CN111500755A - 一种利用固氮酶nif基因鉴定满江红叶腔中共生固氮蓝藻的方法 - Google Patents

一种利用固氮酶nif基因鉴定满江红叶腔中共生固氮蓝藻的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种利用固氮酶nif基因鉴定满江红叶腔中共生固氮蓝藻的方法，属于生物学领域，采用所述引物：nifH‑F：5'‑AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC‑3'；nifH‑R：5'‑TTGTTSGCSGCRTACATSGC CATCAT‑3'，构建鉴定满江红叶腔中共生固氮蓝藻的方法，此方法无需对鉴定样品的微生物进行专门的处理，分离和纯化，可进行免培养的鉴别，本发明所提供的方法有助于快速、准确地鉴定蓝细菌与不同宿主所组成的共生体系中的固氮微生物的分布状况。

Description

一种利用固氮酶nif基因鉴定满江红叶腔中共生固氮蓝藻的 方法
技术领域
本发明提供一种利用固氮酶nif基因鉴定满江红叶腔中共生固氮蓝藻的方法，属于生物学领域。
背景技术
水生植物满江红（Azolla），俗称“红萍”，是一种生长在淡水水面的蕨类植物，因富含氮素和蛋白质等营养在我国和亚洲农村被用作绿肥和饲料已有数百年历史。上世纪80年代初，随着国际上可持续农业的兴起，我国对满江红研究予以高度重视。农业部在福建省农科院设立了专门的红萍研究机构，其中“国家红萍资源圃”征集国内外满江红品种资源达200多种。这种细小的植物繁殖快,生物量高，归因于其叶腔中栖息着一种固氮蓝藻，具有将空气中氮气的转化为可供机体使用的氮形式的能力。这种固氮蓝藻是属于革兰氏阴性细菌的光自养原核生物，故又称蓝细菌（cyanobacterium）。满江红与蓝细菌共生关系极为密切，蓝细菌在满江红的有性世代和无性世代中均是以一种全封闭的形式传递的。在无性繁殖中，蓝细菌随满江红枝叶的裂殖而在叶腔增殖传递；在有性世代中，蓝细菌进入满江红雌性孢子果的囊群盖中休眠，而等到宿主雌孢子受精萌发后又同步进入幼苗的叶腔中继续传递。因此，满江红是一个相对封闭的共生体。
长期以来，人们借助显微镜可以观察到满江红的叶腔中共生着的蓝藻是由多个细胞串联成的丝状体，形态酷似念珠藻（Nostoc），其中含有营光合作用的营养细胞和专司固氮的异形胞。异形胞中的固氮酶可将大气氮转化为植物可利用的结合态氮，以NH4的形态满足宿主生长对氮素的需求。宿主则蔗糖为主的碳源作为回报。
对于固氮微生物来说，固氮酶(Nitrogenase)的合成是由固氮基因(nif)操纵和调节的。固氮酶复合物主要由两部分组成: nifH编码的铁蛋白( 又称为固氮还原酶) 和nifDK编码的钼铁蛋白( 又称为固氮酶)。在固氮菌的基因组中，固氮相关的nif 基因都是作为一个或几个基因簇存在的，称为固氮基因簇( nitrogen-fixationgene cluster) ，是生物固氮的遗传基础。发现几乎所有已测序的固氮菌都至少含有6个保守的基因: nifH，nifD，nifK， nifE， nifN和nifB ，并且这6个基因在所有已鉴定的系统中对固氮都是必需的。蓝细菌门是一类古老的细菌门类，固氮蓝细菌的种类繁多，已知的固氮蓝藻的固氮酶由H、D、K三种基因组成。在通常情况下，D、H两个基因靠在一起，而K基因与它们之间则隔着一段由12000个核苷酸组成的DNA（脱氧核糖核酸）序列。当环境没有氮源时，它的DNA上的这12000个核苷酸会被切下，使K、D、H基因紧挨在一起形成一个独立的操纵子，此时固氮酶就开始显示活力，蓝藻体内的生物固氮‘机器’才开始运转。 由于利用已知的固氮菌nif 基因簇中的共有基因簇的序列可以发现和检测新的可能的固氮菌，本发明以固氮菌中含有的nifH基因簇为基础设计引物，通过直接提取满江红共生复合体的DNA,用PCR方法扩增出固氮酶基因的片段，高通量测序后通过比对细菌数据库中的固氮微生物，从而快速准确地鉴定出固氮蓝细菌的类别。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用固氮酶nif基因鉴定满江红叶腔中共生固氮蓝藻的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用固氮酶nif基因鉴定满江红叶腔中共生固氮蓝藻的引物，所述引物为：nifH-F：5'-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3'；nifH-R：5'-TTGTTSGCSGCRTACATSGC CATCAT-3'。
一种利用固氮酶nif基因鉴定满江红叶腔中共生固氮蓝藻的方法，所述方法包括如下：
（1）对满江红样本表面消毒除菌处理；
在鉴定前，为了排除外源细菌等微生物的干扰，提出对满江红表面消毒除菌处理的方法，具体如下：取100克（鲜重）在自然条件下生长的萍体，用自来水清洗，去掉黏附的土壤等杂物，细心剪去根系。后选取健康的萍体再用无菌水清洗。捞取洗净的健康萍体，置于灭菌的烧杯中，加入适量的0.1%升汞溶液，将萍体浸没，用灭菌的镊子连续搅拌3分30秒，使满江红的叶、茎和幼根充分与溶液接触，以确保灭菌效果；随后倾尽升汞溶液，迅速用无菌水清洗经灭菌的萍体，至少清洗4次，每次3min，尽量洗去残留在萍体上的升汞。消毒后的满江红样品用于进一步实验处理。
（2）满江红DNA提取与PCR扩增
用植物基因组提取试剂盒分离提取样本的DNA，以提取的满江红基因组DNA为模板，以nifH基因序列作为扩增的目标区域片段，引物序列为nifH-F：5'-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3'；nifH-R：5'-TTGTTSGCSGCRTACATSGC CATCAT-3'；反应体系20μl：4 μl 的5×FastPfu Buffer；2 μl 的2.5 mM dNTPs；各0.8 μl的5 μM ForwardPrimer及nifH基因Reverse Primer；0.4 μl TransStart FastPfu Polymerase；0.2 μlBSA；10 ng Template DNA；补ddH2O至20 μl；PCR反应参数：1× (3 minutes at 95℃)；35循环× (30 seconds at 95℃；30 seconds at；45 seconds at 72℃) ，循环退火温度55℃；10 minutes at 72℃；PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，对nif基因的扩增序列进行高通量测序；
（3）数据处理与生物信息学分析。
用Flash软件对Miseq测序得到的PE reads根据overlap关系进行拼接，Trimmomatic软件对拼接序列质量进行质控和过滤，获得高质量的Tags序列。在Usearch（vsesion 7.0）平台，按照97%相似性对非重复序列（不含单序列）进行操作分类单元(operation taxonomic unit，OTU)聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU的代表序列。为了得到每个OTU对应的物种分类信息，基于silva数据库，采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并分别在从域（domain）到种（species）各个分类学水平统计各样本的群落组成。
本发明的优点在于：
1. 对共生于满江红叶腔中以固氮蓝藻为主的固氮微生物体系具有较高精度的辨识能力。在以往对满江红叶腔共生菌的常规显微检测中，由于蓝细菌的形态较大，容易被光学镜检识别，以蓝细菌为代表的细菌类群是最早发现的共生于满江红叶腔中的微生物群落。一直认为满江红仅是萍藻的共生体。而在电镜镜检水平，可以观察到丰富的其他类型的细菌附着在蓝藻的藻丝上。郑伟文等（1990）用电子显微镜证明自然界的满江红和人工培养的无藻满江红均有伴生细菌。Nierzwicki等（1990, 1991）应用电镜技术将满江红叶腔内生细菌分为6个超微结构类型。但传统的显微镜检不能对细菌的种属作出进一步的判断。本专利在前人工作的基础上，直接采用高通量测序平台对满江红内生细菌固氮酶基因nif序列进行多样性鉴定，不仅比较准确地确定出细菌的门类，还可以统计它们相对的丰度状况，从而了解不同固氮细菌群落在满江红叶腔中的组成水平。通过本方法发现在小叶满江红中蓝细菌的nif基因占了约88%的丰度。除蓝细菌外，变形菌门的细菌nif基因占了12%的丰度，可见在满江红的叶腔中，除固氮蓝藻外，其他具有固氮能力的细菌群落占了一定的优势。
2. 无需对鉴定样品的微生物进行专门的处理，分离和纯化，可进行免培养的鉴别。近三十年来，人们通过分离培养技术先后从满江红的叶腔分离出可独立生长的蓝细菌，6个国家9个实验室的研究者采用传统的平板培养法，从4个生物种的满江红中分离鉴定出9个属15个种的内生细菌，均不是预期的蓝细菌种类。因此，迄今为止分离纯化满江红共生蓝藻的尝试均未获得成功。而采用本发明的鉴定技术，不需要对满江红叶腔中的固氮蓝细菌进行分离，纯化和培养。直接通过提取的基因组DNA就可以迅速地加以鉴别。
3. 具有广阔的应用前景，可推广到其他蓝细菌为主的共生固氮体系的固氮微生物的鉴定。以蓝细菌为寄主的共生体系有着十分明显多样性，具体表现在：①固氮蓝细菌能与进化进程中不同类别的物种形成共生固氮体系，主要有真菌类的地衣（lichen）、苔藓类植物的叶苔（liverworts）与角藓(hornworts)、蕨类植物满江红(Azolla)、裸子植物苏铁(cycads)及被子植物根乃拉草(Gunnera)。而固氮的根瘤菌只能与豆科植物组成共生体，固氮的弗兰克氏菌主要与非豆科的乔木组成共生体。②蓝细菌即可包裹在地衣真菌的菌丝中进行光合和固氮作用，又能在植物的根、茎、叶等不同器官寄生形成共生。如在苔藓与蕨类植物中，蓝细菌生活在宿主提供的叶隙或叶腔中进行固氮作用；在苏铁中，蓝细菌侵染到宿主珊瑚状根中，形成胞外侵染圈进行固氮作用；而在根乃拉草中，蓝细菌侵染到茎后，进入到一种称为茎腺组织的细胞中进行胞内固氮作用。本发明所提供的技术流程有助于快速、准确地鉴定蓝细菌与不同宿主所组成的共生体系中的固氮微生物的分布状况。
附图说明
图1满江红根部表面的扫描电镜照片。上图为自然条件下生长的满江红根部，左图为右图方框的放大图。长白箭头示根毛细胞，左图短箭头示根表的杆状细菌。下图为经茎尖组织培养的满江红根部。左图为右图方框的放大图。长白箭头示根毛细胞，细小箭头示根细胞间隙的分泌物。图中白色标尺=100µm。
图2 扫描电镜照片显示含藻与无藻满江红的茎尖区域共生藻的存在状况。左图为含藻满江红的茎尖区域剖面，可见附着于茎尖（A, apex）附近的初分支腺毛（PBH,primarybranched hair）的蓝藻为缺乏异形胞却又活跃分裂的营养细胞（又称藻殖段，即Homogonia, H）正进入幼叶腔（YL, young leaf）。右图为无藻满江红的茎尖区域剖面，未见共生蓝藻，但可见发生于茎尖的初生分支腺毛与幼叶的分支腺毛相互交织搭桥，引导蓝藻细胞向幼叶腔（图中椭圆形区域）运动（箭头）。右图叶腔中的SSH(secondary simple hair)为正在发育的次生单支腺毛。茎尖区域的叶原基用LP（leaf promodium）标示。标尺=20µm。
图3两种满江红样品内生细菌的PCR扩增产物的电泳图谱，M：DNA分子量标准；1：含藻满江红16S rRNA基因(细菌通用引物对照)；2：含藻满江红nifH基因；3：无藻满江红nifH基因； CK: 空白对照。
图4 两种满江红样品含nifH基因细菌在属水平的群落丰度的百分比。
具体实施方式
实施例1
一、材料与方法
1.材料来源与制备
实验材料小叶满江红(Azolla microphylla Kaulfus), 早先从国际水稻研究所(International Rice Research Institute)引进, 原编号为IRRI 4018。
表面灭菌的满江红制备：取100克（鲜重）在自然条件下生长的萍体，用自来水清洗，去掉黏附的土壤等杂物，细心剪去根系。后选取健康的萍体再用无菌水清洗。捞取洗净的健康萍体，置于灭菌的烧杯中，加入适量的0.1%升汞溶液，将萍体浸没，用灭菌的镊子连续搅拌3分30秒，使满江红的叶、茎和幼根充分与溶液接触，以确保灭菌效果。随后倾尽升汞溶液，迅速用无菌水清洗经灭菌的萍体，清洗4次，每次3min，尽量洗去残留在萍体上的升汞。上述经表面无菌处理的的供试满江红样品在无菌操作台上剥取满江红的茎尖在立体解剖镜下用无菌的细针挑取并弃去包被茎尖的叶片，仅保留茎尖分生组织和1-2个叶原基，分别接入灭菌的无氮和有氮的培养液的三角瓶内。代表满江红培养生长的不同模式。
（2）无氮模式下的满江红样品用IRRI培养液进行培养，样品用AmA表示，其培养液的配方为(mg/L)：NaH2PO4 ·H2O 89; K2SO4 89.1; CaCl2 ·2H2O 147; MgSO4 ·7H2O405.3; MnCl2·4H2O 1.8; Na2Mo2·2H2O 0.38; H3BO3 1.14; ZnSO4 ·7H2O 0.04; CuSO4·5H2O 0.04; CoCl2· 6H2O 0,04; EDTA-Fe (FeSO4· 7H2O 0.249, EDTA 0.261, KOH0.157)。pH6.5。
（3）有氮模式下的满江红样品用加氮的Nickell满江红培养液进行培养，样品用AmB表示。Nickell培养液的配方是(mg/L)：KNO3 202; KCl 150; KH2PO4 136; Cu(NO3)2·4H2O 708; CaCl2 167; MgSO4·7H2O 246; MgCl2 96; H3BO3 0.1; MnSO4·4H2O 0.1;ZnSO4·4H2O 0.3; CuSO4·5H2O 0.1; Na2MoO4·2H2O 0.1; EDTA-Na2 370; FeSO4·7H2 O280。pH 6.5。
以上操作均在本研究所组培实验室的无菌环境下（苏净SW-CJ-2F型）完成。
培养条件为：26/18ºC（日/夜），光强1.5万Lux。10-15天更新培养液。待繁殖足量后分别称取样品用于下一步的实验。
扫描电镜样品制备与观察
选取上述满江红植株的营养体，在解剖镜下细心去除根系后，将剥离的萍体用2.5%戊二醛溶液（0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.4）在室温下固定4小时，用同样的磷酸缓冲液洗涤3次后，用2%锇酸在4℃下固定2小时，又经磷酸缓冲液充分洗涤后，用乙醇逐级脱水，并经环氧丙烷替换两次。试样用HCP-2型临界点干燥器干燥，将经干燥的样品粘附于铜台上，在高倍解剖镜下用细针解剖，使满江红叶腔内的微生物群落充分暴露，再用IB-5型离子溅射仪喷镀铂钯，用JEOL JSM-6380lv 型扫描电子显微镜观察并拍片，加速电压15千伏。
满江红DNA提取与nif基因的PCR扩增
采用DNA提取试剂盒(上海生工) 和说明书的操作步骤提取样本的DNA，用1％琼脂糖凝胶电泳对检测所提取DNA的完整性。
以提取的满江红基因组DNA为模板，在ABI GeneAmp® 9700型反应仪上进行PCR反应。
nif基因的扩增引物为nifH-F（5'-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3'），nifH-R（5'-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3'）。
反应体系20μl：4 μl的5×FastPfu Buffer；2 μl的2.5 mM dNTPs；各0.8 μl的正向扩增引物 (5 μM) 及反向扩增引物(5 μM)；0.4 μlTransStartFastPfu聚合酶；0.2 μlBSA；10 ng 模板 DNA；补ddH2O至20 μl。
PCR反应参数为：95℃预变性3 min, 35循环(95℃变性20 s，55℃退火45s，72 ℃延伸1 min)，72℃延伸 10 min。
PCR产物经1.8％琼脂糖凝胶电泳检测后，委托上海美吉生物科技有限公司用Illumina的MiSeq测序仪对nif基因的扩增序列进行高通量测序。
数据处理与生物信息学分析
用Flash软件对Miseq测序得到的PE reads根据overlap关系进行拼接，Trimmomatic软件对拼接序列质量进行质控和过滤，获得高质量的Tags序列。在Usearch（vsesion 7.0）平台，按照97%相似性对非重复序列（不含单序列）进行操作分类单元(operation taxonomicunit，OTU)聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU的代表序列。为了得到每个OTU对应的物种分类信息，基于silva数据库，采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并分别在从域（domain）到种（species）各个分类学水平统计各样本的群落组成。分析在美吉生物科技有限公司的生物云平台（i-sanger）上完成。
二、结果
1．表面无菌的满江红样品的获得与验证
得到植株表面无外源微生物污染，但叶腔仍含有共生蓝藻(下称symbiont或cyanobiont)为优势种的内生细菌群落的满江红样本是进行本研究的前提。参照本发明提供的表面无菌满江红制备的方法，经过近两个月的茎尖组织培养，取得了在IRRI无氮培养液正常生长的小叶满江红群体，成功率为10%。无外源微生物污染验证方法有三：1，培养60天后，培养液洁净通透，未见污染；2，用扫描电镜随机检查10株萍体及其根系，萍体叶片，尤其是根毛间隙未见到任何细菌（图1），而叶腔中以共生蓝细菌为主的内生细菌群落与自然界的满江红叶腔菌落无异（图2）而自然条件下生长的满江红，可见细菌附着于植株，尤其是根表皮细胞（图1）。通过茎尖组织培养也取得了在Nickell富氮培养液健康生长的萍体。成功率为5%。验证方法同上。即培养60天后，结合态氮丰富的Nickell培养液依然澄清洁净，叶片和根表未见微生物存在，且叶腔内未见蓝藻藻丝存在的迹象，用nifH-PCR测序检测未见固氮蓝藻的nif片段(详见结果3-4)。本文将表面无菌、叶腔中含有以蓝藻藻丝为优势的微生物群落、nifH-PCR检测阳性的满江红，简称为含藻满江红(Azolla with symbiont)，叶腔中未见共生藻且测序检测无蓝细菌nif基因者即称为无藻满江红(symbiont-freeAzolla)。
含藻满江红与无藻满江红叶腔微生物群落的电镜观察
利用扫描电镜对含藻满江红与无藻满江红叶腔中微生物群落的形态做进一步观察（图2），可以看到两者有如下差别：
1、含藻满江红叶腔中以蓝藻为优势的内生菌占据了大部分的可用空间。由异形胞（小五星标志）和营养细胞组成的蓝藻丝状体缠绕于叶腔约15个单支腺毛细胞之间，并彼此连接成网络状结构；
2、无藻满江红的从幼叶到老叶，除了环绕在叶腔周围的腺毛外，均未见藻丝。在低倍放大的电镜视野中，叶腔基本是中空的。
内生微生物的nifH基因的PCR扩增及扩增产物样本的测序数据
应用基因组试剂盒对含藻和无藻满江红提取总DNA，以细菌的nifH基因的区段设计引物，以提取的DNA为模板进行PCR扩增。扩增泳道均在500bp附近扩增出单一的DNA条带（电泳结果见图3），表明在满江红的培养基中无论是否添加氮素，其内生的细菌群落均具有nifH基因区域的特异性扩增。
对分别在无氮和富氮两种培养模式下的满江红样本不同细菌群落的PCR扩增产物进行高通量的测序分析，将得到的代表nifH基因区段的样本测序数据总结在表1中。
表1不同满江红样本的两种细菌基因扩增区段的测序数据统计
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由表1可见：通过对固氮菌nifH基因区段的扩增产物进行高通量测序，对读取的序列PEreads进行拼接，质控和过滤后，获得标签Tags序列。从生长于无氮培养基的满江红样品（AmA）以及生长于富氮培养基的满江红样品（AmB）所得到的标签序列的数量，碱基数，序列的平均长度及长度范围比较而言，两者间差异并不大，即使有所差异也无实际意义。但在Usearch（vsesion 7.0）平台，按照97%相似性对非重复序列（不含单序列）进行操作分类单元(operation taxonomic unit，OTU)聚类后，可以看出，在富含结合态氮的Nickell培养基中生长的满江红（AmB），其基于≥97％的相似度水平，通过聚类分析共获得的有效OTUs的数目大幅度的减少，以nifH基因标记的OTU减少了64%。由于IRRI培养基和Nickell培养基除氮素外，其余培养成分基本相同。测序结果表明：结合态氮对满江红内生细菌无论是总菌群和固氮菌群的多样性的减少起到了关键的作用。
nif基因鉴别的内生菌群落组成
为了得到每个OTU对应的细菌物种的分类信息，基于silva数据库，采用RDPclassifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，本研究对固氮酶基因nifH的检测给出了答案。测序结果表明（见表1），从含藻满江红样品(AmA)中得到36959条序列，而无藻满江红（AmB）也得到38869条序列。但两者间的微生物的可操作分类单元(OTU)明显不同，由图4表明：含藻满江红(AmA)nifH测序序列形成14个细菌的OTU，满江红共生体的nifH基因主要来自蓝藻门，变形菌门和未知细菌的门类。其中蓝藻门的nifH基因的细菌群落占了88.44%的优势, 划分到种属水平均为满江红的共生蓝藻Nostocazollae，变形菌门中含有nifH基因的细菌群落占了11.32%。而无藻满江红（AmB）仅有5个OTUs，来自变形菌门（99.71%）和未知门类的细菌（0.29%）, Pseudomonas_stutzeri占99.54%，还有0.16%含有nifH基因的细菌落无法认定到纲的水平。值得注意的是在加氮模式下生长的无藻满江红（AmB）蓝藻门的nifH基因未检出。
三、对两种鉴定方法的比较及结论
通过利用电镜的扫描镜检技术和本发明的技术对生长在IRRI和Nickelle培养液的小叶满江红共生腔中的微生物群落的鉴定结果进行比较，可以得出以下结论：
1、无氮条件促进满江红的共生腔中存在的固氮微生物群落形成一定程度的遗传多样性，并对满江红念珠藻Nostocazollae产生增强效应。通过电镜与光学显微镜观察在无氮模式的环境条件下生长的满江红样品，均能看到叶腔中与满江红共生的蓝藻形态酷似念珠藻（Nostoc），一般称为满江红念珠藻（Nostocazollae）。在电镜下，小叶满江红叶腔中充满了念珠状的蓝细菌的藻丝，其间间隔有较大的异形胞。一般认为，异形胞就是固氮酶所在的场所，可以推断出此时叶腔中的蓝细菌以能固氮的Nostocazollae占有极大地优势。除藻丝外，还可以看见有内生细菌附着于蓝藻细胞表面或与分泌物交织聚集形成生物被膜结构。但无法对细菌的种属加以判定。而通过本发明提供的鉴定技术可以进一步判断出共生于满江红共生体的nifH基因主要来自蓝藻门，变形菌门和未知细菌的门类。其中蓝藻门的nifH基因的细菌群落占了88.44%的优势, 划分到种属水平均为满江红的共生蓝藻Nostocazollae，变形菌门中含有nifH基因的细菌群落占了11.32%。
2、有氮条件抑制了满江红的共生腔中固氮微生物群落的遗传多样性，对满江红念珠藻Nostocazollae产生强烈的抑制效应。通过电镜与光学显微镜观察在有氮模式的环境条件下生长的满江红样品，均发现叶腔中满江红共生的满江红念珠藻（Nostocazollae）的藻丝消失了。而通过本发明提供的鉴定技术可以进一步判断出主要是来自蓝藻门的nifH基因的消失，导致叶腔中变形菌门和未知细菌的门类nifH占近100%的优势。
比较IRRI和Nickelle培养液的化学组成，两者的主要差别在后者含有较多的结合态氮[KNO3，Cu(NO3)2]，表现出对共生蓝藻的显著抑制作用。为此我们通过剥离包裹共生蓝藻的幼叶，让Nostocazollae与NO3 —和Cu++充分接触。据我们观察，附着于茎尖的蓝藻藻殖段（homogonia）并不含异形胞（见图2），且生命力强。如不将之充分暴露于NO3 —和Cu++，它们可能存活下来。Li Fay-Wei et al. (2018) 报道，在培养液中添加NH4NO3可使满江红体内的共生蓝藻消失，以致无法用PCR检出nifH。我们也曾做了同样的尝试，但经过连续的继代培养后其共生蓝藻又“复活”了。而在Nickelle培养液生长的无藻满江红投入无氮的IRRI培养液则难以存活。这说明在氮的“压力”下，满江红叶腔中绝大部分的固氮蓝藻被抑制了。这样的满江红在无氮条件下将难以存活。总的来说，氮把Azolla-Nostocazollae共生固氮体系还原为“纯粹”的蕨体。原先互惠互利的碳氮代谢通路已不复存在。无藻满江红需要依赖外源结合态氮才能存活。深入探讨和比较含藻满江红与无藻满江红的生长速度、营养品质及其影响因子的分子机制，有望为作物增产和品质改良提供新的线索和思路。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院生物技术研究所
<120> 一种利用固氮酶nif基因鉴定满江红叶腔中共生固氮蓝藻的方法
<130> 2
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aaaggyggwa tcggyaartc caccac 26
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttgttsgcsg crtacatsgc catcat 26

Claims (2)

1.一种利用固氮酶nif基因鉴定满江红叶腔中共生固氮蓝藻的引物，其特征在于：所述引物为：nifH-F：5'-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3'；nifH-R：5'-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3'。
2.一种利用固氮酶nif基因鉴定满江红叶腔中共生固氮蓝藻的方法，其特征在于：所述方法包括如下：
（1）对满江红样本表面消毒除菌处理；
（2）满江红DNA提取与PCR扩增
用植物基因组提取试剂盒分离提取样本的DNA，以提取的满江红基因组DNA为模板，以nifH基因序列作为扩增的目标区域片段，引物序列为nifH-F：5'-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3'；nifH-R：5'-TTGTTSGCSGCRTACATSGC CATCAT-3'；反应体系20μl：4 μl 的5×FastPfu Buffer；2 μl 的2.5 mM dNTPs；各0.8 μl的5 μM ForwardPrimer及nifH基因Reverse Primer；0.4 μl TransStart FastPfu Polymerase；0.2 μlBSA；10 ng Template DNA；补ddH2O至20 μl；PCR反应参数：1× (3 minutes at 95℃)；35循环× (30 seconds at 95℃；30 seconds at；45 seconds at 72℃) ，循环退火温度55℃；10 minutes at 72℃；PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，对nif基因的扩增序列进行高通量测序；
（3）数据处理与生物信息学分析。
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