aus Protaminobacter rubrum im Vektor pBR322 (Bolivar et al . , Gene, 2 (2) (1977), 95-113; Peden, Gene 22 (2-3) (1983), 277-280) enthält, wurde in den Vektor pBluescriptSK (Strata- gene, Heidelberg) cloniert, wobei ein als pSK279,l bezeichnetes Plasmid erhalten wurde. Zur „in fra- me"-Clonierung eines vakuolären Transitpeptides des Patatin-Gens (297 bp, Rosahl et al . , 1986) wurde die Signalsequenz des Patatingens mit Hilfe des PCR-Verfahrens amplifiziert und nach Spaltung der Enden mit den Restriktionsenzymen Apal und Sall in pBluescriptSK cloniert, wobei das Plasmid pSK297 erhalten wurde. Das Plasmid pSK297 wurde mit dem Restriktionsenzym Sall gespalten, die überstehenden Enden wurden in glatte Enden überführt und anschließend mit dem 1,7 kb-Fragment des Plasmids pSK279,l ligiert, dessen Enden vorher ebenfalls in glatte Enden überführt worden waren. Das erhaltene Plasmid wurde als UL5-19 bezeichnet. Zur Kontrolle wurde der Übergangsbereich zwischen der Signalsequenz und der Saccharose-Isomerase codierenden Nucleotidsequenz sequenziert, um sicherzustellen, dass der Übergang korrekt war. Dabei stellte sich heraus, dass zwar der Übergang korrekt war, die Sac- charose-Isomerase codierende Nucleotidsequenz des Plasmids pHWG279,l jedoch mehrere Sequenzfehler, unter anderem ein Stop-Codon, enthielt. Deshalb wurde das Hindlll-Fragment gegen ein eine fehlerfreie Saccharose-Isomerase codierendes Hindlll- Fragment ausgetauscht. Das erhaltene Plasmid pHWG432,3 wurde nach Transformation in Escherichia coli DH5alpha auf enzymatische Aktivität überprüft. Die mit der Signalsequenz fusionierte cDNA wurde isoliert, indem das Plasmid pHWG432,3 mit Xbal ge- spalten wurde, die überstehenden Enden geglättet wurden und danach eine Spaltung mit Asp718 erfolgte. Das dabei erhaltene 2,0 kB-Fragment wurde in den binären Vektor pBinB33-Hyg cloniert, der mit Sall, wobei die überstehenden Enden anschließend geglättet wurden, und Asp718 gespalten worden war, so dass eine gerichtete Clonierung möglich war. Mit dem dabei erhaltenen, als UL8-19 bezeichneten Vektor wurde der Agrobacterium tumefaciens-Stamm pGV2260 (Deblaere et al . , Nucl . Acids Res., 13 (1985), 4777-4788) mittels Elektroporation transformiert. Die transformierten Agrobakterien wurden zur Transformation der AGPase-antisense-Linie 93 der Kartoffel (sogen. „Saccharose-Kartoffel"; Müller-Röber et al . , 1990) und der Kartoffel-Wildtyp- Varietät Desiree verwendet. Dabei wurden die transgenen Pflanzen 086BK beziehungsweise 096BK erhalten.

Beispiel 2:

Herstellung von Vektoren, die eine Sorbit- Dehydrogenase codierende Nucleotidsequenz enthalten

Es wurde eine Reihe von Konstrukten hergestellt, die in einem binären Vektor jeweils einen in Pflan- zen exprimierbaren Promotor, jeweils die Sorbit- dehydrogenase codierende Nucleotidsequenz aus Glu- conobacter suboxidans und jeweils das Polyadenylie- rungssignal der T-DNA-Octopin-Synthase enthielten. Auch in diesem Beispiel wurde die codierende Nucle- otidsequenz entweder mit der Signalsequenz des Patatin-Gens fusioniert, um eine vakuoläre Lokalisation des Genprodukts zu erreichen, oder zur Expression des Genprodukts im Cytosol der Zelle ohne die vakuoläre Target-Sequenz verwendet. Als Promotoren wurden der CaMV 35 S-Promotor oder der B33-Promotor des B33-Gens der Kartoffel verwendet. Im Fall der Kartoffel wurde der binäre Vektor pBinB33-Hyg verwendet, der bereits den B33-Promotor und das Polya- denylierungssignal enthält, und im Fall der Zucker- rübe der binäre Vektor pGA492. Mit den erhaltenen Plasmiden wurden Agrobakterien transformiert. Die transformierten Agrobakterien wurden entweder zur Transformation der Kartoffel oder der Zuckerrübe verwendet. Im Folgenden wird die Konstruktion des Plasmids U120/19 beschrieben, bei dem die Sorbit- Dehydrogenase codierende Sequenz am 5' -Ende „in frame" mit dem Signalpeptid des Patatin-Gens und am 3' -Ende mit dem Polyadenylierungssignal der Octo- pin-Synthase der T-DNA fusioniert ist und unter der Kontrolle des B33-Promotors steht.

Der Vektor pSK297 (pBluescript mit 297 bp der vakuolären Targetsequenz des Patatin-Gens) wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRV gespalten. Aus dem Plasmid pHWG469 (siehe Figur 2) (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Mattes, Universi- tat Stuttgart) , das das native Gen der Sorbit- Dehydrogenase aus Gluconobacter suboxidans im Vektor pBR322 (Bolivar et al., Gene, 2 (2) (1977), 95- 113; Peden, Gene 22 (2-3) (1983), 277-280) enthält, wurde ein eine Sorbit-Dehydrogenase aus Gluconobac- ter suboxidans codierendes Fragment durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen EcoRV und Hindlll ausgeschnitten und nach Überführung überhängender Enden in glatte Enden gerichtet hinter die vakuoläre Targetsequenz cloniert, so dass ein durchgängiges Leseraster entstand. Das Leseraster wurde an der Fusionsstelle mittels Sequenzierung überprüft. Aus dem so erhaltenen Plasmid UL19/19 wurde mittels Spaltung mit den Restriktionsenzymen Asp718 und BamHI ein 1145 bp-Fragment ausgeschnitten, das das fusionierte Protein codiert. Dieses Fragment wurde in den binären Vektor pBinB33 (Becker, NAR, 18 (1990), 203) cloniert. Mit dem resultierenden Plasmid UL20/19 wurde der Agrobacterium tumefaciens- Stamm pGV2260 transformiert. Die transformierten Agrobakterien wurden zur Transformation der Linien 21 und 33 der Kartoffellinie 096BK verwendet. Dabei wurden die transgenen Pflanzen 158BK beziehungs- weise 159BK erhalten.

Beispiel 3:

Herstellung eines binären Vektors, der eine Mannit- Dehydrogenase codierende Nucleotidsequenz enthält

Es wurde eine Reihe von Konstrukten hergestellt, die in einem binären Vektor die Mannit-Dehydrogenase codierende Nucleotidsequenz aus Pseudomonas fluorescens DSM 50106 (Brünker et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1351 (1997), 157-167) zusammen mit jeweils einem pflanzenspezifischen Promotor und dem Polyadenylierungssignal der T-DNA-Octopin-Synthase enthielten. Auch in diesem Beispiel wurde die codierende Nucleotidsequenz entweder mit der Signalsequenz des Patatin-Gens fusioniert, um eine va- kuoläre Lokalisation des Genprodukts zu erreichen, oder ohne die vakuoläre Target-Sequenz verwendet, um das Genprodukt im Cytosol der Zelle zu exprimie- ren. Als Promotoren wurden der CaMV 35 S-Promotor oder der B33-Promotor des B33-Gens der Kartoffel verwendet. Im Fall der Kartoffel wurde der binäre Vektor pBinB33-Hyg verwendet, der bereits den B33- Promotor und das Polyadenylierungssignal enthält, und im Fall der Zuckerrübe der binäre Vektor pGA492. Mit den erhaltenen Plasmiden wurden Agro- bakterien transformiert. Die transformierten Agro- bakterien wurden entweder zur Transformation der Kartoffel oder der Zuckerrübe verwendet.

Beispiel 4:

Transformation von Agrobacterium tumefaciens

Der DNA-Transfer in die Agrobakterien erfolgte mittels direkter Transformation nach dem Verfahren von Höfgen und Willmitzer (Nucl . Acids Res . , 16 (1988), 9877). Die Plasmid-DNA transformierten Agrobakte- rien wurde nach dem Verfahren von Birnboim und Doly (Nucl. Acids Res., 7 (1979), 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gele- lektrophoretisch analysiert.

Beispiel 5:

Transformation der Kartoffel

Die Pflanzentransformation erfolgte durch Agrobak- terium tumefaciens (Stamm pGV2260 in C58C1; Deblae- re et al . , Nucl. Acids Res., 13 (1985), 4777-4788) vermittelten Gentransfer nach dem in Dietze et al . , Gentransfer to Plants, (1995), 24-29, beschriebenen Verfahren. Die transgenen Pflanzen wurden entweder auf Kanamycin oder Hygromycin enthaltenden Medien selektiert . Beispiel 6 :

Induktion regenerierbarer Kalli aus Blättern der Zuckerrübe

Etwa einen Monat nach der Keimung von Zuckerrüben- samen im Gewächshaus wurden Versuche zur Induktion von Kalli gemäß dem von Saunders et al . (Saunders, J. W. und Doley, W. P., J. Plant. Physiol., 124 (1986) , 473-479) beschriebenen Verfahren durchgeführt. Dabei wurden einer jeden Pflanze junge, drei bis fünf Zentimeter lange Blätter abgenommen, desinfiziert, mit sterilem Wasser dreimal gespült und auf sterilem Filterpapier getrocknet. Jedes Blatt wurde anschließend in Stücke von etwa 0,25 cm² geschnitten und die so erhaltenen Explantate wurden in Petrischalen auf MSBl-Medium kultiviert. Nachdem die Schalen mit einer Kunststofffolie luftdicht abgeschlossen worden waren, wurden sie dreißig Tage bei 30 °C im Dunklen inkubiert und anschließend in Kulturkammern überführt. Vier bis zehn Wochen nach Kulturbeginn erschienen auf oder unter den Blat- texplantaten weiße brüchige Kalli.

Beispiel 7 :

Gewinnung von Zellsuspensionen aus induzierten Kal- li der Zuckerrübe

Vier bis sechs Wochen nach ihrem Erscheinen wurden die Kalli entnommen und in 250 ml-Erlenmeyerkolben, die mit Folie verschlossen worden waren, in 100 ml flüssigem MSBl-Medium kultiviert. Die Erlenmeyer- kolben wurden auf einem Rotationsschüttler bei etwa 200 U/min geschüttelt. Nach etwa zwei bis drei Wochen wurde eine Zellsuspension erhalten.

Beispiel 8 :

Transformation von Zellsuspensionen und jungen Kalli der Zuckerrübe

ZeilSuspension

Die Transformation wurde mit Zellsuspensionen nach etwa dreiwöchigem Kultivieren durchgeführt. Zu 10 ml Suspensionsmedium wurden 10 ml frisches MSBl- Medium zugegeben. Die so verdünnte Suspension wurde auf vier Petrischalen verteilt.

Aus Stammkulturen von Agrobacterium tumefaciens- Stämmen, die mit den erstellten Binärvektoren transformiert worden waren, wurden 50 μl entnommen und in 2 ml LB-Medium, das Rifampicin und Tetracyc- lin enthielt, kultiviert. Die Kulturen wurden zwei Tage mit 200 U/min bei 30° C gerührt. Dieser Stamm wurde in frisches Medium umgesetzt und unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen die Nacht über kultiviert.

Die Infektion der Pflanzenzellen erfolgte, indem 50 μl eines jeden Agrobacterium_, tumefaciens-Stammes einer der die entsprechenden Rübenzellen enthalten- den Petrischalen zugesetzt wurden. Die Rübenzellen und die Bakterien wurden drei Tage lang in einer Kulturkammer in der Dunkelheit kultiviert. Anschließend wurden die Bakterien von den Pflanzenzellen entfernt, indem zunächst mit MSB1 und 600 mg/1 Cefotaxim und dann mit MSB1 plus 300 mg/1 Cefotaxim gewaschen wurde. Die so gewaschenen Rübenzellen wurden in Petrischalen auf einem Blatt sterilen Whatman-Papier kultiviert, das auf Kanamy- cinhaltigem MSBl-Medium plus 300mg/l Cefotaxim lag. Die Schalen wurden mit Kunststofffolie luftdicht verschlossen und fünfzehn Tage in der Kulturkammer inkubiert. Drei bis acht Wochen danach erschienen weiße Kalli auf einer Schicht abgestorbener Zellen.

Dispersion neu induzierter Kalli

Es wurden junge, aus Blattexplantaten frisch induzierte Kalli transformiert. Dabei wurden Kalli verwendet, die nach zwei bis sechs Wochen auf Blättern gerade erschienen waren. Diese Kalli wurden in ste- rilen Kunststoffröhrchen in flüssigem MSBl-Medium dispergiert und dem gleichen Transformationsverfahren wie die Zellsuspensionen unterworfen.

Beispiel 9:

Regeneration von Zuckerrüben-Pflanzen aus transformierten Kalli

Nachdem die transformierten Kalli zunächst einen Monat auf MSB1 und Cefotaxim oder MSB1 und Cefotaxim und Kanamycin kultiviert worden waren, erfolgte die weitere Kultivierung der transformierten Kalli auf MSBl-Medium.

Nach einer bestimmten Zeit entwickelten sich aus bestimmten Kalli Sprossen und/oder Embryonen. Sobald die Sprossen mit der Entwicklung von Blättern begonnen hatten, wurden diese auf MS-Medium, das 1 mg/1 Naphtalinessigsäure enthielt, eingewurzelt. Nach zwei bis sechs Wochen erschienen Wurzeln. Nach der Entwicklung von Wurzeln wurden die Pflanzen im Gewächshaus- in Humuserde aklimatisiert . Nach weiteren drei Monaten hatten sich vollständige Pflanzen entwickelt .

Beispiel 10:

Nachweis des gebildeten Mannit-Dehydrogenase-, Sorbit-Dehydrogenase- und Saccharose-Isomerase-Gens in transformiertem Gewebe

Die Vorselektion von transformierten Pflanzen erfolgte auf Kanamycin beziehungsweise Hygromycin enthaltenden Medien. Zum Nachweis der Transgene wurde zunächst genomische DNA aus den entsprechenden Geweben (Kartoffelknollen oder Zuckerrüben- Speicherwurzel) isoliert. Jeweils 30 ng genomische DNA wurde als Template für eine Polymerase- Kettenreaktion (PCR; Saki et al . , Science, 239 (1988), 487-491) verwendet. Als Primer dienten genspezifische Sonden aus dem 5'- und 3' -Bereich der Saccharose-Isomerase aus Protaminobacter rubrum, der Sorbit-Dehydrogenase aus Gluconobacter suboxidans und der Mannit-Dehydrogenase aus Pseudomonas fluorescens. Die Reaktionen wurden jeweils in einer Lösung mit einem Gesamtvolumen von 50 μl, enthaltend 1 μM der 3'- und 5' -Primer, 0,2 mM dNTPs, 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KC1 und 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,4, mit 1 E Tag-Polymerase (Gibco-BRL) durchgeführt. Die PCR-Ansätze wurden jeweils 40 Zyklen mit 1-minütiger Denaturierung bei 95°C, 1-minütiger Primeranlagerung bei 65°C und 2, 5-minütiger Synthese bei 72°C unterworfen, wobei eine 10-minütige abschließende Synthese zur Ketten- ^'Vervollständigung die gesamte Reaktion beendete. Die Analyse der Reaktionsprodukte erfolgte mittels Gelelektrophorese, wobei das dem jeweiligen Transgen entsprechende PCR-Produkt über die Fragmentgröße bestimmt wurde. Nach Subclonierung und par- tieller Sequenzierung der PCR-Produkte konnten die Transgene eindeutig identifiziert werden.

Beispiel 11:

Nachweis der Saccharose-Isomerase-Aktivität in transformiertem Gewebe

Der Nachweis der Saccharose-Isomerase-Aktivität in transformierten Kartoffelknollen wurde wie folgt durchgeführt. Kartoffelknollen transgener Kartoffelpflanzen und der als Kontrolle verwendeten Wild- typ-Varietät Desiree wurden zerkleinert und jeweils 2 bis 5 g des zerkleinerten Materials wurden nach Zugabe von 50 ml kochendem Wasser in einem Omni- Mixer 2 min homogenisiert und anschließend 15 min in einem Wasserbad bei 95°C erhitzt. Der Nachweis von Isomaltulose erfolgt nach Zentrifugation und Verdünnung des Überstandes mit Hilfe des HPAEC- Verfahrens . Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1: Nachweis von Isomaltulose in transgenen Kartoffelpflanzen g Isomaltulose/kg Frischgewicht

Desiree 1 0,0

Desiree 2 0,0

Desiree 3 0,0 transgene Probe 1 23,6 transgene Probe 2 14,0 transgene Probe 3 44,8 transgene Probe 4 31,4 transgene Probe 5 38,5

Claims

Ansprύche

1. Transgene Pflanze, die in mindestens einer ihrer Zellen aus in der Pflanze gebildeter Saccharose Isomaltulose erzeugen kann, wobei die Pflanze in der mindestens einen Zelle eine stabil integrierte und in ihr exprimierbare Nucleotidsequenz enthält, die die Aktivität einer Saccharose-Isomerase codiert .

2. Transgene Pflanze nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass diese in der mindestens einen Zelle eine zusätzliche stabil integrierte und exprimierbare Nucleotidsequenz enthält, die die Aktivität einer Sorbit-Dehydrogenase codiert und die die Zelle in die Lage versetzt, aus der gebildeten Isomaltulose 6-O- -D-Glucopyranosyl-D-sorbit (1,6- GPS) zu erzeugen.

3. Transgene Pflanze nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass diese in der mindestens einen Zelle eine zusätzliche stabil integrierte und exprimierbare Nucleotidsequenz enthält, die die Aktivität einer Mannit-Dehydrogenase codiert und die die Zelle in die Lage versetzt, aus der gebildeten Isomaltulose 1-0- -D-Glucopyranosyl-D-mannit (1,1- GPM) zu erzeugen.

4. Transgene Pflanze nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass diese in der mindestens einen Zelle eine zusätzliche stabil integrierte und exprimierbare Nucleotidsequenz, die die Aktivität einer Sorbit-Dehydrogenase codiert, und eine zusätzliche stabil integrierte und exprimierbare Nuc- leotidsequenz enthält, die die Aktivität einer Mannit-Dehydrogenase codiert, wobei diese Nucleotidsequenzen die Zelle in die Lage versetzen, aus der gebildeten Isomaltulose 1-O-α-D-Glucopyranosyl-D- mannit und 6-O-α-D-Glucopyranosyl-D-sorbit zu er- zeugen.

5. Transgene Pflanze, die in mindestens einer ihrer Zellen eine stabil integrierte und exprimierbare Nucleotidsequenz enthält, die die Aktivität einer Sorbit-Dehydrogenase codiert.

6. Transgene Pflanze, die in mindestens einer ihrer Zellen eine stabil integrierte und exprimierbare Nucleotidsequenz enthält, die die Aktivität einer Mannit-Dehydrogenase codiert.

7. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Kartoffel ist .

8. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis

6, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Zuckerrübe ist .

9. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleotidsequenz in einem Pflanzen-Vektor enthalten ist.

10. Transgene Pflanze nach Anspruch 9, wobei die codierende Nucleotidsequenz eine cDNA oder eine genomische DNA-Sequenz ist.

11. Transgene Pflanze nach Anspruch 10, wobei die Saccharose-Isomerase codierende Nucleotidsequenz aus einem Mikroorganismus, insbesondere aus einem Mikroorganismus der Gattung Protaminobacter, Erwinia, Serratia, Leuconostoc, Pseudomonas, Agrobacterium oder Klebsiella, die Sorbit-Dehydrogenasen co- dierende Nucleotidsequenz aus einem Mikroorganismus, insbesondere aus einem Mikroorganismus der Gattung Gluconobacter, und die Mannit-Dehydrogenase aus einem Mikroorganismus, insbesondere aus einem Mikroorganismus der Gattung Pseudomonase, erhält- lieh ist.

12. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die codierende Nucleotidsequenz unter der funktioneilen Kontrolle mindestens eines regulatorischen Elementes steht, das die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleistet.

13. Transgene Pflanze nach Anspruch 12, wobei das mindestens eine regulatorische Element ein Promotor, insbesondere ein pflanzenspezifischer Promotor ist .

14. Transgene Pflanze nach Anspruch 13, wobei der Promotor ein gewebe- oder organspezifischer, vorzugsweise ein speicherorganspezifischer Promotor ist.

15. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die codierende Nucleotidsequenz im Leseraster entweder an eine Signalsequenz fusioniert ist, welche ein Signalpeptid codiert, das den Transport des Proteins mit der Aktivität einer Saccharose-Isomerase, des Proteins mit der Aktivität einer Sorbit-Dehydrogenase oder des Proteins mit der Aktivität einer Mannit-Dehydrogenase zu einem bestimmten Zellkompartiment oder einer bestimmten Zellorganelle gewährleistet, oder nicht an eine Signalsequenz fusioniert ist, so daß das Protein mit der Aktivität einer Saccharose-Isomerase, das Protein mit der Aktivität einer Sorbit- Dehydrogenase oder das Protein mit der Aktivität einer Mannit-Dehydrogenase im Cytosol lokalisiert ist .

16. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die codierende Nucleotidsequenz funk- tionell mit Terminations- und/oder Polyadenylie- rungssignalen verbunden ist.

17. Vermehrungs- und/oder Erntematerial einer Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 16.

18. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze nach Anspruch 1, umfassend

a) die Transformation einer oder mehrerer Pflanzenzellen mit einer die Aktivität einer Saccharose- Isomerase codierenden Nucleotidsequenz,

b) die Integration der Nucleotidsequenz in das Genom der transformierten Zelle (n) und

c) die Regeneration von Pflanzen, die aus Saccharose Isomaltulose erzeugen.

19. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend

a) die Transformation einer oder mehrerer Pflanzenzellen mit einer oder mehreren Nucleotidsequenz (en) ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer die Aktivität einer Saccharose-Isomerase codierenden Nucleotidsequenz, einer die Aktivität einer Sorbit- Dehydrogenase codierenden Nucleotidsequenz und einer die Aktivität einer Mannit-Dehydrogenase codie- renden Nucleotidsequenz,

b) die Integration der Nucleotidsequenz (en) in das Genom der transformierten Zelle (n) und

c) die Regeneration von Pflanzen, die Sorbit- Dehydrogenase, Mannit-Dehydrogenase- und/oder Sac- charose-Isomerase erzeugen.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Transformation eine Cotransformation der jeweils eingesetzten Nucleotidsequenzen ist.

21. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die zu trans- formierenden Zellen transgene Zellen sind, die mindestens eine stabil integrierte Nucleotidsequenz enthalten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer die Aktivität einer Saccharose-Isomerase codierenden Nucleotidsequenz, einer die Aktivität ei- ner Sorbit-Dehydrogenase codierenden Nucleotidsequenz und einer die Aktiviät einer Mannit- Dehydrogenase codierenden Nucleotidsequenz.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die transformierte (n) Nucleotidsequenz (en) in einem Pflanzenvektor enthalten sind.

23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die codierende (n) Nucleotidsequenz (en) eine cDNA oder eine genomische DNA Sequenz ist (sind) .

24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Saccharose-Isomerase codierende Nucleotidsequenz aus einem Mikroorganismus, insbesondere aus einem Mikroorganismus der Gattung Protaminobacter, Erwinia, Serra- tia, Leuconostoc, Pseudomonas, Agrobacterium oder Klebsieila, die Sorbit-Dehydrogenase codierende Nucleotidsequenz aus einem Mikroorganismus, insbe- sondere aus einem Mikroorganismus der Gattung Glu- conobacter, und die Mannit-Dehydrogenase codierende Nucleotidsequenz aus einem Mikroorganismus, insbesondere einem Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas, erhältlich ist.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 24 wobei die codierende (n) Nucleotidsequenz (en) jeweils unter der funktionellen Kontrolle mindestens eines regulatorischen Elementes steht/stehen, das die Transkription in pflanzlichen Zellen gewähr- leistet.

26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei das mindestens eine regulatorische Element ein Promotor, insbesondere ein pflanzenspezifischer Promotor ist.

27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei der Promotor ein gewebe- oder organspezifischer, vorzugsweise ein speicherorganspezifischer Promotor ist.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 27, wobei die codierende (n) Nucleotidsequenz (en) entweder im Leseraster an eine Signalsequenz fusioniert ist (sind) , welche ein Signalpeptid codiert, das den Transport des codierten Proteins zu einem bestimmten Zellkompartiment oder einer bestimmten Zellorganelle gewährleistet, oder nicht an eine Signalsequenz fusioniert ist, so daß das codierte Protein im Cytosol lokalisiert ist.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 28, wobei die codierende (n) Nucleotidsequenz (en) funk- tionell mit Terminations- und/oder Polyadenylie- rungssignalen verbunden ist (sind) .