CN112795513A - 一种植物内生菌富集分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种植物内生菌富集分离方法，具体步骤如下：选用健康、无病菌植物，用溶有表面活性剂的无菌水，流水清洗植物，将清洗后的植物用去污剂清洗，然后在升汞中浸泡，用无菌水漂洗若干次消毒后的植物，将漂洗后的植物切碎植入或涂布于培养基中培养，培养基中培养出的菌落分离纯化。本发明能处理干净植物表面的微生物，同时也能得到植物内的不同内生菌，能为研究植物内生菌的种群组成特征，丰富内生菌资源具有十分重要的作用。

Description

一种植物内生菌富集分离方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是一种植物内生菌富集分离方法。
背景技术
越来越多的学者或科研人员对植物内生菌进行了研究，植物内生菌成为我国微生物研究的热点课题，植物内生菌是一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的真菌或细菌，普遍存在于高等植物中，木本、草本植物，单子叶植物和双子叶植物内均有内生细菌。内生菌能在植物内获得稳定生活环境，也增强了植物抗病、抗干旱、固氮的能力，从而内生菌已成为生物防治中有潜力的微生物农药、增产菌或作为潜在的生防载体菌而加以利用。
现有技术中，一般采用的方法对植物表面的微生物处理不干净，导致污染内生菌，同时在分离过程中，通过稀释进行涂布培养，虽然能较快得到内生菌，但不能得到植物内的不同内生菌。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种内生菌分离方法，使用这种分离方法能处理干净植物表面的微生物，同时也能得到植物内的不同内生菌。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种植物内生菌富集分离方法，具体步骤如下：
第一步：选材，选用健康、无病菌植物；
第二步：流水清洗，用溶有表面活性剂的无菌水，流水清洗植物；
第三步：浸泡消毒，将清洗后的植物用去污剂清洗，然后在升汞中浸泡；
第四步：漂洗，用无菌水漂洗若干次消毒后的植物；
第五步：切碎，将漂洗后的植物切碎植入或涂布于培养基中培养；
第六步：分离纯化，培养基中培养出的菌落分离纯化。
作为本发明进一步的方案，所述第二步中的表面活性剂为洗涤剂，所述流水为无菌水，并使用超声波。
作为本发明进一步的方案，所述第三步中的去污剂为聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯，所述升汞的浓度为0.12%~0.16%，浸泡25~35s。
作为本发明进一步的方案，所述第四步中用无菌水对植物清洗至少三次。
作为本发明进一步的方案，所述第五步中的植物用无菌刀切成4~6mm的小段，将小段植入培养基中。
作为本发明进一步的方案，所述第五步中的植物匀浆后涂布在培养基上。
作为本发明进一步的方案，所述培养基为牛肉膏蛋白胨培养基或低营养培养基。
作为本发明进一步的方案，所述在培养基中加入抑制菌。
作为本发明进一步的方案，所述第六步中采用划线分离，挑取菌落纯化培养。
作为本发明进一步的方案，所述分离纯化次数至少3次。
本发明具有的优点和积极效果是：由于本发明采用如上技术方案，通过洗涤剂、超声波无菌水流水清洗、聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯溶液、在升汞中浸泡除去植物表面的微生物，通过植入或匀浆涂布、划线分离、纯化等到内生菌，本发明为研究植物内生菌的种群组成 特征，丰富内生菌资源具有重要作用。
附图说明
图1是本发明一种植物内生菌富集分离方法的流程图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
如图1所示，本发明的一种植物内生菌富集分离方法，具体步骤如下：
第一步：选用健康、无病菌植物；
第二步：用溶有洗涤剂的无菌水洗涤植物表面，然后使用超声波无菌水流水清洗植物表面；
第三步：将清洗后的植物用聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯溶液清洗，然后在溶度为0.12%的升汞中浸泡25s；
第四步：用无菌水对植物清洗至少三次；
第五步：当是植物的根或茎时，用无菌刀将根或茎切成6mm的小段，将将小段植入培养基中；当是植物的叶或嫩茎时，用匀浆机将叶或嫩茎进行匀浆后涂布在培养基上。
第六步：至少3次将培养基中培养出的菌落划线分离、纯化。
根据目标内生菌所需的培养基选择牛肉膏蛋白胨培养基或低营养培养基，在培养基中添加选择性抑制菌来抑制非目标微生物的生长，使植物内生菌在培养基上生长。
实施例2
如图1所示，本发明的一种植物内生菌富集分离方法，具体步骤如下：
第一步：选用健康、无病菌植物；
第二步：用溶有洗涤剂的无菌水洗涤植物表面，然后使用超声波无菌水流水清洗植物表面；
第三步：将清洗后的植物用聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯溶液清洗，然后在溶度为0.14%的升汞中浸泡30s；
第四步：用无菌水对植物清洗至少三次；
第五步：当是植物的根或茎时，用无菌刀将根或茎切成6mm的小段，将将小段植入培养基中；当是植物的叶或嫩茎时，用匀浆机将叶或嫩茎进行匀浆后涂布在培养基上。
第六步：至少3次将培养基中培养出的菌落划线分离、纯化。
根据目标内生菌所需的培养基选择牛肉膏蛋白胨培养基或低营养培养基，在培养基中添加选择性抑制菌来抑制非目标微生物的生长，使植物内生菌在培养基上生长。
实施例3
如图1所示，本发明的一种植物内生菌富集分离方法，具体步骤如下：
第一步：选用健康、无病菌植物；
第二步：用溶有洗涤剂的无菌水洗涤植物表面，然后使用超声波无菌水流水清洗植物表面；
第三步：将清洗后的植物用聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯溶液清洗，然后在溶度为0.16%的升汞中浸泡30s；
第四步：用无菌水对植物清洗至少三次；
第五步：当是植物的根或茎时，用无菌刀将根或茎切成6mm的小段，将将小段植入培养基中；当是植物的叶或嫩茎时，用匀浆机将叶或嫩茎进行匀浆后涂布在培养基上。
第六步：至少3次将培养基中培养出的菌落划线分离、纯化。
根据目标内生菌所需的培养基选择牛肉膏蛋白胨培养基或低营养培养基，在培养基中添加选择性抑制菌来抑制非目标微生物的生长，使植物内生菌在培养基上生长。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域熟练技术人员应当理解，这些仅是举例说明，可以对本实施方式作出多种变更或修改，而不背离本发明的原理和实质，本发明的保护范围仅由所附权利要求书限定。

Claims (10)

1.一种植物内生菌富集分离方法，其特征在于：具体步骤如下：
第一步：选材，选用健康、无病菌植物；
第二步：流水清洗，用溶有表面活性剂的无菌水，流水清洗植物；
第三步：浸泡消毒，将清洗后的植物用去污剂清洗，然后在升汞中浸泡；
第四步：漂洗，用无菌水漂洗若干次消毒后的植物；
第五步：切碎，将漂洗后的植物切碎植入或涂布于培养基中培养；
第六步：分离纯化，培养基中培养出的菌落分离纯化。
2.根据权利要求1所述的一种植物内生菌富集分离方法，其特征是：所述第二步中的表面活性剂为洗涤剂，所述流水为无菌水，并使用超声波。
3.根据权利要求1所述的一种植物内生菌富集分离方法，其特征是：所述第三步中的去污剂为聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯，所述升汞的浓度为0.12%~0.16%，浸泡25~35s。
4.根据权利要求1所述的一种植物内生菌富集分离方法，其特征是：所述第四步中用无菌水对植物清洗至少三次。
5.根据权利要求1所述的一种植物内生菌富集分离方法，其特征是：所述第五步中的植物用无菌刀切成4~6mm的小段，将小段植入培养基中。
6.根据权利要求1所述的一种植物内生菌富集分离方法，其特征是：所述第五步中的植物匀浆后涂布在培养基上。
7.根据权利要求1所述的一种植物内生菌富集分离方法，其特征是：所述培养基为牛肉膏蛋白胨培养基或低营养培养基。
8.根据权利要求7所述的一种植物内生菌富集分离方法，其特征是：所述在培养基中加入抑制菌。
9.根据权利要求1所述的任意一种植物内生菌富集分离方法，其特征是：所述第六步中采用划线分离，挑取菌落纯化培养。
10.根据权利要求9所述的一种植物内生菌富集分离方法，其特征是：所述分离纯化次数至少3次。
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