CN104293679B

CN104293679B - 一种小麦纹枯病菌的分离方法

Info

Publication number: CN104293679B
Application number: CN201410218757.8A
Authority: CN
Inventors: 徐建强; 侯颖; 刘圣明; 范倩倩; 杨改凤
Original assignee: Henan University of Science and Technology
Current assignee: Henan University of Science and Technology
Priority date: 2014-05-22
Filing date: 2014-05-22
Publication date: 2017-11-14
Anticipated expiration: 2034-05-22
Also published as: CN104293679A

Abstract

本发明公开了一种小麦纹枯病菌的分离方法，属于植物病原分离技术领域。该方法包括以下步骤：(1)取采集到的有典型云纹状病斑的小麦纹枯病植株，剪取茎基部有单个典型云纹状病斑的茎段，用70～80％酒精消毒15～25秒钟，无菌水洗净；(2)取处理后的茎段在22～28℃黑暗条件下培养1～2天，挑取病斑处白色菌丝接种到含乳酸的马铃薯蔗糖培养基上，再在22～28℃黑暗条件下培养2～3天；(3)挑取小块菌落转至马铃薯蔗糖斜面培养基上，在22～28℃黑暗条件下培养4～6天，即可进行菌株保存。该方法操作简单，省时、省力，安全、经济，分离成功率高，达95％以上。

Description

一种小麦纹枯病菌的分离方法

技术领域

本发明涉及一种植物病原真菌的分离方法，具体涉及一种小麦纹枯病菌的分离方法，属于植物病原分离技术领域。

背景技术

在研究病原真菌的形态、生理、生态以及病原菌对寄主植物的致病性和筛选对病原菌有抑制作用的药剂等多种试验中，常常需要病原真菌的纯培养物。然而，在自然情况下，病原菌通常是与其他杂菌混生在一起，从受病组织或其他基物中将病原菌单独分离出来，叫作植物病原真菌的分离。植物病原真菌的分离在植物病理学科研工作中具有十分重要的地位。对分离到的病原真菌进行保存可以满足植物病理学日常教学的需要，使学生对植物病原真菌有更直观的认识。

小麦纹枯病(Rhizoctonia cerealis)是影响我国江淮流域、中原地区和华北平原南部小麦生产的主要病害之一，自1998年以来呈加重发生的趋势，造成小麦重大损失。小麦感染纹枯病后，苗期会出现烂芽、死苗症状，成株期会出现花秆烂茎、倒伏，发病后期导致枯白穗，严重影响小麦产量。由于小麦纹枯病菌属于弱寄生真菌，可从发病植株基部分离获得纯培养，为以后的融合群鉴定及药剂筛选等提供便利。小麦纹枯病菌的分离是进行后续研究的基础。

植物病原真菌的分离包括组织分离法和稀释分离法。由于小麦纹枯病菌不产孢，通常情况下采用组织分离法进行分离。组织分离法的步骤包括：切取小块患病组织(3～5mm)，用75％酒精消毒20s左右，再用0.1％升汞溶液或2～3％的NaClO消毒3min左右，最后用无菌水清洗2～3次，滤纸吸干水后转入含有乳酸的PSA上培养3～4天，每皿4～5块，一般一个病斑切下的小块放入一个培养皿中培养，待病组织小块上长出典型而无杂菌的小麦纹枯病菌菌落时，用接种针挑取菌落边缘小块至斜面培养基上，培养3～4天无杂菌生长，既得小麦纹枯病菌的纯菌种，便可置于冰箱中保存。组织分离法在样品较少时应用很好，成功率可达90％以上，但如果要进行小麦纹枯病大量病株的分离，则凸显许多问题：

(1)样品处理较为繁琐，且费时费力，需要对染病茎秆进行切取，并经历两次消毒，还要用无菌滤纸吸干水分，一般每个病株需要处理15min左右才能将分离材料进行培养；

(2)所需试剂、耗材较多，在消毒、清洗过程中需要多个培养皿，如培养时每个病株切下的茎段都需要一个培养皿，如果病株较多，则需要的培养皿数更多，并且需要购买更多的酒精和NaClO，成本较高，而用升汞则易污染环境，且操作安全性较低；

(3)对试验操作严格，分离材料必须是新鲜的，消毒时间不可过长或过短，过长病菌菌丝易被杀死，过短则消毒不彻底，易产生杂菌。

由于组织分离法存在费时、费力、成本高、操作要求高等缺陷，不适宜对大量的小麦纹枯病株进行病原菌分离。

发明内容

本发明的目的是提供一种小麦纹枯病菌的分离方法。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种小麦纹枯病菌的分离方法，包括以下步骤：

(1)取采集到的有典型云纹状病斑的小麦纹枯病植株，剪取茎基部有单个典型云纹状病斑的茎段，用70～80％酒精消毒15～25秒钟，无菌水洗净；

(2)取处理后的茎段在22～28℃黑暗条件下培养1～2天(待病斑上长出白色菌丝)，挑取病斑处白色菌丝接种到含乳酸的马铃薯蔗糖培养基上，再在22～28℃黑暗条件下培养2～3天；

(3)挑取小块菌落转至马铃薯蔗糖斜面培养基(PSA)上，在22～28℃黑暗条件下培养4～6天，即可进行菌株保存。

所述步骤(1)中先将采集到的有典型云纹状病斑的小麦纹枯病植株在室内通风阴凉条件下摊开放置4～5天(以便于植株表面的水分挥发)，再剪取茎基部有单个典型云纹状病斑的茎段。

所述步骤(1)中茎段的长度为1.5～3厘米。

所述步骤(1)中茎段先用清水冲洗干净，吸水纸吸干上面的水分后再用酒精消毒。

所述步骤(2)中先将处理后的茎段置于铺有无菌滤纸的平底容器(如培养皿)中(一个容器可以放置多个茎段)，在容器中加入适量的无菌水保湿。

所述步骤(2)中含乳酸的马铃薯蔗糖培养基的配方为：每200mL马铃薯蔗糖培养基中含有0.5～1.5mL浓度为20～30％的乳酸。

所述的马铃薯蔗糖培养基(PSA)的配方为：去皮马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂粉16g，水1000mL。

所述步骤(3)中先选取生长一致的菌落，再用接种针从菌落边缘挑取小块菌落。

本发明的有益效果：

本发明根据病株湿度将从田间采回的小麦植株在室内通风阴凉条件下放置一段时间(4～5天)，待上面的水分挥发后再进行后续消毒处理，采用茎段保湿培养的方法，使茎秆上尽快长出菌丝。同时为了排除细菌污染，茎段处理时应先用70～80％的酒精消毒(时间不宜过长)，再接种于含乳酸的马铃薯蔗糖培养基上，两者均有抑制细菌滋生的作用。

本发明中小麦纹枯病菌的分离方法操作简单，对试验人员的要求不高，适于对大量小麦纹枯病病株进行病原菌的分离；优点主要体现在：

(1)省力，该法仅需对发病茎秆进行简单处理，无需从一个病斑的病健交界处切取5～6块3mm×3mm的组织块，也无需升汞溶液或次氯酸钠消毒、无菌水清洗及滤纸吸干等步骤，操作简单；

(2)省时，采用组织分离法进行小麦纹枯病菌分离时，一般每个病株的操作过程需要15min左右，而此法则可在1min内完成1个病株的酒精消毒、培养皿保湿的步骤，操作迅速；

(3)经济，组织分离法同一病斑上切下的几个组织小块用酒精及NaClO消毒时各需一副培养皿，三次无菌水清洗时又需要三幅培养皿，且每分离一个菌株培养皿均需更换一次，1个病株至少需要5副培养皿才可以分离完毕，而此法保湿及分离时4～5个病株用1个培养皿即可，且操作中不用升汞或NaClO等化学试剂，所需耗材及试剂很少，节约了试验成本；

(4)分离成功率高，处理后的茎秆能很快长出白色菌丝，转入PSA上后也能很快长出小麦纹枯病菌的典型菌落，成功率达95％以上。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

本实施例中小麦纹枯病菌的分离方法，包括以下步骤：

(1)从田间采集小麦纹枯病病株，带回实验室后摊开，室内阴凉通风条件下放置5天；

(2)剪取病株茎基部有单个、典型的云纹状病斑的一段茎秆，长约2厘米，清水冲洗干净，用吸水纸吸干上面的水分，75％酒精消毒20秒钟，再用无菌水冲洗2次；

(3)将无菌水冲洗后的茎段放入皿底铺有无菌滤纸的培养皿里，用移液枪向培养皿中加入2mL无菌水保湿，25℃生化培养箱黑暗条件下培养2天，直至上面长出白色菌丝；

(4)用接种针从每个茎秆上挑取白色菌丝，转入含乳酸的马铃薯蔗糖培养基上(每200mL PSA培养基中含有1mL浓度为25％的乳酸；PSA培养基的配方为：去皮马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂粉16g，水1000mL)，25℃生化培养箱黑暗培养2天；

(5)选取生长一致的菌落，用接种针从菌落边缘挑取小块菌落，转至PSA斜面上，25℃生化培养箱黑暗培养5天，进行菌株保存。

实施例2

本实施例中小麦纹枯病菌的分离方法，包括以下步骤：

(1)从田间采集小麦纹枯病病株，带回实验室后摊开，室内阴凉通风条件下放置4天；

(2)剪取病株茎基部有单个、典型的云纹状病斑的一段茎秆，长1.5厘米，清水冲洗干净，用吸水纸吸干上面的水分，70％酒精消毒25秒钟，再用无菌水冲洗3次；

(3)将无菌水冲洗后的茎段放入皿底铺有无菌滤纸的培养皿里，用移液枪向培养皿中加入1mL无菌水保湿，22℃生化培养箱黑暗条件下培养3天，直至上面长出白色菌丝；

(4)用接种针从每个茎秆上挑取白色菌丝，转入含乳酸的马铃薯蔗糖培养基上(每200mL PSA培养基中含有1.5mL浓度为20％的乳酸；PSA培养基同实施例1)，22℃生化培养箱黑暗培养3天；

(5)选取生长一致的菌落，用接种针从菌落边缘挑取小块菌落，转至PSA斜面上，22℃生化培养箱黑暗培养6天，进行菌株保存。

实施例3

本实施例中小麦纹枯病菌的分离方法，包括以下步骤：

(2)剪取病株茎基部有单个、典型的云纹状病斑的一段茎秆，长3cm，清水冲洗干净，用吸水纸吸干上面的水分，80％酒精消毒15秒钟，再用无菌水冲洗干净；

(3)将无菌水冲洗后的茎段放入皿底铺有无菌滤纸的培养皿里，用移液枪向培养皿中加入1.5mL无菌水保湿，28℃生化培养箱黑暗条件下培养2天，直至上面长出白色菌丝；

(4)用接种针从每个茎秆上挑取白色菌丝，转入含乳酸的马铃薯蔗糖培养基上(每200mL PSA培养基中含有0.5mL浓度为30％的乳酸；PSA培养基同实施例1)，28℃生化培养箱黑暗培养2天；

(5)选取生长一致的菌落，用接种针从菌落边缘挑取小块菌落，转至PSA斜面上，28℃生化培养箱黑暗培养4天，进行菌株保存。

试验例

从洛阳市洛龙区丰李镇小作村麦田采集小麦纹枯病病株132株，拿回实验室后选取症状典型的病株100株，进行小麦纹枯病菌的分离，采用组织分离法及茎段保湿培养法各分离50株。

(1)传统的组织分离法

采用组织分离法分离时，对茎秆进行清水处理后，剪取单个典型病斑的小麦茎秆，每个茎段在病健交界处切取3mm×3mm的组织块，依次用70％酒精消毒25s，2.5％的NaClO消毒3min，然后在无菌水中冲洗三遍，无菌滤纸吸干水后放于含乳酸的PSA上培养，5d后观察，挑取生长一致的菌落进行保存。

由于此法要经过茎秆分段再切块、多次消毒、清水冲洗及滤纸吸干等步骤，一个病株处理完毕约需15min，病株多时相当费力；且两次消毒及三次清洗时需要的培养皿较多(约200副)，培养时每个病株又需要1个培养皿，所需耗材很多；操作过程中如酒精及NaClO消毒时间把握不准，易将病菌也杀死，故对操作要求高；50个病株分离用了2周时间，共分离到小麦纹枯病菌46株，成功率达92％。

(2)本发明中茎段保湿培养法

采用茎段保湿培养法分离时，茎秆经清水处理后，剪取单个典型病斑的茎段，2～3cm，70％酒精消毒25s后在无菌水中冲洗一遍，然后将茎段放于皿底有无菌滤纸的培养皿里保湿培养，每个培养皿放5个茎秆，50个病株需10个培养皿即可；3d后，茎段上已长出白色菌丝；用接种针挑取茎段上的白色菌丝，转至含乳酸的PSA上培养，每个PSA平板可转5个茎段上的菌丝，培养3d后进行菌株保存。

采用茎段保湿培养法，经过一周的时间50株小麦纹枯病病株全部分离完毕，共得到小麦纹枯病菌48株。

上述两种分离方法的比较见下表1。

表1组织分离法与茎段保湿培养法的比较

Claims

1.一种小麦纹枯病菌的分离方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）将采集到的有典型云纹状病斑的小麦纹枯病植株在室内通风阴凉条件下摊开放置4~5天，再剪取茎基部有单个典型云纹状病斑的茎段；茎段先用清水冲洗干净，吸水纸吸干上面的水分后再用70~80%酒精消毒15~25秒钟，无菌水洗净；

（2）将处理后的茎段置于铺有无菌滤纸的平底容器中，在容器中加入无菌水保湿，在22~28℃黑暗条件下培养1~2天，挑取病斑处白色菌丝接种到含乳酸的马铃薯蔗糖培养基上，再在22~28℃黑暗条件下培养2~3天；

（3）选取生长一致的菌落，用接种针从菌落边缘挑取小块菌落转至马铃薯蔗糖斜面培养基上，在22~28℃黑暗条件下培养4~6天，即可进行菌株保存。

2.根据权利要求1所述的小麦纹枯病菌的分离方法，其特征在于：所述步骤（2）中含乳酸的马铃薯蔗糖培养基的配方为：每200mL马铃薯蔗糖培养基中含有0.5~1.5mL浓度为20~30%的乳酸。

3.根据权利要求2所述的小麦纹枯病菌的分离方法，其特征在于：所述的马铃薯蔗糖培养基的配方为：去皮马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂粉16g，水1000mL。