CN111655027B - 在组蛋白去乙酰化酶抑制剂存在下再生植物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物育种领域，尤其涉及由细胞和其它组织进行植物再生。更具体地，本发明提供了使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂改善愈伤组织形成和由愈伤组织进行的植物再生的方法和手段。

Description

在组蛋白去乙酰化酶抑制剂存在下再生植物
技术领域
本发明涉及植物育种领域，尤其涉及由细胞和其它组织再生植物。更具体地，本发明提供了使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂改善愈伤组织形成和由愈伤组织再生植物的方法和手段。
发明背景
植物再生包括细胞、组织和器官在限定的物理和化学条件下进行体外培养。植物中的再生很早便是公知的。在植物中，分化的细胞能够在适当的培养条件下再生为完整的组织阵列。再生可涉及直接或间接器官形成。在直接再生中，由外植体组织直接诱导出体外器官；在间接再生中，通常由中间组织愈伤组织形成新生器官。植物愈伤组织是可以产生新组织的未分化的结构。通过用不同比例的激素对其进行处理，可以由生长的愈伤组织不同地诱发出植物叶、芽、根和胚。
通常，在整个植物再生过程中可以识别出三个阶段。首先，外植体组织的体细胞可以响应激素信号，以获得与分生细胞类似的特征，这一过程称为“去分化”。其次，对具有器官生成能力的愈伤组织细胞进行重新编程，并在激素平衡的影响下确定特定器官的形成。第三再生阶段是形态发育，其与外源供应激素无关。因此，外源激素治疗是触发体外再生早期发育事件的关键因素。
然而，对于许多植物而言，获得可以再生为完整植物的去分化细胞(愈伤组织)并不总是可行的。众所周知，甜菜难以进行去分化和植物再生。这些困难是例如通过农杆菌介导转化程序获得转基因甜菜的主要障碍。几十年来，育种者和研究人员一直在致力于研发更有效的方案，以转化和再生愈伤组织形成困难(recalcitrant)的植物。通常，此类植物表现出基因型变异，导致不同品系之间的愈伤组织和芽形成率产生巨大的差异(Ivic-Haymes&Smigocki(2005)，“Identification of highly regenerative plants withinsugar beet(Beta vulgaris L.)”，In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant，41(4)，483-488；Mishutkina&Gaponenko(2006)，“Sugar beet(Beta vulgaris L.)morphogenesis in vitro:effects of phytohormone type and concentration in theculture medium,type of explants,and plant genotype on shoot regenerationfrequency”，Russian Journal of Genetics)，42(2)，150-157；Tomita等(2013)，“Evaluation of the potential for somatic embryogenesis in sugar beet(Betavulgaris L.)breeding lines and improvement of regeneration efficiency”，PlantBiotechnology，30(5)，479-487)。通常，某些基因型的再生根本不可行。Kishchenko等，2005(“roduction of transgenetic sugarbeet(Beta vulgaris L.)plants resistantto phosphinothricin”，Cell biology international，29(1)，15-19)以及Kagami等2015(“Sugar beet(Beta vulgaris L.)”，Agrobacterium Protocols：Volume 1，335-347)公开了用于甜菜转化公知方案，但是这些方案具有很强的基因型依赖性。
在诱导单倍体胚胎发生以由例如小孢子产生双单倍体植物的情况下，已经发现，通过向培养基中添加如曲古菌素A(trichostatin A，TSA)的HDACi(组蛋白去乙酰化酶抑制剂)，可以使大大增加的源自多种植物物种的雄配子体的细胞经历胚胎发生生长(WO2015/044199A1)。然而，在愈伤组织形成和再生中使用TSA是相当不乐观的。在Furuta等((2011)，“The CKH2/PKL chromatin remodeling factor negatively regulates cytokininresponses in Arabidopsis calli”，Plant and cell physiology，52(4)，618-628)中，拟南芥中突变体cytokinin hypersensitive 2(ckh2)的表征显示，组蛋白去乙酰化与细胞因子诱导的愈伤组织生长密切相关。在促进下胚轴外植体愈伤组织生长中，TSA的应用已被用作细胞分裂素的部分替代品。细胞分裂素(激动素)和TSA既不单独也不联合诱导愈伤组织生长。近来，Lee等((2016)，“Histone deacetylation-mediated cellulardedifferentiation in Arabidopsis”，Journal of plant physiology，191，95-100)描述了，组蛋白去乙酰化是拟南芥从叶片外植体形成愈伤组织所必需的。然而，用TSA进行处理导致愈伤组织形成具有缺陷。作为此的支持，一个亚组的HDAC基因在愈伤组织中上调，且某些hdac突变体表明愈伤组织形成能力降低。
总结这些发现，似乎在拟南芥中TSA对由叶片诱导的愈伤组织具有相反的作用，并且与细胞分裂素组合，TSA并不在下胚轴外植体中诱导愈伤组织。
令人意外地是，本发明人发现，组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)，如TSA，对Betavulgaris物种植物(如糖用甜菜)中的愈伤组织诱导具有积极作用。TSA和其它HDACi的这种作用之前尚未针对间接再生方案证明，或证明可以克服例如甜菜基因型的困难。重要的是，TSA或任何其它HDACi均未用于任何作物转化方案中以提高效率。
因此，本发明的第一方面是HDACi在用于由植物细胞，特别是由体细胞植物细胞或胚胎植物细胞，优选地是由分离自植物的外植体或其部分，诱导愈伤组织形成或产生具有增强的芽再生能力的愈伤组织的方法中的用途。胚胎植物细胞优选是非单倍体细胞。与在不使用HDACi的情况下产生愈伤组织和相同基因型的相同方法对比评估了芽再生的增强能力。
发明简述
本发明提供了一种用于由至少一个植物细胞诱导愈伤组织形成或产生具有增强的芽再生能力的愈伤组织的方法，该方法包括在HDACi的存在下培养该至少一个植物细胞的步骤。原则上，仅使用一个植物细胞就足以实施本发明的方法。因此，如果在下文中使用多个“植物细胞”，则该措辞必须理解为需要最少数量的植物细胞。
适用于本发明方法的植物细胞包括胚胎植物细胞和体细胞植物细胞。这些植物细胞的提供方式对于根据本发明的方法而言并不重要。例如，可以从分离自植物的外植体中提供胚胎或体细胞植物细胞。植物的哪一部分适合获得外植体取决于特定的植物物种。通常，合适的植物细胞可以从例如植物的下胚轴、叶柄、芽和轴向分生组织、叶片、花、薄壁组织或薄壁组织细胞、节间、种子、胚和根获得。
根据本发明，“组蛋白去乙酰化酶抑制剂”或“HDACi”是指抑制组蛋白去乙酰化酶的任何化合物。应当理解，HADCi可以是单一化合物或几种化合物的组合。适于提供所需组蛋白去乙酰化酶抑制活性的化合物的优选类型是异羟肟酸和异羟肟酸酯，例如，曲古菌素A(TSA)、伏立诺他(SAHA)、贝利司他(PXD101)、LAQ824和帕比司他(LBH589)。根据本发明，优选使用TSA作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂。根据本发明使用的HDACi的其它示例包括环状四肽(例如，trapoxin B)和缩肽、苯甲酰胺(例如，恩替诺特(MS-275)、CI994和mocetinostat(MGCD0103))、亲电子酮和脂族酸化合物(例如，苯丁酸乙酯和丙戊酸)。
培养植物细胞可包括使植物细胞在包含HDACi的培养基中生长。可替代地或另外地，例如可以通过轰击、电穿孔或显微注射或者技术人员公知的任何其他方法将HDACi引入植物细胞中。根据本发明，优选在含有HDACi的培养基中生长植物细胞。可以使用本领域公知的任何愈伤组织诱导培养基(CIM)进行培养步骤。原则上，几种类型的基础盐混合物可以用于细胞培养，但是最优选地，该培养基包括改良的MS(Murashige and Skoog)培养基、White氏培养基或木本植物培养基。
根据本发明的优选方面，CIM补充有HDACi。培养基中HDACi的浓度范围可以为约0.01μM至约5.0μM。发现不同植物对HDACi的耐受性不同。至少在一些植物中，HDACi(尤其是TSA)的浓度超过5.0μM可能具有细胞毒性。为了实现所需的对愈伤组织形成的促进，培养基中HDACi的浓度优选在0.01μM至1.0μM的范围内。
除HDACi之外，还可以在培养基中使用一种或多种其他添加剂。例如，可以向培养基中补充植物生长调节剂，例如，植物生长素、细胞分裂素和赤霉素，以诱导愈伤组织形成。可以提供维生素来促进生长，例如Gamborg B5维生素。富集氮、磷和钾也被证明是有帮助的。
令人意外地是，发现本发明的方法适合于诱导愈伤组织形成或产生具有增强的芽再生能力的愈伤组织，即使在困难植物物种或植物基因型中也适合。因此，使用本发明的方法可以改善困难植物物种或植物基因型的间接再生。
在本发明的优选实施方案中，可以先诱导愈伤组织形成，再由愈伤组织再生芽。由于根据本发明HDACi，特别是TSA的使用促进了愈伤组织形成，因此产生了用于植物再生的改良方法。本发明人发现，通过使用HDACi，特别是TSA，经常形成更多的愈伤组织，但是即使没有形成更多或甚至形成更少的愈伤组织，愈伤组织的质量也得到了明显的改善，即，形成的愈伤组织显示出增强的芽再生能力。因此，本发明提供了一种用于由愈伤组织再生芽的方法，其包括以下步骤：
(a)如上所述由至少一个植物细胞诱导愈伤组织形成，以及
(b)在促进由愈伤组织长出芽的条件下培养步骤(a)中获得的愈伤组织。
合适的培养条件是技术人员公知的。根据所涉及的植物，这些条件可能有所不同。
根据本发明的另一个方面，可以在转化植物细胞的方法以及修饰植物细胞基因组的方法中利用HDACi对愈伤组织形成的有益作用。人们发现，在困难植物物种或植物基因型中，通过使用HDACi可以提高转化效率。因此，本发明还涉及HDACi在转化植物细胞的方法中的使用，以及HDACi在修饰植物细胞基因组的方法中的使用。
因此，本发明提供了一种用于转化植物细胞的方法，其包括以下步骤：
(a)如上所述由至少一个植物细胞诱导愈伤组织形成，以及
(b)将至少一个目的核苷酸序列引入到将在步骤(a)中使用的植物细胞和/或步骤(a)中获得的愈伤组织的细胞中。
诱导愈伤组织形成的步骤(a)使用上文所述的方法进行。优选地，愈伤组织形成是在TSA的存在下诱导的，TSA可以添加到培养基中或直接引入植物细胞中。
在步骤(b)中，通过以引起核酸序列的稳定或瞬时表达的方式将核酸分子引入细胞中来转化细胞。现在，单子叶和双子叶植物细胞的转化都是常规的，最合适的转化技术的选择将由实验者来确定。方法的选择将根据待转化植物的类型而有所不同；本领域技术人员应认识到特定方法对于给定植物类型的适用性。合适的方法可包括但不限于：电穿孔植物原生质体；脂质体介导转化；聚乙二醇(PEG)介导转化；使用病毒进行转化；微量注射植物细胞；微粒轰击植物细胞；真空渗入；以及农杆菌介导转化。
根据本发明的一个实施方案，将至少一个目的核苷酸序列引入到将在诱导愈伤组织形成的步骤(a)中使用的植物细胞中。应当理解，在这种情况下，步骤(b)在步骤(a)之前进行。根据本发明的另一个实施方案，将至少一个目的核苷酸序列引入步骤(a)中获得的愈伤组织的细胞中。应当理解，在这种情况下，步骤(b)在步骤(a)之后进行。根据本发明的又一个实施方案，在愈伤组织诱导/形成过程中将至少一个目的核苷酸序列引入植物细胞中，即，步骤(a)和(b)并行或同时进行。此外，可以将目的核苷酸序列引入将用于愈伤组织形成的细胞和步骤(a)产生的愈伤组织的细胞中。根据该实施方案，该方法包括以下步骤：
(i)将至少一个目的核苷酸序列引入植物细胞中，
(ii)由步骤(i)中获得的细胞诱导愈伤组织形成，以及
(iii)将至少一个目的核苷酸序列引入步骤(ii)中获得的愈伤组织的细胞中。
引入至少一个目的核苷酸序列的步骤可以使用本领域通常已知的任何合适的方法来进行。有多种方法可用于将目标核酸转移到植物细胞中。一种示例性的载体介导方法是农杆菌介导转化，例如对于甜菜如Lindsay&Gallois，1990，Journal of ExperimentalBotany，以及Kischenko等，2005，Cell Biology International所述，对于玉米如Ishida等，2007，Agrobacterium-mediated transformation of maize所述，或者对于小麦如日Japan Tobacco company的PureWheat Technology所述。其他合适的技术包括粒子轰击、真空渗入、浸花法和电穿孔。
根据本发明的目的核苷酸序列可以是DNA或RNA序列，例如mRNA、siRNA、miRNA等。更特别地，该目的核苷酸序列编码至少一种表型性状。优选地，由DNA或RNA赋予的表型性状可选自由以下各项所构成的组：对生物胁迫的抗性/耐性，包括病原体抗性/耐性，其中病原体可以是病毒、细菌、真菌或动物病原体；对生物胁迫的抗性/耐性，包括抗/耐冷性、干旱胁迫抗性/耐性、抗/耐渗透性、抗/耐热性、抗/耐寒性或霜冻性、氧化胁迫抗性/耐性、抗/耐重金属性、盐胁迫或水渍抗性/耐性、抗/耐倒伏性、抗/耐落粒性，或对一种或多种除草剂(如草甘膦、草铵膦、2,4-D、麦草畏、ALS抑制剂)的抗性/耐性等。该至少一种目的表型性状还可选自由以下各项所构成的组：修饰其它目的农艺性状，包括产量增加、开花时间修饰、种子颜色修饰、胚乳成分修饰、营养成分修饰或目的途径代谢工程。
如本文所使用的，核酸(分子)或核苷酸(序列)或多核苷酸是指DNA和RNA。DNA还包括cDNA和基因组DNA。核酸分子可以是单链或双链的，并且可以化学合成或通过体外或甚至体内的生物表达来产生。
很明显，如果参考相应DNA分子的核苷酸序列来定义RNA分子的核苷酸序列，就应该用尿嘧啶(U)代替核苷酸序列中的胸腺嘧啶(T)。根据本申请的上下文，将清楚究竟是提及RNA分子还是DNA分子。
此外，本发明还提供了一种用于修饰植物细胞基因组的方法，其包括以下步骤：
(a)如上所述由至少一个植物细胞诱导愈伤组织形成，以及
(b)修饰将在步骤(a)中使用的植物细胞和/或步骤(a)中获得的愈伤组织的细胞的基因组，所述修饰通过将位点特异性效应酶以及任选的修复核酸分子引入所述细胞中来进行，优选所述位点特异性效应酶识别所述细胞的基因组中的预定位点，
其中，所述基因组的修饰选自
i.替换至少一个核苷酸；
ii.缺失至少一个核苷酸；
iii.插入至少一个核苷酸；或
iv.i.-iii.的任何组合。
诱导愈伤组织形成的步骤(a)通过上文所述的方法进行。优选地，在作为HDACi的TSA存在下诱导愈伤组织形成；可以将TSA添加到培养基中或直接引入到植物细胞中。
在步骤(b)中，修饰细胞基因组是通过双链DNA断裂(DSB)诱导酶或单链DNA断裂(DSB)诱导酶(切口酶)来完成的，所述酶优选识别所述细胞的基因组中的预定位点。
修饰基因组的步骤可以在诱导愈伤组织形成之前和/或之后进行。因此，根据本发明的第一方面，如步骤(b)中所述对植物细胞的基因组进行修饰，然后将所得的修饰的植物细胞用于诱导愈伤组织形成的后续步骤(a)中。根据本发明的另一个方面，首先进行诱导愈伤组织形成的步骤(a)，然后在步骤(b)中借助于位点特异性效应酶修饰所得的愈伤组织的至少一个细胞。根据本发明的又一个实施方案，在愈伤组织诱导/形成过程中，如步骤(b)所述修饰植物细胞的基因组，即，步骤(a)和(b)平行或同时进行。此外，可以修饰在愈伤组织形成步骤中使用的植物细胞和诱导愈伤组织形成步骤获得的愈伤组织细胞的基因组。根据本发明的这个方面，该方法包括以下步骤：
(i)修饰植物细胞的基因组，
(ii)由步骤(i)中获得的细胞诱导愈伤组织形成，以及
(iii)修饰步骤(ii)中获得的愈伤组织细胞的基因组。
位点特异性效应酶的示例特别是酶，例如，核酸酶、切口酶、重组酶、转座酶、碱基编辑器或包括这些工具的分子复合物。这些效应物具有将双链裂解(双链DNA断裂诱导酶(DSBI))或单链裂解(单链DNA断裂诱导酶(SSBI))引入基因组靶位点的能力，或具有将靶向修饰(包括点突变、插入或缺失)引入目的基因组靶位点的能力。位点特异性效应酶可单独发挥作用，也可以与其他分子一起作为分子复合物的一部分发挥作用。位点特异性效应酶可以作为融合分子存在，或者作为通过共价或非共价相互作用中的至少一种缔合的单个分子存在，从而使得位点特异性效应物复合物的成分紧密物理结合。该复合物可包括修复模板，以在靶位点进行靶向序列转化或替换。修复模板(RT)表示单链或双链核酸序列，其可以在任何基因组编辑过程中提供，从而引起双链或单链DNA断裂，继而通过提供RT作为辅助同源性修复的已知序列的模版而辅助靶向修复所述DNA断裂。
如本文所使用的，“双链DNA断裂诱导酶”或“DSBI酶”是能够在称为“识别位点”的特定核苷酸序列上诱导双链DNA断裂的酶。双链DNA断裂(DSB)诱导酶可以例如选自由大范围核酸酶、TAL效应物核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR系统，如CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、CRISPR/Csm1、CRISPR/MAD7、CRISPR/CasX或CRISPR/CasY。稀有切割的(rare-cleaving)核酸内切酶是识别优选为约14至70个连续的核苷酸的位点的DSBI酶，因此，即使在诸如大多数植物基因组的较大基因组中，裂解频率也非常低。归巢核酸内切酶，也称为大范围核酸酶，构成了此类稀有切割核酸内切酶的家族。它们可由内含子、独立基因或间插序列编码，并呈现出惊人的结构和功能特性，使它们与更经典的限制性内切酶区分开，通常与细菌限制性修饰II型系统区分开。它们的识别位点具有一般的不对称性，这与大多数限制性内切酶识别位点的特征性二元对称性相反。已显示由内含子或内含肽编码的几种归巢核酸内切酶可促进其各自的遗传因子向等位基因无内含子或无内含肽位点归巢。通过在无内含子或无内含肽等位基因中进行位点特异性双链断裂，这些核酸酶会产生重组末端，从而参与基因转化过程，该过程会复制编码序列，并导致在DNA水平插入内含子或间插序列。在WO 03/004659的表I(第17至20页)(其通过引用并入本文)中提供了其他稀有切割大范围核酸酶及其各自的识别位点的列表。
此外，存在设计定制的基本可以识别选择的任何靶核苷酸序列的稀有切割的核酸内切酶的方法。简而言之，可以利用设计为识别特异性核苷酸序列的锌指结构域和诸如Fokl的天然限制性酶的非特异性DNA切割结构域之间的杂合体制备嵌合限制性酶。例如，此类方法在下述文献中进行了描述：WO 03/080809；WO 94/18313；WO 95/09233；Isalan等，2001，自然生物技术(Nature Biotechnology)19，656-660；Liu等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，5525-5530)。
定制设计的核酸内切酶的另一个示例包括所谓的TALE核酸酶(TALEN)，其基于融合到核酸酶(例如，FokI或其变体)的催化结构域的细菌属黄单胞菌(Xanthomonas)的转录激活因子样效应物核酸酶(TALE))。这些TALE的DNA结合特异性由串联排列的34/35个氨基酸重复单元的重复可变残基(RVD)定义，从而使得RVD特异性地识别靶DNA中的一个核苷酸。可以组装重复单元以基本识别任何靶序列，并且可以将重复单元与核酸酶的催化结构域融合以产生序列特异性核酸内切酶(参见例如，Boch等，2009，Science326：第1509-1512页；Moscou和Bogdanove，2009，Science 326：第1501页；以及WO 2010/079430、WO 2011/072246、WO 2011/154393、WO 2011/146121、WO 2012/001527、WO 2012/093833、WO 2012/104729、WO 2012/138927、WO 2012/138939)。WO2012/138927还描述了单体(紧凑型)TALEN和具有各种催化结构域的TALEN及其组合。
最近，已经描述了一种新型的可定制核酸内切酶系统，即所谓的CRISPR/Cas系统。CRISPR系统在其自然环境中描述了一种分子复合物，该分子复合物包含至少一个与可制备特异性DNA双链断裂的Cas核酸酶或另一种CRISPR核酸酶(如Cpf1核酸酶)(Zetsche等，“Cpf1是2类CRISPR-Cas系统的单RNA指导核酸内切酶”，细胞(Cell)，163，第1-13页，2015年10月)结合的非编码RNA。目前，CRISPR系统分为两类，包括五种类型的CRISPR系统，例如用Cas9作为效应子的II型系统，以及用Cpf1作为效应分子的V型系统(Makarova等，NatureRev.Microbiol.，2015)。在人工CRISPR系统中，可以将合成的非编码RNA和CRISPR核酸酶和/或可选的修饰的CRISPR核酸酶(修饰用作切口酶或缺乏任何核酸酶功能)与至少一种合成或人工指导RNA或gRNA和/或tracrRNA结合使用(Makarova等，2015，同上)。CRISPR/Cas在自然系统中介导的免疫应答需要CRISPR-RNA(crRNA)，其中控制CRISPR核酸酶特异性激活的该指导RNA的成熟在迄今为止已表征的各种CRISPR系统之间存在显著差异。首先，将入侵DNA(也称为间隔区)整合到CRISPR基因座近端的两个相邻重复区域之间。II型CRISPR系统将Cas9核酸酶编码为干扰步骤的关键酶，该系统既包含crRNA，又包含反式激活RNA(tracrRNA)作为指导基序。这些杂交并形成双链(ds)RNA区域，其被RNAseIII识别并可以进行裂解以形成成熟的crRNA。然后，这些反过来又与Cas分子缔合，以便将核酸酶特异性地引导至靶核酸区域。重组gRNA分子既可包含可变DNA识别区域，也可包含Cas相互作用区域，因此可以独立于特异性靶核酸和所需的Cas核酸酶进行专门设计。作为另一种安全机制，靶核酸区域中必须存在PAM(与前间隔区邻近基序)；这些是直接来自Cas9/RNA复合物识别DNA的DNA序列。来自酿脓链球菌的Cas9的PAM序列已被描述为“NGG”或“NAG”(标准IUPAC核苷酸代码)(Jinek等，“A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptivebacterial immunity”，Science 2012，337：816-821)。来自金黄色葡萄球菌的Cas9的PAM序列是“NNGRRT”或“NNGRR(N)”。其他变体CRISPR/Cas9系统是公知的。因此，脑膜炎双球菌Cas9在PAM序列NNNNGATT处裂解。嗜热链球菌Cas9在PAM序列NNAGAAW处裂解。最近，已经描述了用于弯曲杆菌的CRISPR系统的另一种PAM基序NNNNRYAC(WO 2016/021973A1)。对于Cpf1核酸酶，与通常由Cas9系统识别的富含G的PAM相反，没有tracrRNA的Cpf1-crRNA复合物有效地识别和裂解由较短的富TPAM进行的靶DNA(Zetsche等，同上)。此外，通过使用修饰的CRISPR多肽，可以获得特异性单链断裂。Cas切口酶与各种重组gRNA的组合使用还可通过双DNA切口诱导高度特异性DNA双链断裂。此外，通过使用两个gRNA，可以优化DNA结合的特异性，从而可以优化DNA裂解。同时，还有其他最初针对细菌描述的CRISPR效应子，如CasX和CasY效应子，它们代表了其他效应子，可用于基因组工程目的(Burstein等，“New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes”，Nature，2017，542，237-241)。
此外，根据本发明的方法，可以将修饰的Cas或Cpf1变体或任何其他修饰的CRISPR效应子变体(例如，Cas9变体)用作碱基编辑复合物(例如，BE3、VQR-BE3、EQR-BE3、VRER-BE3、SaBE3、SaKKH-BE3)的一部分(参见Kim等，Nat.Biotech.，2017,doi:10.1038/nbt.3803)。因此，根据本发明，可以设想人工修饰的CRISPR核酸酶，就双链裂解酶而言，其可能确实不是任何“核酸酶”，而是切口酶或核酸酶死亡变体，其仍具有固有的DNA识别及结合能力。
如本文所使用的，“碱基编辑器”是指具有与其从中衍生的蛋白质相同的催化活性的蛋白质或其片段，该蛋白质或其片段，单独或当以分子复合物形式提供时在本文中称为碱基编辑复合物，具有可介导目标碱基修饰的能力，即，目标碱基的转化导致目标点突变。优选地，在本发明的上下文中，至少一个碱基编辑器临时或永久地连接至至少一个位点特异性效应子，或可选地连接至至少一个位点特异性效应子复合物的组分。该连接可以是共价和/或非共价的。
DSBI酶或SSBI酶的裂解位点与DNA上诱导双链DNA断裂的确切位置有关。裂解位点可包含在(覆盖)DSBI或SSBI酶的识别位点中，也可以不包含在(覆盖)该位点上，因此可以说DSBI或SSBI酶的裂解位点位于其识别位点处或附近。DSBI或SSBI酶的识别位点，有时也称为结合位点，是由DSBI或SSBI酶(特异性)识别并确定其结合特异性的核苷酸序列。例如，TALEN或ZNF单体具有分别由其RVD重复或ZF重复确定的识别位点，而其裂解位点由其核酸酶结构域(例如，FokI)确定，并且通常位于识别位点之外。在二聚TALEN或ZFN的情况下，裂解位点位于相应单体的两个识别/结合位点之间，其中发生裂解的中间DNA区域称为间隔子区域。
本领域技术人员将能够选择识别特定识别位点并在预选位点处或附近的裂解位点诱导DSB或SSB的DSBI或SSBI酶，或设计此类DSBI或SSBI酶。或者，可以使用任何常规转化方法或通过与在其基因组中具有DSBI或SSBI酶识别位点的生物体杂交，将DSBI或SSBI酶识别位点引入靶基因组中，然后可以在DSBI或SSBI酶的裂解位点处或附近引入任何所需的DNA。
在该实施方案的特别优选的方面，将修复核酸分子另外引入植物细胞中。
如本文所使用的，“修复核酸分子”是单链或双链DNA分子或RNA分子，其用作修饰裂解位点处或附近的预选位点的基因组DNA的模板。如本文所使用的，“用作修饰基因组DNA的模板”是指，通过在预选位点两侧的侧翼区和相应的同源区之间的同源重组，可选地与修复核酸分子的两端中的一端处的非同源末端连接(NHEJ)组合(例如在只有一个侧翼区的情况下)，而在预定位点复制或整合修复核酸分子。通过同源重组的整合将使得修复核酸分子能够精确地连接至靶基因组直至核苷酸水平，而NHEJ可导致修复核酸分子与基因组DNA之间的连接处的小插入/缺失。
如本文所使用的，“基因组的修饰”是指，基因组已经由至少一个核苷酸改变。这可以通过替换至少一个核苷酸和/或缺失至少一个核苷酸和/或插入至少一个核苷酸而发生，只要与修饰前的预选基因组靶位点的核苷酸序列相比导致至少一个核苷酸发生总改变，从而可以鉴定修饰，例如通过本领域技术人员熟知的诸如测序或PCR分析等的技术。
如本文所使用的，“预选位点”或“预定位点”表示基因组(例如，核基因组)中期望插入、替换和/或缺失一个或多个核苷酸的特定核苷酸序列。这可以是例如在先前引入的外源DNA或转基因中或与之连接的内源基因座或特定核苷酸序列。该预选位点可以是特定的核苷酸位置，该位置意在插入一个或多个核苷酸。预选位点还可以包含一个或多个要交换(替换)或缺失的核苷酸的序列。
如在本申请的上下文中使用的，术语“约”是指所述值的+/-10％，优选地是所述值的+/-5％。例如，大约100个核苷酸(nt)应理解为介于90和110nt之间的值，优选介于95和105之间。
如本文所使用的，“侧翼区”是修复核酸分子的核苷酸序列与预选位点侧翼(即，上游或下游)的DNA区域的核苷酸序列同源的区域。显而易见的是，应当选择侧翼区的长度和序列同一性百分比，以使得能够在所述侧翼区与它们在预选位点上游或下游的相应DNA区之间进行同源重组。与修复核酸分子的侧翼DNA区具有同源性的位于预选位点侧翼的DNA区也被称为基因组DNA中的一个或多个同源区域。
为了具有足够的重组同源性，修复核酸分子的侧翼DNA区的长度可有所不同，并且长度应至少为约10nt、约15nt或约20nt。然而，侧翼区可以尽可能长(例如，高达约100-150kb，例如完整的细菌人工染色体(BAC))。优选地，侧翼区将为约50nt至约2000nt，例如约100nt、200nt、500nt或1000nt。此外，位于目的DNA两侧的区域不必与同源区域(位于预选位点两侧的DNA区域)相同，并且可具有与预选位点两侧的DNA区域约80％至约100％的序列同一性，优选地为约95％至约100％的序列同一性。侧翼区越长，对同源性的要求越不严格。此外，为了在不改变相邻DNA序列的DNA序列的情况下实现预选位点处的靶DNA序列的交换，侧翼DNA序列应优选与在预选位点两侧的上游和下游DNA区域相同。
如本文所使用的，“上游”是指核酸分子上更靠近所述核酸分子的5'端的位置。同样地，术语“下游”是指核酸分子上更靠近所述核酸分子的3'端的位置。为避免疑问，核酸分子及其序列通常以其5'至3'方向(从左至右)表示。
为了在预选位点处进行靶序列修饰，必须选择侧翼区，使得上游侧翼区的3'端和/或下游侧翼区的5'端与预定位点的端部对齐。这样，上游侧翼区的3'端确定预定位点的5'端，而下游侧翼区的5'端确定预定位点的3'端。
如本文所使用的，所述预选位点位于所述裂解(和/或识别)位点之外或远离所述裂解(和/或识别)位点是指，欲进行基因组修饰的位点(预选位点)不包含裂解位点和/或DSBI或SSBI酶的识别位点，即，预选位点与裂解(和/或识别)位点不重叠。因此，在这方面之外/远离这方面是指裂解(和/或识别)位点的上游或下游。
已根据本发明的方法进行转化或基因编辑并且可能具有修饰基因组的修饰植物细胞可以再生为完整的(可育)植物。因此，在本发明的优选方面，分别在植物细胞的转化或植物细胞的基因组修饰之后进行再生植物的步骤。
因此，本发明提供了一种用于产生转基因植物的方法，其包括以下步骤：
(a)根据上述方法转化植物细胞，以及
(b)由步骤(a)产生的转基因细胞或从其衍生的转基因细胞再生转基因植物。
步骤(b)的转基因植物或转基因细胞稳定地或瞬时地包含步骤(a)中作为转基因引入的至少一个目的核苷酸序列。
此外，本发明还提供了一种产生经遗传修饰的植物的方法，其包括以下步骤：
(a)根据上述方法修饰植物细胞的基因组，以及
(b)由步骤(a)产生的细胞或从其衍生的细胞(包括步骤(a)产生的基因组的修饰)再生植物。
再生技术依赖于组织培养生长培养基中某些植物激素的操纵，有时也依赖于可以与所需的目的核苷酸序列一起引入的杀虫剂和/或除草剂标志物。由培养的原生质体进行植物再生在下述文献中进行了描述：Evans等，Protoplasts Isolation and Culture，Handbook of Plant Cell Culture，pp.124-176，MacMillilan Publishing Company，NewYork，1983；以及Binding,Regeneration of Plants,Plant Protoplasts，pp.21-73，CRCPress，Boca Raton，1985。还可以由植物愈伤组织、外植体、原生质体、未成熟或成熟胚、胚组织、分生组织、器官或其部分获得再生。此类再生技术在以下文献中进行了描述：Klee(1987)Ann.Rev.of Plant Phys.38:467486。为了由诸如未成熟胚的转基因组织获得完整的植物，可以将它们在受控的环境条件下，在一系列包含营养素和激素的培养基中生长，此过程称为组织培养。一旦产生完整的植物并产生种子，就开始进行后代评估。
本发明适用于任何植物物种，无论是单子叶植物还是双子叶植物。优选地，可经受本发明的方法和用途的植物是不属于拟南芥属的植物或者不是拟南芥物种的植物。更优选地，可以经受本发明的方法和用途的植物选自由大麦(Hordeum vulgare)、球茎大麦(Hordeum bulbusom)、双色高粱(Sorghum bicolor)、甘蔗(Saccharum officinarium)、玉蜀黍属(Zea spp.)(包括玉米(Zea mays))、谷子(Setaria italica)、小粒野生稻(Oryzaminuta)、水稻(Oryza sativa)、澳洲野生稻(Oryza australiensis)、高秆野生稻(Oryzaalta)、普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、黑麦(Secalecereale)、黑小麦(Triticale)、苹果(Malus domestica)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、滨海大麦草(Hordeum marinum)、节节麦(Aegilops tauschii)、Daucusglochidiatus、甜菜属(Beta spp.)(包括甜菜)、小胡萝卜(Daucus pusillus)、Daucusmuricatus、胡萝卜(Daucus carota)、大桉(Eucalyptus grandis)、美花烟草(Nicotianasylvestris)、绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)、普通烟草(Nicotianatabacum)、本氏烟草(Nicotiana benthamiana)、番茄(Solanum lycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、中果咖啡(Coffea canephora)、葡萄(Vitis vinifera)、Erythrante guttata、Genlisea aurea、黄瓜(Cucumis sativus)、川桑(Marusnotabilis)、近缘种须弥芥(Crucihimalaya himalaica)、卵叶须弥芥(Crucihimalayawallichii)、弯曲碎米荠(Cardamine nexuosa)、北美独行菜(Lepidium virginicum)、荠菜(Capsella bursa pastoris)、Olmarabidopsis pumila、硬毛南芥(Arabis hirsute)、油菜(Brassica napus)、甘蓝(Brassica oleracea)、芜青(Brassica rapa)、萝卜(Raphanussativus)、芥菜(Brassica juncacea)、黑芥菜(Brassica nigra)、芝麻菜(Erucavesicaria subsp.sativa)、甜橙(Citrus sinensis)、麻风树(Jatropha curcas)、毛果杨(Populus trichocarpa)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、Cicer yamashitae、Cicerbijugum、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、Cicer reticulatum、Cicer judaicum、木豆(Cajanuscajanifolius)、蔓草虫豆(Cajanus scarabaeoides)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、大豆(Glycine max)、棉属(Gossypium sp.)、紫云英(Astragalus sinicus)、百脉根(Lotusjaponicas)、蓝猪耳(Torenia fournieri)、洋葱(Allium cepa)、大葱(Alliumfistulosum)、大蒜(Allium sativum)、向日葵(Helianthus annuus)、菊芋(Helianthustuberosus)和/或韭菜(Allium tuberosum)所构成的组。特别优选的是甜菜(Betavulgaris)、玉米(Zea mays)、小麦(Triticum aestivum)、大麦(Hordeum vulgare)、黑麦(Secale cereale)、向日葵(Helianthus annuus)、马铃薯(Solanum tuberosum)、双色高粱(Sorghum bicolor)、芜青(Brassica rapa)、油菜(Brassica napus)、芥菜(Brassicajuncacea)、甘蓝(Brassica oleracea)、大豆(Glycine max)和/或棉属(Gossypium sp.)。
甜菜(Beta vulgaris)物种的植物特别是Beta vulgaris subsp.maritima(沿海甜菜)亚种(Seemangold)或Beta vulgaris subsp.vulgaris亚种的植物。这些包括，例如，Beta vulgaris subsp.vulgaris var.altissima(狭义上的甜菜)、Beta vulgarisssp.vulgaris var.vulgaris(牛皮菜(Mangold))、Beta vulgaris ssp.vulgarisvar.conditiva(甜菜根(beetroot))、Beta vulgaris ssp.vulgaris var.crassa/alba(饲料甜菜(fodder beet))。
本发明的主题还是通过上述方法或植物的一部分或种子获得或可获得的植物。因此，本发明的一个实施方案是通过上述转化植物细胞并由所述细胞及其后代、种子或部分再生植物的方法获得或可获得的转基因植物，其中，后代、种子或部分稳定地或瞬时地包含至少一个目的核苷酸序列作为转基因。本发明的另一个实施方案是通过上述修饰植物细胞的基因组并由所述细胞及其后代、种子或部分再生植物的方法获得或可获得的经遗传修饰的植物，其中，后代、种子或部分包括通过本发明方法引入的基因组中的修饰。
植物的部分包括诸如叶子、植物茎、茎、根、营养芽、分生组织、胚、花药、胚珠或果实的植物器官，如愈伤组织、贮藏组织、分生组织、胚性组织、叶组织、芽组织、根组织、植物肿瘤组织或生殖组织的植物组织；包括植物细胞，例如具有细胞壁或其聚集体或原生质体的分离的植物细胞；并且可以表示多个器官的融合，例如花或种子或器官的一部分，如来自茎的横切节段。
本发明的另一个主题是源自上述转基因植物或遗传修饰植物的植物细胞或种子。衍生自上述转基因植物的植物细胞包含至少一个目的核苷酸序列作为转基因，而衍生自上述经遗传修饰的植物的植物细胞包含其基因组中的修饰。
参考本文描述的以下附图和实施例将对本发明进行进一步描述。但是，应当理解，本发明不限于这些实施例。
除非在实施例中另有说明，否则所有重组DNA技术均根据如在以下文献中所述的标准方案进行：Sambrook等(1989)，分子克隆：实验指南第二版，美国冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约；以及Ausubel等(1994)，分子生物学实验室指南(Current Protocols in Molecular Biology)第1卷和第2卷，实验室指南(CurrentProtocols)，美国。BIOS Scientific Publications(UK)和英国布莱克威尔出版公司(Blackwell)联合出版的R.D.D.Cray的植物分子生物学Labfax(1993)中描述了用于植物分子研究的标准材料和方法。标准分子生物学技术的其他参考包括Sambrook和Russell(2001)，《分子克隆：实验室手册》第三版，美国冷泉港实验室出版社，纽约，Brown(1998)分子生物学LabFax第二版的第I卷和第II卷，英国学术出版社(Academic Press)。用于聚合酶链反应的标准材料和方法可参见Dieffenbach和Dveksler(1995)，PCR引物：实验室指南，美国冷泉港实验室出版社，以及McPherson等(2000)PCR-基础知识：从背景到实践(PCR-Basics:From Background to Bench)，第一版，德国施普林格出版社(Springer Verlag)。
本文参考或引用的所有专利、专利申请和出版物或公共公开内容(包括互联网上的出版物)均以引用的方式全文并入本文。
附图简述
图1示出了补充有0.5、1.0或5.0μM TSA的培养基中愈伤组织诱导的定性分析结果。还示出了在不含TSA的培养基中的对照诱导。对每种条件下的十个外植体进行随机拍照。
图2示出了补充有0.01或0.1μM TSA的培养基中愈伤组织诱导的定性分析结果。还示出了在不含TSA的培养基中的对照诱导。对每种条件下的十个外植体进行随机拍照。
图3示出了使用不同量的TSA进行愈伤组织诱导和植物再生的柱状图。
A：在补充有0.5、1.0和5.0μM TSA的培养基中培养的叶片外植体的愈伤组织诱导频率。
B：在每种条件下产生的愈伤组织的量，该量根据每个变体中获得的带有收获的愈伤组织的培养皿的数量来估算。
C：芽再生能力，其取决于每种实验条件下每个叶片外植体的已发育芽的数量。
图4示出了使用不同量的TSA进行愈伤组织诱导和植物再生的柱状图。
A：在补充有0.01和0.1μM TSA的培养基中培养的叶片外植体的愈伤组织诱导频率。
B：在每种条件下产生的愈伤组织的量，该量根据每个变体中获得的带有收获的愈伤组织的培养皿的数量来估算。
C：芽再生能力，其取决于每种实验条件下每个叶片外植体已发育芽的数量。
图5示出了在愈伤组织诱导过程中3个时间点具有发育脆性愈伤组织的叶片外植体的定量分析。培养基中添加了不同浓度的TSA。
图6在困难基因型中，在补充了TSA的培养基中诱导的愈伤组织的芽再生得以改善。A：对照基因型(1)以及具有中等水平(2)芽再生困难性或高水平(3)芽再生困难的基因型的平均愈伤组织诱导频率。愈伤组织的诱导是在不含TSA的培养基(白色条)或补充有0.01μM TSA的培养基(灰色条)中进行的。B：在对照培养基(白色条)或补充有0.01μM TSA的培养基(灰色条)中产生的愈伤组织的芽再生频率。进行了两个实验，每个基因型重复3次重复。需要注意的是，只有在包含TSA的培养基中产生愈伤组织时，非常困难的基因型3才能再生芽。
实施例
1.甜菜愈伤组织诱导方案的技术描述
该方法基于Kischenko等人在2005年Cell Biology International的公开内容。
1.基因型为S706的微繁殖芽用作起始原料。将芽在补充有30g/l蔗糖和0.25mg/l苄基腺嘌呤(BAP)的MS盐中繁殖。
2.为诱导脆性愈伤组织，从微繁殖芽中分离出叶片外植体，并在含有包括15g/l蔗糖和2mg/l BAP的MS盐的培养基中孵育叶片外植体作为对照，并在补充有0.01μM TSA(B1)、0.1μM TSA(B2)、0.5μM TSA(B3)、1.0μM TSA(B4)和5.0μM TSA(B5)的相同培养基中孵育叶片外植体，孵育条件是在黑暗中于28℃放置7周。
3.在愈伤组织诱导培养基中孵育4、5、6和7周期间，监测叶片外植体中愈伤组织的发育。
4.对产生脆性愈伤组织的叶片外植体进行评分，以计算愈伤组织的诱导频率(产生脆性愈伤组织的叶片外植体的百分比)。
在将TSA以0.01μM至1.0μM的浓度范围添加到愈伤组织诱导培养基中时，观察到了愈伤组织诱导频率提高(图1、图2、图3A和图4A)。该效果取决于TSA浓度，因为更高浓度的TSA(例如，5.0μM)似乎具有细胞毒性。此外，TSA提高了每个叶片外植体的愈伤组织的数量(图3B和4B)。
2.芽再生方案的技术说明
1.在含有MS盐、30g/l蔗糖、1mg/l GA3和1mg/l TDZ的培养基中收获步骤4的脆性愈伤组织，并转移至单独的培养皿中。
2.将培养皿在24℃的光照下(16小时)温育10天。
3.在立体显微镜下对发育中的芽进行计数，以估计再生能力(每个初始叶片外植体的芽数)。
3.结果
观察到每个外植体再生芽的数量增加(图3C和4C)。此外，TSA加速了愈伤组织的形成，因此缩短了产生转基因事件的时间(图5)。28天后已经出现了带有愈伤组织的大量叶片外植体。如果不使用TSA，则即使在49天后也无法达到该数字。此外，最初的初始测试表明，通过添加TSA，可以减少愈伤组织形成的基因型依赖困难性。
进一步的实验表明，在补充有TSA的培养基(CIM)中诱导的愈伤组织的芽再生在甜菜(Beta vulgaris)的困难基因型中得到了改善。基因型1和2代表甜菜(Beta vulgaris)的困难基因型，通过标准方案从其愈伤组织中仅可再生少量植物。基因型3是绝对困难的，通过已知方案不可能进行再生。愈伤组织的诱导是在不含TSA的培养基(白色条)或补充有0.01μM TSA的培养基(灰色条)中进行的(图6A)。在对照培养基(白色条)或补充有0.01μMTSA的培养基(灰色条)中得到的愈伤组织的芽再生频率(图6B)。进行了两个实验，每个基因型重复3次。在基因型1中，添加TSA会导致愈伤组织形成增加以及此类愈伤组织的芽再生能力提高：平均愈伤组织诱导频率从66.3％增加到82％，每个外植体的平均芽数从4.7增加到7.7。对于基因型2，未观察到愈伤组织诱导频率显著增加，但是所产生的愈伤组织明显具有改善的品质，因此芽再生能力明显增强：每个外植体的平均芽数从2.4增加到4.6。对于具有高困难型的基因型3，在不使用TSA和使用TSA的情况下，愈伤组织的诱导频率都非常低，使用TSA的愈伤组织诱导频率可能会稍高。然而，仅当在TSA存在下诱导了愈伤组织时，才可能从产生的愈伤组织再生芽。

Claims (13)

1.一种由至少一个甜菜亚种(Beta ssp)植物细胞增加愈伤组织形成频率的方法，其包括在组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)的存在下在诱导愈伤组织的培养基中培养所述至少一个植物细胞的步骤，其中，所述HDACi是曲古菌素A(TSA)，其浓度为0.01至1.0 µM。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个植物细胞是体细胞或胚胎细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物细胞是从植物分离的外植体或其部分。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中培养所述至少一个细胞的所述步骤包括(i)使所述至少一个细胞在包含所述HDACi的培养基中生长，和/或(ii)将所述HDACi引入所述至少一个细胞中，例如通过轰击、电穿孔或显微注射将所述HDACi引入所述至少一个细胞中。
5.一种由愈伤组织间接再生芽的方法，其包括以下步骤：(a)根据权利要求1至4中任一项所述的方法由至少一个甜菜亚种植物细胞诱导愈伤组织形成，以及(b)在促进所述愈伤组织长出芽的条件下培养步骤(a)中获得的所述愈伤组织。
6.一种用于转化甜菜亚种植物细胞的方法，其包括以下步骤：(a)根据权利要求1至4中任一项所述的方法由至少一个植物细胞诱导愈伤组织形成，以及(b)将至少一个目的核苷酸序列引入到将在步骤(a)中使用的植物细胞中和/或引入到步骤(a)中获得的所述愈伤组织的细胞中。
7.一种用于产生甜菜亚种转基因植物的方法，其包括以下步骤：(a)根据权利要求6所述的方法转化植物细胞，以及(b)由步骤(a)得到的转基因细胞或由其衍生的转基因细胞再生转基因植物。
8.一种用于修饰甜菜亚种植物细胞基因组的方法，其包括以下步骤：(a)根据权利要求1至4中任一项所述的方法由至少一个植物细胞诱导愈伤组织形成，以及(c)修饰将在步骤(a)中使用的植物细胞和/或步骤(a)中获得的所述愈伤组织的细胞的基因组，所述修饰通过将位点特异性效应酶以及任选的修复核酸分子引入所述细胞中来进行，其中，所述基因组的所述修饰选自i.替换至少一个核苷酸；ii.缺失至少一个核苷酸；iii. 插入至少一个核苷酸；或iv. i.至iii.的任何组合。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述位点特异性效应酶识别所述细胞的基因组中的预定位点。
10.一种生产经遗传修饰的甜菜亚种植物的方法，其包括以下步骤(a)根据权利要求8或9所述的方法修饰植物细胞的基因组，以及(b)由步骤(a)产生的细胞或由其衍生的细胞再生植物。
11.HDACi在用于由至少一个甜菜亚种植物细胞增加愈伤组织形成频率的方法中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述甜菜亚种植物细胞是分离自植物的外植体。
13.HDACi在用于甜菜亚种植物间接再生的方法、在用于植物细胞转化的方法或在用于修饰植物细胞基因组的方法中的用途。
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