CN111849837A - 一种促进植物种子萌发和/或幼苗生长的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了南极稀有放线菌Plantibacter sp.NJL1，及其在促进植物种子萌发和/或幼苗生长中的应用，属于微生物菌种及其应用领域。所述南极稀有放线菌Plantibacter sp.NJL1分离自南极普利兹湾海洋沉积物，具有耐受低温、高盐等耐逆特征，且能促进植物种子萌发，将其应用于植物种子的萌发，能够显著提高种子有效发芽率，幼苗生长更好，NJL1定殖于幼苗根部，改变根系形态，根毛增多，有利于营养物质的吸收。因此，南极稀有放线菌Plantibacter sp.NJL1可以开发成农作物种子萌发调节剂，在农业生产中具有应用潜力。

Description

一种促进植物种子萌发和/或幼苗生长的方法
技术领域
本发明涉及微生物菌种及其应用领域，具体涉及一种南极稀有放线菌Plantibacter sp. NJL1及其在促进植物种子萌发和/或幼苗生长中的应用。
背景技术
Plantibacter（植物杆菌属）是放线菌门下研究较少的稀有放线菌类群。最初从植物共附生环境分离获得，目前在植物根际、叶际、植物体内、落叶等植物相关环境中均得到分离，此外也有少量报道从非植物相关环境例如空气、海洋沉积物等环境中能分离获得该属细菌。迄今该属共报道了两个标准种，Plantibacter flavus (Lin and Yokota 2006)和Plantibacter auratus (Behrendt, Ulrich et al.2002)。
由于该属菌株最初从植物分离获得，因此已有研究开展了部分促进植物生长的研究，例如Plantibacter sp. WZW03菌株能促进植物对土壤中钾盐的利用，尤其对西瓜根的生长有促进作用，能增加根的长度、重量和体积，可能对西瓜生长有促进作用(Wang, Piaoet al. 2019)；P. flavus 251和M259菌株都能增加拟南芥等植物根的长度和生物量，体现出促进植物生长的作用(Mayer, Dorr de Quadros et al.2019)。可见该属细菌对于植物的促生长作用具有普遍性，往往通过改变根的长度和形态来促进植物对营养物质的吸收利用，或者通过产生植物激素例如吲哚-3-乙酸来促进植物生长。但迄今的研究局限在促进植物生长方面，对Plantibacter属细菌是否具有促进植物种子萌发的作用尚未报道。
种子萌发与幼苗的发育是植物生命过程中最先也最重要的一个步骤，种子有效萌发率的高低以及幼苗生长状态直接影响作物产量。目前已有的研究表明一些菌株能促进植物种子萌发，例如植物内生细菌Arthrobacter agilis UMCV2和Bacillus methylotrophicus M4-96能促进草莓瘦果种子萌发，提高草莓产量(Hernandez-Soberano，Ruiz-Herrera et al.2020)；放线菌Nocardiopsis dassonvillei strain MB22能促进小麦发芽与幼苗生长(Allali,Goudal et al.2019)。微生物促进植物生长的作用比较普遍，但能促进植物种子萌发的种类并不是太多。因此，本发明获得能促进植物种子萌发的Plantibacter属细菌，拓展了植物种子萌发调节剂的候选微生物类群，具有重要应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有促进种子萌发作用的南极放线菌新种，将其应用于植物种子萌发和/或幼苗生长中，为农作物种子萌发调节剂的开发提供候选。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明从南极普利兹湾（Prydz Bay）460米深处海洋沉积物中分离得到Plantibacter属新种，暂命名为Plantibacter sp. NJL1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO: M 2020374。该菌株具有耐受低温、高盐等耐逆特征，能在低温条件下较快生长，且具有促进植物种子萌发的作用，因此，将其应用到促进植物种子萌发和/或幼苗生长中。
所述植物为拟南芥生态型Col0与Ler，为植物研究常用模式物种。
本发明还提供了一种促进植物种子萌发和/或幼苗生长的方法，包括：将植物种子接种于含有南极稀有放线菌NJL1的育苗基质中进行培养。
植物种子依次进行消毒和预冷处理后，再接种到育苗基质中进行育苗，有助于提高发芽率。
作为优选，所述育苗基质的基础培养基为1/2MS培养基。具体的， 1/2MS培养基为：每1L培养基中mg含量为：硝酸钾950，硝酸铵825，二水氯化钙220，硫酸镁185，磷酸二氢钾85，硫酸锰11.15，硫酸锌4.3，硼酸3.1，碘化钾0.4，钼酸钠0.125，硫酸铜0.0125，氯化钴0.0125，乙二胺四乙酸二钠37.3，硫酸亚铁27.8，肌醇100，甘氨酸2，烟酸0.5，VB6 0.5， VB10.1，蔗糖30000，添加1.5%琼脂配置为固体培养基，pH5.8左右。
作为优选，所述育苗基质中南极稀有放线菌NJL1的浓度为OD600=0.01~0.00001。NJL1浓度在OD600为0.01到0.00001范围内均能促进拟南芥种子有效发芽，更为优选，菌液浓度为OD600=0.001~0.00001，OD600=0.0001的菌液浓度时有效发芽率平均达到86%。
所述培养条件为：按照常规条件进行育苗培养。
本发明具备的有益效果：
(1)本发明提供的南极稀有放线菌Plantibacter sp. NJL1具有耐受低温、高盐等耐逆特征，且能促进植物种子萌发，将其应用于植物种子的萌发过程，能够显著提高种子有效发芽率，而且幼苗生长更好，NJL1定殖于幼苗根部，改变根系形态，根毛增多，有利于营养物质的吸收。因此，南极稀有放线菌Plantibacter sp. NJL1可以开发成农作物种子萌发调节剂，在农业生产中具有应用潜力。
(2)本发明首次报道了Plantibacter属细菌在促进植物种子萌发方面的作用，也是首个来自南极能促进植物种子萌发的细菌。该菌株可以作为种子萌发促进剂，用于提升作物种子的有效萌发，尤其对难萌发或者受损种子的萌发具有促进作用。
附图说明
图1为培养在2216E平板上的菌落。
图2为拟南芥种子经NJL1菌株处理后发芽情况。
图3为拟南芥种子经NJL1菌株处理后的有效发芽率。
图4为NJL1菌液处理后拟南芥幼苗根部定殖检测，其中左图为不同浓度菌液处理下的幼苗，右图为对应的根部检测结果。
图5为处理组比对照组的根部长度差异。
图6为处理组与对照组根毛形态差异。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不局限于此。
实施例1
一、菌株分离与鉴定
Plantibacter sp. NJL1是分离自南极普利兹湾（Prydz Bay）460米深处海洋沉积物的稀有放线菌。
具体分离过程：采集南极普利兹湾海洋沉积物，低温保藏运送回实验室，在无菌操作台中利用梯度稀释法进行平板分离，采用的培养基为2216E培养基（蛋白胨5g，酵母粉1g，琼脂18g，海水1000 ml，121℃（98.1 KPa）高压灭菌20 min，加终浓度为100μg/ml 制霉菌素以抑制真菌生长）。经过多次划线纯化后，菌株在平板上形成黄色单菌落，如图1所示。
提取基因组DNA后利用27F和1492R引物对进行PCR扩增16S rRNA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。经过与标准菌株库进行比较，发现最相似的标准菌株为Plantibacter flavus DSM 14012T，因此初步鉴定为Plantibacter属的细菌，命名为Plantibacter sp. NJL1。
该菌株生长温度范围为0-35℃（最适25℃），耐受的盐度范围为0-8%（最适1%）。该菌株已经保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉、武汉大学，保藏时间2020年7月29日，保藏号为CCTCC NO: M 2020374。该菌株基因组与最相似的标准菌株Plantibacter flavus DSM 14012T的基因组DDH（DNA：DNA杂交）值为64.6%，低于相同物种70%的阈值，因此初步推断该菌株为Plantibacter属下的新种，也是首个分离自南极的Plantibacter菌株。
二、植物种子发芽促进作用
实验步骤：
1、拟南芥种子的消毒：用30%的84消毒液洗涤拟南芥种子15-20min，为保证种子表面的充分灭菌，洗涤过程在涡旋仪上进行。之后用无菌去离子水漂洗种子5-6次，洗去种子表面的消毒液残留。种子放置在4℃冷处理48h。
2、菌处理培养基的配制：将培养至OD=0.8到1之间的NJL1菌液分别稀释10倍，102倍，103倍。将1ml原菌液和梯度稀释好的菌液分别加入40℃左右的100ml 1/2MS 固体培养基中作为不同浓度下的菌处理组（OD=0.01,OD=0.001,OD=0.0001,OD=0.00001），之后倒板。对照组（mock）中加入1ml 2216E 培养基。每组处理分别设置四个生物学重复。
3、用1ml枪头吸取经冷处理后的拟南芥种子点在菌处理1/2MS固体培养基上。每天观察种子萌发状态并记录萌发率。
实验结果：有效发芽的评判标准为：11 天大的拟南芥幼苗长出两片真叶且两片子叶舒展开。经不同浓度的NJL1菌液处理，拟南芥种子有效萌发率均明显高于对照，处理组的幼苗比对照组生长更好（图2，3）。与对照（mock）相比，NJL1菌液在OD为0.01到0.00001浓度范围内都能促进拟南芥种子有效发芽，且其中菌液浓度为OD=0.001、0.0001、0.00001时促进作用显著（P<0.05），OD=0.0001的菌液浓度时有效发芽率平均达到86%（图3）。
三、在拟南芥幼苗中的定殖检测与根毛形态改变
实验方法：在超净工作台中，无菌切割11天大的拟南芥幼苗根部，将根在75%的乙醇中涮洗5-10s，除去拔出培养基的根部表面带有的菌。根用镊子捞出后在0.45% NaCl溶液中漂洗一次。取洗好的根于研钵中，加入1ml 0.45% NaCl溶液进行研磨，直至根全部磨碎。吸取研磨好的液体于1.5ml 离心管中保存，进行梯度稀释，分别稀释10倍，100倍，各取200ul涂布于2216E固体培养基上。每24h记录菌落的生长情况。
实验结果：从拟南芥幼苗根部均能在2216E平板上分离培养出NJL1菌株，而对照不能培养出菌株（图4）。从原液、10倍与100倍稀释涂布的平板上，菌落密度呈现梯度减少，符合预期。同时也能看出，与对照相比，菌液处理组幼苗生长情况更好。
除了能加快拟南芥发芽，促进幼苗成长外，用NJL1菌株处理的植物根形态发生了显著变化，处理组根部普遍变短变粗（图5）、且根毛增多（图6）。这种变化可能更利于菌株更多定殖到根部，促进营养物质吸收。
序列表
<110> 中国极地研究中心（中国极地研究所）
中国科学院分子植物科学卓越创新中心
自然资源部第一海洋研究所
<120> 一种促进植物种子萌发和/或幼苗生长的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1543
<212> DNA
<213> 植物杆菌(Plantibacter sp. NJL1)
<400> 1
ggagggtggc gcggtcgaga ttagagtttg atcctggctc aggacgaacg ctggcggcgt 60
gcttaacaca tgcaagtcga acgatgaagc ccagcttgct gggtggatta gtggcgaacg 120
ggtgagtaac acgtgagtaa cctgcccttg actctgggat aagcgttgga aacgacgtct 180
aataccggat acgagcttcc accgcatggt gagttgctgg aaagaatttt ggtcaaggat 240
ggactcgcgg cctatcagct tgttggtgag gtaacggctc accaaggcga cgacgggtag 300
ccggcctgag agggtgaccg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 360
ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc gaaagcctga tgcagcaacg ccgcgtgagg 420
gacgacggcc ttcgggttgt aaacctcttt tagcagggaa gaagcgaaag tgacggtacc 480
tgcagaaaag gcaccggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta gggtgcaagc 540
gttgtccgga attattgggc gtaaagagct cgtaggcggt ttgtcgcgtc tgctgtgaaa 600
tcccgaggct caacctcggg tctgcagtgg gtacgggcag actagagtgc ggtaggggag 660
attggaattc ctggtgtagc ggtggaatgc gcagatatca ggaggaacac cgatggcgaa 720
ggcagatctc tgggccgcta ctgacgctga ggagcgaaag ggtggggagc aaacaggctt 780
agataccctg gtagtccacc ccgtaaacgt tgggcgctag atgtggggac cattccacgg 840
tttccgtgtc gtagctaacg cattaagcgc cccgcctggg gagtacggcc gcaaggctaa 900
aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggcggag catgcggatt aattcgatgc 960
aacgcgaaga accttaccaa ggcttgacat atacgagaac gggccagaaa tggtcaactc 1020
tttggacact cgtaaacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1080
gttaagtccc gcaacgagcg caaccctcgt tctatgttgc cagcacgtaa tggtgggaac 1140
tcatgggata ctgccggggt caactcggag gaaggtgggg acgacgtcaa atcatcatgc 1200
cccttatgtc ttgggcttca cgcatgctac aatggccagt acaaagggct gcaataccgt 1260
aaggtggagc gaatcccaaa aagctggtcc cagttcggat tgagatctgc aactcgacct 1320
catgaagtcg gagtcgctag taatcgcaga tcagcaacgc tgcggtgaat acgttcccgg 1380
gccttgtaca caccgcccgt caagtcatga aagtcggtaa cacccgaagc cagtggccta 1440
accgcaagga tggagctgtc taaggtggga tcggtaatta ggactaagtc gtaacaaggt 1500
agccgtaatc tctagaggan ccccnggtac cgagtccgat cgc 1543

Claims (8)

1.一种南极稀有放线菌，其特征在于，所述南极稀有放线菌命名为Plantibacter sp.NJL1，其保藏号为CCTCC NO: M 2020374。
2.如权利要求1所述的南极稀有放线菌在促进植物种子萌发和/或幼苗生长中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，南极稀有放线菌促进植物幼苗根部变粗，增加根毛数量。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥。
5.一种促进植物种子萌发和/或幼苗生长的方法，其特征在于，包括：将植物种子接种于含有如权利要求1所述的南极稀有放线菌的育苗基质中进行培养。
6.如权利要求5所述的促进植物种子萌发和/或幼苗生长的方法，其特征在于，所述育苗基质的基础培养基为1/2MS培养基。
7.如权利要求5所述的促进植物种子萌发和/或幼苗生长的方法，其特征在于，所述育苗基质中南极稀有放线菌NJL1的浓度为OD600=0.01~0.00001。
8.如权利要求5所述的促进植物种子萌发和/或幼苗生长的方法，其特征在于，所述育苗基质中南极稀有放线菌NJL1的浓度为OD600=0.0001。
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