CN116685197A - 促进植物再生和转化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物育种领域，尤其涉及从细胞和其它组织再生植物。更具体地，本发明提供了使用SNP与BnBBM的组合改善植物愈伤组织和枝芽形成和再生的方法和手段。

Description

促进植物再生和转化
技术领域
本发明涉及植物再生和体细胞胚发生诱导的技术领域，优选在糖用甜菜和玉米中。更具体地，本发明提供了使用硝普钠(SNP)改善植物的愈伤组织和枝芽(shoot)形成和再生的方法和手段。
技术背景
通过组织培养再生整个植物的能力是一种被广泛描述和广泛应用的现象。最常用的从体细胞再生植物的方法包括在含有生长调节剂的培养基上培养外植体以诱导愈伤组织形成，然后从去分化的愈伤组织进行器官发生或胚发生。由于再生过程的长度和外植体去分化然后再分化新组织和器官时发生的许多发育事件，在分子遗传水平上剖析体外再生的现象是困难的。突变体筛选和功能研究特别有助于鉴定控制发育途径的蛋白质。
控制再生的蛋白质包括那些从感受态体细胞诱导体细胞胚发生的蛋白质。BABYBOOM(BBM)AP2/ERF结构域蛋白是种子和根－分生组织表达的转录因子，其在欧洲油菜小孢子衍生的胚培养物中被鉴定为胚发育的标记(Boutilier,Kim,et al.("Ectopicexpression of BABY BOOM triggers a conversion from vegetative to embryonicgrowth."The Plant Cell 14.8(2002):1737-1749.)。作者描述了BABY BOOM(BBM)显示出与AP2/ERF转录因子家族的相似性并优先在发育中的胚和种子中表达，其参与了欧洲油菜未成熟花粉粒胚发育的体外诱导(小孢子胚发生)。BBM在拟南芥(Arabidopsis)和芸苔(Brassica)属植物中的异位表达导致在转基因幼苗上自发形成体细胞胚和子叶样结构。异位BBM表达诱导了额外的多效性表型，包括肿瘤生长和叶和花形态的改变。
Florez,Sergio L.,et al.("Enhanced somatic embryogenesis in Theobromacacao using the homologous BABY BOOM transcription factor."BMC Plant Biology15.1(2015):121.)描述了使用源自可可树的转录因子Baby Boom(BBM)来促进体细胞可可细胞从营养状态向胚状态转变。虽然TcBBM的瞬时异位表达仅适度增强胚发生潜能，但组成型过表达显著增加了体细胞胚发生增殖，而且似乎也抑制了后续发育。
Srinivasan,Chinnathambi,et al.("Heterologous expression of the BABYBOOM AP2/ERF transcription factor enhances the regeneration capacity oftobacco(Nicotiana tabacum L.)."Planta 225.2(2007):341.)通过拟南芥和欧洲油菜BBM基因的异源表达，检测了异位BBM表达对烟草(Nicotiana tabacum L.)发育和再生能力的影响。35S..BBM烟草品系表现出许多表型，包括愈伤组织形成、叶片起皱和不育，但它们没有经历自发的体细胞胚发生。由于初级转化体的完全雄性和雌性不育，不能评价具有严重异位表达表型的35S..BBM植物在幼苗阶段的再生增强.因此，通过在35S启动子的控制下表达类固醇诱导的、翻译后控制的BBM融合蛋白(BBM:GR)，产生了具有强烈错误表达表型的可育BBM异位表达系。这些品系在施用DEX后表现出自发的芽和根形成，而体细胞胚发生可从在补充有细胞分裂素的培养基上培养的体外发芽的幼苗下胚轴诱导。
WO201 1/003850A1描述了一种通过在转化过程中诱导BBM来提供可育植物的一般方法。然而，可育植物的恢复需要植物激素，如生长素或细胞分裂素。
硝普钠(SNP)是一种众所周知的用于例如降低血压的药物。然而，在植物生物技术中，SNP也被描述用于植物再生。Xu et al.(Effects of sodium nitroprusside oncallus induction and shoot regeneration in micropropagated Dioscoreaopposite',Plant Growth Regulation volume 59,Article number:279(2009))描述了硝普钠对薯蓣(Dioscorea)的愈伤组织诱导和芽再生的影响。Chin Tan et al.(Effects ofsodium nitroprusside on shoot multiplication and regeneration of Vanillaplanifolia Andrews.In Vitro Cellular&Developmental Biology-Plant volume 49,pages 626-630(2013))描述了硝普钠(SNP)等NO供体对香荚兰(Vanilla planifolia)的芽增殖和再生的影响。Charu Kalra和Shashi B.Babbar(Nitric oxide promotes in vitroorganogenesis in Linum usitatissimum L.Plant Cell,Tissue and Organ Culture(PCTOC)volume 103,pages353-359(2010))描述了一氧化氮(NO)供体(如SNP)对亚麻(Linum usitatissimum)下胚轴外植体的茎发生、芽器官发生和根发生的影响。CharuKalra and Shashi B.Babbar(Nitric oxide promotes in vitro organogenesis inLinum usitatissimum L.Plant Cell,Tissue and Organ Culture(PCTOC)volume 103,pages353-359(2010))描述了一氧化氮(NO)供体(如SNP)对亚麻下胚轴外植体的茎发生、芽器官发生和根发生的影响。Han et al.,(Sodium nitroprusside promotesmultiplication and regeneration of Malus hupehensis in vitro plantlets.PlantCell,Tissue and Organ Culture volume 96,pages 29-34(2009))描述了硝普钠(SNP)对组织培养中湖北海棠(Malus hupehensis)的增殖、再生和生根的影响。Sarropoulou etal.,(In vitro plant regeneration from leaf explants of the cherry rootstocksCAB-6P,Gisela 6,and MxM 14using sodium nitroprusside.In Vitro Cellular&amp；Developmental Biology-Plant volume 50,pages 226-234(2014))描述了欧洲酸樱桃(Prunus cerasus L.)砧木的增殖，其使用包括SNP的组织培养方法，导致促进愈伤组织诱导、体外枝芽增殖和从叶外植体生根。US 7,855,325和US 7,388,126将SNP描述为基于农杆菌的玉米转化实验中的培养基成分，以提高转化效率。
然而，SNP在糖用甜菜愈伤组织再生中的应用以及SNP与BBM介导的枝芽(shoot)诱导的联合应用从未被描述过。
迄今为止，通过BBM转化诱导体细胞胚发生仅描述于辣椒、烟草、拟南芥、欧洲油菜、可可、毛白杨，但从未描述于属于经济上最相关作物之一的甜菜。基于体细胞胚发生的转化以前在甜菜(Beta vulgaris)中是不可能的，并且对糖用甜菜中生物技术过程的总体时间线具有积极影响。
发明内容
在本发明中发现，通过将化学品SNP应用于植物细胞，显著促进了甚至来自顽拗(recalcitrant)基因型的愈伤组织的诱导。发现SNP对愈伤组织诱导的复杂机制具有有益作用，特别是对于糖用甜菜，玉米和菠菜的顽拗基因型。得到的愈伤组织可以再生为正常的枝芽，产生的植物显示正常的表型。当SNP和欧洲油菜BBM(BnBBM)的效应连续组合时，获得顽拗基因型的芽诱导的最佳结果。BnBBM能够促进甜菜(Beta vulgaris)、玉蜀黍(Zeamays)和菠菜(Spinacia oleracea)的体细胞胚发生。体细胞胚发生以激素非依赖性方式实现，产生可育植物。
本发明描述了用于在例如甜菜、玉蜀黍和菠菜中诱导体细胞胚发生和植物再生的核苷酸和方法。本发明产生无多效性表型的可育植物，能够转化顽拗基因型，减少体细胞克隆变异和高频率共转化。总的来说，与其它再生方法相比，用该方法显著缩短了植物再生所需的时间，并且获得的植物的质量也明显得到改善。所获得植物的高质量对根系特征具有特定价值，例如重量、蔗糖含量以及叶片参数(如光合作用)。
特别地，本发明是关于一种不依赖于基因型的基于愈伤组织的再生方法，该方法通过使用BBM的诱导型或组成型表达与SNP结合产生可育植物。转化率显著增加。植物的再生不依赖于激素，支持体细胞胚发生并避免器官发生(例如没有根的枝芽形成)。本发明显著缩短了转化所需的时间。
因此，根据第一个方面，本发明提供了一种促进体细胞胚发生或器官发生的方法，包括以下步骤：
(a)从至少一个植物细胞诱导愈伤组织形成，包括在硝普钠(SNP)存在下孵育所述至少一个植物细胞，特别是在包含SNP的培养基中，和
(b)向步骤(a)中使用的至少一个植物细胞或向步骤(a)中获得的愈伤组织的至少一个细胞中引入包含编码核苷酸序列的表达盒，所述编码核苷酸序列选自：
(i)SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:1的序列至少80％相同的序列；以及
(ii)编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2的序列至少80％相同的序列的多肽的核苷酸序列，
其中所述核苷酸序列与异源组成型调节元件或异源诱导型调节元件可操作地连接；以及
(c)在促进从所述愈伤组织生长出胚和/或枝芽的条件下培养在步骤(b)中获得的愈伤组织，其中在所述愈伤组织中，所述多肽由所述表达盒组成型表达或在诱导所述异源诱导型表达系统时表达。
适用于在步骤(a)中诱导愈伤组织的植物细胞包括胚性植物细胞和体细胞植物细胞。本文所用的复数“植物细胞”不能理解为需要最小数量的植物细胞。原则上，只有一个植物细胞可能就足够了。提供这些植物细胞的方式对于本发明的方法并不重要。植物细胞可以以分离的形式或作为植物组织的一部分使用。例如，可以从分离自植物的外植体提供胚性或体细胞植物细胞。细胞从外植体中分离出来，或者外植体直接用于愈伤组织的诱导。
植物的哪部分适合获得外植体取决于特定的植物物种。通常，合适的植物细胞可以从植物的下胚轴、枝芽、叶、芽、花和根获得。优选地，从植物分离的外植体或其部分用于本发明的方法。
原则上，本发明适用于任何植物物种，无论是单子叶植物还是双子叶植物，甚至是顽拗的基因型。例如，可以经受本发明的方法和用途的植物可以选自下组，该组由以下各项组成：大麦(Hordeum vulgare)，球茎大麦(Hordeum bulbusom)，高粱(Sorghum bicolor)，甘蔗(Saccharum officinarium)，玉蜀黍属(Zea spp.)，包括玉蜀黍(Zea mays)，谷子(Setaria italica)，小粒野生稻(Oryza minuta)，水稻(Oryza sativa)，澳洲野生稻(Oryza australiensis)，高秆野生稻(Oryza alta)，普通小麦(Triticum aestivum)，硬粒小麦(Triticum durum)，黑麦(Secale cereale)，小黑麦(Triticale)，苹果(Malusdomestica)，二穗短柄草(Brachypodium distachyon)，碱大麦(Hordeum marinum)，节节麦(Aegilops tauschii)，红枣(Daucus glochidiatus)，甜菜属(Beta spp.)，包括甜菜(Betavulgaris)，美洲胡萝卜(Daucus pusillus)，胡萝卜(Daucus muricatus)，胡萝卜(Daucuscarota)，巨尾桉(Eucalyptus grandis)，美花烟草(Nicotiana sylvestris)，绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)，烟草(Nicotiana tabacum)，本氏烟草(Nicotianabenthamiana)，番茄(Solanum lycopersicum)，马铃薯茄(Solanum tuberosum)，藤壶菌(Coflea canephora)，葡萄(Vitis vinifera)，刺桐(Erythrante guttata)，旋刺草(Genlisea aurea)，黄瓜(Cucumis sativus)，海参(Marus notabilis)，沙生拟南芥(Arabidopsis arenosa)，堪察加拟南芥(Arabidopsis lyrata)，鼠耳芥(Arabidopsisthaliana)，须弥芥(Crucihimalaya himalaica)，卵叶须弥芥(Crucihimalayawallichii)，弯曲碎米荠(Cardamine nexuosa)，北美独行菜(Lepidium virginicum)，荠(Capsella bursa pastoris)，无苞芥(Olmarabidopsis pumila)，南芥(Arabis hirsute)，欧洲油菜(Brassica napus)，甘蓝(Brassica oleracea)，芜菁(Brassica rapa)，萝卜(Raphanus sativus)，芥菜(Brassica juncacea)，黑芥(Brassica nigra)，芝麻菜(Erucavesicaria)亚种，紫花苜蓿(sativa)，橙子(Citrus sinensis)，麻风树(Jatrophacurcas)，毛果杨(Populus trichocarpa)，蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)，山下西芹(Cicer yamashitae)，西芹(Cicer bijugum)，鹰嘴豆(Cicer arietinum)，野生鹰嘴豆(Cicer reticulatum)，鹰嘴豆(Cicer judaicum)，木豆(Cajanus cajanifolius)，蔓草虫豆(Cajanus scarabaeoides)，菜豆(Phaseolus vulgaris)，大豆(Glycine max)，棉子(Gossypium)属，黄芪(Astragalus sinicus)，百脉根(Lotus japonicas)，夏槿(Toreniafournieri)，洋葱(Allium cepa)，大葱(Allium fistulosum)，大蒜(Allium sativum)，向日葵(Helianthus annuus)，菊芋(Helianthus tuberosus)和或韭菜(Allium tuberosum)。特别优选的是甜菜(Beta vulgaris)，玉蜀黍(Zea mays)，菠菜(Spinacia oleracea)。
为了诱导愈伤组织形成，在SNP存在下培养植物细胞。特别地，它们在含有SNP的培养基中培养。用SNP作为培养基成分，即使对于顽拗基因型，愈伤组织诱导也是可能的。培养基中SNP的浓度范围可以从约10pM到约1mM。为了实现愈伤组织形成所需的加强，培养基中SNP的浓度优选在10pM到100pM的范围内，例如25pM到75pM。此外，可以加入本领域熟知的用于诱导愈伤组织的其它添加剂。原则上，本领域已知的任何培养基可以补充SNP，特别是常用于诱导愈伤组织形成的培养基。根据所讨论的植物，培养基的组成可以变化。原则上，可以向培养基中加入几种类型的基础盐混合物，但优选地，培养基包含改良的Murashige和Skoog(MS)培养基，White's培养基或木本植物培养基，最优选MS培养基。以前的研究表明，在MS培养基中单独或彼此组合存在适当量和浓度的生长素和细胞分裂素时，促进了愈伤组织诱导。根据本发明，这些组分也可以优先加入培养基中。示例性生长素包括萘乙酸(NAA)，吲哚-3-乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)。示例性的细胞分裂素包括6-苄基氨基嘌呤(BAP)和6-糠基氨基-嘌呤(激动素)。
在含有SNP的培养基中孵育优选进行约5-10周，更优选约6-8周。发现在例如5周范围内的短期孵育导致再生能力的增加，而例如10周的长期孵育也不导致再生能力的降低。然而，孵育约6-8周可获得最佳结果。
在本发明特别优选的实施方案中，SNP存在于步骤(a)的孵育培养基中，但不存在于步骤(c)的培养培养基中。与在孵育步骤(a)和培养步骤(c)中使用SNP相比，这进一步增强了本发明的再生促进效果。最优选地，SNP仅存在于步骤(a)中的孵育培养基中，但在所有其它步骤中不存在。
在本发明方法的步骤(b)中，修饰植物细胞使其能够表达来源于欧洲油菜BBM的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与其至少80％相同的氨基酸序列。具有至少80％同源性的序列也可以是截短的序列，截短优选发生在N-末端。已发现在N末端截短会稍微降低但不会完全阻止BBM用于本发明目的的功能，同时由于较短的序列而带来优势。与SEQ ID NO：2相比，N-末端的缩短可以是例如1-161个氨基酸。例如，可以缺失N-末端氨基酸1-161，1-160，1-155或任何更短的子部分。
为了用BBM修饰，将含有相应编码核酸序列的表达盒直接插入步骤(a)中使用的细胞或步骤(a)中获得的愈伤组织的至少一个细胞中。如果首先在步骤(a)中用SNP作为培养基成分诱导愈伤组织，随后在步骤(b)中用BnBBM转化获得的愈伤组织，则获得特别好的结果。通过这两个步骤的过程，甚至可以从顽拗的植物基因型，例如从甜菜，玉蜀黍或菠菜获得枝芽。
在步骤(b)中使用的编码核苷酸序列包含
(i)SEQ ID NO：1的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：1的序列至少80％，优选至少85％，至少90％，更优选至少95％，至少98％或至少99％相同的序列；或
(ii)编码具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：2的序列具有至少80％，优选至少85％，至少90％，更优选至少95％，至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
为简单起见，上述多核苷酸和多肽称为“BnBBM衍生的核酸”或“BnBBM衍生的多肽”。然而，这并不意味着这些化合物是从BnBBM获得的，而只是它们的序列是从BnBBM的序列衍生的。获得多核苷酸和多肽的方式基本上不受限制。
本发明的一个方面涉及促进植物的体细胞胚发生或器官发生的方法，其包括以下步骤：
(a)从至少一个植物细胞诱导愈伤组织形成，
(b)向步骤(a)中使用的所述至少一个植物细胞中或向步骤(a)中获得的所述愈伤组织的所述至少一个细胞中引入包含编码核苷酸序列的表达盒，所述编码核苷酸序列选自：
(i)与SEQ ID NO：1相比在5'-和/或3'-端截短并且与SEQ ID NO：1的序列至少80％相同的核苷酸序列，以及
(ii)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有与SEQ ID NO:2相比被截短，优选N-末端被截短，并且与SEQ ID NO：2的序列至少80％相同的氨基酸序列，
其中所述核苷酸序列与异源组成型调节元件或异源诱导型调节元件可操作地连接；以及
(c)在促进从所述愈伤组织生长出胚和/或枝芽的条件下培养在步骤(a)中获得的愈伤组织，其中在所述愈伤组织中，所述多肽由所述表达盒组成型表达或在诱导所述异源诱导型表达系统时表达。根据优选的实施方案，步骤(a)包括在硝普钠(SNP)存在下，特别是在包含SNP的培养基中孵育所述至少一个植物细胞。当然，本发明的这个方面的特征还可在于本文公开的关于本发明其它方面的所有特征。
为了本发明的目的，以百分比表示的两个相关核苷酸或氨基酸序列的“序列相同性”是指两个最佳比对的序列中具有相同残基的位置数除以比较的位置数(×100)。缺口，即比对中残基存在于一个序列中而不存在于另一个序列中的位置，被认为是具有不相同残基的位置。通过Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970)进行两种序列的比对。上述计算机辅助序列比对可以使用标准软件程序方便地进行，例如欧洲分子生物学开放软件套装(EMBOSS)中实施的程序NEEDLE，例如6.3.1.2版(Trends in Genetics16(6),276(2000))，其默认参数例如对于蛋白质基质＝EBLOSUM62，gapopen＝10.0和gapextend＝0.5。
编码核苷酸序列与异源组成型调节元件或异源诱导型调节元件可操作地连接。表述“可操作地连接”是指嵌合基因的所述元件以这样的方式彼此连接，即它们的功能是协调的并且允许编码序列的表达，即它们是功能性连接的。例如，当启动子能够确保所述另一核苷酸序列的转录和最终表达时，它与所述另一核苷酸序列功能性连接。如果编码核苷酸序列的两种蛋白以能够形成第一和第二蛋白或多肽的融合蛋白的方式连接，则它们彼此功能性或可操作地连接。
异源组成型调节元件优选为组成型启动子。异源诱导型调节元件可以是诱导型启动子或诱导型表达系统。
术语“诱导型启动子”是指响应于内源性或外源性刺激(例如通过化合物(化学诱导剂))的存在或响应于环境、激素、化学和/或发育信号而选择性表达编码序列或功能性RNA的启动子。诱导型启动子包括例如由光、热、胁迫、盐胁迫、渗透胁迫、植物激素或化学品如乙醇、脱落酸(ABA)、茉莉酮酸酯、水杨酸或安全剂诱导的启动子。
在Potenza at al.,2004.中综述了用于在转基因中靶向表达的启动子。一些非生物胁迫启动子是拟南芥或水稻DREB基因启动子(Dubouzet et al.,2003；Lee et al.,2004；Pellegrineschi at al.,2004)；水稻SISAP1，CDPK7或WSI基因启动子(Mukhopadhyayet al.,2004；Saijo et al.,2000；Takahashi at al.,1994)拟南芥rd29基因启动子(Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki 1993)。一些植物热诱导启动子也可以使用来自拟南芥的hsp18.2或hsp101(Yoshida at al.,1995；Young at al.,2005)、来自大豆的hsp17.6或hsp17.3(Severin and Schoffl,1990；Saidi at al.,2005)。DNA微阵列已用于鉴定胁迫调节序列(Rabbani at al.,2003；EP 1 452 596；WO 02/16655)胁迫反应的信号传导途径包括脱落酸信号，因此ABA诱导型启动子也可以是强大的胁迫诱导型启动子，例如Horgum vulgare A22和hva1启动子(Shen at al.,1993；Straub et al.,1994)，玉蜀黍rab17，DBF1和DBF2(Villardel et al.,1990；Kizis and Pages,2002)，Arabidopsisthaliana ABF3(Genbank accession AK175851)和水稻rab21(Mundy and Chua,1988)。
植物中使用的化学诱导型表达系统和化学诱导剂的组合的一些实例是由乙醇诱导的来自构巢曲霉(A.nidulans)的alcA启动子(Rosian at al.,2001)或由蜕皮激素激动剂诱导的来自云杉色卷蛾(C.fumiferana)的蜕皮激素受体(Koo at al.,2004)。
在另一个实施方案中，从编码核苷酸序列表达多肽由化学物质间接诱导。例如，可以使用GVG基因，其编码修饰的大鼠糖皮质激素反应性转录因子，以复合物的形式保留在植物胞质溶胶中。在应用地塞米松时，这种复合物解离，使GVG蛋白进入细胞核并与靶DNA序列(UAS)结合。来自UAS启动子的转录使得所述多肽产生。这被认为是地塞米松诱导的(尽管是间接的)启动子，用于控制多肽表达(Aoyama and Chua(1997))。在这种情况下，应用地塞米松将诱导多肽的表达及其活性。优选地，诱导型表达系统选自基于蜕皮激素或地塞米松的表达系统。
当基因导致表达产物形成时，称该基因被表达。表达产物是指由编码这种产物的核酸、DNA或RNA例如本文所述的第二核酸的转录和任选翻译产生的中间产物或终产物。在转录过程中，在调节区、特别是启动子控制下的DNA序列被转录成RNA分子。RNA分子本身可以形成表达产物，或者当其能够被翻译成肽或蛋白质时，其可以是中间产物。当作为基因表达的最终产物的RNA能够例如与另一核酸或蛋白质相互作用时，称该基因编码作为表达产物的RNA分子。RNA表达产物的实例包括抑制性RNA，例如有义RNA(共抑制)、反义RNA、核酶、miRNA或siRNA、mRNA、rRNA和tRNA。当基因表达的最终产物是蛋白质或肽时，称该基因编码作为表达产物的蛋白质。
本文所用的核酸(分子)或核苷酸(序列)或多核苷酸是指DNA和RNA。DNA还包括cDNA和基因组DNA。核酸分子可以是单链或双链的，并且可以在体外或甚至在体内通过化学合成或通过生物表达产生。
显然，只要RNA分子的核苷酸序列是参照相应DNA分子的核苷酸序列定义的，核苷酸序列中的胸腺嘧啶(T)应被尿嘧啶(II)取代。参考RNA或DNA分子将从本申请的上下文中清楚。
如本文所用，“包含”等应解释为指定所提及的所述特征，整体，步骤或组分的存在，但不排除一个或多个特征，整体，步骤或组分或其组合的存在或添加。因此，例如包含核苷酸或氨基酸序列的核酸或蛋白质可包含比实际引用的核苷酸或氨基酸更多的核苷酸或氨基酸，即嵌入较大的核酸或蛋白质中。包含功能上或结构上确定的DNA区域的嵌合基因可以包含另外的DNA区域等。
在步骤(b)中，将包含编码核苷酸序列的表达盒导入步骤(a)中使用的至少一个植物细胞中或导入步骤(a)中获得的愈伤组织的至少一个细胞中。将包含编码核苷酸序列的表达盒导入植物细胞的步骤(b)可导致其稳定整合到植物细胞或其后代细胞的基因组中。或者，将表达盒导入植物细胞可导致植物细胞或其后代细胞中编码的多肽短暂出现。就本发明而言，“瞬时转化”是指插入序列不(稳定地)整合到植物细胞的基因组中。根据本发明，优选稳定整合到基因组中。
可以通过任何方式引入表达盒。许多方法可用于将感兴趣的核酸转移到植物细胞中。示例性的载体介导的方法是农杆菌介导的转化，例如描述在Lindsay&Gallois,1990,Journal of Experimental Botany和Kischenko et al.,2005,Cell BiologyInternational for sugar beet，或Ishida et al.,2007,(“Agrobacterium-mediatedtransformation of maize.”Nature protocols,2(7),1614-1621)玉米中的内容。其它合适的技术包括粒子轰击和电穿孔。
在步骤(c)中，在表达多肽的条件下进行培养。培养优选在不含植物激素的培养基中进行。术语“植物激素”在本文中应理解为影响植物细胞和组织的生长和发育的化学物质。植物生长激素包括来自以下五组的化学物质：生长素类，细胞分裂素类，赤霉素类，脱落酸(ABA)和乙烯。除了五个主要组之外，其它两类化学品通常被认为是植物生长调节剂：油菜素类固醇和多胺类。为了诱导植物组织中的再生，通常使用一种或多种细胞分裂素和一种或多种生长素的组合。然而，根据本发明，优选在培养步骤(c)中不使用植物激素。已发现，在培养基中不存在植物激素的情况下，对植物发育的负面副作用(例如体细胞克隆变异)减少。因此，也降低了将培养基成分调整到不同基因型的复杂性。
另外，发现步骤(c)中植物激素的缺乏促进体细胞胚而不是枝芽的形成。因此，在一个优选的实施方案中，在步骤(c)中从愈伤组织直接生长胚。因此，避免了冗长的生根过程，从而缩短了去温室的时间。
通过在无激素转化中使用BnBBM增强的体细胞胚形成－导致植物发育而无明显表型－允许快速确认性状候选基因，特别是根性状和根组织特异性启动子。它还可以与其它遗传元件的共同递送和基因组编辑技术的应用相结合。此外，如果不使用2,4D等激素，特别是当愈伤组织培养更长的时间时，体细胞克隆变异可能减少。
显著的时间节约是植物转化的第二改进。在所述方法中，T0植物可直接用于不同种类的分析，而通常T1植物用于常规转化方法中的这种分析。这是必需的，因为通过器官发生产生的常规T0植物具有明显的表型，而不形成合适的茎根，即甜菜的特定贮藏器官。
由于在所述的发明中使用T0植物，对于上述的分析过程可以节省多达2.5年。
由于具有如上所述的BnBBM衍生多肽的诱导型和组成型表达的植物材料的再生能力增加，其他遗传元件(例如基因工程组分)的共递送效率也被增强。可以获得更多的转基因或修饰植物，否则可以转化或编辑不可转化的基因型。因此，根据本发明的另一方面，如上所述的SNP和BnBBM衍生多肽的组合有益效果可用于产生转基因植物的方法以及产生遗传修饰/编辑植物的方法。已发现，在顽拗性植物物种或植物基因型中，转化效率可以通过在SNP存在下进行愈伤组织诱导并引入如上所述的BnBBM衍生多肽来提高。具有BnBBM衍生多肽的诱导型和组成型表达的植物组织的再生能力增加也导致更有效的共转化率，这对于例如基因组编辑组分的递送是重要的。这已经通过获得SDN1事件成功地证明。当如本文定义的BnBBM衍生多肽存在于培养愈伤组织的步骤中时，植物从已经转化或基因编辑并且可能具有修饰的基因组的修饰植物细胞的再生得到显著改善。此外，本发明的方法能够显著节省时间，这在创建编辑的甜菜杂种时尤其明显。可以节省长达6-7年，因为编辑事件可以直接在最终杂种的两个亲本品系中产生，而不是先在适合转化的基因型中引入必要的修饰，然后通过耗时的杂交和育种步骤将其带到特定杂种的亲本品系。
根据该实施例，该方法进一步包括以下步骤：
(d1)将至少一种感兴趣的核苷酸序列导入步骤(b)中使用的至少一个植物细胞或其前体，或导入步骤(a)中获得的愈伤组织的至少一个细胞，其自身或其后代用于步骤(b)中或已经用于步骤(b)中，和/或
(d2)修饰步骤(a)中使用的所述至少一个植物细胞或其前体，或修饰步骤(a)中获得的愈伤组织的所述至少一个细胞的基因组，所述至少一个细胞其自身或其后代用于步骤(b)中或已经用于步骤(b)中，
通过向所述细胞中引入单链DNA断裂(SSB)诱导酶或双链DNA断裂(DSB)诱导酶(其优选识别所述细胞的基因组中的预定位点)和任选的修复核酸分子，或引入单链DNA断裂(SSB)诱导酶(其优选识别所述细胞的基因组中的预定位点并与碱基编辑酶融合)，
其中所述基因组的修饰选自
I.至少一个核苷酸的取代；
II.至少一个核苷酸的缺失；
III.至少一个核苷酸的插入；或
IV.I.-III.的任何组合。
引入至少一个目的核苷酸序列的步骤(d1)可以使用本领域公知的任何合适的方法进行。许多方法可用于将目的核酸转移到植物细胞中。示例性的载体介导的方法是农杆菌介导的转化，例如描述在Lindsay&Gallois,1990,Journal of Experimental Botany和Kischenko et al.,2005,Cell Biology International for sugar beet，或Ishida etal.,2007,(“Agrobacterium-mediated transformation of maize.”Nature protocols,2(7),1614-1621)玉米中的内容。其它合适的技术包括粒子轰击和电穿孔。
本发明的目的核苷酸序列可以是DNA或RNA序列，例如mRNA，siRNA，miRNA等。更具体地，目的核苷酸序列编码至少一种表型性状。优选地，由DNA或RNA赋予的表型性状可以选自对生物胁迫的抗性/耐受性，包括病原体抗性/耐受性，其中病原体可以是病毒，细菌，真菌或动物病原体，对非生物胁迫的抗性/耐受性，包括寒冷抗性/耐受性，干旱胁迫抗性/耐受性，渗透抗性/耐受性，热胁迫抗性/耐受性，寒冷或霜冻胁迫抗性/耐受性，氧化胁迫抗性/耐受性，重金属胁迫抗性/耐受性，盐胁迫或水淹抗性/耐受性，倒伏抗性/耐受性，落粒抗性/耐受性，或对一种或多种除草剂如草甘膦，草丁膦，2,4-D，麦草畏的抗性/耐受性，ALS抑制剂等。至少一种感兴趣的表型性状还可以选自另一种目的农学性状的修饰，包括产量增加，开花时间修饰，种子颜色修饰，胚乳组成修饰，营养含量修饰或感兴趣途径的代谢工程。
根据本发明的一个实施方案，引入至少一个目的核苷酸序列的步骤(d1)导致植物细胞的瞬时转化。在另一个实施方案中，实现了稳定的转化，其中将步骤(d1)中的目的核苷酸序列插入到植物细胞的基因组中。
在步骤(d2)中，修饰植物细胞的基因组可以通过单链DNA断裂(SSB)或双链DNA断裂(DSB)诱导酶或碱基编辑酶实现，所述酶优选识别所述细胞基因组中的预定位点。
如本文所用，“双链DNA断裂诱导酶”或“DSBI酶”是能够在特定核苷酸序列(称为“识别位点”)处诱导双链DNA断裂的酶。因此，“单链DNA或RNA断裂诱导酶”或“SSB/酶”是能够在特定核苷酸序列处诱导单链DNA或RNA断裂的酶。
为了能够在预定的靶位点断裂，酶优选包括结合结构域和切割结构域。能够诱导双或单链断裂的特定酶是核酸酶及其变体，不再包含核酸酶功能，而是作为与另一种酶组合的识别分子起作用。近年来，已经开发了许多合适的核酸酶，特别是特制的核酸内切酶，包括大范围核酸酶，锌指核酸酶，TALE核酸酶，Argonaute核酸酶(例如，衍生自Natronobacterium gregoryi)，和CRISPR核酸酶，包括例如Cas，Cpf1，CasX或CasY核酸酶作为成簇的规则间隔的短回文重复(CRISPR)系统的一部分。因此，在本发明的一个优选方面，DSB或SSB诱导酶选自CRISPR系统如CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、CRISPR/CasX、CRISPR/CasY、CRISPR/Csm1或CRISP R/MAD7，优选CRISPR/Cas9内切核酸酶，CRISPR/MAD7内切核酸酶或CRISPR/Cpf1内切核酸酶，锌指核酸酶(ZFN)，归巢内切核酸酶，大范围核酸酶和TAL效应物核酸酶。
罕见切割核酸内切酶是具有优选约14-70个连续核苷酸的识别位点的酶，因此具有非常低的切割频率，即使在较大的基因组如大多数植物基因组中也是如此。归巢核酸内切酶，也称为大范围核酸酶，构成这种罕见切割核酸内切酶的家族。它们可以由内含子，独立的基因或插入序列编码，并呈现显著的结构和功能特性，使它们区别于更经典的限制酶，通常区别于细菌限制性修饰II型系统。它们的识别位点具有普遍的不对称性，这与大多数限制酶识别位点的特征二元对称性形成对比。已经显示由内含子或内含肽编码的几种归巢核酸内切酶促进它们各自的遗传元件归巢到等位基因的无内含子或无内含肽位点。通过在无内含子或无内含肽等位基因中产生位点特异性双链断裂，这些核酸酶产生重组基因末端，其参与复制编码序列并导致在DNA水平插入内含子或插入序列的基因转化过程。在WO03/004659的表I(第17-20页)中提供了其它罕见的切割大范围核酸酶及其各自的识别位点的列表(通过引用并入本文)。
此外，可以使用方法来设计定制的罕见切割核酸内切酶，这些内切酶基本上可以识别任何选择的靶核苷酸序列。简言之，嵌合限制酶可使用设计用于识别特定核苷酸序列的锌指结构域和来自天然限制酶如Fokl的非特异性DNA切割结构域之间的杂交体来制备。这种方法已被描述，例如在WO 03/080809、WO 94/18313或WO 95/09233和Isalan et al.(2001).A rapid,generally applicable method to engineer zinc fingersillustrated by targeting the HIV-1promoter.Nature biotechnology,19(7),656；Liuet al.(1997).Design of polydactyl zinc-finger proteins for unique addressingwithin complex genomes.Proceedings of the National Academy of Sciences,94(11),5525-5530.)中。定制设计的内切核酸酶的另一个例子包括TALE核酸酶(TALENs)，它基于来自细菌黄单胞菌属的转录激活因子样效应子(TALEs)，融合到核酸酶的催化结构域(例如Fokl或其变体)。这些TALEs的DNA结合特异性由串联排列的34/35个氨基酸重复单位的重复可变双残基(RVD)定义，使得一个RVD特异性识别靶DNA中的一个核苷酸。可以装配重复单元以基本上识别任何靶序列，并与核酸酶的催化结构域融合，产生序列特异性核酸内切酶(参见例如Boch et al.(2009).Breaking the code of DNA binding specificityof TAL-type III effectors.Science,326(5959),1509-1512；Moscou&Bogdanove(2009).A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.Science,326(5959),1501 -1501；和WO 2010/079430,WO 2011/072246,WO 2011/154393,WO 2011/146121,WO2012/001527,WO 2012/093833,WO 2012/104729,WO 2012/138927,WO 2012/138939)。WO2012/138927进一步描述了具有各种催化结构域及其组合的单体(紧凑型)TALEN和TALEs。
最近，描述了一种新型可定制的核酸内切酶系统；所谓的CRISPR/Cas系统。CRISPR系统在其天然环境中描述了一种分子复合物，该分子复合物包含至少一个小的和单独的非编码RNA以及Cas核酸酶或另一种CRISPR核酸酶，如Cpf1核酸酶(Zetsche et al.,，，Cpf1Is a Single RNA-Guides Endonuclease of a Class 2CRISPR-Cas System",Cell,163,pp.1 -13,October 2015)，它可以产生特定的DNA双链断裂。目前，CRISPR系统分为两类，包括五种类型的CRISPR系统，II型系统，例如，使用Cas9作为效应子和使用Cpf1作为效应分子的V型系统(Makarova et al.,Nature Rev.Microbiol.,2015)。在人工CRISPR系统中，合成的非编码RNA和CRISPR核酸酶和/或任选地修饰的CRISPR核酸酶(经修饰以充当切口酶或缺乏任何核酸酶功能)可以与结合了crRNA和/或tracrRNA的功能的至少一种合成的或人工的指导RNA或gRNA组合使用(Makarova et al.,2015,同上)。在天然系统中由CRISPR/Cas介导的免疫应答需要CRISPR-RNA(crRNA)，其中控制CRISPR核酸酶的特异性活化的这种引导RNA的成熟在迄今已经表征的各种CRISPR系统之间显著不同。首先，将侵入的DNA(也称为间隔区)整合在CRISPR基因座近端的两个相邻重复区之间。II型CRISPR系统编码Cas9核酸酶作为干扰步骤的关键酶，该系统含有crRNA以及反式激活RNA(tracrRNA)作为引导基序。这些杂交并形成双链(ds)RNA区域，其被RNAsell识别并可被切割以形成成熟的crRNAs。然后它们又与Cas分子结合以将核酸酶特异性地导向靶核酸区域。重组gRNA分子可以包含可变DNA识别区和Cas相互作用区两者，并且因此可以被特别设计，而与特定靶核酸和所希望的Cas核酸酶无关。作为进一步的安全机制，PAMs(原型间隔区相邻基序)必须存在于靶核酸区域中；这些是直接来自Cas9/RNA复合物识别的DNA的DNA序列。来自酿脓链球菌的Cas9的PAM序列已经被描述为“NGG”或“NAG”(标准IIIPAC核苷酸编码)(Jinek et al,"A programmabledual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity",Science2012,337:816-821)。来自金黄色葡萄球菌的Cas9的PAM序列是“NNGRRT”或“NNGRR(N)”。进一步的变体CRISPR/Cas9系统是已知的。因此，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)Cas9在PAM序列NNNNGATT.A处切割。嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)Cas9在PAM序列NNAGAAW处切割。最近，针对弯曲杆菌的CRISPR系统描述了另一个PAM基序NNNNRYAC(WO 2016/021973 A1)。对于Cpf1核酸酶，已经描述了没有tracrRNA的Cpf1－crRNA复合物通过短的富含T的PAM有效地识别和切割靶DNA，这与通过Cas9系统识别的通常富含G的PAM相反(Zetsche et al.，同上)。此外，通过使用经修饰的CRISPR多肽，可以获得特异性单链断裂。Cas切口酶与各种重组gRNA的组合使用还可以通过双DNA切口诱导高度特异性的DNA双链断裂。此外，通过使用两种gRNA，可以优化DNA结合的特异性，从而优化DNA切割。最初针对细菌描述的其他CRISPR效应物(如CasX和CasY效应物)是同时可获得的并且代表可以用于基因组工程目的的其他效应物(Burstein et al.,“New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes”,Nature,2017,542,237-241)。
DSBI/SSBI酶的切割位点涉及DNA或RNA上诱导双链断裂的确切位置。切割位点可以包含或不包含在DSBI/SSBI酶的识别位点中(与其重叠)，因此据说DSBI/SSBI酶的切割位点位于其识别位点处或其附近。DSBI/SSBI酶的识别位点，有时也称为结合位点，是被DSBI/SSBI酶(特异性地)识别并确定其结合特异性的核苷酸序列。例如，TALEN或ZNF单体具有分别由其RVD重复或ZF重复决定的识别位点，而其切割位点由其核酸酶结构域(例如Fokl)决定，并且通常位于识别位点之外。在二聚体TALENs或ZFNs的情况下，切割位点位于相应单体的两个识别/结合位点之间，发生切割的该插入DNA或RNA区域称为间隔区。
本领域技术人员能够选择识别特定识别位点的DSBI/SSBI酶，并在预选/预定位点处或附近的切割位点诱导DSB或SSB，或者设计这种DSBI/SSBI酶。或者，可使用任何常规转化方法或通过与在基因组中具有DSBI/SSBI酶识别位点的生物体杂交，将DSBI/SSBI酶识别位点引入靶基因组中，然后可将任何所需核酸引入该DSBI/SSBI酶的切割位点处或附近。
如本文所用的“碱基编辑酶”或“碱基编辑器”是指具有与其所衍生的蛋白质相同的催化活性的蛋白质或其片段，所述蛋白质或其片段单独或当作为分子复合物提供时，在本文中称为碱基编辑复合物，具有介导靶向碱基修饰的能力，即，感兴趣的碱基的转化导致感兴趣的点突变，所述点突变又可导致靶向突变。如果碱基转换不引起沉默突变，而是由包含用碱基编辑器转换的位置的密码子编码的氨基酸的转换。优选地，根据本发明的至少一种碱基编辑器暂时或永久地与至少一种位点特异性效应物连接，或任选地与至少一种位点特异性效应物复合物的组分连接。连接可以是共价的和/或非共价的。本文公开的任何碱基编辑或位点特异性效应物，或其催化活性片段，或碱基编辑器复合物或位点特异性效应物复合物的任何组分可以作为核酸片段引入细胞，所述核酸片段代表或编码DNA，RNA或蛋白质效应物，或其可以作为DNA，RNA和/或蛋白质，或其任何组合引入。
存在两种主要且不同的修复断裂的途径－同源重组和非同源末端连接(NHEJ)。同源重组需要存在同源序列作为模板(例如，“供体”)以指导细胞修复过程，并且修复的结果是无错的和可预测的。在缺乏用于同源重组的模板(或“供体”)序列的情况下，细胞通常试图通过非同源末端连接(NHEJ)的过程来修复断裂。
在该实施方案的特别优选的方面，将修复核酸分子另外引入植物细胞。如本文所用，“修复核酸分子”是单链或双链DNA分子或RNA分子，其用作在切割位点附近的预选位点处或在切割位点处修饰基因组DNA的模板。如本文所用，“用作修饰基因组DNA的模板”是指通过侧翼区域和相应的同源区域之间的同源重组，将修复核酸分子复制或整合到预选位点。任选地在修复核酸分子的两个末端之一处与非同源末端连接(NHEJ)组合(例如，在只有一个侧翼区域的情况下)。通过同源重组的整合将允许修复核酸分子精确连接到靶基因组直至核苷酸水平，而NHEJ可在修复核酸分子和基因组DNA之间的连接处产生小的插入/缺失。
如本文所用，“基因组的修饰”是指基因组改变了至少一个核苷酸。这可以通过至少一个核苷酸的替换和/或至少一个核苷酸的缺失和/或至少一个核苷酸的插入而发生，只要其导致与修饰前预选基因组靶位点的核苷酸序列相比至少一个核苷酸的总改变，从而允许例如通过技术人员熟知的技术如测序或PCR分析等鉴定修饰。
本文所用的“预选位点”，“预定位点”或“预定义位点”表示基因组(例如核基因组或叶绿体基因组)中期望插入、替换和/或缺失一个或多个核苷酸的特定核苷酸序列。这可以是例如内源基因座或在先前导入的外源DNA或转基因中的特定核苷酸序列。预选位点可以是特定的核苷酸位置，在该位置(之后)意图进行一个或多个核苷酸的插入。预选位点还可以包含待交换(替换)或缺失的一个或多个核苷酸的序列。
如本申请上下文中所用，术语“约”意指所述值的+/－10％，优选所述值的+/－5％。例如，约100个核苷酸(nt)应理解为90－110nt，优选95－105之间的值。
如本文所用，“侧翼区域”是具有与预选位点侧翼(即上游或下游)的DNA区的核苷酸序列同源的核苷酸序列的修复核酸分子的区域。显然，应该选择侧翼区的长度和序列相同百分比，以便能够在所述侧翼区和它们相应的预选位点上游或下游的DNA区之间进行同源重组。与修复核酸分子的一个或多个侧翼DNA区域具有同源性的预选位点侧翼的一个或多个DNA区域也称为基因组DNA中的一个或多个同源区域。
为了具有足够的重组同源性，修复核酸分子的侧翼DNA区域的长度可以不同，并且应该至少为约10nt、约15nt、约20nt、约25nt、约30nt、约40nt或长约50nt。然而，侧翼区可以尽可能长(例如长达约100-150kb，例如完整的细菌人工染色体(BACs))。优选地，侧翼区为约50nt至约2000nt，例如约100nt，200nt，500nt或1000nt。此外，目的DNA侧翼的区域不需要与同源区域(预选位点侧翼的DNA区域)相同，并且可以与预选位点侧翼的DNA区域具有约80％至约100％的序列相同，优选约95％至约100％的序列相同。侧翼区越长，对同源性的要求就越不严格。此外，为了在预选位点交换靶DNA序列而不改变相邻DNA序列的DNA序列，侧翼DNA序列应优选与预选位点侧翼的上游和下游DNA区相同。
如本文所用，“上游”表示核酸分子上更靠近所述核酸分子的5'端的位置。同样，术语“下游”是指核酸分子上更接近所述核酸分子的3'端的位置。为避免疑义，核酸分子及其序列通常以其5'到3'方向(从左到右)表示。
为了在预选位点靶向序列修饰，必须选择侧翼区，使得上游侧翼区的3'末端和/或下游侧翼区的5'末端与预定位点的末端对齐。因此，上游侧翼区的3'端决定预定位点的5'端，而下游侧翼区的5'端决定预定位点的3'端。
如本文所用，所述预选位点位于所述切割(和/或识别)位点之外或远离所述切割(和/或识别)位点是指意图进行基因组修饰的位点(预选位点)不包含DSBI/SSBI酶或碱基编辑酶的切割位点和/或识别位点，即预选位点不与切割(和/或识别)位点重叠。因此，在这方面之外/远离是指切割(和/或识别)位点的上游或下游。
在本发明中，发现BnBBM在植物转化中增强体细胞胚形成，并产生与由种子生长的植物相当的高质量的植物。获得的植物的高质量已经通过不存在明显可见的表型而得以证实，而且还通过实验证实了根特征如重量，蔗糖含量以及叶参数如光合作用。在基于农杆菌的转化以及与BnBBM诱导的体细胞胚发生组合的基因枪弹转化方法之后，观察到增加的植物质量。
通过在无激素转化中使用BnBBM增强的体细胞胚形成－导致没有明显表型的植物发育－允许快速确认性状候选基因，特别是根性状和根组织特异性启动子，此外它还可以与基因组编辑技术的应用结合。
显著的时间节约是植物转化的第二改进。在所述方法中，T0植物可直接用于不同种类的分析，而通常T1植物用于常规转化方法中的这种分析。这是必需的，因为通过器官发生产生的常规T0植物具有明显的表型，而不形成合适的茎根，即甜菜的特定贮藏器官。
由于在所述的发明中使用T0植物，对于上述的分析过程可以节省多达2.5年。此外，当使用T0植物时，也存在植物中瞬时基因组编辑的可能性。因此，这种T0级的植物分析代表了本发明的优选实施方案。
产生遗传工程化的甜菜杂种的时间节省甚至更高。可以节省长达6-7年，因为不是在许多单粒型(monogerm)中产生编辑，而是可以在亲本中直接产生编辑以产生杂种(图29)。本发明的进一步改进是从该方法获得的植物中较少的体细胞克隆变异和转基因植物的种子产量的显著增加。这通常是主要问题，特别是对于甜菜植物，并且导致关于不同品系的可用性的强烈限制。本发明的另一方面涉及生产植物的方法。已经发现，使用上述体细胞胚发生和器官发生的方法，即使对于顽拗性植物物种或植物基因型，也可以产生完整植物。此外，发现通过本发明，所得植物不显示多效性表型。
因此，本发明提供了一种用于产生植物的方法，该方法包括如以上参考步骤(a)和(b)所述的体细胞胚发生或器官发生，任选地如以上参考步骤(d1)和(d2)所述的转化或基因组修饰，以及从由以上公开的方法的步骤(c)产生的胚和/或枝芽再生植物，特别是由步骤(d1)产生的转基因植物和/或由步骤(d2)产生的修饰的植物。
优选地，选择体细胞胚发生的条件以便直接形成胚。这可以如上所述实现，例如通过在不含植物激素的培养基中进行培养。从来源于无激素培养基中体细胞胚发生的枝芽中生长出具有天然根而不是由体外枝芽人工诱导的不定根的苗，其允许已经在T0水平进行生理分析。此外，获得的植物的质量明显比用公开的方案产生的植物更好。由于与现有技术相比减少了组织培养工作，这导致了巨大的时间和成本节约。因此，这种T0级的植物分析代表了本发明的优选实施方案。
本发明的主题还是通过上述方法获得或可获得的植物。因此，本发明的一个实施方案是通过上述转化植物细胞和产生植物的方法获得或可获得的转基因植物，以及其后代植物或其部分，其中所述后代或部分包含作为转基因的至少一种目的核苷酸序列。
本发明的另一个实施方案是通过上述修饰植物细胞基因组和产生植物的方法获得或可获得的基因修饰植物(权利要求12)以及其后代植物或部分，其中后代或部分包含通过上述修饰方法引入的基因组修饰。
本发明的另一个主题是来源于上述转基因植物或基因修饰植物的植物细胞或种子。这种植物细胞优选包含编码瞬时或稳定整合的BnBBM衍生多肽的多核苷酸和单链DNA断裂(SSB)－或双链DNA断裂(DSB)－诱导酶或碱基编辑酶，其优选识别所述细胞基因组中的预定位点和任选的修复核酸分子。编码BnBBM衍生多肽的多核苷酸优选与合适的调节序列可操作地连接，使得植物细胞能够表达BnBBM衍生多肽。例如，调控序列是指“启动子”，指的是核苷酸序列，通常位于其编码序列的上游(5’)，通过识别RNA聚合酶和正确转录所需的其它因子来控制编码序列的表达。“组成型启动子”是指在几乎所有组织和任何时间指导基因表达的启动子。组成型启动启动子的实例包括CaMV 35S启动子、双CaMV 35S启动子(70S启动子)、胭脂碱合酶(nos)启动子、BdEF1启动子或泛素启动子，如Pcllbi4或Zmllbil。“受调控的启动子”是指以时间和/或空间调节的方式而非组成性地指导基因表达的启动子，包括组织特异性启动子和诱导型启动子。它包括天然序列和合成序列以及可以是合成序列和天然序列的组合的序列。不同的启动子可以指导基因在不同组织或细胞类型中的表达，或在不同的发育阶段或响应不同的环境条件而表达。可用于植物细胞中的各种类型的新启动子不断被发现，并且是本领域技术人员所熟知的。“组织特异性启动子”是指并非在所有植物细胞中表达、而是仅在特定器官(如叶或种子)、特定组织(如胚或子叶)、或特定细胞类型(如叶薄壁组织或种子储存细胞)中表达的受调控的启动子。这些还包括在果实成熟期间在发育中的种子或果实中、在完全分化的叶中或在衰老开始时受到暂时调节的启动子(例如在胚发生的早期或晚期)。“诱导型启动子”是指那些可以在一种或多种细胞类型中通过外部刺激(如化学物质、光、激素、胁迫或病原体)启动的受调控启动子。诱导型启动子的实例是可由蜕皮激素、地塞米松、乙醇诱导的启动子。这样的启动子在现有技术中是众所周知的(例如，Samalova et al.(2005).pOp6/LhGR:a stringently regulated and highlyresponsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco.ThePlant Journal,41(6),919-935；Gatz&Lenk(1998).Promoters that respond tochemical inducers.Trends in Plant Science,3(9),352-358.)。
本发明的另一个主题是植物细胞，其包含编码瞬时或稳定整合的BnBBM衍生多肽的多核苷酸，和优选识别所述细胞基因组中预定位点的单链DNA断裂(SSB)或双链DNA断裂(DSB)诱导酶或碱基编辑酶，和任选的修复核酸分子，其中优选编码BnBBM衍生多肽的多核苷酸与合适的调节序列可操作地连接，使得植物细胞能够表达所述多肽。当进行上述用于修饰植物细胞基因组的方法时，可以获得这种植物细胞。
本发明的另一方面是SNP与编码如上所述的BnBBM衍生多肽的核酸的组合在用于从愈伤组织进行体细胞胚发生或器官发生和/或植物再生的方法中的用途。特别地，本发明公开了SNP与包含选自以下的编码核苷酸序列的核酸的组合的用途：
(i)SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:1的序列至少80％相同的序列；以及
(ii)编码具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2的序列具有至少80％相同的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列
其用于甜菜、玉蜀黍或菠菜从愈伤组织的体细胞胚发生或器官发生和/或植物再生的方法中；
用于直接或间接再生甜菜植物、玉蜀黍植物或菠菜植物的方法中；
用于在转化甜菜、玉蜀黍或菠菜植物细胞的方法中；或
用于修饰甜菜、玉蜀黍或菠菜植物细胞的基因组的方法中。
根据本发明的另一方面，上述方法和用途中SNP和BnBBM衍生多肽的活性可与编码WUS2多肽的多核苷酸、编码WUS2多肽的mRNA或WUS2多肽组合。特别优选的是玉蜀黍WUS2(ZmWUS2；cDNA:SEQ ID NO:12；蛋白质：SEQ ID NO:13)。
因此，除了引入包含编码BBM衍生的多肽的多核苷酸的表达盒之外，根据这个方面的本发明的方法进一步提供将包含编码WUS2多肽的多核苷酸、编码WUS2多肽的mRNA或WUS2多肽引入到所涉及的至少一个植物细胞中。编码WUS2多肽的多核苷酸可以整合到与BnBBM衍生的多核苷酸相同的表达盒中并可操作地连接到相同的调节元件。
WUS2可以作为包含第二编码核苷酸序列的表达盒提供给所述至少一个植物细胞，所述第二编码核苷酸序列
(i)具有SEQ ID NO：12的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：12的序列至少80％相同的序列；或
(ii)编码具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列或与SEQ ID NO：13的序列具有至少80％相同的序列的多肽，
其中所述第二核苷酸序列与异源调节元件可操作地连接。
此外，WUS2可以作为编码多肽的mRNA提供给所述至少一个植物细胞，所述多肽具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:13的序列至少80％相同的序列。
WUS2也可以作为具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列或与SEQ ID NO：13的序列至少80％相同的序列的多肽引入所述至少一个植物细胞。
此外，可以在至少一个植物细胞中诱导编码具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列或与SEQ ID NO：13的序列至少80％相同的序列的多肽的内源基因的增强的表达水平。这导致内源WUS2基因的表达水平提高，即植物细胞中WUS2多肽以提高的量存在或出现。
内源基因表达的激活可以通过修饰编码WUS2多肽的内源基因的启动子的活性或结构来实现。例如，可以通过基因编辑将增强子元件引入启动子；或者调节启动子的增强子元件可以进一步加强，或者调节启动子的沉默子元件可以通过例如靶向诱变/修饰而弱化；或者，可以通过基因编辑工具如CRISPR系统将修饰引入与增强子相关的表观基因组中(Hilton et al.(2015).Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-basedacetyltransferase activates genes from promoters and enhancers.Naturebiotechnology,33(5),510-517)；或者，可以将基于例如TALE激活剂或dCas9激活剂的合成转录因子引入到细胞中，其中它们能够结合启动子上或附近的靶向识别位点，并激活WUS2基因的转录(Cheng et al.(2013).Multiplexed activation of endogenous genes byCRISPR-on,an RNA-guided transcriptional activator system.Cell research,23(0),1163.)；或者，植物细胞中通过转录后抑制调节WUS2基因表达的microRNA(miRNA)的量可通过例如敲除(无效突变体)或敲低来降低，以增加植物细胞中翻译的WUS2多肽的量。
取决于植物物种以及细胞类型，需要不同水平的基因或表达活化，以便在再生发生时在植物细胞中存在足够量的WUS2多肽。本领域技术人员可利用各种技术来测量内源或引入的基因的实际表达水平，例如qPCR，RT-PCR，Northern印迹或微阵列。这些方法允许本领域技术人员通过常规工作来调节WUS2基因的表达水平，其影响来自不同组织或体细胞和生殖细胞(例如小孢子)的改善的再生能力。在一个优选的实施方案中，植物细胞中编码WUS2多肽的内源基因的表达水平增加至少2倍，3倍或5倍，优选10倍，25倍或50倍，更优选100倍，200倍或500倍。
如以上进一步描述的，可以通过应用一种或多种激活物或其前体来诱导植物细胞中内源基因的表达水平增强。这些激活物或其前体可以应用于培养植物细胞的培养基，然后被植物细胞主动或被动吸收。此外，一种或多种激活物或其前体可以通过显微注射、电穿孔或基因枪轰击直接引入植物细胞。除了上述合成的转录激活物之外，从现有技术中已知许多其它激活物，其可用于提高内源性基因的表达水平，特别是内源性WUS2基因的表达水平。近年来，化学植物遗传学和化学植物生物学的技术领域出现了用小分子处理生物系统以特异性干扰细胞功能。小分子在不同的系统中被商业化用作药物、除草剂和杀真菌剂，但近年来，它们也越来越多地被用作基因调控的工具。例如，化学遗传学涉及通过筛选化合物文库来发现具有各种细胞功能的小分子效应子(Dejonghe&Russinova(2017).PlantChemical Genetics:From Phenotype-Based Screens to Synthetic Biology.PlantPhysiology,pp-01805；Kawasumi,M.,&Nghiem,P.(2007).Chemical genetics:elucidating biological systems with small-molecule compounds.Journal ofInvestigative Dermatology,127(7),1577-1584.)。这种适合于激活靶基因如WLIS2的表达的小分子效应子可以通过遵循不同策略的化学筛选来鉴定(Dejonghe&Russinova，2017)。可以获得综合的化合物文库，其允许对无数小分子进行简单筛选并鉴定可用于激活WUS2等基因的基因表达的效应子。如上所述，提高内源性基因如WUS2的表达水平的另一种方法是应用所谓的合成的转录激活物。它们通常通过将识别结构域和至少一个激活物结构域的融合来设计。所述识别结构域可以来源于已知的系统，如锌指、TAL效应子或CRISPR；为了激活，将例如单纯疱疹病毒衍生的VP-16或VP-64激活结构域与识别结构域的融合可以引起转录的增加。较弱的激活结构域，如人NF-KB的AD，增添了基因激活的多种选择。此外，如内源性启动子所示，激活物的组合可用于引入协同效应(Moore et al.(2014).“Transcription activator-like effectors:a toolkit for synthetic biology.”ACSsynthetic biology,3(10),708-716.；US 2002/0046419 A1；Lowder et al.(2017).“Multiplexed transcriptional activation or repression in plants using CRISPR-dCas9-based systems.”Plant Gene Regulatory Networks:Methods and Protocols,167-184.)。合成的转录激活物可以递送到植物细胞，也可以作为前体引入植物细胞，即作为编码这种人工或合成的转录激活物或其结构域的DNA或RNA分子，或作为稍后在细胞中或在细胞的特定区室中激活的非活性形式的转录激活物。最后，WUS2基因的增强表达也可以通过上游负调节因子的失活或通过产生对这种负调节因子具有抗性的BBM基因的突变版本来实现。
根据上述方面，本发明进一步提供以下步骤(e)，其对步骤(a)中所用的至少一个植物细胞或步骤(a)中获得的愈伤组织的至少一个细胞进行上述方法：
(e)向所述至少一个植物细胞引入
(I)包含第二核苷酸序列的表达盒，所述第二核苷酸序列
(i)具有SEQ ID NO：12的多肽编码序列，或与SEQ ID NO：12的序列具有至少80％相同，优选地与SEQ ID NO：12具有至少85％，至少90％，更优选地至少95％，至少98％或至少99％相同的序列；或
(ii)编码具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列或与SEQ ID NO：13的序列具有至少80％相同，优选至少85％，至少90％，更优选至少95％，至少98％或至少99％相同的序列的多肽，
其中所述第二核苷酸序列与所述第一异源调控元件或第二异源调控元件可操作地连接；或
(II)mRNA，其编码具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:13的序列至少80％相同，优选至少85％，至少90％，更优选与SEQ ID NO:13至少95％、至少98％或至少99％相同的序列的多肽；或
III)多肽，其具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:13的序列至少80％相同，优选至少85％，至少90％，更优选与SEQ ID NO:13至少95％、至少98％或至少99％相同的序列；或
(IV)在所述至少一种植物细胞中诱导编码具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列或与SEQ ID NO：13的序列具有至少80％同一性，优选至少85％，至少90％，更优选至少95％，至少98％或至少99％同一性的序列的多肽的内源基因的增强的表达水平，和
其中在步骤(c)中培养所述愈伤组织以促进的胚生长和/或愈伤组织的出芽是在其中在愈伤组织中如上所述表达BnBBM衍生的多肽，并且WUS2多肽从表达盒表达，从引入的mRNA翻译，从内源基因表达增强或存在的条件下进行的。
第一和第二异源调节元件可以选自组成型启动子、诱导型启动子或诱导型表达系统。
表达盒的引入可导致其稳定整合到至少一种植物细胞或其后代细胞的基因组中。
本发明的另一方面是通过上述方法获得或可获得的转基因植物或其后代植物。此外，本发明提供了所述转基因植物的植物细胞或种子，其中所述植物细胞或种子包含作为转基因的至少一种目的核苷酸。
本发明的另一方面是通过上述方法获得或可获得的经修饰的植物或其后代植物。此外，本发明提供了所述转基因植物的植物细胞或种子，其中所述植物细胞或种子包含基因组中的修饰。
通过纯生物方法获得的细胞，植物，后代植物和植物部分不是本发明的主题。
除非在实施例中另有说明，否则所有重组DNA技术均根据Sambrook等人所述的标准方案进行。Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,SecondEdition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY and in Volumes 1and 2ofAusubel et al.(1994)Current Protocols in Molecular Biology,Current Protocols,USA。植物分子工作的标准材料和方法在Plant Molecular Biology Labfax(1993)byR.D.D.Cray(联合出版BIOS Scientific Publications Ltd(UK)and BlackwellScientific Publications,UK.)中有所描述。标准分子生物学技术的其它参考文献包括Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ThirdEdition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY,Volumes I and II of Brown(1998)Molecular Biology LabFax,Second Edition,Academic Press(UK)。用于聚合酶链式反应的标准材料和方法可以在Dieffenbach and Dveksler(1995)PCR Primer:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,和McPherson at al.(2000)PCR-Basics:From Background to Bench,First Edition,Springer Verlag,Germany中找到。
本文提及或引用的所有专利，专利申请和出版物或公开的公开内容(包括互联网上的出版物)通过引用整体并入本文。
将参考本文描述的以下附图和实施例进一步描述本发明。然而，应当理解，本发明不限于这些实施例。
附图：
图1在有和没有DEX诱导型BBM-GR表达的糖用甜菜中的枝芽形成。A：如果没有DEX诱导剂，就没有枝芽的形成；B：在用DEX诱导剂处理后形成许多枝芽(箭头)。
图2Dex诱导型35s-BnBBM-GR植物看起来与从无转基因的组织培养物再生的对照植物(对照)相当。
图3BnBBM增加了糖用甜菜中的基于愈伤组织的转化效率(转化速率的量化)，所述转化效率为可适应的和顽拗的基因型。A：诱导系统－对照，没有DEX诱导剂的BnBBM-GR和有DEX诱导剂的BnBBM-GR之间再生植物百分比的比较。B：组成型过表达-对照和35S-BnBBM过表达之间的比较。用在组成型启动子下的Tdt表达构建体转化的甜菜植物用作A和B中的对照。
图4 35S-BnBBM(组成型表达)产生胚(B，箭头显示胚(e))和幼苗(C，箭头显示根(r)和幼苗(s))，而用于糖用甜菜的基于标准愈伤组织的trafo仅产生枝条(A；箭头显示来自器官发生但没有根的枝芽(s*))。总之，转基因事件可以通过35S－BnBBM表达(D)产生。
图5 35S-BnBBM主要在无激素培养基上产生胚(B)，而在具有激素的正常再生培养基上产生枝芽和胚(A)。
图6BnBBM打破了糖用甜菜的顽拗性。与没有BnBBM过表达的相同基因型对照愈伤组织(A)相比，35S:BnBBM过表达顽拗基因型愈伤组织(B)。箭头表示枝芽。C：如B中所示的顽拗基因型的再生转基因植物。
图7具有载体70s-tDT的对照构建体与具有载体35S:BnBBM-GR的共转化的比较，以及具有诱导型BnBBM的载体70-tDT在两种不同基因型(顺从(左)和顽拗(右))中的比较。
图8组成型ZmWUS2过表达与组成型BnBBM过表达组合促进了基因枪递送后的玉米再生。箭头表示荧光胚结构。
图9IPR232-pS-01的载体图谱
图10IPR252-pS-01的载体图谱
图11IPR252-pK-02的载体图谱
图12在无激素培养基和BnBBM上再生的体外T0植物显示出正常的根发育。
图13SNP增强了甜菜顺应基因型9BS0448中的愈伤组织诱导。左栏：无SNP(A)，具有10pM SNP(C)和具有100pM SNP(E)的糖用甜菜顺应基因型9BS0448的愈伤组织诱导；箭头表示愈伤组织诱导。
右栏：无SNP(B)，具有10pM SNP(D)和具有100pM SNP(F)诱导的愈伤组织的近视图；箭头表示愈伤组织诱导。
图14SNP增强了糖用甜菜顺应基因型1RV6183中的愈伤组织诱导。无SNP(A)，具有10pM SNP(B)和具有100pM SNP(C)的糖用甜菜顺应基因型1RV6183的愈伤组织诱导；箭头表示愈伤组织诱导。
图15SNP促进了甜菜顽拗基因型8RV6921中的愈伤组织诱导。无SNP(A)，具有10pMSNP(B)和具有100pM SNP(C)的甜菜顽拗基因型8RV6921的愈伤组织诱导；箭头表示愈伤组织诱导。
图16不同基因型愈伤组织诱导的量化。用无SNP(＝标准)，10mM SNP和100mM SNP处理的甜菜基因型9BS0448，1RV6183和8RV6921的愈伤组织诱导率[％]。
图17不同基因型的甜菜愈伤组织枝芽诱导的量化。从用无SNP(＝标准)，用10mMSNP和用100mM SNP处理的甜菜基因型9BS0448和1RV6183的愈伤组织获得的枝芽的定量。
图18SNP增强了糖用甜菜基因型8RR3222中的愈伤组织诱导。无SNP(A)和具有100pM SNP(B)的甜菜基因型8RR3222的愈伤组织诱导。
图19SNP增强了糖用甜菜基因型6RR1798中的愈伤组织诱导。无SNP(A)和具有100pM SNP(B)的甜菜基因型6RR1798的愈伤组织诱导。
图20SNP增强了糖用甜菜基因型7RV5706(单倍体)中的愈伤组织诱导。无SNP(A)和具有100pM SNP(B)的糖用甜菜基因型7RV5706(单倍体)的愈伤组织诱导。
图21土壤杆菌介导的甜菜愈伤组织转化。
用10pM(A和B)或100pM(C和D)处理并随后通过农杆菌介导的方法用pZFN-nptll-70s::tDT转化的糖用甜菜愈伤组织在UV光显微镜下拍摄的照片。
图22质粒向甜菜愈伤组织中的基因枪递送。
已用SNP处理，随后通过基因枪轰击方法用pZFN-nptll-70s::tDT转化的甜菜愈伤组织在UV光显微镜下拍摄的照片。
图23SNP增加了玉米基因型9D1437中胚发生愈伤组织的形成。
无SNP(A-C)，具有10pM SNP(D-F)和具有100pM SNP(G-I)的玉米基因型9D1437的诱导愈伤组织的近视图。
图24pZFN-nptll-70s::tDT的载体图谱
图25用SNP诱导和用BnBBM转化的愈伤组织。
A：用100pM SNP诱导顽拗基因型1T4000(白色箭头)的愈伤组织并用BnBBM-GR转化，随后观察枝芽发育(黑色箭头)，如箭头所示。
B：顽拗性甜菜基因型1T4000的转化率[％]的量化。用或不用SNP诱导各自的愈伤组织，随后在70s启动子控制下用BnBBM-GR转化。当愈伤组织不用SNP处理时，没有获得转化体。而当用SNP诱导愈伤组织并用BnBBM-GR转化时，观察到枝芽发育。使用该两步法，获得的转化率为1.67％。
图26SNP对基因型9BS0448的种子产量的影响。
A：显示了糖用甜菜基因型9BS0448的单株的总种子数和存活种子数。这些植物或者从已经用10pM或100pM诱导的愈伤组织再生，或者常规获得(供体植物)。
B：对于不同的SNP处理以及使用供体植物的对照，显示了每株植物的存活种子的平均值，包括标准偏差。
总之，结果显示从用低SNP浓度(10pM)诱导的愈伤组织获得的植物中活种子显著减少，而用较高SNP浓度(100pM)诱导的愈伤组织导致产生活种子的植物以与常规获得的植物数量相当的方式发育。
图27SNP对基因型1RV6921的种子产量的影响。
A：显示了糖用甜菜基因型1RV6921的单株的种子总数和存活种子数。这些植物从用10pM或100pM诱导的愈伤组织再生，或从未经SNP处理的愈伤组织获得。
B：显示了不同SNP处理的每株植物的存活种子的平均值(包括标准偏差)以及没有SNP用于愈伤组织诱导的对照植物。
总之，结果显示与未经SNP处理的植物相比，用低SNP浓度(10pM)诱导的愈伤组织植物中的活种子减少。
用高SNP处理(100pM)从愈伤组织获得的植物比对照植物发育出显著更多的存活种子。这支持了图26所示的数据，并证实了当在愈伤组织诱导期间以足够的浓度施用时，SNP处理对植物发育的正效应。
图28在无激素培养基中通过BnBBM进行的胚发生。A：含有激素的培养基；B：不含激素的培养基。通过改变培养基组分，即完全除去GA3和BAP，体细胞胚形成显著增加。
图29来自无激素培养基的幼苗与来自含激素培养基的幼苗的比较。A：用植物激素GA3和BAP在培养基上再生芽；B：在无激素培养基上再生幼苗。
图30在没有激素的培养基上生长的幼苗(A和B)，发育正常的根系，左：俯视图；右侧：仰视图
图31通过粒子轰击获得的转基因35S-BnBBM-GR植物。A：体外培养的幼苗(左：俯视图；右侧：仰视图)；B：转移到温室后的小植株。
图32来自无激素方案的植物产生强壮的根系。
图33来自无激素方案的植物发育正常的地上部分(转移到温室后一个月)
图34温室栽培4个月后主根(植株1)形态分析
图35温室栽培4个月后主根(植株2)形态分析
图36来自无激素转化方案的转基因植物分析。
a：以[pE]为单位的光合作用速率
b：主根中的蔗糖浓度[pmol/g]
图37 35S：BnBBM-GR植物是可育的(单株幼苗方案)
a：每株植物的种子产量，以千克为单位
b：每株植物产生的活种子
图38种子产量的比较
图39在温室中发育4个月后主根的比较
A：种子衍生植物的主根
B：通过无激素转化获得的植物的主根
图40WT种子衍生植物和从无激素转化方案获得的转基因植物的主根参数
a：来自种子衍生的WT和通过无激素转化方案获得的转基因35S-BnBBM-GR植物的主根重量[g]的比较
b：来自种子衍生的WT和通过无激素转化方案获得的转基因35S-BnBBM-GR植物的蔗糖含量[umol/g FW]的比较
图41SDN-1混合电路现场测试的概念节省时间
图42应用的BBM版本和各自观察到的再生影响的示意图。
C-末端BBM缺失不再促进自发再生，而N-末端BBM缺失仍然诱导植物再生。与WT相比，N-末端BBM达到大约的水平。40％的再生胚性T1幼苗。
图43大致观察到的表型。10日龄35S::BnBBM和BnBBMAN拟南芥幼苗。在这两种情况下，幼苗都可以看起来是野生型(A)，在下胚轴和根的边界处显示胚性组织(B)，在子叶边缘和/或根尖发育体细胞胚(C)，或发育为无定形的胚性组织团块(D).
箭头表示胚组织。
图44转换比较(选择阶段：C3的结束)
在用过表达构建体(d35s-BnBBMAN)转化的组织中，观察到芽和胚形成[C&D]，对照品系-d35s-tDT[A&B]情况并非如此
图45BnBBM N-末端缺失(d35s-BnBBM-Nter)增加转化效率并引发胚发生N-末端缺失形式(BnBBMA/V)的过表达引发胚发生(A和B)。
再生可以是胚发生(A和B)和器官发生(C)。与对照系(d35s-tDT)(D)相比，BnBBMAN的过表达导致转化效率的明显增加。
图46说明来自d35s-BnBBM-Nter的每株植物的种子产量的条形图。
用d35s-BnBBMAN转化的甜菜植株是可育的并产生有活力的种子。
实施例
1.BnBBM的表达
BnBBM诱导表达的原理是基于大鼠糖皮质激素受体结构域与转录因子BnBBM(BnBBM-GR)的融合。在用地塞米松诱导后，GR受体结构域将改变构象，因此BnBBM-GR蛋白将进入细胞核并产生所需的反应。
二元质粒IPR232-pS-01和IPR252-pS-01由KWS用标准克隆方法产生。T-DNA还含有新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因，其赋予对一系列氨基糖苷类抗生素如卡那霉素或巴龙霉素的抗性，并用于转基因植物细胞和组织的选择。NOS启动子和pAG7终止子位于nptll基因的侧翼。二元载体的的骨架包含colE1和pVS1起点，分别用于大肠杆菌和根癌土壤杆菌中的质粒复制；以及赋予链霉素I大观霉素抗性的aadA基因，用于细菌选择。
二元载体pZFN-nptll-70s::tDT是通过以下标准克隆程序产生的。在该载体的T-DNA中，Tdt序列的cDNA被克隆在双CaMV 35S启动子和胭脂碱合酶(NOS)之间。T-DNA还含有新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因，其赋予对一系列氨基糖苷类抗生素如卡那霉素或巴龙霉素的抗性，并用于转基因植物细胞和组织的选择。NOS启动子和pAG7终止子位于nptll基因的侧翼。二元载体的的骨架包含colE1和pVS1起点，分别用于大肠杆菌和根癌土壤杆菌中的质粒复制；以及赋予链霉素I大观霉素抗性的aadA基因，用于细菌选择。
通过标准方法将二元质粒转化进AGL-1农杆菌菌株中。
2.Dex诱导的35S-BnBBM-GR增强含有激素的组织培养基中来自甜菜愈伤组织的枝芽形成
通过应用以下方法诱导了甜菜(糖用甜菜)的愈伤组织：微繁殖的枝芽用作起始材料。枝芽在含有MS盐，30g/l蔗糖，0.25mg/l苄基腺嘌呤(BAP)和10g/l琼脂(pH6.0)的培养基中繁殖。为了诱导易碎的愈伤组织，将叶外植体在含有MS盐，15g/l蔗糖，2mg/l BAP和8g/l琼脂(pH6.0)的培养基中孵育7－8周。
对于农杆菌介导的转化，将易碎愈伤组织固定在含有MS盐，30g/l蔗糖，1mg/lGA3，1mg/l TDZ和10g/l琼脂(pH6.0)的培养基中，并在24℃下在黑暗中保持1周。携带IPR232－pS－01载体的农杆菌(图12)在含有5g/l胰蛋白胨，2.5g/l酵母提取物，1g/lNaCl，5g/l甘露醇，0.1g/l MgSO4x7H2O，0.25g/l KH2PO4，1g/l谷氨酸(pH7.0)并补充适当抗生素的培养基中于28℃生长24小时。
用OD600＝0.3的农杆菌悬浮液接种愈伤组织，将愈伤组织和农杆菌在含有440mg/l CaCl2×2H2O，170mg/l KH2PO4，1.9g/l KNO3，180.7mg/l MgSO4，1.65g/l NH4NO3，2mg/lBAP，40pg/l乙酰丁香酮，20g/l蔗糖，2g/l葡萄糖和10g/l琼脂(pH6.0)的培养基上在21℃下在黑暗中孵育3天。
将愈伤组织传代培养到含有MS盐(Duchefa#0222)，30g/l蔗糖，1mg/l GA3，1mg/lTDZ，500mg/l替美汀和10g/l琼脂(pH6.0)的培养基中，并在黑暗中于24℃孵育1周。
为了选择转基因愈伤组织，将样品转移到含有MS盐(Duchefa#0222)，30g/l蔗糖，1mg/l GA3，1mg/l TDZ，500mg/l替美汀，10g/l琼脂(pH6.0)和100mg/l巴龙霉素的培养基中。将愈伤组织在24℃下在光/暗循环(16h/8h)中孵育3周。选择转基因愈伤组织并在相同的培养基和条件下传代培养数次，直到最后一次选择，该选择是在培养基中加入或不加入1pM地塞米松(DEX)诱导BnBBM-GR蛋白的情况下进行的。
BnBBM诱导表达的原理是基于大鼠糖皮质激素受体结构域(GR)与转录因子BnBBM(BnBBM-GR)的融合。在用地塞米松(DEX)诱导后，GR受体结构域将改变构象，因此BnBBM-GR蛋白将进入细胞核并产生所需的反应。
分离再生枝芽并在含有MS盐，30g/l蔗糖，0.25mg/l苄基腺嘌呤(BAP)，100mg/l卡那霉素和10g/l琼脂(pH6.0)的培养基中繁殖。从绿色生长枝芽中分离叶外植体用于DNA提取和PCR分析，以证实转基因的存在。将选择的枝芽在含有MS盐，30g/l蔗糖，6.25mg/l NAA和10g/l琼脂(pH6.0)的培养基中生根，并转移到温室中用于种子生产。
图1显示使用DEX，从愈伤组织形成许多枝芽(B)，而没有DEX，很少或没有枝芽形成发生(A)。从DEX诱导的枝芽形成获得的转基因植物与非转基因野生型植物(对照)相比在土壤上显示相似的形态(参见图2)。
因此，与无DEX培养基相比，DEX培养基上糖用甜菜愈伤组织的枝芽形成增加。土壤上无诱导物的转基因35s-BnBBM-GR植物不显示明显的表型。
3.BnBBM显著增加甜菜中基于愈伤组织的转化效率
对于转化率的定量a)，如上所述的基于DEX/GR的诱导型BnBBM系统以及BnBBM的组成型过表达已经在顺应基因型和顽拗基因型上进行了测试。作为对照，使用携带荧光标记基因tdTomato的载体转化各自的基因型。
a)如上所述，在培养基中加入或不加入DEX的情况下测试诱导型BnBBM系统。图3A显示从诱导的枝芽生长的再生转基因植物的定量。显然，通过DEX-诱导，转基因植物形成的频率显著增加。在两种基因型中，观察到转化效率增加7－8倍，在顽拗基因型中达到约18％，在顺应基因型中达到约70％。
b)对于在CaMV 35S启动子控制下的BnBBM组成型过表达，通过计数每板获得的转基因植物来确定转化效率(详细的转化方案参见实施例4)。产生的转基因植物从枝芽(来源于器官发生)或从愈伤组织(来源于胚发生)产生的胚生长(图9)。图3B示出了非常相似的趋势。组成型表达BnBBM的转化效率对于顺应基因型和顽拗基因型已增加至少10倍。
因此，由于BnBBM-GR与DEX的组合，基于愈伤组织的转化效率在顺应基因型和顽拗基因型中显著增加。在甜菜基因型中破坏顽拗型的类似结果也是通过组成型表达获得的。
4.组成型(过)表达产生胚和幼苗
使用与实施例2所述相同的转化方案，除了使用载体IPR252-pS-01代替载体IPR232-pS-01。作为阴性对照，产生了如实施例2所述的愈伤组织，但没有发生农杆菌感染。对于枝芽诱导和繁殖，收获愈伤组织并转移到含有MS盐，30g/l蔗糖，1mg/l GA3，1mg/l TDZ和10g/l琼脂(pH6.0)的枝芽诱导培养基中。将愈伤组织在24℃下在光/暗循环(16h/8h)中孵育1-2周。将再生的芽固定并在含有MS盐，30g/l蔗糖，0.25mg/l BAP和10g/l琼脂(pH6.0)的培养基中培养，并使植物在24℃下在明/暗循环(16h/8h)中生长。
至于诱导型表达，即使是BnBBM的组成型表达也会引起胚和幼苗发育(见图4B和C)，而基于标准愈伤组织的甜菜转化只产生枝芽(见图4A)。这表明BnBBM的组成型表达引发胚发生和器官发生。与对照相比，可以产生许多转基因事件(图4D)。
因此，BnBBM在甜菜中的组成型和诱导型表达发育体细胞胚和枝芽，而标准的基于愈伤组织的转化仅产生枝芽。
5.无激素培养基上的组成型(过)表达
使用与实施例4中所述相同的方案，除了不将植物激素TDZ和GA3加入培养基中。
从具有组成型表达BnBBM的愈伤组织中，主要可以在无激素培养基上获得胚(图5B)。当将这种组织置于具有激素的正常再生培养基上时，产生了枝芽和胚(图5A)。
6.用诱导型BnBBM共转化
对于共转化，将含有每种感兴趣载体的农杆菌以1：1的比例混合(载体35s::BnBBM-GR and载体70s-tDT)。用获得的农杆菌悬浮液接种愈伤组织。将愈伤组织和农杆菌在21℃下在黑暗中孵育3天，随后如实施例2中所述进行传代培养。共转化显示出显著增加的植物组织再生能力，导致在顺应和顽拗基因型中更有效的共转化速率(图7)。此外，如果已表达BnBBM，则提前三周获得共转化体。
用35s BnBBM和70s-tDT载体共转化得到相同的结果。
共转化效率的提高对于共递送用于共转化植物细胞的植物基因组的靶向修饰的基因组编辑组分特别重要。通过CRISPR/Cpf1系统的共递送，用BnBBM和所述基因组编辑组分共转化后成功获得SDN-1事件。
7.BnBBM的使用和激素的避免对TO水平的主根(贮藏器官)的发育产生积极影响
对于甜菜，特别是对于糖用甜菜或红甜菜，从愈伤组织体外再生的植物总是显示非典型表型，特别是对于下胚轴和根。通常，没有正常的根体发育，使得例如糖用甜菜或红甜菜的T0代不能用于测试根相关性状，例如糖积累，线虫抗性，根瘤菌抗性等或启动子表达分析。令人惊奇的是，本发明人发现通过BnBBM再生的，可诱导的，但没有激素的植物产生正常的主根。因此，根相关性状的表型分析和贮藏根成分的分析在T0水平是可能的。
图12显示了用诱导型BnBBM再生且没有激素处理的T0植物。
8.玉米基因枪递送法
通过微粒轰击，一种或多种增强基因、增强多肽、基因组工程成分和/或转基因通过金颗粒共同递送到玉米的未成熟胚中。基因枪递送已根据WO 2019/238911 A1中描述的方案进行。
可以使用例如Bio-Rad PDS-1000/He粒子枪或手持式Helios基因枪系统将增强基因、增强多肽、基因组工程组分和/或转基因递送到靶细胞中。多于一种的构建体可以与基因组工程组分同时共递送到靶细胞中。对于玉米植物的基因枪转化，使用了质粒IPR252-pK-02(图11)。
图8显示了ZmWUS2、BnBBM和荧光标记Tdt的基因枪共递送。轰击后一个月，三个荧光胚结构形成，这表明BnBBM与ZmWUS2结合促进玉米从未成熟胚再生。
9.糖用甜菜培养基中的SNP导致愈伤组织诱导增加
将不同基因型的微繁殖枝芽用作起始材料。枝芽在含有MS盐，30g/l蔗糖，0.25mg/l苄基腺嘌呤(BAP)和10g/l琼脂(pH6.0)的培养基中繁殖。
为了诱导脆性愈伤组织，将叶外植体在28℃下在含有MS盐，15g/l蔗糖，2mg/lBAP，8g/l琼脂，30pM HP或50pM HP，pH6.0与10pM SNP，100pM SNP或无SNP的培养基中孵育7-8周。
图13-15和18-20显示用SNP作为培养基组分，从基因型9BS0448，1RV6183，8RV6921，8RR3222，6RR1798和7RV5706的叶外植体诱导愈伤组织，而没有SNP时，只能观察到很少或没有枝芽形成。
图16显示来自基因型9BS0448，1RV6183和8RV6921的愈伤组织诱导率的定量。
对于基因型9BS0448和1RV6183，与在不含SNP的培养基上培养的组织相比，在培养基中含有10uM SNP时，仅观察到SNP的较小影响，然而当SNP增加到100pM时，获得几乎两倍的诱导率。对于顽拗基因型8RV6921，SNP的作用甚至更剧烈。在没有SNP的情况下，没有观察到愈伤组织诱导，而在10pM SNP的情况下，愈伤组织诱导率处于60％的水平，在100pM SNP的情况下，愈伤组织诱导水平甚至处于90％。
10.将玉米培养基中导致愈伤组织诱导增加的未成熟胚的SNP用于基因型9D1473中的玉米愈伤组织诱导。授粉后9-14天收获0.5-1.4mm的胚。
将未成熟胚置于含有MS盐，3.3mg/l麦草畏，0.7g/l脯氨酸，100mg酪蛋白水解产物，100mg/l肌-肌醇，30g/l蔗糖，95mg/lL-半胱氨酸，19.62mg/l乙酰丁香酮，15mg/lAgNO3，2.3g/l凝胶体，1.25mg/l CuSC，pH5.8的培养基中，在25℃下黑暗7天。
随后将胚转移到含有MS盐，3.3mg/l麦草畏，0.5g/l MES，100mg/l肌-肌醇，30g/l蔗糖，0.7g/l L-脯氨酸，100mg/l酪蛋白水解物，2.3g/l凝胶体，250mg/l羧苄青霉素，15mg/l AgNO3，pH5.8的培养基中，并在25℃黑暗下在C2上以不同的SNP方案每2周传代培养。
图23显示对于玉米基因型9D1437，与在不含SNP的培养基上培养的胚相比，作为培养基成分的SNP增加胚愈伤组织形成。
11.SNP诱导的糖用甜菜愈伤组织可用于农杆菌介导的转化
如上所述诱导糖用甜菜愈伤组织，并将易碎的愈伤组织固定在含有MS盐，30g/l蔗糖，1mg/l GA3，1mg/l噻苯隆(TDZ)和10g/l琼脂，pH6.0的培养基中，并在黑暗，24℃下保持1周。
携带载体pZFN-nptll-70s::tDT的农杆菌AGL-1在含有5g/l胰蛋白胨，2.5g/l酵母提取物，1g/l氯化钠，5g/l甘露醇，0.1g/l MgSO4x7H2O，0.25g/lKH2PO4，1g/l谷氨酸，pH7.0并补充适当抗生素的培养基中28℃下生长24小时。
在OD600为0.8时，将愈伤组织和农杆菌在含有440mg/l CaCl2x2H2O，170mg/lKH2PO4，1.9g/l KNO3，180.7mg/l MgSO4，1.65g/l NH4NO3，2mg/l BAP，40pg/l乙酰丁香酮，20g/l蔗糖，2g/l葡萄糖，10g/l琼脂，pH6.0的培养基中在21℃下在黑暗中孵育3天。
将愈伤组织传代培养到含有MS盐，30g/l蔗糖，1mg/l GA3，1mg/l TDZ，500mg/l替美汀和10g/l琼脂，pH 6.0的培养基中，并在黑暗中于24℃孵育1周。
为了选择转基因愈伤组织，将样品转移到含有MS盐，30g/l蔗糖，1mg/l GA3，1mg/lTDZ，500mg/l替美汀，100mg/l巴龙霉素和10g/l琼脂的培养基中，pH 6.0，并在24℃下在光/暗循环(16h/8h)下孵育3周。
选择转基因愈伤组织并在相同的培养基和条件下传代培养数次。
图21显示由SNP诱导的愈伤组织可用于农杆菌介导的转化，因为在用pZFN-nptll-70s::tDT转化后可见强烈的tdTomato信号。因此，由SNP诱导的愈伤组织可能与例如基因组编辑方法结合。
12.SNP诱导的糖用甜菜愈伤组织可用于基因枪递送
如上所述产生易碎的愈伤组织。通过将愈伤组织在含有MS盐，30g/l蔗糖，6.25mg/l NAA，10g/l琼脂，pH6.0的培养基中在室温黑暗中孵育2.5小时进行渗透处理。
金颗粒的制备和DNA包被通过标准方法进行，如PDS-1000/He说明书中所述。用pZFN-nptll-70s:tDT.涂覆金颗粒。
用PDS-1000/He单元(Bio-Rad)轰击愈伤组织，每次注射使用30ng包被有500ngDNA的金颗粒。破裂压力为450psi，靶组织放置在距离停止屏面9cm处。
图22显示由SNP诱导的愈伤组织可用于基因枪转化，因为在用pZFN-nptll-70s::tDT轰击后可见tdTomato信号。因此，由SNP诱导的愈伤组织可能与例如基因组编辑方法结合。
13.糖用甜菜枝芽再生
从诱导物中收获易碎的愈伤组织并转移到含有MS盐，30g/l蔗糖，1mg/l GA3，1mg/l噻苯隆(TDZ)，10g/l琼脂，pH6.0的枝芽诱导培养基中。将愈伤组织在24℃下在光/暗循环(16h/8h)中孵育1-2周。将再生的枝芽固定并在含有MS盐，30g/l蔗糖，0.25mg/l苄基腺嘌呤(BAP)，10g/l琼脂，pH 6.0的培养基中培养，并使植物在24℃下在明/暗循环(16h/8h)中生长。从SNP处理的愈伤组织再生的基因型9BS0448和1RV6183的枝芽没有显示明显的表型。
图17显示当用SNP诱导愈伤组织时，糖用甜菜基因型9BS0448和1RV6183的愈伤组织枝芽诱导明显地增加。
对于9BS0448，在没有SNP处理的情况下，仅从愈伤组织中获得非常少量的枝芽，而当用SNP诱导该基因型的愈伤组织时，观察到显著增加。
对于基因型1RV6183，可从未接受SNP处理的愈伤组织中获得显著数量的枝芽，然而当用SNP诱导愈伤组织时，在此也检测到明显的增加。
这些结果清楚地表明SNP处理对枝芽诱导的有益影响。
14.由SNP诱导并用BnBBM转化的顽拗基因型1T4000的糖用甜菜愈伤组织
如上所述诱导糖用甜菜基因型1T4000的微繁殖枝芽。为了诱导易碎愈伤组织，在28℃下将叶外植体在上述具有100pM SNP或不具有SNP的培养基中孵育7－8周。
获得的糖用甜菜愈伤组织已通过农杆菌介导的转化或通过在70s启动子控制下的BnBBM-GR基因枪递送进行转化。在转化过程中所用的培养基中没有给出SNP。
图25显示了用SNP诱导并用BnBBM转化的顽拗表型1T4000的愈伤组织。当在70s启动子的控制下用BnBBM-GR转化组织时，使用SNP观察到1.67％的转化率。在没有SNP和BnBBM处理的情况下，没有获得枝芽。
15.SNP对种子产量的影响
从通过包括SNP的愈伤组织诱导获得的糖用甜菜植株测定种子总数以及活种子数。将结果与通过无SNP的愈伤组织诱导获得的植物的数据或与未经历愈伤组织诱导和再生循环但常规获得的植物(供体植物)的数据进行比较。
对于这些方法，使用了两种糖用甜菜品系(1RV6921&9BS0448)，并且在愈伤组织诱导培养基中应用了两种不同的SNP浓度，分别为10pM和100um。
图26显示了用糖用甜菜基因型9BS0448获得的结果，因为已经使用了没有经历愈伤组织诱导和再生循环但已经常规获得的对照供体植物。如图26A和B所示，用低SNP浓度(10mum)处理导致每株植物相对低的活种子数。与供体植物以及用高SNP处理愈伤组织诱导获得的植物相比，存活种子的比率大约降低三分之二。令人惊讶的是，从具有10倍高SNP浓度的愈伤组织诱导获得的植物产生了与传统供体植物一样多的活种子。该观察结果是出乎意料的，因为与常规生产的植物相比，从愈伤组织诱导和再生获得的植物通常具有降低的种子生产率。
在图27中显示了来自糖用甜菜基因型1RV6921的关于活种子数目的结果。使用从愈伤组织产生的未经SNP处理的对照植物。图27b显示当用10um SNP诱导愈伤组织时，每株植物的活种子数再次相对较低。而当与来自10um方案的植物和没有使用SNP用于愈伤组织诱导的植物相比时，100um的愈伤组织诱导导致每株植物的活种子数明显增加。该观察结果支持图26的数据，并显示SNP处理不仅对愈伤组织再生而且对所得植物的质量的有益作用。
16.植物在有和没有激素的培养基上的发育
用35S-BnBBM-GR转化糖用甜菜愈伤组织，并置于含激素(GA3和BAP)或不含激素的标准培养基上。通过省略激素GA3和BAP作为培养基成分，与在含有激素的培养基上培养的愈伤组织相比，体细胞胚形成明显更显著(图28和B)。在标准方案中，枝芽的发育是清楚可见的。
在随后的发育过程中，来源于在不含激素的培养基上培养的胚的幼苗发育出正常的根系(图29)，而在含有激素的培养基上培养的枝芽没有表现出根(图29)。用于植物发育的该方案也称为单苗方案。
在图30和B中显示了从在无激素培养基上生长的幼苗发育的植物。这些植物没有明显的表型，并且在没有人工诱导根生长的情况下形成正常的根系。可以证明通过农杆菌转化(参见图28-30)以及通过粒子轰击(图31)可以实现对BnBBM的这种有益效果。通过粒子轰击转化获得的转基因35S-BnBBM-GR植物在体外发育成适当的根系(图31A)。在转移到温室中后，这些植物不产生明显可见的表型(图31B)，并且具有与通过农杆菌介导的转化获得的植物相似的外观。
17.植物移土温室栽培后的发育
1-3个月后，根据发育状况将植物从无激素培养基转移到土壤中，并在温室中培养1个月。在图32中，显示了这种甜菜植物的根系，其是从在无激素培养基上生长的幼苗发育的。该植物表现出健壮的根系，并且这些植物的地上部分也没有发展出明显的表型(图33)。
在温室中4个月后，评估主根的形态。在横截面中，整体尺寸和整体外观没有观察到主根形态的明显异常(图34和35)。除了主根形态外，还有光合作用速率(图36a)和主根中的蔗糖浓度(图36b)。
如图36a所示，三种植物的光合作用速率每天测定两次。所有结果大约在15microEinstein到25microEinstein的范围内。
在图36b中，对于三种不同的植物，以umol/g表示在主根中蔗糖含量的结果，结果在475和505umol/g之间。
淀粉和可溶性糖含量
提取：植物材料用80％的乙醇在80℃下提取1小时。可溶性糖溶于乙醇。在真空离心机的帮助下将提取物干燥，并将物质溶解在水中。如果还没有用于乙醇提取，将剩余的提取材料研磨，，并在95℃下再次用0.2N KOH提取1小时。在该步骤中淀粉被部分水解和溶解。将样品冷却至室温后，加入1M乙酸以将pH设定为5-6。通过添加适当量的淀粉葡糖苷酶和α-淀粉酶并在37℃下孵育至少4h，并且另外在室温下过夜，淀粉降解成葡萄糖。
浓度测定：水溶液用于通过使用任何类型光度计的耦合光酶测试来测量葡萄糖，果糖，蔗糖和淀粉(经由葡萄糖)的浓度。测量缓冲液含有100mM HEPES pH7.4，1mM NAD，2mMATP，10mM MgCl2和适量的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。添加水性提取物后，在l＝340nm(0值)的波长下测量消光/吸收。为了测量葡萄糖，添加适当量的己糖激酶并测量足够长的时间以将所有葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸和将果糖转化为果糖-6-磷酸。为了测量果糖，添加适量的磷酸葡萄糖异构酶以将所有果糖-6-磷酸转化为葡萄糖-6-磷酸。为了测量蔗糖，添加适当量的转化酶(β-果糖苷酶)以将蔗糖完全分解为葡萄糖和果糖，其又进一步转化为葡萄糖-6-磷酸中间体。每当在这一系列的酶反应中产生葡萄糖-6-磷酸时，它被进一步氧化成葡糖酸-6-磷酸，同时NAD还原成NADH。由于NAD不吸收340nm波长的光，而NADH吸收，因此后一种减少给出了相应浓度的读数。借助NADH在340nm处的消光系数和朗伯-比尔公式，可以计算溶液中NADH的浓度。已知葡萄糖和果糖产生等摩尔浓度的NADH，可以计算两种糖浓度。对于1摩尔蔗糖，会形成2摩尔NADH。通过还知道样品重量和过程中使用的液体体积，可以根据测量的浓度计算葡萄糖、果糖、蔗糖和淀粉的量(每质量的己糖摩尔单位)。
来自无激素转化的植物的所述数据在种子衍生植物的正常范围内。
通过无激素转化方案获得的转基因35S-BnBBM-GR植物显示正常发育和适当发育的根系，而且这些植物也能如图37所示繁殖。从5株不同的转基因植物中确定了以千克为单位的每株植物的种子重量(图37)，此外还计算了每株植物的活种子数(图38)。
4株植物的种子重量结果约为0.015千克/株，其中一株植物的种子几乎为0.045千克。已从所有5株受试植物中获得活种子；然而，结果显示每株植物30粒活种子至每株植物1100粒活种子的一定范围。
在图38中，比较了通过不含BnBBM的基于农杆菌的标准转化获得的植物，所述的具有BnBBM的无激素转化方法和源自作为参考的SB品系9BS0448种子的植物之间的每株植物的活种子数。呈现的结果显示转基因35S-BnBBM-GR植物的种子产量优于通过标准农杆菌转化方法获得的植物。
18.分析来自无激素环境的第二批植物的主根。
在温室中生长4个月后，从种子衍生的甜菜植物或从源自实施例9的转基因35S-BnBBM-GR植物收获主根。如图39和40所示，没有明显的差别。
此外，分析了主根重量(图40)以及蔗糖含量(umol/g FW(鲜重))(图40)。在图40a中，显示了来自WT(野生型)种子的植物和来自无激素途径的转基因35S-BnBBM-GR的根重。结果在约100-350g之间变化。对于蔗糖含量，已经测定350-520umol/g FW的值。
总之，这些结果表明来自所述无激素方案的转基因植物的主根重量以及蔗糖含量与种子来源的野生型对照相当。
19.BnBBM C-端或N-端缺失的影响
拟南芥实验
载体构建
将用于拟南芥中稳定转化的BBMA(1-161)和BBM(390-579)缺失构建体进行PCR扩增，然后克隆到源自pGSC1700(Cornelissen and Vandewiele,1989)的pTYG52二元载体中。
拟南芥中的各个序列在35S启动子的控制下。
植物转化和选择
所有构建体均使用浸花法进行转化(Clough and Bent,1998)。如前所述(Horstman et al.,2017)，用液体漂白剂对种子进行灭菌，并将其接种在>2MS-10培养基(含维生素的半强度Murashige和Skoog盐，pH 5.8，1％蔗糖和0.8％琼脂)和膦丝菌素上(PPT)供选择。将T1-植物在21℃(16h光照/8h黑暗循环)培养10天，之后使用立体显微镜通过视觉检查评估表型。T1-幼苗被评分为非胚发生的(图43A)或胚发生的(图43B-D)。从表达全长BnBBM或BBM△(1 -161)构建体的转基因幼苗观察到的典型表型示于图42中。
数据表明BnBBM蛋白的N-末端区域对于其功能不是绝对必需的，因为这样的N-末端截短的蛋白仍然能够诱导体细胞胚发生。相反，BnBBM蛋白的C-末端区域的缺失损害了其功能，因为其异位表达不足以诱导体细胞胚发生。C-端蛋白质序列可能是必需的BBM蛋白质-蛋白质相互作用、BBM转录激活和/或BBM蛋白质稳定性所必需的。
总之，尽管可以说没有明显的解释，该结果可以被理解为预料不到的。
糖用甜菜实验
BnBBM的全长和N-截短版本的甜菜结果以与拟南芥描述类似的方式获得。与对照实验(图44和图45D)相比，使用BnBBM的N-截短版本可以实现更高的转化频率。
可以看到，与N-截短版本相比，全长BnBBM版本在变换频率方面的效率提高了三倍。这与拟南芥数据一致。
序列：
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Claims (15)

1.一种促进植物体细胞胚发生或器官发生的方法，包括以下步骤：
(a)从至少一个植物细胞诱导愈伤组织形成，包括在硝普钠(SNP)存在下，特别是在包含SNP的培养基中孵育所述至少一个植物细胞，和
(b)向步骤(a)中使用的至少一个植物细胞中或向步骤(a)中获得的愈伤组织的至少一个细胞中引入包含编码核苷酸序列的表达盒，所述编码核苷酸序列选自：
(i)SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:1的序列至少80％相同的序列；以及
(ii)编码具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2的序列至少80％相同的序列的多肽的核苷酸序列，
其中所述核苷酸序列与异源组成型调节元件或异源诱导型调节元件可操作地连接；以及
(c)在促进从愈伤组织生长出胚和/或枝芽的条件下培养在步骤(b)中获得的愈伤组织，其中在所述愈伤组织中，所述多肽由所述表达盒组成型表达或在诱导所述异源诱导型表达系统时表达。
2.根据权利要求1的方法，其中所述异源组成型调节元件是组成型启动子。
3.根据权利要求1的方法，其中所述异源诱导型调节元件是诱导型启动子或诱导型表达系统。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中步骤(b)包括农杆菌介导的转化、粒子轰击、电穿孔或微注射。
5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中步骤(a)的所述至少一个植物细胞是体细胞或胚细胞，优选分离自植物的外植体或其部分。
6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中所述至少一个植物细胞是来自甜菜(Betavulgaris)、玉蜀黍(Zea mays)或菠菜(Spinacia oleracea)的植物细胞。
7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中在步骤(b)中引入所述表达盒导致其稳定整合到所述至少一个植物细胞或其后代细胞的基因组中。
8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中在步骤(c)中，胚直接从愈伤组织生长。
9.根据权利要求1至7中任一项的方法，其中在步骤(c)中，枝芽直接从愈伤组织生长。
10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中步骤(c)中的培养在不含植物激素的培养基中进行。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，进一步包括以下步骤：
(d1)将至少一种感兴趣的核苷酸序列导入步骤(a)中使用的至少一个植物细胞或其前体，或导入步骤(a)中获得的愈伤组织的至少一个细胞，其自身或其后代用于步骤(b)中或已经用于步骤(b)中，和/或
(d2)修饰步骤(a)中使用的至少一个植物细胞或其前体的基因组，或修饰步骤(a)中获得的愈伤组织的至少一个细胞的基因组，所述至少一个细胞其本身或其后代随后用于步骤(b)或已经用于步骤(b)，通过向所述细胞引入单链DNA断裂(SSB)诱导酶或双链DNA断裂(DSB)诱导酶，其优选识别所述细胞的基因组中的预定位点，和任选存在的修复核酸分子，或通过引入单链DNA断裂(SSB)诱导酶，其优选识别所述细胞的基因组中的预定位点并与碱基编辑酶融合，
其中所述基因组的修饰选自
I.至少一个核苷酸的取代；
II.至少一个核苷酸的缺失；
III.至少一个核苷酸的插入；以及
IV.I.-III.的任意组合。
12.一种生产植物的方法，包括
根据权利要求1-10中任一项的方法的体细胞胚发生或器官发生，
任选地根据权利要求11(d1)或(d2)所述的转化或基因组修饰，以及
从权利要求1-10中任一项的方法的步骤(c)产生的胚和/或枝芽再生植物，特别是权利要求11的方法的步骤(d1)产生的转基因植物和/或权利要求11的方法的步骤(d2)产生的修饰的植物。
13.通过权利要求12的方法获得或可获得的转基因植物或经修饰的植物或其后代植物。
14.权利要求13的植物的植物细胞或种子，其中所述植物细胞或种子包含作为转基因的至少一个感兴趣的核苷酸序列，或者其中所述植物细胞或种子包含基因组中的修饰。
15.SNP与选自以下的编码核苷酸序列的组合的用途：
(i)SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:1的序列至少80％相同的序列；以及
(ii)编码具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：2的序列至少80％相同的序列的多肽的核苷酸序列，
其中所述核苷酸序列与异源组成型调节元件或异源诱导型调节元件可操作地连接，
所述用途为
(a)用于从至少一种植物细胞，优选来自甜菜、玉蜀黍或菠菜的植物细胞诱导愈伤组织形成的方法中，或用于植物从愈伤组织的体细胞胚发生或间接再生的方法中，所述植物优选甜菜植物、玉蜀黍植物或菠菜植物；
(b)用于植物细胞，优选来自甜菜、玉蜀黍或菠菜的植物细胞的转化方法中，或用于修饰植物细胞，优选来自甜菜、玉米或菠菜的植物细胞的基因组的方法中，或
(c)用于转基因植物细胞、植物或种子的生产，优选来自甜菜、玉蜀黍或菠菜的转基因植物细胞、植物或种子，或用于遗传修饰的植物细胞，植物或种子的生产，优选来自甜菜、玉蜀黍或菠菜的植物细胞，植物或种子。
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