CN104087515A - 一种小麦茎基腐病菌的分离方法 - Google Patents
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Abstract
一种小麦茎基腐病菌的分离方法，先采集小麦植株，在通风阴凉条件下摊开放置1-2天后，从基部第一、二茎节处变褐色部分剪取1.8-2.2㎝茎段；用清水冲洗，然后用75%酒精消毒15s，再用无菌水漂洗；之后放入底铺有无菌滤纸的培养皿里，加入1-2mL无菌水，然后置于生化培养箱中，25℃、黑暗条件下培养，直至茎段上长出菌丝；挑取菌丝，种到添加乳酸的PSA培养基上，于25℃生化培养箱中黑暗培养；用接种针从菌落边缘挑取小块菌落，转至PSA斜面培养基上，置于生化培养箱中，25℃、黑暗条件下培养3天后，进行菌株保存，即分离出小麦茎基腐病菌。发明方法分离成功率高，处理后的茎秆可很快长出菌丝，转入PSA上后也能很快长出小麦茎基腐病菌的典型菌落，成功率达95%以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种病菌的分离方法，具体的说是一种小麦茎基腐病菌的分离方法。
背景技术
在进行病原真菌的形态、生理、生态及致病性的分子生物学等理论性研究工作中，以及进行品种抗病性鉴定和筛选对病原菌有抑制作用的药剂等应用性研究工作中，常常需要病原真菌的纯培养物。植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，一般都能恢复生长和繁殖。然而，在自然情况下，病原菌通常是与其他杂菌混生在一起的，从受病组织或其它基物中将病原菌单独分离出来，称作植物病原真菌的分离。植物病原真菌的分离在植物病理学科研工作中也具有十分重要的位置：对分离到的病原真菌进行保存可以满足植物病理学及微生物学日常的教学需要，使学生对植物病原真菌有更直观的认识。
近年来，随着气候变暖及秸秆还田等耕作栽培措施的推广，小麦茎基腐病在我国各大麦区发生普遍并造成一定的损失，为害日益严重，逐渐引起农业科技工作者的重视。小麦茎基腐病从小麦分蘖到成熟期均可发生，可使茎基部叶鞘和茎秆变褐，茎节坏死，严重时可使植株死亡、枯白，出现白穗，影响小麦产量。小麦茎基腐病由多种病原真菌侵染引起，主要的致病性真菌类群包括镰孢菌（Fusarium spp.）、小麦根腐离蠕孢（Bipolaris sorokinianum）及其它一些真菌，其中前两者的分离比率很高，但不同小麦生态区域的致病菌种类存在一定差异。鉴于小麦茎基腐病在我国小麦生产区呈流行蔓延的趋势，有必要加紧对其防治策略的研究。由于引起小麦茎基腐病的病原菌均属于兼性寄生真菌，可从发病小麦植株的茎基部分离获得纯培养，为以后的病原菌种类确认、抗病性品种鉴定及药剂筛选等工作提供便利。小麦茎基腐病菌的分离是进行后续研究的基础。
植物病原真菌的分离包括组织分离法和稀释分离法。由于组织分离法存在着费时、费力、成本高、操作要求高等特点，故不适宜对大量的小麦茎基腐病病株进行病原菌分离。
发明内容
本发明目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种小麦茎基腐病菌的分离方法，省时、安全，可大用于大量的小麦茎基腐病病株进行病原菌分离；分离成功率高，处理后的茎秆可很快长出菌丝，转入PSA上后也能很快长出小麦茎基腐病菌的典型菌落，成功率达95%以上。
一种小麦茎基腐病菌的分离方法，其操作步骤为：
步骤一、采集有白穗症状且茎秆基部第一、二茎节处的叶鞘或茎秆变褐色的小麦植株，备用；
步骤二、将采集到的小麦植株在室内通风阴凉条件下摊开放置1-2天；然后从放置后的小麦植株基部第一、二茎节处变褐色部分剪取1.8-2.2㎝茎段；将所剪取的茎段用清水冲洗干净，然后用75%酒精消毒15s，再用无菌水漂洗2-3次，备用；
步骤三、将剪取的茎段放入皿底铺有无菌滤纸的培养皿里，向培养皿中加入1-2mL无菌水，然后置于生化培养箱中，25℃、黑暗条件下培养1-2天，以便于植株表面的水分挥发；直至茎段上长出菌丝，备用；
步骤四、用接种针从每个茎段上挑取菌丝，分别接种到添加乳酸的PSA培养基上，然后置于25℃生化培养箱中黑暗培养2-3天；
所述乳酸的添加量为每200mLPSA培养基中加入1mL质量百分比为 25%的乳酸；
步骤五、用接种针从菌落边缘挑取小块菌落，转至PSA斜面培养基上，置于生化培养箱中，25℃、黑暗条件下培养3天后，进行菌株保存，即分离出小麦茎基腐病菌。
所述PSA培养基，每100mlPSA培养基中含马铃薯20g，蔗糖2g，琼脂2g，pH值为6.0，余量为水。 有益效果是：
1、本发明小麦茎基腐病菌的分离方法，将从田间采回的小麦植株室内通风阴凉条件下放置1-2天，待上面的水分挥发后再进行后续处理，能让茎秆上尽快长出菌丝；；为了排除细菌污染，茎段保湿前应先用75%的酒精消毒，时间太短达不到消毒效果，太长则对要分离的小麦茎基腐病菌造成伤害，以15 s为宜；另外，每200 mL PSA中应预先加入25%的乳酸1 mL，酒精结合乳酸的效果，既达到抑制细菌滋生的作用，又有利于小麦茎基腐病菌的分离。本发明方法分离成功率高，处理后的茎秆可很快长出菌丝，转入PSA上后也能很快长出小麦茎基腐病菌的典型菌落，成功率达95%以上。
2、本发明小麦茎基腐病菌的分离方法仅需对发病茎秆进行简单处理，无需从一个病斑的病健交界处切取4-5块3×3mm的组织小块，也无需升汞溶液或次氯酸钠消毒、无菌水清洗及滤纸吸干等步骤，操作简单； 采用组织分离法进行小麦茎基腐病菌分离时，一般每个病株的操作过程需要10-15 min，而此法则可在1 min内完成1个病株的酒精消毒、培养皿保湿的步骤，1 min完成挑菌丝培养的步骤，操作迅速。
3、现有技术的组织分离法同一茎秆上切下的几个组织小块用酒精及NaClO消毒时各需一副培养皿，三次无菌水清洗时又需要三幅培养皿，每次消毒及清洗培养皿均需更换一次，1个病株需要5副培养皿才可以分离完毕；而此法保湿及分离时4-5个病株用1个培养皿即可，操作中无需升汞或NaClO等化学试剂，所需耗材及试剂很少，节约了试验成本，且安全、对人体无害。
具体实施方式
一种小麦茎基腐病菌的分离方法，其操作步骤为：
步骤一、采集有白穗症状且茎秆基部第一、二茎节处的叶鞘或茎秆变褐色的小麦植株，备用；
步骤二、将采集到的小麦植株在室内通风阴凉条件下摊开放置1-2天；然后从放置后的小麦植株基部第一、二茎节处变褐色部分剪取1.8-2.2㎝茎段；将所剪取的茎段用清水冲洗干净，然后用75%酒精消毒15s，再用无菌水漂洗2-3次，备用；
步骤三、将剪取的茎段放入皿底铺有无菌滤纸的培养皿里，向培养皿中加入1-2mL无菌水，然后置于生化培养箱中，25℃、黑暗条件下培养1-2天，以便于植株表面的水分挥发；直至茎段上长出菌丝，备用；
步骤四、用接种针从每个茎段上挑取菌丝，分别接种到添加乳酸的PSA培养基上，然后置于25℃生化培养箱中黑暗培养2-3天；
所述乳酸的添加量为每200mLPSA培养基中加入1mL质量百分比为 25%的乳酸；
步骤五、选取生长一致的菌落，镜检分生孢子形态，包括颜色、细胞数目、产孢结构等，判断病菌种类；
步骤六、用接种针从菌落边缘挑取小块菌落，转至PSA斜面培养基上，置于生化培养箱中，25℃、黑暗条件下培养3天后，进行菌株保存，即分离出小麦茎基腐病菌。
所述PSA培养基，每100mlPSA培养基中含马铃薯20g，蔗糖2g，琼脂2g，pH值为6.0，余量为水。 实施例1
一种小麦茎基腐病菌的分离方法，其操作步骤为：
步骤一、采集有白穗症状且茎秆基部第一、二茎节处的叶鞘或茎秆变褐色的小麦植株，备用；
步骤二、将采集到的小麦植株在室内通风阴凉条件下摊开放置1天；然后从放置后的小麦植株基部第一、二茎节处变褐色部分剪取1.8㎝茎段；将所剪取的茎段用清水冲洗干净，然后用75%酒精消毒15s，再用无菌水漂洗2次，备用；
步骤三、将剪取的茎段放入皿底铺有无菌滤纸的培养皿里，向培养皿中加入1-2mL无菌水，然后置于生化培养箱中，25℃、黑暗条件下培养1天，以便于植株表面的水分挥发；直至茎段上长出菌丝，备用；
步骤四、用接种针从每个茎段上挑取菌丝，分别接种到添加乳酸的PSA培养基上，然后置于25℃生化培养箱中黑暗培养2天；
所述乳酸的添加量为每200mLPSA培养基中加入1mL质量百分比为 25%的乳酸；
步骤五、选取生长一致的菌落，镜检分生孢子形态，包括颜色、细胞数目、产孢结构等，判断病菌种类；
步骤六、用接种针从菌落边缘挑取小块菌落，转至PSA斜面培养基上，置于生化培养箱中，25℃、黑暗条件下培养3天后，进行菌株保存，即分离出小麦茎基腐病菌。
所述PSA培养基，每100mlPSA培养基中含马铃薯20g，蔗糖2g，琼脂2g，pH值为6.0，余量为水。 实施例2
一种小麦茎基腐病菌的分离方法，其操作步骤为：
步骤一、采集有白穗症状且茎秆基部第一、二茎节处的叶鞘或茎秆变褐色的小麦植株，备用；
步骤二、将采集到的小麦植株在室内通风阴凉条件下摊开放置2天；然后从放置后的小麦植株基部第一、二茎节处变褐色部分剪取2.2㎝茎段；将所剪取的茎段用清水冲洗干净，然后用75%酒精消毒15s，再用无菌水漂洗3次，备用；
步骤三、将剪取的茎段放入皿底铺有无菌滤纸的培养皿里，向培养皿中加入1-2mL无菌水，然后置于生化培养箱中，25℃、黑暗条件下培养2天，以便于植株表面的水分挥发；直至茎段上长出菌丝，备用；
步骤四、用接种针从每个茎段上挑取菌丝，分别接种到添加乳酸的PSA培养基上，然后置于25℃生化培养箱中黑暗培养3天；
所述乳酸的添加量为每200mLPSA培养基中加入1mL质量百分比为 25%的乳酸；
步骤五、选取生长一致的菌落，镜检分生孢子形态，包括颜色、细胞数目、产孢结构等，判断病菌种类；
步骤六、用接种针从菌落边缘挑取小块菌落，转至PSA斜面培养基上，置于生化培养箱中，25℃、黑暗条件下培养3天后，进行菌株保存，即分离出小麦茎基腐病菌。
所述PSA培养基，每100mlPSA培养基中含马铃薯20g，蔗糖2g，琼脂2g，pH值为6.0，余量为水。 实施例3
一种小麦茎基腐病菌的分离方法，其操作步骤为：
步骤一、采集有白穗症状且茎秆基部第一、二茎节处的叶鞘或茎秆变褐色的小麦植株，备用；
步骤二、将采集到的小麦植株在室内通风阴凉条件下摊开放置2天；然后从放置后的小麦植株基部第一、二茎节处变褐色部分剪取2.0㎝茎段；将所剪取的茎段用清水冲洗干净，然后用75%酒精消毒15s，再用无菌水漂洗2次，备用；
步骤三、将剪取的茎段放入皿底铺有无菌滤纸的培养皿里，向培养皿中加入1-2mL无菌水，然后置于生化培养箱中，25℃、黑暗条件下培养1.5天，以便于植株表面的水分挥发；直至茎段上长出菌丝，备用；
步骤四、用接种针从每个茎段上挑取菌丝，分别接种到添加乳酸的PSA培养基上，然后置于25℃生化培养箱中黑暗培养2天；
所述乳酸的添加量为每200mLPSA培养基中加入1mL质量百分比为 25%的乳酸；
步骤五、选取生长一致的菌落，镜检分生孢子形态，包括颜色、细胞数目、产孢结构等，判断病菌种类；
步骤六、用接种针从菌落边缘挑取小块菌落，转至PSA斜面培养基上，置于生化培养箱中，25℃、黑暗条件下培养3天后，进行菌株保存，即分离出小麦茎基腐病菌。
所述PSA培养基，每100mlPSA培养基中含马铃薯20g，蔗糖2g，琼脂2g，pH值为6.0，余量为水。 试验例
从河南省郑州市、洛阳市、许昌市三地采集小麦茎基腐病标本120余株，从中选取症状典型的（茎秆基部第一、二茎节处的叶鞘或茎秆变褐色）的植株100株，分为两组，一组采用常规的组织分离法进行分离小麦茎基腐病菌；第二组采用本发明方法进行分离小麦茎基腐病菌；
一组的采用组织分离法分离时，对茎秆进行清水处理后，每个茎段在病健交界处切取3×3mm的组织块，依次用75%酒精消毒15s、2-3%的NaClO消毒3min，然后在无菌水中冲洗三遍，无菌滤纸吸干水后放于含乳酸的PSA上培养，3-4 天后观察，挑取生长一致的菌落镜检后保存。由于此法要经过茎秆分段再切块、多次消毒、清水冲洗及滤纸吸干等步骤，一个病株处理完毕约需10-15 min，病株多时相当费力；且两次消毒及三次清洗时需要的培养皿较多（约200副），培养时每个病株又需要1个培养皿。
采用本发明方法进行分离时，茎秆经清水处理后，直接剪取第一、二茎节变褐的茎段，约2-3cm，75%酒精消毒15s后在无菌水中冲洗一遍，然后将茎段放于皿底有无菌滤纸的培养皿里保湿培养，每个培养皿放5个茎段，50个病株需10个培养皿即可；2天后，茎段上已长出菌丝；用接种针挑取茎段上的菌丝，转至含乳酸的PSA上培养，每个PSA平板可转5个茎段上的菌丝，培养2d后挑选生长一致的菌落镜检后进行菌株保存。采用茎段保湿培养法，经过一周的时间50株小麦茎基腐病病株全部分离完毕，共得到小麦茎基腐病菌48株。
对两种分离方法获得的93株病菌进行镜检，结果显示：60株为镰孢菌（Fusarium spp.），23株为小麦根腐离蠕孢（Bipolaris sorokinianum），其余10株鉴定，由此表明河南省三地市的小麦茎基腐病的病原菌以镰孢菌为主，其次为小麦根腐离蠕孢。
表1为本试验两种方法的比较：
表1 组织分离法同茎段保湿培养法的比较
| 组别 | 一组 | 二组 |
| 所需培养皿数量（副） | 200 | 40 |
| 茎秆分段 | 需要 | 不需要 |
| NaClO消毒 | 需要 | 不需要 |
| 病株处理时间（分） | 10-15 | 3-5 |
| 所需时间（天） | 14 | 7 |
| 分离成功率（%） | 90 | 96 |
结果表明，一组所需耗材很多；操作过程中如酒精及NaClO消毒时间把握不准，易将病菌也杀死，故对操作要求高；50个病株分离了2周的时间才完成，共分离到小麦茎基腐病菌45株，成功率为90%。而本发明方法省时、省力，节省器材及其试剂，并且操作过程中不使用有害物质，安全，可用于大量小麦茎基腐病病株进行病原菌分离；分离成功率高，成功率达96%以上。
Claims (2)
1.一种小麦茎基腐病菌的分离方法，其特征在于：其操作步骤为：
步骤一、采集有白穗症状且茎秆基部第一、二茎节处的叶鞘或茎秆变褐色的小麦植株，备用；
步骤二、将采集到的小麦植株在通风阴凉条件下摊开放置1-2天；然后从放置后的小麦植株基部第一、二茎节处变褐色部分剪取1.8-2.2㎝茎段；将所剪取的茎段用清水冲洗干净，然后用75%酒精消毒15s，再用无菌水漂洗2-3次，备用；
步骤三、将剪取的茎段放入皿底铺有无菌滤纸的培养皿里，向培养皿中加入1-2mL无菌水，然后置于生化培养箱中，25℃、黑暗条件下培养1-2天，直至茎段上长出菌丝，备用；
步骤四、用接种针从每个茎段上挑取菌丝，分别接种到添加乳酸的PSA培养基上，然后置于25℃生化培养箱中黑暗培养2-3天；
所述乳酸的添加量为每200mLPSA培养基中加入1mL质量百分比为 25%的乳酸；
步骤五、用接种针从菌落边缘挑取小块菌落，转至PSA斜面培养基上，置于生化培养箱中，25℃、黑暗条件下培养3天后，进行菌株保存，即分离出小麦茎基腐病菌。
2.如权利要求所述的小麦茎基腐病菌的分离方法，其特征在于：所述PSA培养基，每100ml PSA培养基中含马铃薯20g，蔗糖2g，琼脂2g，pH值为6.0，余量为水。
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| CN106467904A (zh) * | 2015-08-15 | 2017-03-01 | 河北农业大学 | 小麦赤霉病菌固体培养基产孢方法 |
| CN108384725A (zh) * | 2018-04-25 | 2018-08-10 | 河南科技大学 | 一种烟草根黑腐病菌的分离方法 |
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