CN104168771B - 植物生长促进微生物及其用途 - Google Patents

Abstract

提供了微生物菌株、组合物及使用其增加植物的生长和/或产量的方法。还提供了用于预防、抑制或治疗植物病原体或植物致病性疾病发展的材料和方法。本公开还提供了非天然存在的植物及其衍生物，例如人工感染了本发明的微生物菌株的植物。

Description

植物生长促进微生物及其用途

本申请要求2011年12月13日提交的美国临时申请61/570,237的权益，并且所述美国临时申请通过引用整体并入本文，包括所有表格、图和权利要求。

发明领域

本发明涉及可持续农业的领域。特别地，本公开提供了对农作物生产有用的微生物组合物和方法。具体而言，本文公开的组合物和方法对增强植物生长和/或抑制植物病原体和致病性疾病的发展有用。

序列表并入

所附序列表中的材料据此通过引用并入本申请中。命名为“SGI1540_1WO_CRF_OF_SL_ST25.txt”的随附文件创建于2012年12月13日并且为20KB。可在用Windows OS的电脑上使用Microsoft Word访问所述文件。

发明背景

植物周围的微生物群落非常多样化，包括细菌、真菌、酵母、藻类。这些微生物中的一些可能对植物有害，并且常常称为病原体，而其它的可能因促进植物生长和作物生产力而对植物有益。土壤微生物学和植物生物技术的最新进展已经引起对微生物剂在农业、园艺、林业和环境管理中的用途的兴趣增加。具体而言，已知存在于通常称为根际和根面的土壤生态位的许多微生物已经受到关于其促进植物生长的能力的大量关注。实际上，根际土壤代表可能分离有益微生物的良好微生物储集库。植物根际可在1g土壤中含数以亿计的微生物。理论上，没有人为干预，由于每克土壤的菌落形成单位不足，微生物接种剂在其自然土壤环境中的存活率和效力低。因此，自二十世纪六十年代以来，已经开发了菌落接种物潜在浓度增加的许多生物肥料并且商业化以试图降低对化学肥料的需要。

另外，近年来进行的研究已经表明微生物可用作生物防治剂来增加农业生产率和效率。这些研究已经表明，各种微生物能够抑制植物病原体和/或补充植物生长，从而提供了化学农药的诱人替代物，化学农药由于对人健康和环境质量的潜在负面影响而不太受到青睐。

可以定殖于植物根部并且刺激植物生长的微生物通常称为植物生长促进微生物(PGPM)。在过去的二十年中，已经报道了对多种农作物的生长有积极影响的许多PGPM种类。PGPM常常是高等植物的普遍共生体，并且能够通过许多机制增强其宿主的适应潜力，所述机制例如固定分子氮、移动顽固土壤养分(例如，铁、磷、硫等)、合成植物激素和维生素及分解土壤中常常增加土壤有机质的植物材料。同样，某些微生物可通过防治对植物有致病性的微生物种类(例如，植物病原体)而利于植物生长。例如，一些有益微生物可通过与真菌竞争在植物根部表面上的空间而防治植物的根腐病。在其它情况下，植物天然微生物群落中各种微生物菌株之间的竞争可刺激根部生长并增加矿质养分和水的摄取以增加植物产量。因此，可基于自然生活在土壤中的微生物开发生物肥料作为产品。通过人工接种增加土壤中有益微生物的种群，这些土壤微生物可提高其生物活性，并且因此，为植物供给重要养分和增强其生长的有益因子。

为栽培植物接种PGPM通常被视为有前途的农业方法，因为它允许不使用大量农药而防治有害生物。因为随食物中过量肥料和农药暴露，关于地下水质的环境问题增加，生物替代品变得必要。因此，开发与肥料和农药相容的生物处理或甚至减少这些化学化合物的量可能是农业上的重大进步。已经确定，PGPM对植物生长的刺激常常与PGPM定殖于植物根部的能力密切相关。然而对开发用于获得根部定殖能力高的微生物菌株的有效选择程序的关注相对较少。缺乏此类选择程序减缓了对植物-细菌共生的研究和农业上对PGPM的利用。

因此，持续需要鉴定新的PGPM和/或测试其与现有可商购的作物管理产品的相容性。而且，还需要另外的调查来比较纯培养物菌株与形成协同同生群(consortia)的微生物的互补混合菌株。此类混合同生群可能具有在不同环境和生长条件下以更好的竞争能力一致表现的更高潜力。

发明概述

本文提供了微生物菌株和培养物。还提供了微生物组合物及使用其增加植物的生长和/或产量的方法。还提供了用于通过使用本文公开的微生物组合物处理植物种子的方法。进一步提供了用于预防、抑制或治疗植物病原体发展或植物致病性疾病发展的方法。本公开还提供了非天然存在的植物品种，其为人工感染了本发明的微生物内生菌的品种。还提供了非天然存在的植物品种的种子、生殖组织、营养组织、再生组织、植物部分或后代。本公开进一步提供了用于制备农业组合物的方法。

一方面，本公开提供了分离的微生物菌株、其分离培养物、其生物纯培养物及其富集培养物。在这个方面的某些优选实施方案中，微生物菌株可为SGI-003-H11(保存为NRRLB-50483)、SGI-020-A01(保存为NRRLB-50484)、SGI-026-G06(保存为NRRL B-50485)、SGI-026-G07(保存为NRRL B-50486)或源自所述任一种菌株的菌株。在一些其它优选实施方案中，微生物菌株可包含表现出与序列表中的16S核醣体和/或recA核苷酸序列和/或氨基酸序列的任一个具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或至少99.5％序列同一性的核苷酸或氨基酸序列。在一些实施方案中，微生物菌株还具有如本文所述的植物生长促进活性。

还提供了包括本发明的微生物菌株或其培养物的微生物组合物。根据一些优选实施方案的此类微生物组合物可包含农业有效量的附加化合物或组合物，其中所述附加化合物或组合物可为肥料、杀螨剂、杀细菌剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、杀微生物剂、杀线虫剂或农药。在一些其它优选实施方案中，微生物组合物可进一步包括载体。还有其它优选实施方案中，所述载体可为植物种子。在这个方面的某些实施方案中，将微生物组合物制备成可为乳剂、胶体、粉尘、颗粒、球粒、粉剂、喷雾、乳剂或溶液的制剂。在一些其它优选实施方案中，微生物组合物可为种衣剂。又一方面，还提供了涂有根据本发明所述的微生物组合物的植物种子。

另一方面，提供了用于处理植物种子的方法。此类方法包括使所述植物种子暴露于或接触根据本发明所述的微生物菌株或其培养物。

在本发明的另一方面，本文提供了用于增加植物的生长和/或产量的方法。在一些实施方案中，此类方法包括向所述植物或向所述植物的周围环境施加有效量的根据本发明所述的微生物菌株或其培养物。在一些其它实施方案中，所述方法包括使根据本发明所述的微生物菌株或其培养物在宿主植物的生长培养基或土壤中生长，之后或同时宿主植物在所述生长培养基或土壤中生长。在优选实施方案中，所述植物可为玉米植株或小麦植株。在一些其它实施方案中，所述微生物菌株或其培养物可确定为所述植物上的内生菌。

在本发明的另一方面，提供了用于预防、抑制或治疗植物病原体发展的方法。此类方法包括使根据本发明所述的微生物菌株或其培养物在宿主植物的生长培养基或土壤中生长，之后或同时宿主植物在所述生长培养基或土壤中生长。在一些优选实施方案中，所述植物病原体可为刺盘孢(Colletotrichum)、镰刀菌(Fusarium)、赤霉菌(Gibberella)、明梭孢(Monographella)、青霉菌(Penicillium)或壳多孢(Stagnospora)属的微生物。在一些特别优选的实施方案中，所述植物病原体可为禾谷刺盘孢(Colletotrichum graminicola)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、玉米赤霉菌(Gibberella zeae)、雪腐明梭孢(Monographella nivalis)、青霉菌属某种(Penicillium sp.)或颖枯壳多孢(Stagnosporanodurum)。

本发明的另一方面提供了用于预防、抑制或治疗植物致病性疾病的发展的方法。此类方法包括向所述植物或向所述植物的周围环境施加有效量的根据本发明所述的微生物菌株或其培养物。在一些优选实施方案中，可将所述微生物菌株或其培养物施加到土壤、种子、根、花、叶、所述植物的一部分或整株植物。

本发明的另一方面提供了非天然存在的植物。非天然存在的植物人工感染了本发明的微生物菌株或其培养物。在这个方面的一些实施方案中进一步提供了非天然存在的植物的种子、生殖组织、营养组织、再生组织、植物部分和后代。

本发明的另一方面提供了用于制备农业组合物的方法。此类方法包括将根据本发明所述的微生物菌株或其培养物接种到底层内或底层上并使其生长。

在本发明的另一方面，提供了分离的菌株、其分离的培养物、其生物纯培养物和泛菌(Pantoea)属微生物的富集培养物。在一个实施方案中，所述微生物包含编码16S rRNA基因或recA蛋白质的DNA序列或氨基酸序列，所述DNA序列或氨基酸序列与序列表中公开的编码16S rRNA基因或recA蛋白质的序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或至少99.5％序列同一性。在另一实施方案中，本发明提供了包含上述任何DNA序列或氨基酸序列并且如本文所述，增加植物的生长和/或产量的一类微生物。

根据下面的发明详述和权利要求，本发明的这些和其它目的和特征将变得更加显而易见。

发明详述

除非另有定义，本文使用的所有技术术语、符号和其它科学术语或用辞旨在具有本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义。在一些情况下，为清楚起见和/或供及时参考，本文定义了具有通常所理解的含义的术语，并且本文包括此类定义不一定解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。本领域的技术人员很好理解了本文描述或引用的许多技术和程序并且通常使用常规方法采用。

除非上下文中另有明确规定，单数形式“一”、“一种”和“所述”包括复数个所指代物。例如，术语“一种细胞”包括一种或多种细胞，包括其混合物。

杀菌性：如本文所使用，术语“杀菌性”指组合物或物质增加细菌的死亡率或抑制细菌的生长速率的能力。

生物防治(biological control)：如本文所使用，术语“生物防治”及其缩写形式“生物防治(biocontrol)”定义为利用除人以外的至少第二种生物对病原体或昆虫或任何其它不需要生物的防治。生物防治已知机制的一个实例为使用通过与真菌外部竞争根部表面上的空间防治根腐病的微生物，或抑制病原体的生长或杀伤病原体的微生物。在生物防治情况下的“宿主植物”是易感由病原体引起的疾病的植物。在从其自然环境中分离生物，例如细菌或真菌种类的情况下，“宿主植物”是支持细菌或真菌生长的植物，例如，细菌或真菌为其内生菌的种类的植物。

如本文所使用，“有效量”是足以实现有益或所需结果的量。有效量可分一次或多次施用。就治疗、抑制或保护来说，有效量是足以改善、稳定、逆转、减缓或延迟目标感染或疾病状态的进展的量。本文在提及微生物时使用的表达“有效微生物”旨在意指受试菌株表现出的促进植物生长和/或产量的程度或抑制致病性疾病的程度在统计显著的水平上超过未经处理的对照。在一些情况下，表达“有效量”在本文中用于提及相对于在如本文所述的适合处理条件下，未处理对照中出现的结果，获得有益或所需结果所必需的微生物处理的量。为了本公开的目的，液体制剂的实际施加速率通常将从最少约1×10³个变为约1×10¹⁰个活细胞/mL并且优选从最少约1×10⁶个变为约5×10⁹个活细胞/mL。在大多数情况下，假定将实现至少约50％植物组织的大体均匀接触的施加模式，在下面实例中描述的本发明的菌株在约1×10⁶至1×10⁹个活细胞/mL范围内的施加速率下效果最优。如果微生物作为固体制剂施加，应控制施加速率以产生如通过前述液体处理速率获得的相当的植物组织每单位面积的存活细胞数量。通常，按超过10⁶CFU/g(每克的菌落形成单位)，优选超过10⁷CFU/g，更优选10⁸CFU/g和最优选10⁹CFU/g的浓度递送时，本发明的微生物组合物在生物学上有效。

组合物：“组合物”旨在指活性剂和至少另一种化合物、载体或可为惰性(例如，可检测的药剂或标记或液体载体)或活性(例如肥料)的组合物的组合。

如本公开中所使用，“对照植物”提供了测量受试植物表现型变化的参考点，可能是任何适合的植物细胞、种子、植物组分、植物组织、植物器官或整株植物。对照植物可包括(例如)(a)野生型植物或细胞，即，与用于产生受试植物或细胞的遗传改变的原材料基因型相同的野生型植物或细胞；(b)与原材料基因型相同，但是已经用无效构建体(即，对目标性状没有已知影响的构建体，例如包含报告基因的构建体)转化的植物或细胞；(c)为受试植物或细胞后代间的非转化分离体的植物或细胞；(d)与受试植物或细胞基因相同，但是未暴露于和受试植物或细胞相同的处理(例如，肥料处理)的植物或细胞；(e)在目标基因未表达的条件下的受试植物或细胞本身；或(f)在尚未暴露于特殊处理，例如肥料或肥料和/或其它化学药品的组合的条件下的受试植物或细胞本身。

培养物、分离的培养物、生物纯培养物和富集培养物：如本文所使用，微生物的分离菌株是已经从其自然环境中移出的菌株。同样，术语“分离”不一定反映微生物已经纯化的程度。但是在不同实施方案中，“分离”培养物已经从从中分离的原材料中纯化至少2×或5×或10×或50×或100×。作为非限制性实例，如果从作为原材料的土壤中分离出培养物，则可将生物分离到其在指定量的纯化或部分纯化材料(例如，土壤)中的浓度为原材料中的至少2×或5×或10×或50×或100×的程度。微生物菌株的“大体纯净培养物”指除所需微生物菌株外，大体上不含其它微生物的培养物。换言之，微生物菌株的大体纯净培养物大体上不含其它污染物，可包括微生物污染物以及不良化学污染物。进一步地，如本文所使用，“生物纯”菌株旨在意指和自然界中通常与之相关的材料分开的菌株。注意，与其它菌株或在自然界中不常出现的化合物或材料相关的菌株仍定义为“生物纯”。当然，特定菌株的单一培养物为“生物纯”。在不同实施方案中，“生物纯”培养物已经从在自然界中通常与之相关的材料中纯化至少2×或5×或10×或50×或100×。作为非限制性实例，如果在自然界中培养物通常与土壤相关，则生物可生物纯至其在指定量的在自然界中通常与之相关的纯化或部分纯化材料(例如，土壤)中的浓度为未纯化原材料中的至少2×或5×或10×或50×或100×的程度。如本文所使用，分离微生物菌株的术语“富集培养物”指微生物培养物，其中培养物的总微生物种群含超过50％、60％、70％、80％、90％或95％的分离菌株。

培养：如本文所使用，术语“培养”指生物在各种培养基上或培养基中的繁殖。

如本文所使用，“内生菌”为至少其部分生命期生活在植物内而不会引起明显疾病的内共生体。内生菌可垂直(直接从亲本到子代)或水平(从个体到无关个体)传播。垂直传播的内生真菌通常无性生殖并且通过穿透宿主种子的真菌菌丝从母体植物传播到子代。内生细菌也可从种子垂直转移到幼苗(Ferreira等，FEMS Microbiol.Lett.287：8-14，2008)。相反，水平传播的内生菌通常有性生殖并且通过可被风和/或昆虫媒介传播的孢子传播。农作物的微生物内生菌已经受到关于其防治疾病和昆虫侵扰的能力及其促进植物生长的潜力的大量关注。

真菌病原体：为了本发明的目的，应理解使用术语真菌病原体或真菌旨在包括这种生物的有性(有性型)阶段并且还包括无性(变形)阶段，也分别称为完美和不完美的真菌阶段。例如，变形阶段的禾谷镰刀菌为玉米赤霉菌。

杀真菌性：如本文所使用，“杀真菌性”指组合物或物质降低真菌生长速率或增加真菌死亡率的能力。

突变体：如本文所使用，关于微生物的术语“突变体”或“变异体”指亲代菌株的修饰，其中所需生物活性与亲代菌株表达的活性类似。例如，在伯克霍尔德菌(Burkholderia)的情况下，本文将“亲代菌株”定义为诱变之前的原始伯克霍尔德菌菌株。无需人为干预，在自然界中可能出现突变体或变异体。它们也可通过用本领域技术人员已知的多种方法和组合物处理或通过本领域技术人员已知的多种方法和组合物获得。例如，亲代菌株可用化学药品例如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍、乙基甲砜处理，或通过使用γ、x-射线或紫外光辐照或通过本领域技术人员众所周知的其它方式处理。

杀线虫性：如本文所使用，术语“杀线虫性”指物质或组合物增加线虫死亡率或抑制线虫生长速率的能力。

病原体：如本文所使用的术语“病原体”指生物，例如藻类、蛛形纲动物、细菌、真菌、昆虫、线虫、寄生植物、原生动物、酵母或能够在植物或动物中产生疾病的病毒。如本文所使用的术语“植物病原体”指感染植物的致病性生物。

序列同一性百分比：如本文所使用，“序列同一性百分比”通过比较由两个序列之间局部比对的长度限定的比较窗口上两个最优局部比对序列测定。与用于最优比对两个序列的参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗口中的氨基酸序列可包含添加或缺失(例如，空位或突出)。两个序列之间的局部比对只包括每个序列根据取决于用于进行比对的算法(例如BLAST)的标准被视为足够相似的片段。通过测定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数量以获得匹配位置的数量，匹配位置的数量除以比较窗口中的位置数量并且将结果乘以100计算序列同一性百分比。可通过Smith和Waterman(1981)Add.APL.Math.2：482的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch(J Mol.Biol.48：443，1970)的总体同源性算法，通过Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444，1988)的相似性查找方法，通过启发式实施这些算法(NCBI BLAST、WU-BLAST、BLAT、SIM、BLASTZ)，或通过检查进行用于比较的序列的最优算法。鉴于已经确定两个序列用于比较，优选采用GAP和BESTFIT确定其最优比对。通常，使用空位权重为5.00和空位权重长度为0.30的默认值。多核苷酸或多肽序列之间的术语“大体序列同一性”指使用所述程序与参考序列相比，包含具有至少50％序列同一性，优选至少70％，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％并且最优选至少96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的多核苷酸或多肽。另外，所用的成对序列同源性或序列相似性指比对的两个序列之间相似残基的百分比。在本领域中已经很好地定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括带有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、带有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、带有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、带有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、带有β支化侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和带有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

可对公共或私有数据库中存在的受试核酸或氨基酸序列搜索查询核酸和氨基酸序列。此类搜索可用国家生物技术信息中心基本局部比对搜索工具(NCBI BLAST v 2.18)程序进行。NCBI BLAST程序在国家生物技术信息中心的网站上可用(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。通常可使用NCBI BLAST的下列参数：过滤选项设为“默认”，判断矩阵设为“BLOSUM62”，空位罚分设为“存在：11，延伸：1”，字长设为3，期望值(E阈值)设为1e-3，并且局部比对的最小长度设为查询序列长度的50％。也可使用GenomeQuest^TM软件(Gene-IT，Worcester Mass.USA)测定序列同一性和相似性。

如本文所使用的术语“有害生物”指不希望有的生物，其可包括但不限于细菌、真菌、植物(例如，杂草)、线虫、昆虫和其它致病动物。如本文所使用，术语“杀虫性”指物质或组合物降低有害生物，即不希望有的生物的生长速率，或增加有害生物的死亡率的能力。

后代：如本文所使用，“后代”包括特定植物或植物系的子系体。当前植物的后代包括在F₁、F₂、F₃、F₄、F₅、F₆上形成的种子和后一代植物或在BC₁、BC₂、BC₃上形成的种子和后一代植物或在F₁BC₁、F₁BC₂、F₁BC₃上形成的种子和后一代植物。名称F₁指遗传学上不同的两个亲本之间杂交的后代。名称F₂、F₃、F₄、F₅和F₆指F₁植物自花授粉或同胞授粉后代的后几代。

变异体：如本文所使用，提到核酸和多肽时，本文使用术语“变异体”指表示与参考多肽或多核苷酸相比，在其氨基酸或核酸序列中有一些合成或自然产生的差异的多肽、蛋白质或多核苷酸。例如，这些差异包括在参考多肽或多肽中的取代、插入、缺失或此类变化的任何所需组合。多肽和蛋白质变异体可进一步由电荷的变化和/或翻译后修饰(例如，糖基化、甲基化、磷酸化等)组成。

当提到微生物使用时，术语“变异体”为具有其所属种类的识别特征，同时相对于亲代菌株具有至少一个核苷酸序列变化或可识别的不同性状的微生物菌株，其中所述性状有遗传基础(可遗传)。例如，对于具有植物生长促进活性的苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)020_A01菌株，可识别性状包括1)抑制真菌植物病原体，包括禾谷镰刀菌、玉米赤霉菌、颖枯壳多孢、禾谷刺盘孢发展的能力；2)提高小麦种子产量的能力；和3)具有16S rRNA基因，其核苷酸序列与苏云金芽孢杆菌020_A01的16S rRNA基因有大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％序列同一性；可用于确认变异体为苏云金芽孢杆菌020_A01。

产量：如本文所使用，术语“产量”指可收获的植物物料或植物来源的产品的量，并且通常定义为作物可测量的有经济价值的产物。对于农作物而言，“产量”也指每英亩或每生产单位收获物料的量。产量可根据数量或质量定义。收获的物料可因作物而异，例如，可能是种子、地上生物质、根、果实、棉纤维、植物的任何其它部分或具有经济价值的任何植物来源的产品。术语“产量”还涵盖产量潜力，其为可获得的最大产量。产量可能取决于可通过某些参数监测的若干产量因素。这些参数为本领域的技术人员众所周知并且因作物而异。术语“产量”还涵盖收获指数，这是收获生物质与生物质总量的比例。

本说明书中提及的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，如同明确单独指出每个单独出版物或专利申请通过引用并入的程度相同。

并未承认任何参考构成现有技术。参考的讨论陈述了其作者声明的内容，并且申请人保留向引用文档的精确性和相关性挑战的权利。应清楚地理解，虽然本文参考了许多现有技术出版物，但是这种参考不构成对任何这些文档形成本领域普遍常识的一部分的承认。

对本文指定通用方法的讨论仅仅旨在说明性目的。审阅本公开后，其它替代方法和实施方案将对本领域的技术人员显而易见。

植物生长促进微生物

各种植物相关微生物可以多种方式对植物健康和生理产生积极影响。这些有益微生物通常称为植物生长促进微生物(PGPM)。如本文所使用，术语“植物生长促进微生物”涵盖各种各样改善的植物性质，包括，例如但不限于固氮作用提高、根系发育改善、叶面积增加、植物产量增加、种子发芽增加、光合作用增加或植物的累积生物质增加。在各实施方案中，所述改善是所测量的性质增加至少10％或增加至少25％或增加至少50％或增加至少75％或增加至少100％。因此，作为非限制性实例，微生物可产生上述固氮作用增长百分比，或上述根总重量或叶面积或植物产品产量增长(例如，上述植物产品重量增长百分比)，或在10天或14天或30天内发芽的种子增长百分比，或光合作用速率(例如，通过CO₂消耗测定)或植物累积生物质(例如，通过植物的重量测定)增长百分比。植物产品为物品-通常但不一定-植物产出的食品。可使用任何方便的方法测定产量，例如，每英亩种植产出的植物产品的蒲式耳或磅数。至今，已经报道超过24个属的微生物的分离菌株具有植物生长促进活性和/或生物防治活性，并且仍然还在发现具有相似活性的新的属和种。另外，在一些细菌属中，已经鉴定了多个种和亚种的生物防治剂并且可跨多个空间尺度找到，从全球水平到农场水平，并且甚至在单株植物上。而且，已经报道一些个别微生物分离株不但可以在其来源的植物或作物上，而且在其它作物上表现出生物防治和/或植物生长促进活性。这表明了一些基因型，特别是地理分布广泛的基因型的普适性。正如以上所讨论，如果引入足够数量并且活性持续足够长时间，则单个微生物种群就可以对植物健康有显著影响。

已经假定了几种机制以提供PGPM对植物生长增强的积极影响的解释。微生物对植物生长的有益作用可为直接或间接的。

为了本公开的目的，术语“直接植物生长促进微生物”指可在没有病原体时增强植物生长的微生物。如以下更详细地讨论，直接植物生长促进的实例包括(a)生物施肥，(b)刺激根系生长，(c)根际修复，和(d)植物应力控制。另外，已经报道几种PGPM通过生物防治的机制，即通过降低疾病水平，例如抗生、诱导系统抗性和与病原体竞争养分和生态位，间接促进植物生长。

生物肥料：微生物肥料为植物供给养分并且从而可以在没有病原体压迫时促进植物生长。可直接促进植物生长和/产量的微生物分离株的非限制性实例包括固氮细菌根瘤菌(Rhizobium)和慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)种，其通过共生固氮作用，可在豆科植物根部形成瘤，在瘤中它们可将大气N₂转化为氨，与大气N₂相反，氨可被植物用作氮源。其它实例包括固氮螺菌(Azospirillum)种，其为独立生存的固氮菌，可以施肥并且增加谷类作物例如小麦、高粱和玉米的产量。尽管固氮螺菌有固氮能力，但是接种固氮螺菌引起的产量增加常常仍归因于根系发育增加并因此归因于水和矿物质摄取速率增加。在这点上，已经报道几种根际细菌如固氮菌某种Azotobacter spp.)能够产生各种植物激素(例如，生长素、细胞分裂素)和酶(例如，果胶酶)。已经证实许多这些植物激素和酶密切牵涉于对由根瘤菌形成的结瘤有调控影响的细菌-植物共生组合的感染过程。

在许多情况下，PGPM也可通过改变养分摄取影响植物生长和发育。它们可能变更养分摄取速率，例如通过对根部的直接影响，通过对环境的影响，反过来改变根部行为，和通过直接竞争养分(Gaskin等，Agricult.Ecosyst.Environ.12：99-116，1985)。PGPM可能在改变土壤中的养分利用效率中起作用所凭借的一些因素包括(例如)根部几何形状、养分溶解性、通过产生植物适宜离子形式的养分利用率、养分在植物中的分配和利用效率。例如，低水平的可溶性磷酸盐可限制植物的生长。一些植物生长促进微生物能够使来自有机或无机物结合磷酸盐的磷酸盐溶解，从而利于植物生长。几种微生物来源的酶，例如非特异性磷酸酶、植酸酶、膦酸酶和C-P裂解酶使可溶性磷从土壤中的有机化合物释放。例如，已经发现土壤中的无机磷增加的溶解增强了使用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的油菜幼苗中的磷摄取以及硫氧化和硫摄取增加(Grayston和Germida，Can.J.Microbiol.37：521-529，1991；Banerjee，Phytochemicals and Health，第15卷，1995年5月18日)。

植物刺激剂：一些微生物可生成在没有病原体时刺激植物生长的物质。例如，植物激素的生成是许多植物相关微生物的特征。对于全部5种典型植物激素，即生长素、乙烯、脱落酸、细胞分裂素和赤霉素，已经为至少一种细菌和/或真菌种证明合成为次级代谢产物(对于综述，参见，例如Kim等，Appl.Environ.Microbiol.，77卷，5：1548-1555，2011)。一些微生物也可产生影响植物中的植物激素生成的次级代谢产物。最有名的实例可能为可促进根系生长的生长素激素。其它实例包括已经报道生成吲哚乙酸(IAA)并且增加植物中IAA的量，从而对植物生物质生成有深远影响的假单胞菌(pseudomonad)(Brown，AnnualRev.Phytopathology，68：181-197，1974)。例如，Tien等(Applied EnvironmentalMicrobiol.，37：1016-1024，1979)报道，在御谷(pearl millet)根部周围接种含有巴西固氮螺菌(Azospirillum brasiliense)的营养液导致芽和根重量增加、侧根数量增加，并且所有侧根密被根毛。供给了AA、赤霉素和激动素的组合的植物显示出与由固氮螺菌引起的类似侧根生成。虽然没有完全理解这些植物激素和植物-激素样物质的生物学意义，但是这些微生物的生长刺激活性通常归因于其生成这些物质。

另外，其它激素以及某些挥发性有机化合物(VOC)和辅因子吡咯喹啉醌(PQQ)也刺激植物生长。例如，一些根际细菌，如细菌种枯草杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)和阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的菌株通过释放VOC促进植物生长。已经用2，3-丁二醇和3-羟基-2-丁酮(也称为醋偶姻)作为诱导系统抗性的诱导子观察到了最高水平的生长促进。已经将辅因子PQQ作为植物生长促进剂进行了描述，其在植物中作为抗氧化剂。一些报道表明，因为PQQ是(例如)牵涉于抗真菌活性和诱导系统抗性的几种酶的辅因子，所以作用可能是间接的。

应力控制剂：含有酶1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶的植物生长促进微生物通过降低植物乙烯水平促进植物生长和发育。此类微生物摄取乙烯前体ACC并将其转化为2-氧代丁酸酯和NH₃。已经报道ACC脱氨酶生产者缓解了几种类型的应力，例如，来自植物致病性细菌作用的应力，来自多聚芳烃的应力，来自重金属例如Ca²⁺和Ni²⁺的应力及来自盐和干旱的应力。

另外，已经报道诱导马铃薯产量增加的几种PGPM菌株生成结合Fe³⁺，使其更少可用于自然微生物群落的某些成员的细胞外铁载体(Kloepper等，Nature 286：885-886，1980)。这些根际细菌分泌通过与膜结合铁载体受体结合，特异性增加其铁获得的低分子量、高亲和力铁螯合微生物辅因子。由一些假单胞菌PGPM生成的其中一种铁载体被认为是抑制胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia cartovora)(马铃薯软腐病的病原生物)的生长的假单胞菌素(pseudobactin)(参见，例如，Kloepper等，CurrentMicrobiol.4：317-320，1980)。向生长培养基中添加假单胞菌素抑制了软腐病感染并且还减少了马铃薯植物中致病真菌的数量，连同马铃薯产量的显著增加。支持PGPM生物防治的铁载体理论的大多数证据来自于对绿脓菌荧光素(pyoverdine)(包含荧光假单胞菌的荧光色素的一类铁载体)的研究工作[Demange等，在Iron Transport in Microbes，Plants and Animals中(Winkleman等编辑)，第167-187页，1987]。根据铁载体理论，绿脓菌荧光素展示出由于选择性识别外膜铁载体受体引起的某些功能菌株特异性(Bakker等，Soil Biology and Biochemistry 19：443-450，1989)。

本发明的分离培养物

如本公开实施例部分中更加详细地描述，申请人已经发现几种为植物生长和植物产量的有效促进剂的新型微生物。在许多情况下，分离的微生物对抑制几种植物致病性疾病的发展也有效。微生物分离株选自从全美国几个地点收集的环境样品获得的约5,000个微生物菌株的库。微生物的初步选择基于微生物定殖于植物根部和生成被认为对其与植物的相互作用重要的化学化合物和酶的能力。还在体外拮抗测定中生物测定了微生物抑制各种真菌植物病原体发展的能力。然后在对商业小麦和玉米品种的温室研究中生物测定了所选微生物的微生物菌株促进植物生长的能力和保存种子产量潜力的能力。

分类学分析进一步确定本公开所述代表性微生物与细菌杆菌属、伯克霍尔德菌属、草螺菌(Herbaspirillum)属、泛菌属和土地杆菌属(Pedobacter)密切相关。

生物材料的保存

根据布达佩斯条约，为了所依据的专利程序和法规的目的(布达佩斯条约)，本公开中所述的微生物菌株的纯化培养物于2011年3月28日保存在位于美国皮奥里亚大学路1815号IL61604(1815N.University Street，Peoria，IL61604，USA(NRRL))的农业研究机构培养物保藏中心(NRRL)。

表1：微生物分离株和相应的登录号

微生物菌株已经保存在确保本专利申请由专利和商标委员会根据《美国联邦法规》第37章第1.14条和《美国法典》第35章第122条确定对其有权利的人待决期间有权使用培养物的条件下。保存物表示保存菌株的大体纯净的培养物。保存物可根据需要由外国专利法在提交本申请的副本或其成果的国家使用。然而，应理解保存物的可用性并不构成以损毁通过政府行为授予的专利权实践本发明的许可。

本发明的优选微生物具有保存菌株所有的识别特征，并且尤其是如本文所述能够促进植物生长和/或产量的识别特征和如本文所述能够抑制真菌植物病原体发展的识别特征。具体而言，本发明的优选微生物指如上所述保存的微生物及来源于其的菌株。

微生物组合物

包含分离微生物菌株或其培养物的本发明微生物组合物可呈各种形式，包括但不限于，仍为培养物、全培养物、贮藏的细胞原料、菌丝体和/或菌丝(特别是甘油原料)、琼脂条、甘油/水中的琼脂塞、冻干原料和干燥原料例如滤纸或谷物种子上干燥的冻干物或菌丝体。如本文其它地方所定义，如本公开和本领域使用的“分离培养物”或语法等同物理解为意指提到的培养物为培养液、球粒、刮屑、干燥样品、冻干物或切片(例如，菌丝或菌丝体)；或含有单一类型的生物的支持物、容器或介质例如板、纸、过滤器、基质、稻草、移液管或移液管尖端、纤维、针、凝胶、拭子、管、小瓶、颗粒等。在本发明中，微生物拮抗物的分离培养物为培养液或刮屑、球粒、干燥制剂、冻干物或微生物切片或含有所述微生物，没有其它生物的支持物、容器或介质。

本发明进一步提供了含有本发明的至少一种分离微生物菌株或其培养物和载体的组合物。载体可为赋予多种性质，例如稳定性、可湿性、可分散性等增加的许多载体的任一种或多种。在本发明的组合物中可包括湿润剂例如天然或合成的表面活性剂，其可为非离子型或离子型表面活性剂或其组合。油包水乳剂也可用于配制包括本发明的至少一种分离微生物的组合物(参见，例如，美国专利号7,485,451，通过引用并入本文)。可制备的适合制剂包括可湿性粉剂、粒剂、凝胶、琼脂条或球粒、增稠剂等、微胶囊颗粒等、液体例如水悬浮剂、含水悬浮液、油包水乳剂等。所述制剂可包括谷物或豆类产品(例如，磨碎的谷物或豆类、源于谷物或豆类的汤或面粉)、淀粉、糖或油。所述载体可为农用载体。在某些优选实施方案中，所述载体为种子，并且可将所述组合物施加或涂到种子上或使其浸透种子。

在一些实施方案中，农用载体可为土壤或植物生长培养基。可使用的其它农用载体包括水、肥料、植物性油、保湿剂或其组合。可选地，农用载体可为固体，例如硅藻土、壤土、硅石、藻酸盐、粘土、膨润土、蛭石、果皮、其它植物和动物产品或组合，包括粒剂、球粒或悬浮液。也预期前述任何成分的混合物为载体，例如但不限于糊剂(pesta)(面粉和高岭粘土)、壤土中的琼脂或面粉性球粒、沙子或粘土等。制剂可包括培养的微生物的食物来源，例如大麦、水稻或其它生物材料，例如种子、植物部分、甘蔗渣、来自谷物加工的壳或秆、磨碎的植物材料(“庭园废物”)或来自建筑工地垃圾的木材、来自纸、织物或木材回收的锯屑或小纤维。其它适合制剂将为本领域的技术人员所知。

呈液体形式，例如溶液或悬浮液，本发明的微生物可在水或水溶液中混合或悬浮。适合的液体稀释剂或载体包括水、水溶液、石油馏出物或其它液体载体。

可通过使本发明的微生物分散在适当分开的固体载体中或上面，例如泥炭、小麦、麸皮、蛭石、粘土、滑石、膨润土、硅藻土、漂白土、消毒土壤等来制备固体组合物。当此类制剂用作可湿性粉剂时，可使用生物相容性分散剂例如非离子型、阴离子性、两性或阳离子性分散剂和乳化剂。

在一个优选实施方案中，本文预期的组合物提高了农作物，例如小麦、大麦、燕麦和玉米的生长和产量，并且足量使用时，用作微生物肥料。与其它生物肥料试剂类似，这些组合物因为通常并不烧伤或损伤植物，所以可具有很高的安全系数。

如本公开全篇非常详细地描述，增加植物生长和植物产量可通过向宿主植物或宿主植物的部分施加本发明的一种或多种微生物组合物实现。可按相对于未处理对照，增加植物生长或产量有效的量施加所述组合物。施加给植物时，可按足以增强靶标植物生长的浓度使用活性组分。正如将对本领域技术人员显而易见那样，有效浓度可根据各种因素变化，例如(a)植物或农产品的类型；(b)植物或农产品的生理状况；(c)影响植物或农产品的病原体的浓度；(d)植物或农产品上疾病损伤的类型；(e)天气条件(例如，温度、湿度)；和(f)植物疾病的阶段。根据本发明，典型浓度为高于载体的1×10²CFU/mL的浓度。优选浓度范围从约1×10⁴至约1×10⁹CFU/mL，例如范围从1×10⁶至约1×10⁸CFU/mL的浓度。更优选的浓度为每毫升载体(液体组合物)或每克载体(干燥制剂)约37.5至约150mg干细菌物质的浓度。

在一些实施方案中，本发明组合物中一种或多种微生物的量可根据最终制剂以及利用的植物或种子的大小或类型变化。优选地，组合物中所述一种或多种微生物按整个制剂的约2％w/w/至约80％w/w存在。更优选的，按整个制剂的重量计，组合物中采用的所述一种或多种微生物为约5％w/w至约65％w/w并且最优选约10％w/w至约60％w/w。

正如本领域技术人员将认识到那样，可使用多种常规方法，例如喷粉、涂覆、注射、摩擦、滚动、浸渍、喷洒或刷洗，或不会明显损害待处理靶标植物的任何其它适当技术向靶标植物施加本发明的微生物组合物。特别优选的方法包括为生长培养基或土壤接种微生物细胞的悬浮液并且为植物种子涂覆微生物细胞和/或孢子。

通常，本发明的组合物具化学惰性；因此它们与申请计划(applicationschedule)的基本上任何其它组分相容。它们也可与影响植物生长的物质组合使用，所述物质例如肥料、植物生长调节剂等，条件是此类化合物或物质是生物学相容的。它们也可与生物学相容的杀虫活性剂组合使用，所述杀虫活性剂例如除草剂、杀线虫剂、杀真菌剂、杀昆虫剂等。

当以其可商购获得的制剂和由这些制剂制备的使用形式周作生物肥料时，根据本发明所述的活性微生物菌株和组合物可此外呈与增效剂的混合物形式存在。增效剂为用其增加活性组合物的活性的化合物，而添加的增效剂本身不一定有活性。

当以其可商购获得的制剂和由这些制剂制备的使用形式用作生物肥料时，根据本发明所述的活性生物菌株和组合物可此外呈与抑制剂的混合物形式存在，当在植物的生境中，植物部分表面上或植物组织内施加后，所述抑制剂减少活性组合物的降解。

根据本发明所述的活性微生物菌株和组合物，本身或在其制剂中，也可用作与已知肥料、杀螨剂、杀菌剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、杀微生物剂、杀线虫剂、农药或其任何组合的混合物，例如以便扩大作用范围或以这种方式防止发展对农药的抗性。在许多情况下，增效效应结果，即混合物的活性可超过单独组分的活性。还预期了与其它已知活性化合物，例如生长调节剂、安全剂和/或化学信息素的混合物。

在本发明的一个优选实施方案中，所述组合物可进一步包括至少一种化学或生物肥料。所述组合物中采用的至少一种化学或生物肥料的量可根据最终制剂以及待处理植物和种子的大小变化。优选地，基于整个制剂，采用的所述至少一种化学或生物肥料为约0.1％w/w至约80％w/w。更优选地，所述至少一种化学或生物肥料存在的量为约1％w/w至约60％w/w并且最优选约10％w/w至约50％w/w。

本发明的微生物组合物优选包括至少一种生物肥料。适合本文使用并且可包括在根据本发明所述的微生物组合物中以促进植物生长和/产量的示例性生物肥料包括微生物、动物、细菌、真菌、遗传物质、植物和活生物的天然产物。在这些组合物中，本发明的微生物在与另外的生物配制之前分离。例如，可在与本发明微生物的组合物中提供微生物例如但不限于无色杆菌(Achromobacter)、白粉寄生菌(Ampelomyces)、短梗霉(Aureobasidium)、固氮螺菌、固氮菌、杆菌、白僵菌(Beauveria)、慢生根瘤菌、念珠菌(Candida)、毛壳菌(Chaetomium)、冬虫夏草(Cordyceps)、隐球菌(Cryptococcus)、德巴利酵母菌(Dabaryomyces)、代尔夫特菌(Delftia)、欧文氏菌(Erwinia)、Exophilia、粘帚霉(Gliocladium)、草螺菌、乳酸杆菌(Lactobacillus)、马利亚霉(Mariannaea)、微球菌(Microccocus)、拟青霉(Paecilomyces)、类芽孢杆菌Paenibacillus)、泛菌、毕赤酵母(Pichia)、假单胞菌(Pseudomonas)、根瘤菌、酵母属(Saccharomyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas)、链霉菌(Streptomyces)、踝节菌(Talaromyces)和木霉属(Trichoderma)。还特别优选根据本发明所述的微生物组合物与美国专利申请号US20030172588A1、US20030211119A1；美国专利号7,084,331、7,097,830、7,842,494；PCT申请号WO2010109436A1中公开的微生物组合使用。

在本发明的一个优选实施方案中，所述组合物可进一步包括至少一种化学或生物农药。所述组合物中采用的至少一种化学或生物农药的量可根据最终制剂以及待处理植物和种子的大小变化。优选地，基于整个制剂，采用的所述至少一种化学或生物农药为约0.1％w/w至约80％w/w。更优选地，所述至少一种化学或生物农药存在的量为约1％w/w至约60％w/w并且最优选约10％w/w至约50％w/w。

多种化学农药对本领域的技术人员显而易见并且可使用。示例性化学农药包括氨基甲酸酯、有机磷酸酯、有机氯和拟除虫菊酯类的化学农药。还包括化学防治剂，例如但不限于苯菌灵(benomyl)、硼砂(borax)、敌菌丹(captafol)、克菌丹(captan)、百菌清(chorothalonil)、含铜制剂；含二氯萘醌(dichlone)、氯硝胺(dicloran)、碘、锌的制剂；抑制麦角固醇(ergosterol)生物合成的杀真菌剂，例如但不限于杀稻瘟菌素(blastididin)、霜脲氰(cymoxanil)、氯苯嘧啶醇(fenarimol)、氟硅唑(flusilazole)、灭菌丹(folpet)、抑霉唑(imazalil)、异菌脲(ipordione)、代森锰(maneb)、代森锰锌(manocozeb)、甲霜灵(metalaxyl)、氧化萎锈灵(oxycarboxin)、腈菌唑(myclobutanil)、土霉素(oxytetracycline)、PCNB、五氯苯酚、咪鲜胺(prochloraz)、丙环唑(propiconazole)、灭螨猛(quinomethionate)、亚砷酸钠、二硝甲酚钠(sodium DNOC)、次氯酸钠、苯基苯酚钠、链霉素(streptomycin)、硫、戊唑醇(tebuconazole)、戊唑醇(terbutrazole)、噻苯咪唑(thiabendazolel)、甲基硫菌灵(thiophanate-methyl)、三唑酮(triadimefon)、三环唑(tricyclazole)、嗪氨灵(triforine)、井冈霉素(validimycin)、农利灵(vinclozolin)、代森锌(zineb)和福美锌(ziram)。

本发明的微生物组合物优选包括至少一种生物农药。适合本文使用并且可包括在根据本发明所述的微生物组合物中预防植物致病性疾病的示例性生物农药包括微生物、动物、细菌、真菌、遗传物质、植物和活生物的天然产物。在这些组合物中，本发明的微生物在与另外的生物配制之前分离。例如，可在与本发明微生物的组合物中提供微生物例如但不限于白粉寄生菌、短梗霉、杆菌、白僵菌、念珠菌、毛壳菌、冬虫夏草、隐球菌、德巴利酵母菌、欧文氏菌、Exophilia、粘帚霉、马利亚霉、拟青霉、类芽孢杆菌、泛菌、毕赤酵母、假单胞菌、掷孢酵母属、踝节菌和木霉属的种，其中特别优选内生真菌属(Muscodor)的真菌菌株。还特别优选根据本发明所述的微生物组合物与美国专利号7,518,040、美国专利号7,601,346、美国专利号6,312,940中公开的微生物拮抗剂组合使用。

可与本发明的微生物菌株和组合物组合的真菌的实例包括但不限于内生真菌(Muscodor)类，粉虱座壳孢(Aschersonia aleyrodis)、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)(“白毒蝇碱”)、布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)、腊叶芽枝霉(Chladosporiumherbarum)、棒形虫草(Cordyceps clavulata)、Cordyceps entomorrhiza、多枝虫草(Cordyceps facis)、细虫草(Cordyceps gracilis)、Cordyceps melolanthae、蛹虫草(Cordyceps militaris)、蚁虫草(Cordyceps myrmecophila)、Cordyceps ravenelii、冬虫夏草(Cordyceps sinensis)、蜂头虫草(Cordyceps sphecocephala)、长头虫草(Cordycepssubsessilis)、单侧生虫草(Cordyceps unilateralis)、变形虫草(Cordycepsvariabilis)、Cordyceps washingtonensis、棒孢除蚊菌(Culicinomyces clavosporus)、蝗噬虫霉(Entomophaga grylli)、舞毒蛾噬虫霉(Entomophaga maimaiga)、蝇虫霉(Entomophaga muscae)、Entomophaga praxibulli、菜蛾虫霉(Entomophthoraplutellae)、砖红镰刀菌(Fusarium lateritium)、桔形被毛孢(Hirsutellacitriformis)、汤普松多毛孢(Hirsutella thompsoni)、金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)(“绿毒蝇碱”)、黄绿绿僵菌(Metarhizium flaviride)、白色气霉菌(Muscodoralbus)、佛罗里达新接霉(Neozygitesfloridana)、莱氏野村菌(Nomuraea rileyi)、粉拟青霉菌(Paecilomyces farinosus)、玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)、新蚜虫疠霉(Pandora neoaphidis)、球孢白僵菌(Tolypocladium cylindrosporum)、蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii)、根虫瘟霉(Zoophthora radicans)和菌根种例如双色蜡蘑(Laccaria bicolor)。其它真菌杀虫种对本领域的技术人员显而易见。

本发明还提供了通过按有效量向土壤(即，在犁沟中)、植物的一部分(即，喷淋)或种植前在种子上(即，种子包衣或拌种)施加多种惯用制剂的任一种。惯用制剂包括溶液、可乳化浓缩物、可湿性粉剂、悬浮浓缩物、可溶性粉剂、粒剂、悬浮-乳化浓缩物、浸有活性化合物的天然和合成材料和聚合物中的极细控释胶囊。在本发明的某些实施方案中，将微生物组合物配制成可用于即用型制剂中或在使用时混在一起的粉剂。在任一实施方案中，在种植之前或种植时可将粉剂与油混合。在一个替代实施方案中，植物生长促进剂或生物防治剂其中一种或两种为处理时混在一起的液体制剂。本领域的普通技术人员理解，本发明组合物的有效量取决于组合物的最终制剂以及待处理植物的大小或种子的大小。

根据最终制剂和施加方法，可向本发明的组合物中引入一种或多种适合的添加剂。可将添加剂例如羧甲基纤维素和呈粉剂、粒剂或胶乳形式的天然和合成聚合物，例如阿拉伯树胶、几丁质、聚乙烯醇和聚乙酸乙烯酯，以及天然磷脂(例如脑磷脂和卵磷脂)和合成磷脂添加到本组合物中。

在一个优选实施方案中，将微生物组合物配制成单一稳定溶液或乳液或悬浮液。对于溶液而言，通常在添加生物试剂之前将活性化学化合物溶于溶剂中。适合的液体溶剂包括石油基芳香烃(例如二甲苯、甲苯或烷基萘)、脂族烃(例如环己烷或石蜡，例如石油馏分、矿物和植物油)、醇(例如丁醇或乙二醇)及其醚和酯、酮(例如甲乙酮、甲基异丁基酮或环己酮)、强极性溶剂(例如二甲基甲酰胺和二甲基亚砜)。对于乳液或悬浮液而言，液体介质为水。在一个实施方案中，化学试剂和生物试剂悬浮在单独的液体中并且在施加时混合。在悬浮液的一个优选实施方案中，化学试剂和生物试剂合并成表现出相当长保质期的即用型制剂。使用时，可在种植作物时喷洒液体或可作为雾化喷雾施加在叶面或施加在犁沟中。可在种子发芽之前，利用本领域已知的各种技术，包括但不限于滴灌、喷洒器、土壤注射或土壤喷淋，按有效量在种子(即，种子包衣或拌种)上或向土壤(即，在犁沟中)或直接向根部接触的土壤引入液体组合物。

任选地，可添加稳定剂和缓冲剂，包括碱和碱土金属盐及有机酸(例如柠檬酸和抗坏血酸)、无机酸(例如盐酸或硫酸)。也可添加杀生物剂并且生物剂可包括甲醛或甲醛释放剂和苯甲酸衍生物，例如对羟基苯甲酸。

病原体

本领域的技术人员将认识到，原则上根据本发明所述的方法和组合物可应用于抑制任何植物病原体或任何植物致病性疾病的发展。并非旨在使本发明限于特定培养物类型或细胞类型。例如，经历复杂形式的分化、丝状形成、孢子形成等的微生物细胞也可用于本发明的方法和组合物。

适合本发明的方法和材料的应用的植物致病性疾病的实例包括但不限于各种致病性真菌引起的疾病。优选对农业、园艺、用于生产生物燃料分子和其它化学药品的植物生物质和/或林业而言重要或令人感兴趣的致病性真菌应用本发明的方法。特别感兴趣的是致病性假单胞菌种(例如，青枯假单胞菌(Pseudomonas solanacearum))、叶缘焦枯病菌(Xylella fastidiosa)；茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、梨火疫病菌(Erwinia amylovora)、镰刀菌种、通用型疫病菌种(Phytophthora)(例如，马铃薯晚疫病菌(P.infestans))、葡萄孢(Botrytis)种、小球腔菌(Leptosphaeria)种、白粉菌(子囊菌门(Ascomycota))和锈菌(担子菌门(Basidiomycota))等。

目标植物病原体的非限制性实例包括(例如)直立枝顶孢霉(Acremoniumstrictum)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、互隔交链孢霉(Alternariaalternata)、茄链格孢(Alternaria solani)、根腐丝囊霉(Aphanomyces euteiches)、烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)、白绢病菌(Athelia rolfsii)、出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)、玉米生平脐蠕孢(Bipolaris zeicola)、灰霉病菌(Botrytiscinerea)、京都丽赤壳菌(Calonectria kyotensis)、玉蜀黍头孢霉(Cephalosporiummaydis)、苜蓿尾孢(Cercospora medicaginis)、大豆灰斑病菌(Cercospora sojina)、可可盘孢(Colletotrichum coccodes)、草莓刺盘孢(Colletotrichum fragariae)、禾谷刺盘孢、葡萄白腐病菌(Coniella diplodiella)、雪霉病菌(Coprinopsis psychromorbida)、茎枯菌(Corynespora cassiicola)、苍白弯孢(Curvularia pallescens)、柱盘孢黑腐病菌(Cylindrocladium crotalariae)、苹果褐斑病菌(Diplocarpon earlianum)、棉色二孢菌(Diplodia gossyina)、色二孢菌某种(Diplodia spp.)、黑附球菌(Epicoccum nigrum)、白粉菌(Erysiphe cichoracearum)、禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌(Fusarium oxyporum)、韭菜尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.tuberosi)、尖孢镰刀菌豌豆专化型(Fusariumproliferatum var.proliferatum)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、轮状镰刀菌(Fusarium verticillioides)、岛灵芝(Ganoderma boninense)、白地霉(Geotrichumcandidum)、赤腐病塔地小丛壳(Glomerella tucumanensis)、葡萄黑腐病菌(Guignardiabidwellii)、玉蜀黍球梗孢菌(Kabatiella zeae)、苜蓿小光壳菌(Leptosphaerulinabriosiana)、苜蓿黄斑病菌(Leptotrochila medicaginis)、壳球孢(Macrophomina)、菜豆壳球孢(Macrophomina phaseolina)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)、木蓼叉丝壳(Microsphaera manshurica)、桃褐腐病菌(Moniliniafructicola)、香蕉黑条叶斑病菌(Mycosphaerella fijiensis)、草莓球腔菌(Mycosphaerella fragariae)、稻黑孢菌(Nigrospora oryzae)、榆蛇口壳霉(Ophiostomaulmi)、果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)、纹枯病菌(Pellicularia sasakii)(立枯丝核菌(Rhizoctonia solani))、大豆霜霉病菌(Peronospora manshurica)、豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)、马铃薯坏疽茎点霉(Phoma foveata)、苜蓿茎点霉(Phomamedicaginis)、大豆拟茎点霉种子腐烂病菌(Phomopsis longicolla)、樟疫霉(Phytophthora cinnamomi)、红腐疫霉(Phytophthora erythroseptica)、草莓疫霉(Phytophthora fragariae)、致病疫霉(Phytophthora infestans)、苜蓿疫霉(Phytophthora medicaginis)、大雄疫霉(Phytophthora megasperma)、棕榈疫霉(Phytophthora palmivora)、白叉丝单囊壳(Podosphaera leucotricha)、苜蓿假盘菌(Pseudopeziza medicaginis)、秆锈病菌亚种(Puccinia graminis subsp.Tritici)(UG99)、玉米锈病菌(Puccinia sorghi)、灰梨孢(Pyricularia grisea)、稻梨孢(Pyricularia oryzae)、终极腐霉(Pythium ultimum)、立枯丝核菌、玉蜀黍丝核菌(Rhizoctonia zeae)、座坚果菌属某种(Rosellinia sp.)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)、三叶草菌核菌(Sclerotinina trifoliorum)、齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii)、大豆褐纹壳针孢(Septoria glycines)、番茄壳针孢(Septoria lycopersici)、玉米毛球腔菌(Setomelanomma turcica)、草莓白粉病(Sphaerotheca macularis)、马铃薯粉痂菌(Spongospora subterranea)、匐柄霉属某种(Stemphylium sp)、马铃薯癌肿病菌(Synchytrium endobioticum)、黑粉菌(Thecaphora)(马铃薯楔孢黑粉菌(Angiosorus))、根串珠霉(Thielaviopsis)、印度腥黑粉菌(Tilletia indica)、绿色木霉(Trichodermaviride)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)、苜蓿黄萎病菌(Verticillium albo-atrum)、茄子黄萎病菌(Verticillium dahliae)、茄子黄萎病菌(Verticillium dahliae)、黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)、水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)。

在本发明的一个优选实施方案中，本发明的方法和材料对抑制病原体烟曲霉菌、灰霉病菌、甜菜褐斑病菌(Cerpospora betae)、刺盘孢属某种、弯抱霉属某种(Curvulariaspp.)、镰刀菌属某种、岛灵芝、白地霉、赤霉菌属某种、明梭孢属某种、香蕉黑条叶斑病菌、棕榈疫霉、栎树猝死病菌(Phytophthora ramorum)、青霉菌属某种、终极腐霉、立枯丝核菌、根霉属某种(Rhizopus spp.)、裂褶菌属某种(Schizophyllum spp.)、核盘菌、壳多孢属某种、茄子黄萎病菌或黄单胞菌有用。在一个特别优选的实施方案中，本发明的方法和材料可用于抑制几种具有商业重要性的植物病原体的发展，包括禾谷镰刀菌NRRL-5883、雪腐明梭孢ATCC MYA-3968、玉米赤霉菌ATCC-16106、颖枯壳多孢ATCC-26369、禾谷刺盘孢ATCC-34167和青霉菌属某种病原体。

种衣剂

在一个特别优选的实施方案中，配制本发明的微生物组合物作为种子处理剂。预期可通过使用专门设计和制造以精确、安全和有效地向种子施加种子处理产品的处理剂施加设备，使用混合、喷洒或其组合的常规方法，大体均匀地为种子涂上一层或多层本文公开的微生物组合物。此类设备使用不同类型的涂布技术，例如旋转涂布机、鼓式涂布机、流化床技术、喷出床、旋转薄雾或其组合。液体种子处理剂，例如本发明的液体种子处理剂可通过旋转“喷雾器”盘或在通过所述喷洒方式移动时将种子处理剂均匀分布到种子上的喷雾嘴施加。优选地，然后使种子再混合或翻滚一段时间以实现额外处理剂分布和干燥。种子可在涂布发明的组合物之前引发或未引发以增加发芽和出苗的均匀性。在一个替代实施方案中，可向活动种子上计量干粉制剂并使其混合直至完全分布。

本发明的另一方面提供了用受试微生物组合物处理的种子。一个实施方案提供了至少一部分表面积涂有根据本发明所述的微生物组合物的种子。在一个特定实施方案中，经微生物处理的种子的微生物孢子浓度或微生物细胞浓度为约10⁶至约10⁹个/颗种子。每颗种子可能还具有更多孢子或微生物细胞，例如10¹⁰、10¹¹或10¹²个孢子/颗种子。微生物孢子和/或细胞可随意涂到种子上，或优选地，可在涂到种子上之前将其配制成液体或固体组合物。例如，可通过混合固体载体和孢子的悬浮液，直至固体载体浸满孢子或细胞悬浮液，制备包含所述微生物的固体组合物。然后可干燥这种混合物以获得所需颗粒。

在一些其它实施方案中，预期本发明的固体或液体微生物组合物进一步含有能够保护种子免受选择性除草剂例如活性碳的有害影响的功能剂、养分(肥料)和能够提高发芽和产物质量的其它试剂或其组合。

本领域已知的种子包衣方法和组合物在通过添加本发明其中一个实施方案修改时可特别有用。例如，在美国专利号5,918,413、5,554,445、5,389,399、4,759,945和4,465,017中公开了此类包衣方法及其应用装置。例如，其中在美国专利申请号US20100154299、美国专利号5,939,356、5,876,739、5,849,320、5,791,084、5,661,103、5,580,544、5,328,942、4,735,015、4,634,587、4,372,080、4,339,456和4,245,432号中公开了种子包衣组合物。

可向包含发明组合物的种子处理制剂中添加多种添加剂。可添加粘合剂并且包括优选由可为天然或合成的粘性聚合物构成，而对待涂布的种子没有植物毒性影响的粘合剂。所述粘合剂可选自聚乙酸乙烯酯；聚乙酸乙烯酯共聚物；乙烯醋酸乙烯酯(EVA)共聚物；聚乙烯醇；聚乙烯醇共聚物；纤维素，包括乙基纤维素、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素和羧甲基纤维素；聚乙烯吡咯烷酮；多糖，包括淀粉、改性淀粉、糊精、麦芽糊精、藻酸盐和壳聚糖；脂肪；油；蛋白质，包括明胶和玉米蛋白；阿拉伯树胶；虫胶；偏二氯乙烯和偏二氯乙烯共聚物；木质素磺酸钙；丙烯酸共聚物；聚乙烯丙烯酸酯；聚氧乙烯；丙烯酰胺聚合物和共聚物；聚丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酰胺单体；和聚氯丁烯。

可采用多种着色剂的任一种，包括有机发色团，分类为亚硝基；硝基；偶氮，包括单偶氮、双偶氮和多偶氮；吖啶、蒽醌、吖嗪、二苯基甲烷、吲达胺、靛酚、甲川、噁嗪、酞菁、噻嗪、噻唑、三芳基甲烷、氧杂蒽。可添加的其它添加剂包括微量养分，例如铁、锰、硼、铜、钴、钼和锌的盐。可施加聚合物或其它防尘剂以使处理剂保留在种子表面。

在一些特定实施方案中，除微生物细胞或孢子外，所述包衣可进一步包含一层粘附剂。所述粘附剂应无毒、生物可降解和带粘性。此类材料的实例包括但不限于聚乙酸乙烯酯；聚乙酸乙烯酯共聚物；聚乙烯醇；聚乙烯醇共聚物；纤维素，例如甲基纤维素、羟甲基纤维素和羟甲基丙基纤维素；糊精；藻酸盐；糖；糖蜜；聚乙烯吡咯烷酮；多糖；蛋白质；脂肪；油；阿拉伯树胶；明胶；糖浆和淀粉。例如，在美国专利号7,213,367和美国专利申请号US20100189693中可找到更多实例。

在种子处理制剂中还可包括各种添加剂，例如粘附剂、分散剂、表面活性剂和养分及缓冲成分。其它常规种子处理添加剂包括但不限于包衣剂、湿润剂、缓冲剂和多糖。可向种子处理制剂中添加至少一种农业上可接受的载体，例如水、固体或干粉。干粉可源自多种材料，例如碳酸钙、石膏、蛭石、滑石、腐殖质、活性炭和各种含磷化合物。

在一些实施方案中，种子包衣组合物可包含至少一种填料，其为有机或无机、天然或合成组分，活性组分与之组合以利于其施加到种子上。优选地，填料为惰性固体例如粘土、天然或合成硅酸盐、硅石、树脂、蜡、固体肥料(例如铵盐)、天然土壤矿物质(例如高岭土、粘土、滑石、石灰、石英、硅镁土、蒙脱石、膨润土或硅藻土)或合成矿物质(例如硅石、氧化铝或硅酸盐)，特别是硅酸铝或硅酸镁。

种子处理制剂可进一步包括下列一种或多种成分：其它农药，包括仅在地底下起作用的化合物；杀真菌剂，例如克菌丹、福美双(thiram)、甲霜灵、咯菌腈(fludioxonil)、恶霜灵(oxadixyl)和这些物质的每一种的异构体等；除草剂，包括选自草甘膦(glyphosate)、氨基甲酸盐、硫代氨基甲酸盐、乙酰胺、三嗪、二硝基苯胺、甘油醚、哒嗪酮、尿嘧啶、苯氧、尿素和苯甲酸的化合物；除草安全剂例如苯并噁嗪、二苯甲基衍生物、N，N-二烯丙基二氯乙酰胺、各种二卤代酰基、噁唑烷基和四氢噻唑基化合物、乙酮、萘二甲酸酐化合物和肟衍生物；化学肥料；生物肥料；和生物防治剂，例如来自根瘤菌属、杆菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属(Serratia)、木霉属(Trichoderma)、球囊霉属(Glomus)、粘帚霉属和菌根真菌的其它天然存在或重组的细菌和真菌。这些成分可分层添加到种子上或可选地，可作为本发明种子包衣组合物的一部分添加。

优选地，种子处理中使用的新型组合物或其它成分的量应不抑制种子发芽或引起对种子的植物毒性伤害。

在本发明中用于处理种子的制剂可呈悬浮液、乳剂、颗粒在含水介质(例如，水)中的浆料、可湿性粉剂、可湿性粒剂(干燥可流动)和干粒剂形式。如果配制成悬浮液或浆料，制剂中活性成分的浓度优选按重量计(w/w)约0.5％至约99％，优选5-40％或如本领域技术人员另外配制。

如上所述，可向制剂中并入其它常规非活性或惰性成分。此类惰性成分包括但不限于：常规粘着剂；分散剂例如用作组合分散剂/粘着剂以用于种子处理的甲基纤维素；聚乙烯醇；卵磷脂、聚合物分散剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮/醋酸乙烯酯)；增稠剂(例如，提高颗粒悬浮液粘性和减少沉降的粘土增稠剂)；乳化稳定剂；表面活性剂；防冻化合物(例如，尿素)、染料、着色剂等。在McCutcheon的第1卷，″Emulsifiers and Detergents，″MCPublishing Company，Glen Rock，N.J.，U.S.A.，1996中可找到在本发明中有用的其它惰性成分。在McCutcheon的第2卷，″Functional Materials，″MC Publishing Company，GlenRock，N.J.，U.S.A.，1996中可找到在本发明中有用的另外的惰性成分。

可通过多种方法，包括但不限于在容器(例如，瓶子或包)中混合、机械施加、翻滚、喷雾和浸渍，向种子施加本发明的包衣制剂。多种活性或惰性材料可用于使种子与根据本发明所述的微生物组合物接触，例如常规膜包衣材料，包括但不限于水基膜包衣材料例如SEPIRET^TM(Seppic，Inc.，N.J.)和OPACOAT^TM(Berwind Pharm.Services，P.A.)。

根据本发明所述的组合物用于种子处理的量将根据种子的类型和活性成分的类型变化，但是处理将包括使种子与农业有效量的发明组合物接触。如以上所讨论，有效量指发明组合物足以影响有益或预期结果的量。有效量可分一次或多次施用。

除包衣层外，可用下列一种或多种成分处理种子：其它农药，包括杀真菌剂和除草剂；除草安全剂；肥料和/或生物防治剂。这些成分可分层添加到种子上或可选地，可添加到包衣层中。

可使用多种技术和机器，例如流化床技术、滚筒碾粉机方法、滚动静态种子处理机和鼓式涂布机向种子施加本发明的种衣剂。其它方法，例如喷射床也可能有用。种子可在包衣之前预定径(pre-size)。包衣之后，通常种子经干燥，然后转移到定径机上定径。这些程序在本领域中已知。

还可用膜外包衣包裹经微生物处理的种子以保护包衣。此类外包衣在本领域已知并且可使用流化床和鼓式膜包衣技术施加。

在本发明的另一实施方案中，可通过利用固体基质引发将根据本发明所述的组合物可引到种子上。例如，一定量的发明组合物可与固体基质材料混合，然后使种子处于和固体基质材料的接触中一段时间以使组合物引到种子上。然后可任选地将种子与固体基质材料分离并且储存或使用，或直接储存或种植固体基质材料加上种子的混合物。在本发明中有用的固体基质材料包括聚丙烯酰胺、淀粉、粘土、硅石、氧化铝、土壤、沙子、聚脲、聚丙烯酸酯或能够吸收或吸附发明组合物一段时间并且向种子内或种子上释放该组合物的任何其它材料。有用的是，确保发明组合物和固体基质材料相互相容。例如，应选择固体基质材料以致可以按合理速率，例如在几分钟、几小时或几天内释放所述组合物。

原则上，能够发芽形成植物的任何植物种子均可根据本发明处理。适合的种子包括谷类、咖啡、甘蓝类作物、纤维作物、花、水果、豆类、油类作物、树、块茎作物、蔬菜以及单子叶和双子叶类的其它植物的种子。优选地，包衣的作物种子包括但不限于菜豆、胡萝卜、玉米、棉花、草、莴苣、花生、胡椒、马铃薯、油菜籽、水稻、黑麦、高粱、大豆、甜菜、葵花、烟草和西红柿种子。最优选地，为大麦或小麦(春小麦或冬小麦)种子涂布本发明组合物。

制备根据本发明所述的微生物组合物

使用本领域已知的标准静态干燥和液体发酵技术制备微生物的培养物以用于本发明的微生物组合物中。生长通常在生物反应器中实现。

生物反应器指支持生物活性环境的任何装置或系统。如本文所述，生物反应器是可使微生物，包括本发明的微生物在其中生长的器皿。生物反应器可为供微生物生长的任何适当形状或尺寸。生物反应器尺寸和规模范围可从10mL至升到立方米并且可由不锈钢或本领域已知和使用的任何其它适当材料制成。生物反应器可为批式生物反应器、分批补料式或连续式生物反应器(例如，连续搅拌反应器)。例如，生物反应器可为微生物领域所知和用于培养和收获微生物的恒化器。生物反应器可从商业供应商处获得(同样见BioreactorSystem Design，Asenjo&Merchuk，CRC Press，1995)。

对于小规模操作，例如批式生物反应器可用于测试和开发新工艺，并且用于不能转换为连续操作的工艺。

在生物反应器中生长的微生物可悬浮或固定。在生物反应器中的生长通常在适合生长的温度和pH的需氧条件下。对于本发明的微生物，细胞生长可在介于5-37℃之间的温度下实现，优选温度在15至30℃、15至28℃、20至30℃或15至25℃范围内。营养培养基的pH可在4.0-9.0之间变化，但是优选操作范围通常呈pH4.0至7.0或4.5至6.5或pH5.0至6.0的弱酸性至中性。通常，在接种后20-72小时内获得最高细胞产量。

当然，培养本发明微生物的最适条件将取决于特定菌株。然后，依靠选择过程中应用的条件和大部分微生物的基本要求，本领域的普通技术人员将能够确定必需养分和条件。所述微生物通常将在含有可被微生物同化并且支持有效细胞生长的碳源、氮源和无机盐的培养基上的需氧液体培养物中生长。优选的碳源为己糖，例如葡萄糖，但是易于同化的其它来源例如氨基酸可被替代。许多无机和蛋白质物质可用作生长过程中的氮源。优选的氮源为氨基酸和尿素，但是其它氮源包括气态氨、无机硝酸盐和铵盐、微生物、嘌呤、嘧啶、酵母膏、牛肉膏、朊蛋白胨、大豆粉、酪蛋白的水解产物、酒糟等。其中可并入营养培养基中的无机矿物为能够产生钙、锌、铁、锰、镁、铜、钴、钾、钠、钼酸盐、磷酸盐、硫酸盐、氯、硼酸盐等离子的惯用盐类。不受其限制，优选对真菌菌株使用马铃薯葡萄糖液体培养基和对细菌菌株使用R2A肉汤预混料。

新型植物品种

在本发明的另一方面，还提供了通过向没有内生微生物的植物人工引入本发明的微生物内生菌产生的新型植物。在这个方面的一些实施方案中，引入植物的微生物内生菌可为具有植物生长促进活性、生物防治活性或两种活性的组合的内生微生物。本领域已知先前发现向禾谷植物类引入微生物内生菌有效的多种方法。其中此类方法的实例包括美国专利申请号20030195117A1、美国专利申请号20010032343A1和美国专利号7,084,331中描述的方法。对于本领域的技术人员将变得显而易见的是，许多前述方法可对生产本发明的新型植物有用。

人工注射后，优选通过PCR扩增分离的内生微生物的DNA序列并且通过进行扩增DNA序列的同源性搜索确认内生菌。进一步地，优选向上述内生微生物引入表达可识别方式的外源基因，并且通过以上可识别方式，使用外源基因确认存在感染植物的上述内生微生物的定殖。

适合本发明方法的植物

原则上，根据本发明所述的方法和组合物可用于任何植物种类。单子叶以及双子叶植物类特别适合。所述方法和组合物优选用于对农业、园艺、生产用于生产液体燃料分子和其它化学药品的生物质和/或林业而言重要或令人感兴趣的植物。

因此，本发明对多种植物有用，优选属于被子植物(Angiospermae)和裸子植物(Gymnospermae)纲的高等植物。双子叶植物(Dicotylodenae)和单子叶植物(Monocotyledonae)亚纲的植物特别优选。双子叶植物属于马兜铃目(Aristochiales)、菊目(Asterales)、肉穗果目(Batales)、桔梗目(Campanulales)、白花菜目(Capparales)、石竹目(Caryophyllales)、木麻黄目(Casuarinales)、卫矛目(Celastrales)、山茱萸目(Cornales)、岩梅目(Diapensales)、五桠果目(Dilleniales)、川续断目(Dipsacales)、柿树目(Ebenales)、杜鹃花目(Ericales)、罗氏楼梯草(Eucomiales)、大戟目(Euphorbiales)、豆目(Fabales)、壳斗目(Fagales)、龙胆目(Gentianales)、牻牛儿苗目(Geraniales)、小二仙草目(Haloragales)、金缕梅目(Hamamelidales)、八角目(Illiciales)、胡桃目(Juglandales)、唇形目(Lamiales)、樟目(Laurales)、玉蕊目(Lecythidales)、莱脱纳目(Leitneriales)、木兰目(Magniolales)、锦葵目(Malvales)、杨梅目(Myricales)、桃金娘目(Myrtales)、睡莲目(Nymphaeales)、罂粟目(Papeverales)、胡椒目(Piperales)、车前草目(Plantaginales)、蓝雪目(Plumbaginales)、川草目(Podostemales)、花葱目(Polemoniales)、远志目(Polygalales)、蓼目(Polygonales)、报春花目(Primulales)、山龙眼目(Proteales)、大花草目(Rafflesiales)、毛茛目(Ranunculales)、鼠李目(Rhamnales)、蔷薇目(Rosales)、茜草目(Rubiales)、杨柳目(Salicales)、檀香目(Santales)、无患子目(Sapindales)、瓶子草科(Sarraceniaceae)、玄参目(Scrophulariales)、山茶目(Theales)、昆栏树目(Trochodendrales)、伞形目(Umbellales)、荨麻目(Urticales)和菫菜目(Violales)。单子叶植物属于泽泻目(Alismatales)、天南星目(Arales)、槟榔目(Arecales)、凤梨目(Bromeliales)、鸭跖草目(Commelinales)、环花目(Cyclanthales)、莎草目(Cyperales)、谷精草目(Eriocaulales)、水鳖目(Hydrocharitales)、灯芯草目Juncales)、百合目(Lilliales)、茨藻目(Najadales)、兰目(Orchidales)、露兜树目(Pandanales)、禾本目(Poales)、帚灯草目(Restionales)、霉草目(Triuridales)、香蒲目(Typhales)和姜目(Zingiberales)。属于裸子植物纲的植物为苏铁目(Cycadales)、银杏目(Ginkgoales)、麻黄目(Gnetales)和松柏目(Pinales)。

适合的种类可包括秋葵属(Abelmoschus)、冷杉属(Abies)、槭属(Acer)、剪股颖属(Agrostis)、葱属(Allium)、六出花属(Alstroemeria)、凤梨属(Ananas)、穿心莲属(Andrographis)、须芒草属(Andropogon)、艾属(Artemisia)、芦竹属(Arundo)、颠茄属(Atropa)、小檗属(Berberis)、菾属(Beta)、红木属(Bixa)、芸苔属(Brassica)、金盏花属(Calendula)、山茶花属(Camellia)、喜树属(Camptotheca)、大麻属(Cannabis)、辣椒属(Capsicum)、红花属(Carthamus)、长春花属(Catharanthus)、三尖杉属(Cephalotaxus)、菊属(Chrysanthemum)、金鸡纳属(Cinchona)、西瓜属(Citrullus)、咖啡属(Coffea)、秋水仙属(Colchicum)、锦紫苏属(Coleus)、黄瓜属(Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、狗牙根属(Cynodon)、曼陀罗属(Datura)、石竹属(Dianthus)、洋地黄属(Digitalis)、薯蓣属(Dioscorea)、油棕属(Elaeis)、麻黄属(Ephedra)、蔗茅属(Erianthus)、古柯属(Erythroxylum)、桉属(Eucalyptus)、羊茅属(Festuca)、草莓属(Fragaria)、雪花莲属(Galanthus)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、向日葵属(Helianthus)、橡胶树属(Hevea)、大麦属(Hordeum)、莨菪属(Hyoscyamus)、麻风树属(Jatropha)、莴苣属(Lactuca)、亚麻属(Linum)、黑麦草属(Lolium)、羽扇豆属(Lupinus)、番茄属Lycopersicon)、石松属(Lycopodium)、木薯(Manihot)、苜蓿属(Medicago)、薄荷属(Mentha)、芒属(Miscanthus)、芭蕉属(Musa)、烟草属(Nicotiana)、稻属(Oryza)、黍属(Panicum)、罂粟属(Papaver)、银胶菊属(Parthenium)、狼尾草属(Pennisetum)、矮牵牛属(Petunia)、虉草属(Phalaris)、梯牧草属(Phleum)、松属(Pinus)、早熟禾属(Poa)、大戟属(Poinsettia)、杨属(Populus)、萝芙木属(Rauwolfia)、蓖麻属(Ricinus)、蔷薇属(Rosa)、甘蔗属(Saccharum)、柳属(Salix)、血根草属(Sanguinaria)、赛莨菪属(Scopolia)、黑麦属(Secale)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、米草属(Spartina)、菠菜属(Spinacea)、菊蒿属(Tanacetum)、红豆杉属(Taxus)、可可属(Theobroma)、小黑麦属(Triticosecale)、小麦属(Triticum)、北美穗草属(Uniola)、藜芦属(Veratrum)、长春花属(Vinca)、葡萄属(Vitis)和玉蜀黍属(Zea)的成员。

本发明的方法和组合物优选用于对农业、园艺、用于生产生物燃料分子和其它化学药品的生物质和/或林业而言重要或令人感兴趣的植物。非限制性实例包括，例如柳枝黍(Panicum virgatum)(柳枝稷)、高粱(Sorghum bicolor)(高粱、苏丹草)、巨芒(Miscanthusgiganteus)(芒属)、甘蔗属某种(Saccharum sp.)(能源甘蔗)、香脂杨(Populusbalsamifera)(白杨)、玉蜀黍(Zea mays)(玉米)、橹豆(Glycine max)(大豆)、欧洲油菜(Brassica napus)(油菜)、小麦(Triticum aestivum)(小麦)、陆地棉(Gossypiumhirsutum)(棉花)、稻(Oryza sativa)(水稻)、向日葵(Helianthus annuus)(葵花)、紫花苜蓿(Medicago sativa)(苜蓿)、菾菜(Beta vulgaris)(甜菜)、珍珠粟(Pennisetumglaucum)(御谷)、匍黍属某种(Panicum spp.)、高梁属某种(Sorghum spp.)、芒属某种(Miscanthus spp.)、甘蔗属某种(Saccharum spp.)、蔗茅属某种(Erianthus spp.)、杨属某种(Populus spp.)、须芒草(Andropogon gerardii)(大须芒草)、紫狼尾草(Pennisetumpurpureum)(象草)、虉草(Phalaris arundinacea)(虉草)、狗牙根(Cynodon dactylon)(百慕大草)、高羊茅(Festuca arundinacea)(牛尾草)、互花米草(Spartina pectinata)(草原索草)、变叶芦竹(Arundo donax)(芦竹)、黑麦Secale cereale)(黑麦)、柳属某种(Salixspp.)(柳树)、桉属某种(Eucalyptus spp.)(桉树)、小黑麦属某种(Triticosecale spp.)(小麦属-小麦X黑麦)、竹(Bamboo)、红花(Carthamus tinctorius)(红花)、麻风树(Jatropha curcas)(麻风树)、蓖麻(Ricinus communis)(蓖麻)、油棕(Elaeisguineensis)(油棕)、海枣(Phoenix dactylifera)(枣椰树)、紫花假槟榔(Archontophoenix cunninghamiana)(假檳榔)、皇后葵(Syagrus romanzoffiana)(克利巴椰子)、亚麻(Linum usitatissimum)(亚麻)、芥菜(Brassica juncea)、木薯(Manihotesculenta)(木薯)、番茄(Lycopersicon esculentum)(西红柿)、莴苣(Lactuca saliva)(莴苣)、粉芭蕉(Musa paradisiaca)(香蕉)、马铃薯(Solanum tuberosum)(土豆)、甘蓝(Brassica oleracea)(花椰菜、菜花、抱子甘蓝)、野茶树(Camellia sinensis)(茶)、草莓(Fragaria ananassa)(草莓)、可可树(Theobroma cacao)(可可)、咖啡树(Coffeaarabica)(咖啡)、葡萄树(Vitis vinifera)(葡萄)、菠萝(Ananas comosus)(凤梨)、辣椒(Capsicum annum)(辣椒和甜椒)、洋葱(Allium cepa)(洋葱)、香瓜(Cucumis melo)(瓜)、黄瓜(Cucumis sativus)(黄瓜)、笋瓜(Cucurbita maxima)(南瓜)、裸仁南瓜(Cucurbitamoschata)(南瓜)、菠菜(Spinacea oleracea)(菠菜)、西瓜(Citrullus lanatus)(西瓜)、黄秋葵(Abelmoschus esculentus)(秋葵)、茄子(Solanum melongena)(茄子)、罂粟(Papaver somniferum)(罂粟)、东方罂粟(Papaver orientale)、欧洲紫杉(Taxusbaccata)、太平洋紫杉(Taxus brevifolia)、青蒿(Artemisia annua)、大麻(Cannabissaliva)、喜树(Camptotheca acuminate)、长春花(Catharanthus roseus)、长春花(Vincarosea)、金鸡纳树(Cinchona officinalis)、秋水仙(Coichicum autumnale)、加州藜芦(Veratrum californica)、毛地黄(Digitalis lanata)、洋地黄(Digitalis purpurea)、薯蓣属某种(Dioscorea spp.)、穿心莲(Andrographis paniculata)、颠茄(Atropabelladonna)、曼陀罗(Datura stomonium)、小檗属某种(Berberis spp.)、三尖杉属某种(Cephalotaxus spp.)、草麻黄(Ephedra sinica)、麻黄属某种(Ephedra spp.)、古柯(Erythroxylum coca)、雪花莲(Galanthus wornorii)、莨菪属某种(Scopolia spp.)、蛇足石松(Lycopodium serratum)(蛇足石杉(Huperzia serrata))、石松属某种(Lycopodiumspp.)、蛇根木(Rauwolfia serpentina)、萝芙木属某种(Rauwolfia spp.)、血根草(Sanguinaria canadensis)、天仙子属某种(Hyoscyamus spp.)、金盏花(Calendulaofficinalis)、小白菊(Chrysanthemum parthenium)、毛喉鞘蕊花(Coleus forskohlii)、艾菊(Tanacetum parthenium)、灰白银胶菊(Parthenium argentatum)(银胶菊)、橡胶属某种(Hevea spp.)(橡胶)、留兰香(Mentha spicata)(薄荷)、辣薄荷(Mentha piperita)(薄荷)、红木(Bixa orellana)、六出花属某种(Alstroemeria spp.)、蔷薇属某种(Rosa spp.)(玫瑰)、香石竹(Dianthus caryophyllus)(康乃馨)、矮牵牛属某种(Petunia spp.)(矮牵牛花)、一品红(Poinsettia pulcherrima)(猩猩木)、烟草(Nicotiana tabacum)(烟草)、白羽扇豆(Lupinus albus)(羽扇豆)、海燕麦(Uniola paniculata)(燕麦)、翦股颖(bentgrass)(翦股颖属某种(Agrostis spp.))、美洲山杨(Populus tremuloides)(颤杨)、松属某种(Pinus spp.)(松树)、冷杉属某种(Abies spp.)(冷杉)、槭属某种(Acer spp.)(槭树)、大麦(Hordeum vulgare)(大麦)、草地早熟禾(Poa pratensis)(早熟禾)、黑麦草属某种(Lolium spp.)(黑麦草)、梯牧草(Phleum pratense)(梯牧草)和针叶树。有兴趣的是生长用于能源生产的植物，所以称为能源作物，例如纤维素基能源作物如柳枝黍(Panicumvirgatum)(柳枝稷)、高粱(Sorghum bicolor)(高粱、苏丹草)、巨芒(Miscanthusgiganteus)(芒属)、甘蔗属某种(Saccharum sp.)(能源甘蔗)、香脂杨(Populusbalsamifera)(白杨)、大须芒草(Andropogon gerardii)(大须芒草)、紫狼尾草(Pennisetum purpureum)(象草)、虉草(Phalaris arundinacea)(虉草)、狗牙根(Cynodondactylon)(百慕大草)、高羊茅(Festuca arundinacea)(牛尾草)、互花米草(Spartinapectinata)(草原索草)、紫花苜蓿(Medicago sativa)(苜蓿)、变叶芦竹(Arundo donax)(芦竹)、黑麦(Secale cereale)(黑麦)、柳属某种(Salix spp.)(柳树)、桉属某种(Eucalyptus spp.)(桉树)、小黑麦属某种(Triticosecale spp.)(小麦属-小麦X黑麦)和竹(Bamboo)；和糖基能源作物如甘蔗属某种(Saccharum sp.)(能源甘蔗)、菾菜(Betavulgaris)(甜菜)和甜高粱(Sorghum bicolor(L.)Moench)(甜高粱)；和生产生物燃料的能源作物如橹豆(Glycine max)(大豆)、欧洲油菜(Brassica napus)(油菜)、向日葵(Helianthus annuus)(葵花)、红花(Carthamus tinctorius)(红花)、麻风树(Jatrophacurcas)(麻风树)、蓖麻(Ricinus communis)(蓖麻)、非洲油棕(Elaeis guineensis)(非洲油棕)、美洲油棕(Elaeis oleifera)(美国油棕)、可可椰子(Cocos nucifera)(椰子)、亚麻荠(Camelina sativa)(野亚麻)、水黄皮(Pongamia pinnata)(水黄皮)、油橄榄(Oleaeuropaea)(橄榄)、亚麻(Linum usitatissimum)(亚麻)、海甘蓝(Crambe abyssinica)(阿比西尼亚甘蓝)和芥菜(Brassicajuncea)。

本文指定通用方法的讨论仅仅旨在说明性目的。其它替代性方法和实施方案将在审阅本发明后对于本领域的技术人员显而易见并且包括在本申请的精神和范围内。

应理解，提供下列实施例是为了说明，而非限制本发明。

实施例

实施例1：从环境样品中分离微生物

使用超声处理根和连续稀释方法鉴定产孢根际细菌。如下所述，使用“超声处理根、连续稀释”方法分离下列微生物：从针状草样品分离的SGI-026-G06和SGI-026-G07分离株；从野黑麦样品分离的SGI-041-B03分离株；和从在复合土壤样品中生长的小麦根组织分离的SGI-020-A01分离株。

开发富集方法以特异性鉴定产孢根际细菌。简言之，加热处理经超声处理的根提取物以杀伤植物细胞，然后接种到加富培养基上。将热处理存活并且形成菌落的微生物视为产孢菌。发现这种方法对选择革兰氏阳性菌(Gram-positive bacteria)特别有效。新取样根用作这些富集的原材料。根尖端处存在的纤细部分最嫩，可具有高的根毛密度，并且通常具有高密度的根际细菌。用无菌刀片将根的这些区域切成5-10cm片段，然后在无菌milliQ水中洗涤以去除大的土壤颗粒。需要时，通过将根置于50mL有25mL1×无菌磷酸盐缓冲盐水(即PBS缓冲液)的离心管(Falcon tube)中并且离心1分钟来实现更严格的洗涤。随后将每个根样品悬浮在20mL无菌PBS缓冲液中并且在冰上使用飞世尔科技超声波破碎仪(Fisher Scientific Sonic Dismembrator)在8瓦特下以1分钟间隔超声处理2次。对于热处理，通常将1mL经超声处理的根细胞悬浮液转移到无菌埃彭道夫管(Eppendorf tube)中，将埃彭道夫管在80℃水浴中培育20分钟。连续稀释至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和10^-7的浓度之前，使经热处理的细胞悬浮液冷却至室温。将各100μL的10倍稀释液涂到装有用琼脂固化的微生物培养基和抑制真菌生长的100mg/L放线菌酮(cycloheximide)的培养板上。在一些情况下，接种之前必须进行1/10或1/100稀释以便获得适于挑取菌落的恰当CFU密度。用无菌移液管尖端挑取分离菌落，排列到各自每个孔装有150μL2×YT液体培养基的96孔微量滴定板中。微量滴定板在30℃下培育1-2天以便获得高细胞密度以进一步表征和存档。

形成生物膜的细菌的分离。如下所述，使用“生物膜形成菌”方法分离下列微生物分离株：从丝兰(Yucca)植物根样品分离的SGI-003-H11分离株；从草根样品分离的SGI-034-C09分离株；和从野胡萝卜(Queen Anne’s Lace)植物样品分离的SGI-034-E10分离株。

生物膜形成菌方法：在此程序中，如Fall等(Syst.Appl.Microbiol.27，372-379，2004)所述，从经超声处理的根段分离形成生物膜的细菌。如上所述，在根表面形成生物膜的细菌通常是非常好的根部定殖细菌。一般而言，当此类细菌以高密度存在时，它们可对植物健康有显著影响并且可将侵染病原体完全排除在外。简言之，使用超声处理去除松散附着于根部的细菌和真菌细胞，只留下牢牢粘附于根表面的微生物。用这种方法选择形成生物膜的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。

新取样的根用作这些富集的原材料。根尖端处存在的纤细部分是最嫩的组织，具有高的根毛密度并且通常具有高密度的根际细菌。用无菌刀片将根的这些区域切成5-10cm片段，然后通过将其放在50mL有25mL1×PBS的离心管中洗涤并且离心1分钟。使来自洗涤的碎片沉降，然后用无菌镊子将洗涤过的根段转移到50mL装有25mL1×PBS的离心管中，并且在冰上使用飞世尔科技超声波破碎仪以30秒间隔超声处理2次，触发间隔停顿30秒。将超声处理的根样品转移到无菌塑料陪替氏培养皿(Petri dish)中并且不加盖，使其在生物安全柜中完全干燥。然后将每个根段放在装有1％琼脂(10g/L酪蛋白消化物、10g/L甘露糖醇、10g/L琼脂)的单独CMA板上。有时，用无菌镊子将根段推到琼脂培养基中。随后在37℃下培育所述板并且监测生物生长。通常在1-2天后，从根部和CMA培养基上显露出多个微生物生长菌。沿所述片段用无菌移液管尖端挑取具有独特形态的生长菌并将这些生长菌的每一个转移到装有0.3％琼脂糖的CMA板中央。随后在37℃下培育CMA板1-2天并监测生长。通常，形成生物膜的分离株在这种培养基上显示出枝状生长。

用无菌环转移生物质并且从CMA板到CMKA板(2％琼脂、1.2g/LK2HPO4)划线纯化每个分离株。CMKA培养基限制生物膜生长并且允许挑取单个菌落进行存档。

实施例2：微生物分离株的生长和储存

分离的细菌作为纯净培养物储存。将细菌菌落转移到装有R2A肉汤液体培养基(Tecknova)的小瓶中并且在30℃下250rpm振荡，使其生长2天。然后将培养物转移到装有15％甘油的小瓶中并储存在-80℃下。

实施例3：DNA提取、测序和分类

将20μl等份的细菌细胞悬浮液转移到装有20μl的2×裂解缓冲液(100mM TrisHCL(pH8.0)、2mM EDTA(pH8.0)、1％SDS、400μg/mL蛋白酶K)的96孔PCR板中。裂解条件如下：55℃培育30分钟，接着94℃培育4分钟。一等份的裂解产物用作PCR扩增的模板DNA的来源。

为扩增16S rRNA区，在含有4μl细菌裂解反应物、各2μM的PCR引物、6％吐温20(Tween-20)和10μl的2×ImmoMix(Bioline USA Inc，Taunton，MA)的20μl最终体积反应物中制备每种PCR混合物。用于PCR扩增的引物为M13-27F(5’-TGTAAAACGACGGCCAGTTAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’SEQ ID NO：8)和1492R M13尾(5’-CAGGAAACAGCTATGACCGGTTACCTTGTTACGACTT-3’；SEQ ID NO：9)。在PTC-200个人热循环仪(MJ-Research，MA，USA)中进行PCR，如下：94℃，10分钟；94℃，30秒；52℃，30秒；72℃，75秒循环30次；72℃，10分钟。各2μl等份的PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶上跑电泳以确认预期尺寸的单一条带。阳性条带经分离、纯化并提交进行PCR测序。由圣地亚哥的克雷格·文特尔研究所(J.Craig Venter Institute)使用454技术在正向和反向引物方向进行测序。

使用DDBJ/GenBank/EMBL数据库进行对测定核苷酸序列的同源性搜索。随后，使用ClustalW系统发育树构建程序分析了本文所述分离细菌菌株、表现出与分离细菌菌株的高序列同源性的属和种的细菌和其它各种细菌属和种之间16rRNA基因的核苷酸序列的系统发育关系。还使用GenomeQuest^TM软件(Gene-IT，Worcester Mass.USA)测定了序列同一性和相似性。序列分析结果显示，基于每个16rRNA序列与各微生物＞98％的序列同源性，可以认为细菌分离株SGI-003_H11、SGI-020_A01、SGI-026_G06、SGI-026_G07、SGI-034_C09、SGI-034_E10、SGI-041_B03分别与成团泛菌、苏云金芽孢杆菌、鼻疽伯克霍尔德菌、越南伯克霍尔德菌、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、草螺菌属某种、土地杆菌属某种有关。

实施例4：细菌分离株的生物化学特征

进一步研究分离细菌在其与植物的相互作用中重要的性质。研究的性质包括固氮、铁载体分泌、无机磷的溶解、1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶的生成、2，3丁二醇的生成和植物生长激素生长素的生成。表2中示出了体外生物化学测定的结果。

固氮：

将细菌细胞悬浮液划在下列不包括氮源的组成的固体培养基上：KOH4.0g/L；K₂HPO₄0.5g/L；MgSO₄·7H₂O0.2g/L；NaCl0.1g/L；CaCl₂0.02g/L；FeSO₄·7H₂O0.005g/L；NaMoO4·2H₂O0.002g/L；MnSO4·7H₂O0.01g/L；苹果酸5.0g/L；结冷胶0.1-1.0g/L；和任选0.5％v/v溴百里酚蓝，pH7.0。必要时可改变结冷胶或琼脂浓度以获得所需培养基厚度；通常用0.5g/L。在30℃下划线培养2-5天。每天监测这些板并且在菌落出现时选择菌落。在一些情况下，生长期越长(长达两周或更长)允许捕获生长越缓慢的分离株。通常使用20或200μL气溶胶屏障移液管尖端将这些划线平板的菌落挑取到装有150μL/孔2YT培养基的96孔细胞培养板中。可选地，从板上直接挑取分离株菌落到无N培养基中以确认其无N生长能力。如表2中归纳的结果表明，仅分离株SGI-026-G07显示出可检测水平的固氮能力。

铁载体分泌：

该测定用于鉴定产生为体外高亲和力Fe³⁺-螯合化合物的铁载体的细菌分离株。通常，在基本上没有Fe的基本培养基上培养微生物分离株。该测定中使用的所有玻璃器皿经酸洗并且用milliQ水冲洗3次以去除可能改变测定结果的残留Fe。MM9培养基的组成如下：K₂HPO₄0.5g/L；NH₄Cl1.0g/L；MgSO₄·H₂O0.2g/L；NaCl0.5g/L；PIPES缓冲液7.55g/L；葡萄糖10.0g/L；葡萄糖酸2.5g/L；苹果酸2.5g/L；酪蛋白氨基酸0.5g/L。用5N KOH将培养基调节至pH7.0，并且使用0.2μM过滤器(Coming)灭菌。

通常使用Beckman FX液体工作站和每个孔有150μL MM9生长培养基的96孔细胞培养板，以高通量形式进行该测定。在层流净化罩下使用耐高温高压的搅拌针(pin-tool)无菌分布和转移培养物和培养基。转移后，在30℃下培育培养物5天。培育之后，使用96孔0.22μM滤板通过离心收获培养物上清液。从每个孔转移10μL经过滤的上清液到Falcon测定板。使用稀释于MM9培养基中的去铁敏(DFO)制成标准曲线。向每个上清液和标准孔添加200μL的CAS测定溶液[10mM HDTMA、Fe(III)-溶液：1mM FeCl₃.6H2O、10mM HCl、2mM CAS]，接着在室温下培育20-30分钟。630nm下蓝色CAS测定溶液(SpectroMax M2)的吸光度与每个孔中的铁载体浓度成反比(即，随铁载体量增加，测定溶液应变为更深的橙色)。

无机磷的溶解：

如下评估了微生物分离株体外溶解矿物磷酸盐的能力。将待检细菌划在琼脂磷酸盐生长培养基上[羟磷灰石-Ca₁₀(PO₄)₅(OH)₂5.0g/L；NH₄Cl1.0g/L；MgSO₄·H₂O0.2g/L；NaCl0.5g/L；FeSO₄·7H₂O0.01g/L；Na₂MoO₄·7H₂O0.01g/L；MnSO₄·7H₂O0.01g/L；葡萄糖5.0g/L；葡萄糖酸2.5g/L；苹果酸2.5g/L；酪蛋白氨基酸0.5g/L；结冷胶20.0g/L；pH7.2)]，并且每天监测其生长。由于存在磷酸钙，培养基有不透明的外观。如果细菌具有磷酸钙溶解能力，则会观察到细菌生长和培养基失去颜色。有溶解矿物相磷酸盐的能力的分离株将在菌落周围的不透明培养基上产生清晰的光晕。如表2中所归纳，通过本文所述的体外测定法测定，在任何测试微生物中均不可检测到溶解矿物磷酸盐的能力。

ACC脱氨酶生成：

植物生长促进根际细菌(PGPM)用于促进植物生长和发育的主要机制之一是通过植物中乙烯的直接前体1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)的脱氨降低乙烯水平。ACC脱氨酶催化1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)水解成α-酮丁酸和氨。然后通过在HCl中与2，4-二硝基苯肼反应形成苯腙衍生物间接确定α-酮丁酸产物的存在。添加NaOH后，可用分光光度法通过测量其在540nm的吸光度测定苯腙的量(Penrose和Glick，Physiol Plant.May；118：10-1，2003)。通常使用96孔细胞培养板以高通量形式进行该测定。每个孔装有150μL补充了2.0g/L(NH₄)₂SO₄的DF盐生长培养基。在层流净化罩下使用耐高温高压的搅拌针无菌分布和转移培养物和培养基。转移后，在30℃下培育培养物2天。达到混浊后，再次使用无菌搅拌针在层流净化罩下将培养物转移到每孔装有150μL补充了5mM ACC作为唯一氮源的DF盐生长培养基的96孔板中，接着在30℃下培育4天。使用分光光度计测量每种培养物在600nm下的吸光度。如Penrose和Glick，2003，同上所述，在这些条件下(OD＞0.2)显示出稳健生长的分离株继续进一步测定ACC脱氨酶活性。

如表2中所归纳，试验结果表明下列分离株产生大量的ACC脱氨酶：SGI-003-H11、SGI-026-G06、SGI-026-G07和SGI-041-B03。

2，3丁二醇生成：

如下，如Ryu等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100：4927-4932，2003)所述，使用毛细管气相色谱质谱法评估了细菌分离株体外合成2，3-丁二醇的能力。通常使用每孔有150μL DF盐生长培养基的96细胞培养孔板以高通量形式进行该测定。在制备大量平板用于初步筛选大分离株库时也可使用titer-tek。在层流净化罩下使用耐高温高压的搅拌针无菌分布和转移培养物和培养基。转移后，在30℃下培育培养物5天。培育之后，使用96孔0.22μM滤板通过离心收获培养物上清液。使用L200多道移液管从每个孔转移50μL经过滤的上清液到96深孔板的每孔装有450μL50％甲醇的相应孔中并且用粘性封板条密封，接着使用Ryu等(2003，同上)描述的方法进行2，3-丁二醇量化测定。如表2中所归纳，试验结果表明下列分离株产生大量的2，3-丁二醇：SGI-003-H11、SGI-034-C09和SGI-041-B03。

生长素的生成：

生长素是可直接影响植物生长的激素。因为已知许多根际和内生细菌分离株具有合成生长素吲哚-3-乙酸(IAA)及其衍生物的生化途径，所以进行该测定以确定细菌分离株是否产生了生长素。色氨酸常常是这个合成中的前体；因此，该测定量化了来自补充了低浓度的氨基酸色氨酸的培养基上生长的细菌分离株的IAA(生长素)生成。

通常使用每孔有150μLYT生长培养基的96孔细胞培养板以高通量形式进行该测定。在制备大量平板用于初步筛选大分离株库时使用titer-tek。在层流净化罩下使用耐高温高压的搅拌针无菌分布和转移培养物和培养基。转移后，在30℃下培育培养物5天。培育之后，使用96孔0.22μM滤板通过离心收获培养物上清液。从每个孔转移10μL经过滤的上清液到Falcon测定板中。向每个上清液和标准孔添加200μL的Salkowsky测定溶液(Gordon和Weber，Plant Physiol.26：192-195，1951)，接着在室温下培育15-20分钟。因为Salkowsky测定溶液从黄色到紫色/粉红色的颜色变化与每个孔中生长素(IAA)的浓度成比例，所以通过535nm下所述板在SpectroMax M2上的吸光度监测反应。如表2中所归纳，试验结果表明下列分离株产生大量的植物激素生长素：SGI-003-H11、SGI-020-A01、SGI-034-C09、SGI-034-C09和SGI-041-B03。

表2：细菌分离株的生物化学特征(ND：不可检测)

实施例5：细菌分离株对真菌植物病原体的生物防治活性

体外拮抗测定用于评估分离的细菌菌株抑制几种植物真菌病原体发育的能力，包括禾谷镰刀菌NRRL-5883、雪腐明梭孢ATCC MYA-3968、玉米赤霉菌ATCC-16106、颖枯壳多孢ATCC-26369、禾谷刺盘孢ATCC-34167和青霉菌属某种病原体。在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上进行测定。使用之前，使细菌的分离菌株在五分之一强度胰蛋白胨大豆肉汤琼脂(TSBA/5)上生长24h。

对于每种真菌病原体而言，通过菌丝翻转真菌的活跃生长菌落并且将菌丝束转移到PDA琼脂培养基上产生分生孢子接种物。用12h/天的光周期在25℃下培育板7天后，用弱磷酸盐缓冲液(0.004％磷酸盐缓冲液，pH7.2，含0.019％MgCl₂)从PDA板上洗掉真菌分生孢子。然后立即将真菌分生孢子在弱磷酸盐缓冲液中的悬浮液(约1×10⁵个分生孢子/mL)喷到琼脂表面，然后在用于拮抗试验之前，在25℃下培育经喷涂的板48-72h。

要开始拮抗试验，在所述板周边内按等距离点接种分离微生物菌株的细胞。5天后，在微生物菌落周边出现缺乏菌丝生长的明显空白区(即，生长抑制区)时，将细菌菌株评为抗生阳性。如表3中所归纳，拮抗测定的结果证明本文公开的每种微生物均抑制几种真菌植物病原体的发展，包括禾谷镰刀菌、雪腐明梭孢、玉米赤霉菌、颖枯壳多孢、禾谷刺盘孢、青霉菌属某种。

表3：细菌分离株对真菌植物病原体的生物防治活性

实施例6：小麦产量潜力的增强

在温室中用分离株SGI-020-A01研究了细菌接种对植物生长和产量的影响。微生物细胞悬浮液制备如下。从分离株的甘油原液或划线平板上将肉汤培养物接种到2YT培养基或类似生长培养基。通常，在用于生长室、温室或田间之前，引发细菌培养物48-72小时以使培养物达到对数生长晚期。具有更长倍增时间的分离株提前经进一步引发。在30℃下于旋转摇荡器上在200rpm下培育培养物。生长后，4℃下在10,000×g下使细胞沉淀15分钟并且再悬浮在10mM MgSO₄缓冲液(pH7.0)中。对每种分离株按CFU/mL计标准化细胞密度。通常，为每种分离株制备约10⁹CFU/mL悬浮液并且于冰上转移到接种位置。通过将这些细胞悬浮液于灌溉水中稀释1/20至最终密度5×10⁷CFU/mL进行接种。对于1L盆栽试验，将20mL这种稀释细胞悬浮液均匀分布在每个重复盆的表面。

用缺乏养分的田间土壤进行温室试验。去除大岩石和碎石后，充分混合田间土壤以确保均匀性。装填后，将每个盆中的土壤压下约2cm以使播种层结实。将商用小麦品种的种子(硬红春麦；Howe Seeds，Inc.)播种在装有田间土壤培养基的1L盆(10.5cm×12.5cm锥形直径塑料盆)中。将2g春小麦种子(约70粒种子)均匀分布在每个盆中并且施50mL田间土壤并均匀覆盖在种层上。统一出现小麦胚芽鞘和随后出现第一叶后，为植物种群接种20mL的10⁹CFU/mL SGI-020-A01。阴性对照的植物仅接受20mL的接种物缓冲液。每种情况在8块平地上重复进行，每块地含4个1L盆(n＝4个/平地)。平地随机分布在4个试验区。然后种子和植物在温室中保持在环境温度(范围从约8℃到约22℃)下60天，其中整个试验中昼间光周期为约11.5小时阳光/12小时黑暗。根据温度和生长阶段统一为植物底层浇水至适当水化水平。在播种约30天后，用桩支撑每个盆约70个单株并且松散地绑在一起以防止交叉污染和将由于落入其它盆中的植物的变化引起的位置效应减到最低。在播种约60天后，使植物变干准备收获。在播种约80天后收获小麦穗。通过就在穗下方切割取下每个麦穗。汇合每个重复盆中的麦穗，称重并且随后用作产量潜力的估计值。在同一天收获种群中的所有植物并且按随机顺序收获处理组以消除处理组间收获时间上大的差异。因此，用分离株SGI-020-A01处理的小麦植株与未处理的对照植物相比，显示出产量潜力增加40％(2.95g/盆比2.10g/盆)。对所有8个重复记录了平均和标准偏差并且进行了ANOVA(方差分析)。通过分析每个重复盆在重量上的麦穗产量，量化了微生物分离株SGI-020-A01在增强小麦产量潜力中的功效。P值＜.05视为显著。

实施例7：玉米生物质生成的增强

在温室试验中用下列每一种细菌分离株研究了细菌接种对植物生长和产量的影响：SGI-034-C09、SGI-034-E10、SGI-003-H11、SGI-041-B03、SGI-026-G06和SGI-026-G07。用缺乏养分的田间土壤进行温室试验。去除大岩石和碎石后，将田间土壤与盆栽土壤充分混合(70：30)以确保均匀性。装填后，将每个盆中的土壤压下约2cm以使播种层结实。将商用玉米品种的种子(Dow AgroSciences)播种在各自装有土壤培养基的1L盆(10.5cm×12.5cm锥形盆)中。2颗玉米粒按胚芽朝上的方向均匀分布在每个盆中，接着施50mL田间土壤，田间土壤均匀覆盖在种层上。发芽后，如有必要每盆剔除一颗幼苗，以便每个盆只装一株。

统一出现玉米胚芽鞘和随后出现第一叶后，为植物种群接种约20mL、10⁹CFU/ml选自SGI-034-C09、SGI-034-E10、SGI-003-H11、SGI-041-B03、SGI-026-G06和SGI-026-G07的微生物分离株。如以上实施例6中所述制备微生物细胞悬浮液。阴性对照的植物仅接受20mL的接种物缓冲液。

每种情况在8块平地上重复进行，每块地含2个1L盆(n＝2个/平地)。平地随机分布在4个试验区。然后种子和植物在温室中保持在环境温度(范围从约8℃到约22℃)下60天，整个试验中昼间光周期为约11.5小时阳光/12小时黑暗。根据温度和生长阶段统一为植物底层浇水至适当水化水平。在播种约60天后，收获玉米地上生物质。

在同一天收获种群中的所有植物并且按随机顺序收获处理组以消除处理组间收获时间上大的差异。分析玉米植株总生物量上的差异。如表4所记录，用每种微生物分离株处理的玉米植株与未处理的对照植物相比，显示出总生物量的显著增加。对所有8个重复记录了平均和标准偏差并且进行了ANOVA(方差分析)。

表4：微生物分离株增强植物总生物量的功效

处理	植物生物量(g)	p值	生物量增加(％)
				未处理	58.6	N/A	N/A
SGI-034-C09	106.3	＜.0001	181％
				SGI-034-E10	103.6	＜.0001	177％
SGI-003-H11	100.7	＜.0001	172％
				SGI-041-B03	99.5	0.0001	170％
SGI-026-G06	98.3	0.0002	168％
				S GI-026-G07	97.3	0.0003	166％

实施例8：小麦种子和玉米种子的种衣处理

按照Sudisha等(Phytoparasitica，37：161-169，2009)描述的以下程序，做少量修改进行小规模种子处理实验。通常，通过将1g阿拉伯树胶粉末(MP Biomedical)加到9mL水中并且混合至均匀制成生物聚合物原液。用PBS洗涤活跃生长的微生物细胞或微生物孢子制剂的混浊培养物并且调节到OD600为约5.0。在50mL离心管中通过离心使3mL经调节的细胞悬浮液沉淀。轻轻倒出所得上清液，用3mL生物聚合物原液代替并且充分混合所得悬浮液。通常，将约25g种子加入离心管中并用力振荡或涡旋以确保树胶/细胞悬浮液的均匀分布。将包衣种子覆盖在塑料称量船上以在层流净化罩中经定期混合，干燥直至不再有胶粘性，通常需3小时。然后将包衣种子储存在4℃下并且定期测试稳定性。以上述方式为多种小麦种子和玉米种子包衣并测试，包括常见硬红春麦品种Briggs、Faller、Glenn、Hank、RB07、Samson；硬红冬麦品种Jerry、McGill、Overland；和玉米种子品种DKC62-61以及商业玉米品种(Dow Agro Sciences)。

使用标准平板计数法进行对用于种衣剂中的微生物的活力试验。通常，通过于等份的恰当缓冲液中洗涤种子并且将等量缓冲液涂在营养琼脂培养基上测试预定量的包衣种子中活微生物的存在。在30℃下培育1-4天后测定活的菌落形成单位。活力试验显示储存在4℃下约5周后每颗种子存在1×10⁴-4×10⁷个活的菌落形成单位。当用微生物孢子为种子包衣时，大部分受试微生物的活力保持稳定至少4个月，包括在美国于冷藏集装箱内外的多洲际运输。当冷藏(4℃)储存时，种子包衣上的微生物存活，试验期间活力损失很小。结果表明，用本文公开的组合物包衣的种子可冷藏储存更长时间并且表明微生物将在较高温度分布期存活。另外，测试了包衣种子的发芽率并且确定与对照种子基本上相同，对照种子为仅用阿拉伯树胶包衣的种子或未包衣种子。

实施例9：微生物组合物的固态制剂

这个部分描述了微生物肥料的示例性制剂，其中根据本发明所述的细菌经封装并且肥料呈固体形式。藻酸盐珠粒制备如下：

根据藻酸盐性质(M/G比例)将1mL的30％甘油添加到1、1.5或2％藻酸钠溶液中以获得25mL的最终体积。经离心沉淀来自从本发明其中一种细菌分离株或两种或更多种分离株的组合获得的250mL培养物的细菌细胞，然后用盐水溶液(0.85％NaCl，w/v)洗涤，悬浮在25mL藻酸盐混合物中，并且充分混合。然后在轻微搅动下将这种细胞悬浮液滴加到1.5或2％(w/v)的CaCl₂预冷无菌水溶液中以获得细菌-藻酸盐珠粒。使这些珠粒在室温下硬化2-4小时。通过筛分收集珠粒并用无菌水洗涤几次并储存在4℃下。为了保护制剂，在约-45℃下冻干15小时之前，可在约-80℃下冷冻新鲜的湿润珠粒。冻干珠粒可储存在合适的容器中，例如无菌玻璃瓶。

为了估计活菌数，可通过使100mg珠粒再悬浮在磷酸盐缓冲盐水(pH7.0)中30分钟，接着均质化使封装的细菌从珠粒中释放。在30℃下培育48小时后通过标准平板计数法测定释放细菌的总数量。间隔1个月，用类似方法计算珠粒中的细胞密度。

实施例10：微生物组合物与商业杀真菌剂相容性

因为关于农业上使用农药，环境问题日益增加，生物替代品越来越被认为是必然。然而，新的生物制剂也必须使生物存活和表达其特定有益效应。化学杀真菌剂通常不但对有害微生物有毒，而且对有益微生物有毒。然而，当以降低速率施加时，这些微生物试剂的存活机会可能增加。

在本研究中，泥炭基载体材料用于接种杀真菌剂处理的以及裸露的作物种子。通常按以下方式估算杀真菌剂的细菌耐受性：a)接种细菌的裸露种子在适当细菌生长培养基例如胰酶解酪蛋白大豆琼脂(TSA；胰蛋白胨15g/L；大豆蛋白胨5g/L、氯化钠5g/L和琼脂15g/L)板上生长，b)经杀真菌剂处理的接种了细菌的种子在常见TSA板上生长，和c)经杀真菌剂处理的接种了细菌的种子在无菌生长袋中生长。通常，在每个实验中用3种浓度的杀真菌剂：生产商推荐的剂量和两个较低剂量(推荐剂量的75％和50％)。接种后储存经杀真菌剂处理的接种了细菌的种子并且在不同时间间隔(2小时、4小时和6小时)用于检查对种子发芽的影响。在陪替氏培养板(petri-plate)中监测种子发芽和细菌的存在。对于生长袋研究，使用经杀真菌剂处理(推荐剂量)的种子，并且在幼苗生长7天时测量根和胚轴长度。

通过杀真菌剂富集的TSA板上的细菌生长确定，本发明的一些根际细菌分离株与几种常用杀真菌剂相容。一般而言，经接种泥炭包衣的裸露和杀真菌剂处理的种子与未接种的对照相比均未显示出发芽上的显著变化。而且，与未接种的对照相比，在所有根际细菌处理中观察到对根和幼苗总长度的促生长作用。

实施例11：非自然存在的品种和育种程序的研发

使用与本领域已知过程类似的过程，其中包括美国专利申请号20030195117A1、美国专利申请号第20010032343A1和美国专利号7,084,331中描述的过程，将本发明的内生细菌引入不同基因型和地理来源，缺乏此类内生真菌的农作物中，包括谷类，以产生农艺特征改善的植物-内生菌组合。因此，在育种/品种开发程序中，可基于其形成和维持产生农艺学利益的共生组合的能力产生和选择合成植物-内生菌组合。也可在此类育种程序中利用对所述组合的农艺特征的评级。其中这些特征包括单不限于耐旱性、生物质积累、对昆虫侵扰的抗性、牲畜(例如，食草动物)适口性、易于繁殖和种子产量。此类组合可能在对害虫和杂草有毒的微生物代谢产物的积累水平上不同，包括麦角生物碱(ergot alkaloid)水平、黑麦草碱(loline)水平、波胺(peramine)水平或黑麦震颤素(lolitrem)水平，同时表现出农作物的所需农艺特征，包括对昆虫摄食或侵染的抗性、对非生物胁迫的抗性、牲畜适口性、生物质积累、易于繁殖和种子产量及其它性状。

实施例12：产量研究

用不同微生物处理剂为玉米种子(玉蜀黍)包衣并且播种在准备好的田间。以随机完全区组设计重复每种处理剂5次。单次重复由4个30英尺长的床(行)组成，每张床上播种60颗种子(相距6英寸)。为了观察目的，仅从中间两行取数据。

如以下表5所示，重复中一定百分比的植物萌芽时记录到植物出现两次。用塑料带标记每一小块土地中间两行的10株植物以记录生命统计例如植物高度、叶绿素测量、植物重量等。

种植31和56天后记录的植物高度(测量最高/最长叶片的尖端)表明处理组间植物高度无显著差异。到种植第后110天，大部分植物干燥并且叶片缩小，因此在一些情况下，植物看起来(测量)比先前测量中更短，但是总体上，植物高度在处理组间没有差异。在种植第5周，从每一小块土地经标记的10株植物的下部叶片(地上约60cm)和上部叶片(从顶部第二个完全展开的叶片)测量叶绿素含量(SPAD单位)。处理组间叶绿素含量没有显著差异。在种植第110和111天，收获作物。在土壤水平上割下来自每一小块土地的10株标记植物并且为植物的地上部分称重(整株重量或WPtWt)，取下玉米穗并且测量穗轴长度(穗带粒长度)(仅填有可出售玉米粒的区域)，然后从穗轴上取下玉米粒并且测量其重量，即每个穗的粒重(KnlWt/个穗)。

人工收割每一小块地10株植物不久后，引进机械收割机K2(Allis-Chalmers Mfrg，Milwaukee，WI)。这种机器从每一小块地中间两行机械除去剩余植物，从穗轴上取下玉米粒，并且测量玉米粒水分和重量(10个穗+机器收割)。按玉米粒(包括来自机器收割穗轴+人工收割穗轴的玉米粒)重量(1b.)计，15.5％水分含量下的预计总产量(每英亩玉米粒的磅数)对于SGI-003-H11(成团泛菌)而言为10368.14磅/英亩或185.15蒲式耳/英亩。这是所有生物处理间的最高产量并且与解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)SGI-015_F03的处理明显不同。另一种高等生产者是用苏云金芽孢杆菌SGI-020_A01处理。

总之，不同处理中的所有植物在提供了相同量的肥料、芽前除草剂(在季节后期人工拔草)，在生长期间和温暖季节每周浇水，并且特别是对玉米棉铃虫的害虫防治的田间条件中相似地发芽和生长。所有条件相同，用SGI-003-H11(成团泛菌)处理产生高于非微生物、对照处理的最高产量。因此，003_H11产生比对照组高约17％的产量。因此，在本发明的各实施方案中，根据本文所述任何方法施加有效量的生物产生比对照组高至少10％或至少12.5％或至少15％或约17％的产量，在一些实施方案中，这可通过每英亩植物产物(例如，玉米穗)的磅数或每英亩植物产物的蒲式耳数测定。表5中列出的生物为SGI-003-H11(成团泛菌)、SGI-015-F03(解淀粉芽孢杆菌)和SGI-020-A01(苏云金芽孢杆菌)。

表5

已经描述了本发明的许多实施方案。然而，应理解本文所述实施方案的要素可组合以产生另外的实施方案并且在不背离本发明精神和范围的前提下可做各种修改。相应地，替代方案和等效方案在本文所述和要求保护的本发明范围内。

申请中的标题仅仅是为了方便读者，并不以任何方式限制本发明及其实施方案的范围。

本说明书中提及的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，如同明确单独指出每个单独出版物或专利申请通过引用并入的程度相同。

Claims (25)

1.一种微生物菌株的富集培养物，所述微生物菌株是保存为NRRL B-50483的SGI-003-H11菌株。

2.一种微生物菌株的分离培养物，所述微生物菌株是保存为NRRL B-50483的SGI-003-H11菌株。

3.一种微生物菌株的生物纯培养物，所述微生物菌株是保存为NRRL B-50483的SGI-003-H11菌株。

4.一种分离的微生物菌株，其是保存为NRRL B-50483的微生物菌株或由此来源的菌株。

5.一种分离的微生物菌株，其包含SEQ ID NO：1的DNA序列；并且进一步地，其中所述微生物菌株具有植物生长促进活性。

6.一种组合物，其包含根据权利要求1-5中任一项所述的微生物菌株或培养物和农业有效量的化合物或组合物，所述化合物或组合物选自肥料和农药。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述化合物或组合物选自杀螨剂、杀昆虫剂、杀微生物剂、杀线虫剂。

8.根据权利要求6所述的组合物，其中所述化合物或组合物选自杀细菌剂和杀真菌剂。

9.一种组合物，其包含根据权利要求1-5中任一项所述的微生物菌株或培养物和载体。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述载体为植物种子。

11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述组合物为种衣剂。

12.根据权利要求9所述的组合物，其中所述组合物制备成选自胶体、颗粒、粉剂、喷雾、乳剂和溶液的制剂。

13.根据权利要求9所述的组合物，其中所述组合物制备成选自粉尘和球粒的制剂。

14.一种用于处理植物种子的方法，所述方法包括使所述植物种子暴露于或接触根据权利要求1-5中任一项所述的微生物菌株或培养物。

15.一种用于增加植物的生长和/或产量的方法，所述方法包括向所述植物或向所述植物的周围环境施加有效量的根据权利要求1-5中任一项所述的微生物菌株或培养物。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述微生物菌株或培养物在宿主植物的生长培养基或土壤中生长，之后或同时宿主植物在所述生长培养基或土壤中生长。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述植物为玉米植株或小麦植株。

18.根据权利要求15所述的方法，其中所述微生物菌株或培养物经确定为所述植物上的内生菌。

19.一种用于预防、抑制或治疗选自明梭孢生物的植物病原体发展的方法，所述方法包括使根据权利要求1-5中任一项所述的微生物菌株或培养物在宿主植物的生长培养基或土壤中生长，之后或同时宿主植物在所述生长培养基或土壤中生长。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述植物病原体是雪腐明梭孢。

21.一种用于预防、抑制或治疗植物的由选自明梭孢生物的植物病原体引起的致病性疾病发展的方法，所述方法包括向所述植物或向所述植物的周围环境施加有效量的根据权利要求1-5中任一项所述的微生物菌株或培养物。

22.根据权利要求21所述的方法，其中将所述微生物菌株或培养物施加到土壤、所述植物的一部分或所述整株植物。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述植物的一部分是种子、根、花或叶。

24.一种非天然存在的植物的植物部分，其是人工感染了根据权利要求1-5中任一项所述的微生物菌株或培养物的植物，其中所述植物部分为根、花或叶。

25.一种用于制备农业组合物的方法，所述方法包括将根据权利要求1-5中任一项所述的微生物菌株或培养物接种到底层内或底层上并且使所述微生物菌株或培养物在1-37℃的温度下生长，直至获得每毫升或每克至少10²-10³个的细胞或孢子数量。