KR20040050594A

KR20040050594A - 토양의 불용성 인산염을 가용화하는 신규의 균주레클레르시아 아데카르복실라타 케이에스제이8

Info

Publication number: KR20040050594A
Application number: KR1020020078452A
Authority: KR
Inventors: 이기성; 장화형; 한갑진
Original assignee: 이기성
Priority date: 2002-12-10
Filing date: 2002-12-10
Publication date: 2004-06-16
Also published as: KR100460633B1

Abstract

본 발명은 불용성 인산염을 가용화하는 신규의 균주 레클레르시아 아데카르복실라타(Leclercia adecarboxylata) KSJ8과, 이 균주를 작물재배 토양에 처리하여 불용성 인산염을 가용화 하는 것에 관한 것이다.

본 발명의 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8은 토양내에 있는, 불용성 인산염인 3인산칼슘, 하이드록시아파타이트, 인광석, 파이테이트 등을 생물이 사용하는 가용성 인산 이온으로 만들어준다.

Description

토양의 불용성 인산염을 가용화하는 신규의 균주 레클레르시아 아데카르복실라타 케이에스제이8{THE NOVEL LECLERCIA ADECARBOXYLATA KSJ8 WHICH SOLVES INSOUBLE PHOSPHATE IN SOIL}

본 발명은 불용성 인산염을 가용화하는 신규의 균주 레클레르시아 아데카르복실라타(Leclercia adecarboxylata) KSJ8과, 이 균주를 작물재배 토양에 처리하여 불용성 인산염을 가용화 하는 방법에 관한 것이다.

인(phosphorus)은 식물의 생장과 발육을 위해 매우 중요한 필수적 영양원소로서 대량의 공급이 필요한 대량영양원소(macronutrient)이다. 작물의 최대 수확을 위해서는 식물이 가용할 수 있는 인의 유무는 매우 중요한 조건이 된다. 식물이 생장하는 토양에는 400 ~ 1200 mg/kg의 인이 포함되어 있다(Rodriguez and Fraga, Biotech. Adv. 1999, 17:319-339).

그러나 토양내 대부분의 인은 불용성 상태이어서 식물은 사용할 수 가 없다. 즉, 토양내 인은 화학적으로 공고하게 결합된 불용성 복합체나 유기적으로 결합된 파이테이트(phytate)와 같은 상태로 존재하여 식물이 사용할 수 없는 불용성 인산염으로 존재한다(Paul and Clark, Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press, San Diego, CA, 1996).

따라서, 자연상태의 토양에서 가용할 수 있는 인은미량영양원소들(micronurtients)의 농도보다도 적은 양으로 존재하고 있다. 결국, 가용성 인의 농도가 토양에서 식물의 생장과 발육의 증진에 있어 제한요소인 것이다. 더욱이, 토양에 가용성 인이 든 무기인산비료를 공급하면 이들 중 75 % 이상이 매우 빠르게 불용성 인산염 상태로 변화되어, 식물은 공급된 가용성 인의 25 % 이하만을 사용할 수 있다(Goldstein, Am. J. Altern. Agric. 1986, 1:51-57).

따라서, 농부들은 가용성 인의 부족에 따른 식물의 생장 및 발육의 저하를 막고자 계속해서 과도한 무기인산비료를 농토에 공급하는 과도한 시비를 반복하게된다. 그러나, 이렇게 과도한 시비로 공급되는 대부분의 가용성 인은 농토에서 다량의 불용성 인산염으로 변화되고 이것이 축적되어 결국은 식물의 생장 및 발육이 정상적으로 이루어지지 않는 염류장해 토양이 된다.

더욱이 이런 염류장해토양은 고부가가치의 작물을 생산하는 시설재배지에서 더욱 자주 발생하여 농업생산성 및 농업경제에 있어 매우 큰 문제가 되고 있다.

그러나, 다행스럽게도 토양에는 이러한 불용성 인산염을 가용화 상태로 전환 하는 미생물들이 있음이 알려졌다. 이들 불용성 인산염을 가용화하는 미생물(phosphate solubilizing bacteria, PSB)은, 식물의 근권부에서 유기산을 분비하거나 특정 효소를 분비하여 토양의 불용성 인산염을 가용화 인으로 전환시켜 식물이 흡수하여 사용할 수 있도록 하는 일종의 공생관계를 유지하는 것으로 추정되고 있다(Goldstein, Am. J. Altern. Agric. 1986, 1:51-57).

PSB 미생물은 슈도모나스(Pseudomonas), 바실러스(Bacillus), 라이조비움 (Rhizobium), 부르크홀데리아(Burkholderia), 아크로모박터(Achromobacter), 아그로박테리움(Agrobacterium), 마이크로코코스(Microccocus), 아에레오박터 (Aereobacter), 플라보박테리움(Flavobacterium)과 에위니아(Erwinia)에 속하는 몇몇 종들에서만 발견되었다.

이들의 불용성 인산염 가용성 스펙트럼을 조사한 결과, 특정 불용성 인산염에 대해서만 가용성이 있거나 혹은 그 가용성 이 광범위한 경우 전반적으로 낮은 활성을 보였다(Illmer and Schinner, Soil Biol. Biochem., 1992, 24:389-395; Rodriguez et al., Rev. ICIDCA, 1996, 30:47-54; Arora and Gaur, Indian J. Exp. Biol., 1979, 17:1258-1261; Halder and Chakrabartty, Folia Microbiol.,1993, 38:325-330).

PSB 미생물은 토양 내에 존재하기는 하지만 항상 그 세포수가 식물 근권을 형성하는 다른 미생물들과 경쟁하여 우점할 정도로 충분히 높지 않다. 따라서, 토양내 PSB 미생물들이 불용성 인산염을 분해하여 만드는 가용성 인의 양은 식물의 생장과 발육을 증가시킬 정도로 높지 않다. 그러므로 인위적으로 다량의 PSB 미생물을 토양에 접종할 경우 식물의 생장과 발육을 증가시킬 수 있는 유용성이 있다.

이처럼 불용성 인산염 가용화 미생물을 사용하여 식물 생장을 증진시키고자하는 연구가 수행되어 효과가 있다고 보고되었다(Kloepper et al., ISI Atlas Sci.Anim. Plant Sci., 1988, pp. 60-64; Chabot et al., Appl. Environ. Microbiol., 1996, 62:2767-2772).

기존에 알려진 불용성 인산염 가용화 미생물 외에 신규한 불용성 인산염 가용화 미생물(PSB)을 발굴해내는 노력이 경주되어 라넬라 아쿠아틸리스(Rahnellaaquatilis)가 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)를 가용화 할 수 있음이 보고되었고(Kim et al., FEMS Microbiol. Lett., 1997, 153:273-277), 관련 유전자인 pqq도 확인된 바 있다(Kim et al., FEMS Microbiol. Lett., 1998, 159:121-127).

또한, Kim 등은 엔테로박터 아글로메란스(Enterobacter agglomerans)도 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)를 분해하여 가용성 인을 생성할 수 있음을 확인한 바 있다(Kim et al., Soil Biol. Biochem., 1998, 30:995-1003).

한편, 한국공개특허공보 특2002-0017516(화산회 토양에 고정된 인산염을 가용화하는 새로운 미생물)에는 화산회 토양에 고정된 인산염을 가용화시키는 바실러스 스패리쿠스 PSB-13에 관한 것이 공개되어 있다.

그러나, 여전히 작물재배 토양내의 불용성 인산염을 가용화 하는 새로운 균주의 개발이 요구되고 있다.

본 발명의 목적은 작물재배 토양의 불용성 인산염을 보다 높은 효율로 가용화하는 신규의 미생물 균주를 제공하는 데 있다.

또한, 신규 균주를 이용하여 작물재배 토양의 불용성 인산염을 가용화하는 방법을 제공하는데 있다.

도 1은 본 발명의 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8의 불용성 인산염 가용화능을 나타낸 사진.

위: 하이드록시아파타이트에 대한 가용화능.

아래: 3인산칼슘에 대한 가용화능.

도 2는 본발명의 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8의 계통분류학적 근연도를 나타낸 그림.

도 3은 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8을 염류장해토양에 접종한 후 전기전도도의 변화를 나타낸 그래프.

도 4는 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8을 염류장해토양에 접종한 후 인(Pi)의 농도변화를 나타낸 그래프.

도 5는 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8을 토양 처리한 결과 식물의 생장증진 효과를 보여주는 사진.

A: 상추 배양 사진 B: 배추 배양 사진

Control : 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8을 접종하지 않은 경우.

KSJ8 : 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8을 접종한 경우.

본 발명의 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8은 토양내에 있는, 불용성 인산염인 3인산칼슘, 하이드록시아파타이트, 인광석, 파이테이트 등을 생물이 사용하는 가용성 인산 이온으로 만들어주어, 식물의 생장을 증진시킨다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 불용성 인산염 가용화능이 높은 균주를 선발하기 위하여, 토양으로부터 분리한 미생물을 불용성 인산염들(3인인산칼슘, 하이드록시아파타이트, 인광석, 파이테이트)이 각각 포함된 고체배지에 접종하여 배양하였을 때 나타나는 고체배지의 투명환 크기를 분석하여 불용성 인산염의 가용화능이 높은 균주를 선발하였다.

선발된 균주에서 수득한 16S 라이보좀 DNA의 상동성을 비교분석하고, 생물학적 특성을 조사한 바, 레클레르시아 아데카르복실라타(Leclercia adecarboxylata) 의 신규한 균주로 밝혀져, 이를 레클레르시아 아데카르복실라타(Leclercia adecarboxylata) KSJ8로 명명하고, 이 균주를 특허출원을 위한 국제미생물기탁기관인 한국생명공학연구원 유전자은행에 2002년 11월 28일 수탁번호 KCTC 10388BP로 기탁하였다.

본 발명의 발명자들이 연구하여 개발한 동일자 출원하는 엔테로박터 인터메디우스(Enterobacter intermedius) KSJ16과는 토양내 불용성 인산염을 가용화하는 기능과 생리생화학 특성은 유사하나 DNA의 염기서열과 계통분류학적 근연도를 조사한 결과 다른속, 다른종임이 밝혀졌다.

본 발명의 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8은 그램음성 세균이며 막대형이고 운동성이 있다.

본 발명의 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8은 에스쿨린(esculin)과 젤라틴(gelatin)을 가수분해하며, 트립토판(tryptophan)을 가수분해하여 인돌(indole)을 생산하며, 카탈라제(catalase)와 옥시다제(oxidase)의 활성도 가지고 있다. 또한 시트레이트(citrate), 페닐알라닌(phenylalanine)과 락토오즈(lactose)를 사용할 수 있고 포도당 발효에 의해 유기산을 생성한다.

상기 결과로부터 본 발명의 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8는 광범위한 불용성 인산염의 가용화능이 높기 때문에 염류 장해토양의 개선 및 식물생장증진에 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8을 이용하여 장해토양의 개선 및 식물의 생장을 증진시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 균주를 이용하여 장해토양을 개선하고 식물생장을 증진시키는 방법은, 트립토판-이스트(TYE) 액체배지에서 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8을 배양하는 제 1단계와, 배양된 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8을 염류장해토양에 접종하여 식물의 생장을 증진하는 제 2단계로 구성되어 있다.

상기 1 단계의 배양시 25 ~ 30 ℃에서 2 일간 배양한다.

배양된 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8을 증류수나 NaCl 0.8 %의 등장액으로 세척하여 보관한다.

보관된 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8을 1x10⁷cfu/ml 농도로 염류장해토양에 1 주일에 1 회씩 2 회 접종한 후 상토에서 발아한 작물을 이식하여 생육한다.

작물 이식 후 계속하여 1 주일 간격으로 4 주간 더 본 발명의 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8을 접종한다.

상기의 방법으로 본 발명의 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8을 접종하면 염류장해토양에서도 정상적인 작물의 생장과 발육이 이루어진다(도5 참조).

이하 실시예와 실험예에 의하여 본 발명을 상세히 설명하나, 이들에 의해 본 발명의 내용이 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> 균주의 선발

국내에서 채집한 토양을 2 mm 체에 걸러 미생물 추출원으로 사용하였다.

습윤토양 5 g에 25 % Ringer's 용액 50 ml을 넣고 2 분간 진탕한 후, 1 시간 교반하였다.

교반한 토양 시료를 5 분간 초음파 처리를 3 회 반복하여 토양입자로부터 미생물을 탈락시켰다.

10 분간 1,500 rpm으로 원심분리한 후, 상등액을 불용성 인산염 가용화 미생물의 탐색 시료로 이용하였다.

상기 분리한 미생물을 최소배지인 MOPS 배지에 불용성 인산염(3인산칼슘과하이드록시아파타이트)이 각각 포함된 고체배지에 접종하여 배양하였다.

배양 후 고체배지에 투명환을 나타내는 불용성 인산염 가용화 균주를 순수 배양하였다.

순수 배양된 균주를 상기의 불용성 인산염 고체배지에 각각 접종하여 각 균주의 불용성 인산염 가용화 범위를 조사하였다.

투명환의 크기를 분석하여 불용성 인산염의 가용화능이 높은 균주를 분리하였다(도1 참조).

<실험예 1> 분리된 균주의 염기서열과 기존 균주와의 유전유사도 조사

실시예 1에서 선발한 균주의 유전체(genomic DNA)를 CTAB 용액을 이용하여 분리하였다.

16S 라이보좀 DNA(rDNA)을 PCR을 이용하여 증폭하여 클로닝하고 그 염기서열을 결정하였다.

그 결과 본 균주의 염기서열은 첨부한 서열목록의 서열번호 1 과 같이 나타났다.

결정된 16S rDNA의 염기서열을 NCBI의 유전자은행에 등록된 균주들과 비교하여 계통수와 유전유사도를 조사하고 그 결과를 도 2에 나타냈다.

도 2에서 보는 바와 같이 선발된 균주는 레클레르시아 아데카르복실라타의 신균주로 나타났다.

본 발명자들은 선발된 균주를 레클레르시아 아데카르복실라타(Leclerciaadecarboxylata) KSJ8로 명명하고, 이를 2002년 11월 28일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10388BP).

<실험예 2> 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8 균주의 효능 실험

본 발명의 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8에 대해, Benson(1990, Microbiological Applications: A Laboratory Manual in General Microbiology, WCB Publishers, Dubuque)과 한국미생물학회(1998, 미생물실험서, 한국미생물학회, 을유문화사)의 방법에 따라 생리생화학적 특성을 조사하였다.

그 결과, 본 발명의 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8은 운동성이 있는 세균이었으며, 에스큘린(esculin)을 분해하는 에스큘리나제(esculinase) 활성이 있고, 유해한 과산화수소를 전환하는 카탈라제(catalase)의 활성이 있었다.

또한, 시트레이트(citrate)를 탄소원으로 사용할 수 있으며, 젤라틴(gelatin)을 가수분해하는 등의 단백질 분해능이 있으며, 트립토판(tryptophan)을 아미노산 재료로 사용하여 인돌(indole)을 생산하였다.

사이토크롬 옥시다제(cytochrome oxidase)의 활성도 있어 호기성세균임을 알 수 있었으며, 페닐알라닌(phenylalanine)을 분해하여 페닐피루빅 에시드(phenylpyruvic acid)를 생산하는 페닐알라나제(phenylalanase)의 활성이 있었고, 락토오즈(lactose)를 분해하는 베타-갈락토시다제(β-galactosidase)의 활성도 있었다.

또한, 포도당을 발효하여 유기산을 생성하는 균주임을 메틸 레드시험(methyl red test)를 통해 확인하였다.

그러나, 보게스-프로스카우어 시험(Voges-Proskauer test) 결과, 포도당을 발효하여 acetyl-methyl-carbinol(acetoin)이나 2,3-butandiole을 생성하지 못하였으며 녹말을 분해하는 아밀라제(amylase)의 활성이 없음을 확인하였다.

또한, 그램염색 결과 본 발명의 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8은 막대형의 그램음성 세균임을 확인하였다.

<실시예 2> 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8 균주의 활용

트립토판-이스트(TYE) 액체배지를 시중에서 구입하여 준비하였다.

실시예 1에서 얻은 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8을 2 일간 25 ~ 30℃에서 배양했다.

배양된 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8 미생물을 NaCl 0.8 %의 등장액으로 세척하여 보관했다.

준비해놓은 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8을 염류장해토양에 1×10⁷cfu/㎖의 농도로 1 주일에 1 회씩 2 회 접종하였다.

상토에서 발아한 작물을 이식한 후, 1 주일에 1 회씩 4주 간 더 접종하여,

염류장해토양에서의 작물에 본 발명의 미생물을 활용하여 토양을 개선시켰다.

<실험예 3> 염류장해토양 개선 및 식물생장증진 효과

본 발명의 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8을 2 일간 30 ℃에서 배양한 다음, 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8을 1x10⁷cfu/ml의 농도로 50 ml의 증류수에 희석하여 150g의 염류장해토양에 접종한 후, 전기전도도의 변화를 조사하였다.

대조군은 증류수만을 처리하였다.

전기전도도를 측정하기 위한 토양용액은 토양과 수분의 비율이 1 : 5가 되도록 증류수를 첨가하여 2 ~ 3시간 방치한 후, 여과 침출하여 사용하였다.

그 결과, 접종전 염류장해토양의 전기전도도가 11.0 ds/m 이던 것이, 접종 후부터 전진적으로 낮아져 4 일 이후부터는 7.0 ds/m 이하로 나타났다(도3 참조).

상기의 결과로부터, 본 발명의 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8 균주는 염류장해토양의 전기전도도를 낮추는 개선 효과가 있음을 알 수 있었다.

<실험예 4> 가용화 인의 함량 변화 조사

염류장해토양의 수용성 가용화 인의 함량을 조사하기 위하여 10g의 염류장해토양에 50ml의 증류수를 첨가하여 3시간동안 진탕한 후 여과하여 토양용액으로 사용하였다.

인산의 양은 아스코르브산에 의한 몰리브텐 청법을 사용하여 측정하였다.

실험군의 경우는 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8을 1x10⁷cfu/ml의 농도로 50 ml의 증류수에 희석하여 150g의 염류장해토양에 접종한 후 24시간마다 10g의 처리토양을 취하여 대조군의 경우와 같이 50ml의 증류수를 첨가하여 3시간 동안 진탕한 후 여과하여 토양용액으로 사용하였다.

인의 측정은 역시 이스코르브산에 의한 몰리브텐 청법을 사용하여 측정하였다.

그 결과, 염류장해토양의 가용화 인의 함량은 25 ㎍/g이였는데 비해서 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8 균주를 접종한 경우는 처리 후 4일간은 대조군의 2배 이상의 수용성 가용화 인이 형성되었으며 5일째는 35 ㎍/g으로 낮아졌다.

그러나, 6-7일에는 다시 증가하여 50 ㎍/g 이상으로 나타났으나 8일째에는 38 ㎍/g으로 낮아졌다 (도 4 참조).

상기의 결과로부터, 본 발명의 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8 균주는 염류장해토양으로부터 다량의 수용성 가용화 인을 생산하는 생인산비료세균(biofertilizer)임을 알 수 있었다.

<실험예 5> 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8 균주의 작물생장증진효과 실험

본 발명의 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8 균주의 작물생장증진효과를 상추, 배추와 고추를 대상으로 pot 실험을 통해 조사하였다.

각각의 종자를 상토에서 발아시켜 본잎이 2장 나왔을 때 가로 55cm, 세로 45cm, 높이 15cm 크기의 스치로폴 용기에 담은 염류장해토양에 이식하였다.

여기에 본 발명의 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8 균주를 1주일에 1회 처리하였다.

사용된 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8 균주는 100 ml의 트립토판-이스트(TYE)배양액에서 18시간 배양하여 원심분리하여 모은 후 증류수로 2회 세척하고 200ml의 증류수에 현탁한 것을 1회 처리용으로 사용하였다.

상추의 경우는 3회 처리한 후 수확하였고 배추는 4회 처리한 후 수확하였다.

마지막 처리 후 1주일 후에 작물의 생장 및 발육 상태를 조사하였다.

작물의 배양을 위해서 1일 1회 충분한 물을 공급하였으며 비료나 농약 등의 처리는 하지 않았다.

대조군은 증류수만을 동일한 시기에 처리하였다.

그 결과, 염류장해토양에 이식한 대조군에 비해서 본 발명의 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8 균주를 접종한 경우에는 육안으로도 분명히 구분되는 작물의 생장 및 발육의 증가를 확인할 수 있었다. (도 5 참조).

배추와 상추의 총무게, 뿌리무게, 엽수, 초장, 엽면적, 엽록소의 양을 비교하여 표 1과 같이 나타내었다.

<표 1> 작물의 생육 증진 효과

작물	구분	생체중(g)	뿌리무게(g)	옆수(장)	초장(cm)	옆면적(cm²)	엽록소(**)
배추	대조군	189.35	2.20	17	32.5	2512.70	34.12
배추	KSJ8	338.24	4.52	21	38.5	4530.09	40.20
상추	대조군	17.38	2.47	13	13.7	428.70	31.44
상추	KSJ8	92.23	8.20	21	22.6	2135.43	27.21

표 1에서와 같이 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8 균주를 처리한 작물은 염류장해토양에서 배양한 대조군에 비해 뿌리의 무게가 2배이상 증가되었으며 그외의 수치들도 염류장해토양에서 작물이 정상적으로 발육됨을 보여주었다.

특히, 상추의 경우 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8 균주에 의해 염류장해를 극복하는 효과가 더욱 뛰어남을 알 수 있었다.

상기의 결과로부터, 본 발명의 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8 균주는 염류장해토양에서 작물의 생장 및 생육을 증진시키는 식물생장증진근권세균(PGPR)임 알 수 있었다.

본 발명에 의해 토양내 불용성 인산염을 가용화 하는 레클레르시아 아데카르복실라타 KSJ8 균주가 제공된다.

또한, 본 발명의 균주를 토양에 처리하여 식물생장을 촉진하는 방법이 제공된다.

Claims

불용성 인산염을 가용화하는 균주 레클레르시아 아데카르복실라타 (Leclercia adecarboxylata) KSJ8(KCTC 10388BP).
제 1항의 균주를 작물 재배 토양에 접종하여 토양내 불용성 인산염을 가용화하여 작물의 생육을 촉진하는 방법.