CN114933969B - 一株具有促进植物种子萌发和幼苗生长作用的纤毛虫原生动物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一株纤毛虫原生动物，其对植物种子萌发、生长有明显促进作用。所述的纤毛虫，为肾形虫(Colpoda sp.)JH2‑5‑4株，其保藏编号为CCTCC NO：C202229。本发明在采集了2000多株来自全国各地土壤的肾形虫后，经过植物种植实验筛选出可用作微生物肥料的高效活性株，所筛选的纤毛虫可显著缩短植物种子的萌发时间，促进幼苗成活率。
Description
技术领域
本发明属于微生物肥料技术领域，具体涉及一株具有促进植物种子萌发和幼苗生长作用的纤毛虫原生动物。
背景技术
我国作为农业大国，全国粮食播种面积达17.64亿亩，占全世界现有耕地面积的7％左右。而化肥作为粮食产量的保证，在我国农业生产过程中起到重要的作用，我国化肥年产量可达5395.8万吨。但化肥滥用会导致农业污染问题，破坏土壤和污染水源，威胁生态环境和人类健康。因此化肥的合理使用也受到越来越多的关注。而开发微生物肥料等有机肥来取代化肥已成为种植业的研究热点之一。
微生物肥料也称微生物菌肥，主要成分为放线菌、光合细菌、芽孢杆菌、解磷、解钾细菌等，微生物肥料中的功能微生物可以消耗和利用生活垃圾和农业污染物，增加土壤肥力，改善土壤状态，减少环境污染。目前我国微生物肥料累积应用面积仅3亿亩，且肥料生产存在产品活菌数低、种类少、效果不稳定、成本和价格较高等问题。并且目前微生物肥料菌种的开发和应用基本局限于细菌和真菌，而对于土壤微生物中具有高的生态多样性，高生物活性的原生动物纤毛虫类并没有开发制成微生物肥料的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有促进植物种子萌发和幼苗生长作用的纤毛虫原生动物，且对植物种子萌发、生长有明显促进作用，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供纤毛虫的一种用途，所述的用途是在制备微生物肥料中的应用。
作为实施例的具体记载，所述的纤毛虫，为肾形虫(Colpoda sp.)JH2-5-4株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO.：C202229，保藏日期为2022年3月15日，保藏地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心。
所述的肾形虫(Colpoda sp.)JH2-5-4株，其28S rDNA为SEQ ID NO:1；18S rDNA为SEQ ID NO:2。
本发明再一个方面还提供一种微生物肥料，其中包含有上述的肾形虫(Colpodasp.)JH2-5-4株。
本发明还提供所述的纤毛虫在促进植物种子萌发和幼苗生长中的应用。
所述的植物，作为实施例的具体记载，为拟南芥。
本发明在采集了2000多株来自全国各地土壤的肾形虫后，经过植物种植实验筛选出可用作微生物肥料的高效活性株，所筛选的纤毛虫可显著缩短植物种子的萌发时间，促进幼苗成活率。
附图说明
图1：JH2-5-4形态学特征照片图，其中A和B为不同的生活史状态中的营养体和休眠包囊，Bar为10μm；
图2：28S rDNA通用引物PCR扩增产物的电泳图谱图，其中电泳图的左侧泳道为DNAmarker DL2000(从上到下2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)；右侧泳道为28SrDNA扩增的目的片段；经PCR扩增后用1％的琼脂糖凝胶电泳25min可观察到明亮的条带，片段长度约为1800bp左右；
图3：18S rDNA通用引物PCR扩增产物的电泳图谱图，其中电泳图的左侧泳道为DNAmarker DL2000(从上到下2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)；右侧泳道为18SrDNA扩增的目的片段；经PCR扩增后用1％的琼脂糖凝胶电泳25min可观察到明亮的条带，片段长度约为1800bp左右；
图4：对照组拟南芥生长过程，A、B、C、D分别为不同时间点照片，依次是20211006、20211026、20211008、20211124；
图5：肾形虫JH2-5-4(采集自云南迪庆)影响拟南芥生长的过程图，A、B、C、D分别为不同时间点拍摄图，依次是20211006、20211026、20211008、20211124；
图6：肾形虫PJ01A01(采集自黑龙江鹤岗)影响拟南芥生长的过程图，A、B、C、D分别为不同时间点拍摄图，依次是20211006、20211026、20211008、20211124；
图7：肾形虫LHA0612(西藏那曲崩错)影响拟南芥生长的过程图，A、B、C、D分别为不同时间点拍摄图，依次是20211006、20211026、20211008、20211124；
图8：肾形虫RZ04A(山东青岛)影响拟南芥生长的过程图，A、B、C、D分别为不同时间点拍摄图，依次是20211006、20211026、20211008、20211124。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1：肾形虫JH2-5-4的分离、鉴定
分别在中国的不同省份地区采集大约200g土，取其中2克，用纱布包裹后，使用灭菌三蒸水浸泡。土壤浸泡大约24h，使用口吸管对土壤浸出液中的纤毛虫进行分离。在分离过程中使用双抗溶液(青霉素-链霉素)清洗两次，灭菌三蒸水清洗一次。清洗完成后，使用分光密度OD＝0.2(波长600nm)的大肠杆菌菌液喂食，25℃恒温培养。
采集自云南迪庆地区的JH2-5-4株系，其营养体呈肾形；口近侧缘，在纤毛前庭底部具有胞口；口前的边缘呈锯齿状；除了2根较长的尾纤毛外，其他纤毛长度均一致(图1A)。JH2-5-4株系的休眠包囊干燥后呈圆球形，常大量聚成一团(图1B)。
提取该株系的基因组DNA，经过28S rDNA和18S rDNA序列扩增测序，通过NCBI比对鉴定后，确定为肾形虫，命名其为肾形虫(Colpoda sp.)JH2-5-4株。该株系保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.：C202229，保藏日期为2022年3月15日，保藏地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心。
引物序列为F3：5'-ACSCGCTGRAYTTAAGCAT-3'；R2：5'-AACCTTGGAGACCTGAT-3'，进行28S rDNA的PCR扩增，扩增片段为1812bp(图2)，序列如下：
5'-TGAGATCAACTCTTACTTGGATTTTCAAGGGTCGTCACGAGCGCACCTAACATCGCATAGAGTGCGATGCTCTTCCTGACATATAGCCTTCGCTCTGGATAATCCAATTTCAAGGCGGTAGTCAGTTAAAAAGAAAAGATAACTCTTCTAGGGGCACATGCCGACGTCTCCAAGCTCGCTTTGAAGTGTTACCACAAAATCCACGTCCTACTTCAGGAATATTAACCTGATTCCCTTTTGATATCGCGTAGTCAAGCTACGAACGTATATAAAGAAGGAATTTCCCTATATCTTAGGATCGAGTAACCCATGACCAATTGCTGTTCTCATGGAACCCTCCTCCACTTCGGCCTTCAAAGTTCTCATTTGAATATTTGCTACTACCACCAAGATCTGCACTAGAGGCAGTTCCACCCAAGCTCACGCTAAAGGCTTCTACACTTGCCCCCACGCCCTCTTACTCATTAGTGCCTCATATTAAATTTGCACTAATGGTTGAGTATCGGCAGCACGCTTCAGCGCCATCAATTTTCAGGGCTAATTCATTCGGCAGGTGAGTTGTTACACACTCCTTAGCGGGTTCCGACTTCCATGGCCACCGTCCTGCTGTCTTTATGAATCAACACCTTTTATGGTATCTGATGAGCGTGCATTTGGGCGCCTTAACTCAACGTTAGGTTCATCCCTCATCGCCAGTTCTGCTTACCAAAAACGGCCCACTTAGAACGATACATTCTGCCCTAGAGTTCAGTTAAGAAAACTCGAGGTTCTTACCAATTTAAAGTTTGAGAATAGGTCAAAGGTGTTTCACCTCTGATGCCTCTAATCATTCGCTTTACCTAATAAAACTGCATATACGTTCCAGCTATCCTGAGAGAAACTTCAGAGGGAACCAGCTACTAGATGGTTCGATTAGTCTTTCGCCCCTATACTCAAGTTTGACGAACGATTTGCACGTCAGTATCGCTACGAGCCTCCACCARAGTTTCCCCTGGCTTCACCCTACTCAAGCATAGTTCACCATCTTTCGGGTCCTACCAAATATGCTCTTACTCGAACCTTTCACAAAAGATCATGGTCGGTCGATGCTGCGGGAGTTCGGCGTACCTCACCCCTTGGCACCTTATACTTACTTTCATTAAGCCTATGAGTTTTTGCACTCGCAAACTCGCATATGTGATAGACTCCTTGGTCCGTGTTTCAAGACGGGTCAGTACAAGCCGTTGTGGCAGGACCTATTTCCTCAGGCCAGTTTACTGTTTTGAAGGGAGATTCTACCAGAAGGCAGGGCTTTCTCCCAACTGACTCCAGCAAAATGAGACCTGGTCCTGCCCTTTAACTATGAAATCCCGATAGAGTGCCATTACATCGTAGCAGCTAGCCAATAACGTACATTACTACTACGAGCTGGTTCCTCACATCGGTTGCTTCATAGCTAACATAAATCCACTTGTACTGCTTCCTCCTCAACGATTTCAAGTCTTTTAACCCTCTTTTCAAAGTTCTTTTCACCTTTCCTTCACAGTACTTGTTCGCTATCGGTTTCCCATAGATATTTAGCTTTAGAAGAAGTTTATCTCCCATTTAGGGCTGCAATCCCAAACAACCCGACTCTTAGATAAATAACATTCGGTTCAATGGAAGCTACATACGGGATTTTCACCCTCTATGATGTCCTGTTCCAAGGAACTTATGCTTCCAAATCCCCTGTTGTTACTCACTTTAGATTACAATTCGAAAACCGAGACGGCCTCCGATTCTAAACTTGAGCTATTGCCGCTTCACTCGCCGCTACTGAGGCAATCTTCGTGA-3'(SEQ ID NO:1)；
EukA：5'-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3'；EukB：5'-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3'，进行18S rDNA的PCR扩增，扩增片段为1713bp(图3)，序列如下：
5'-GGAACCATGTCACTTCTCCTTCCTCTAGTGATAAGGTTTACTTCTATTCCCACGATCGGGTCAAGCCCGGCCACGGTCCTTTAGGTTCACCGGACCACTCAAAATCGGTAGGAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCAGCACAAGCTGATGACTTATGCTTACTAGGAATTCCTCGTTCAAGATCTATAATTCCAAAGATCTATCCCTAGCACGACATACATTATACAAGATTACCCGTACTCTTCCGAGACAGGAAAGTAAAGCTTGTTGCATATGTCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGGACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCTCAAACTTCCTTGTGCTTGCACACAAAGTCCCTCTAAGAAGTTAGCCTCCTATTTACATAGAAGTAACTAGTTAGCAGGTTAAGGTCTCGTTCGTTAACGGAATTAACCAGACAAATCACTCCACCAACTAAGAACGGCCATGCACCACCACCCATAGAATCAAGAAAGAGCTTTCAATCTGTCAATCCTAACTATGTCTGGACCTGGTAAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACTCCTGGTGGTGCCCTTCCGTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCAGAACCCAAAGACTTTGATTTCTCATAAGGTGCTGATGAGGCTTAAGAAACCTCACCAATCCCTAGTCGGTATAGTTTATGGTTAAGACTAGGACGGTATCTGATCGTCTTTGATCCCCTAACTTTCGTTCTTGATTAATGAAAACATCCTTGGCAAATGCTTTCGCATAAGTTCGTCTTTAATAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAATTAAATACGGATGCCCCCAACTGTCCCTATTAATCATTACTTTGACCTCAAGAAACCAACAAATAGGTCAAAGTCCTATTCCATTATTCCATGCTGCAGTATCCAAGCAATTGCCTGCCTGAAACACTCTAATTTTTTCAAAGTAAAGTGTATGATCCACTAGCCGACCACTGAAGGACGTGCTAGCTTCCCATACGGATGACCAGGCTCCTGAACCGACTGCGAGAGCCGTGAACAGCGCCGGCCAGAAATTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTACTCGATAAGTGGTTTAAATTGTTCTCATTGCAATCTCGCAACCCCATGTGGGGCCCGAGTTGTTATTTCTTGTCACTACCTCCCTGAATTAGGATTGGGTAATTTACGCGCCTGCTGCCTTCCTTAGATGTGGTAGCCATTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTGATCGCCATGGTAGTCCAATACACTACCATCGAAAGCTGATAGGGCAGAAACTTGAACGATTCGTCGCGGCGAGGCCGCGATCCGCTCAGTTATTATGAATCATCACTATCCTGTTGCCAGGGTTAGTTTAATATCTAATAAATACAACCCTTCCGAAAAGTCAGGTTTGACAGCATGTATTAGCTCTAGAATTACTACGGTTATCCATGTAGAAGAAAATAATCGAATAAACTATAACTGTTTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCGCTGTATATAACTTATACTTAGACATGCAGGCGTAGTCATAGCC-3'(SEQ ID NO:2)。
实施例2：肾形虫JH2-5-4促进植物种子发芽研究
在分离的众多肾形虫株系中，根据气候差异，挑选了山东青岛、黑龙江鹤岗、西藏那曲崩错、云南迪庆这4个地区的肾形虫进行植物种植实验测试。
拟南芥种子在4℃暗培养7天，使发芽同步化。种子在75％的酒精中消毒10分钟后，在0.1％琼脂糖中重悬。泥炭和适量的三蒸水混合均匀，进行高压蒸汽灭菌，去除土壤原有生物。将纱布裁剪成合适大小，放置于花盆底部，将吸水后的泥炭分装至花盆中备用。使用移液枪每次吸取1颗种子种植在花盆中，每个花盆种植9颗种子，共20个重复花盆。对照组仅添加与处理组对应体积和密度的大肠杆菌菌液，实验组则在含有种子的花盆中添加20,000只肾形虫。将花盆贴上标签，实验组和对照组分别集中分布在两个托盘中。放置在不同培养箱中，25℃，16/8h(光照/黑暗)，湿度65％，光照强度4950lux。培养期间观察土壤状况并对植株进行拍照记录，适量浇水，同时每隔2周给植物浇灌1/10MS培养基，为植物添加少量矿物营养。
结果发现来自于云南迪庆地区的肾形虫提高拟南芥的发芽率效果最好，发芽率高达87.77％(表1)。
表1：不同地区筛选的肾形虫提高拟南芥的发芽率的数据表
实施例3：肾形虫JH2-5-4促进植物生长研究
将肾形虫JH2-5-4与山东青岛、黑龙江鹤岗、西藏那曲崩错这三个地区的肾形虫进行植物种植实验对比测试。
拟南芥种子在4℃暗培养7天，使发芽同步化。种子在75％的酒精中消毒10分钟后，在0.1％琼脂糖中重悬。泥炭和适量的三蒸水混合均匀，进行高压蒸汽灭菌，去除土壤原有生物。将纱布裁剪成合适大小，放置于花盆底部，将吸水后的泥炭分装至花盆中备用。使用移液枪每次吸取1颗种子种植在花盆中，每个花盆种植1颗种子，共9个重复花盆。对照组仅添加与处理组对应体积和密度的大肠杆菌菌液，实验组则在含有种子的花盆中添加20,000只肾形虫。将花盆贴上标签，实验组和对照组分别集中分布在两个托盘中。放置在培养箱中，25℃，16/8h(光照/黑暗)，湿度65％，光照强度4950lux。培养期间观察土壤状况并对植株进行拍照记录，适量浇水，同时每隔2周给植物浇灌1/10MS培养基，为植物添加少量矿物营养。
对拟南芥的生长状态的记录可以看出，添加了肾形虫JH2-5-4的拟南芥植株生长速度均显著优于对照组(图4-图8)。
因此，本发明所筛选的肾形虫JH2-5-4株可显著促进植物发芽和生长，可用作微生物肥料中的活性非菌类微生物。
序列表
<110> 中国海洋大学
<120> 一株具有促进植物种子萌发和幼苗生长作用的纤毛虫原生动物
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1812
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgagatcaac tcttacttgg attttcaagg gtcgtcacga gcgcacctaa catcgcatag 60
agtgcgatgc tcttcctgac atatagcctt cgctctggat aatccaattt caaggcggta 120
gtcagttaaa aagaaaagat aactcttcta ggggcacatg ccgacgtctc caagctcgct 180
ttgaagtgtt accacaaaat ccacgtccta cttcaggaat attaacctga ttcccttttg 240
atatcgcgta gtcaagctac gaacgtatat aaagaaggaa tttccctata tcttaggatc 300
gagtaaccca tgaccaattg ctgttctcat ggaaccctcc tccacttcgg ccttcaaagt 360
tctcatttga atatttgcta ctaccaccaa gatctgcact agaggcagtt ccacccaagc 420
tcacgctaaa ggcttctaca cttgccccca cgccctctta ctcattagtg cctcatatta 480
aatttgcact aatggttgag tatcggcagc acgcttcagc gccatcaatt ttcagggcta 540
attcattcgg caggtgagtt gttacacact ccttagcggg ttccgacttc catggccacc 600
gtcctgctgt ctttatgaat caacaccttt tatggtatct gatgagcgtg catttgggcg 660
ccttaactca acgttaggtt catccctcat cgccagttct gcttaccaaa aacggcccac 720
ttagaacgat acattctgcc ctagagttca gttaagaaaa ctcgaggttc ttaccaattt 780
aaagtttgag aataggtcaa aggtgtttca cctctgatgc ctctaatcat tcgctttacc 840
taataaaact gcatatacgt tccagctatc ctgagagaaa cttcagaggg aaccagctac 900
tagatggttc gattagtctt tcgcccctat actcaagttt gacgaacgat ttgcacgtca 960
gtatcgctac gagcctccac caragtttcc cctggcttca ccctactcaa gcatagttca 1020
ccatctttcg ggtcctacca aatatgctct tactcgaacc tttcacaaaa gatcatggtc 1080
ggtcgatgct gcgggagttc ggcgtacctc accccttggc accttatact tactttcatt 1140
aagcctatga gtttttgcac tcgcaaactc gcatatgtga tagactcctt ggtccgtgtt 1200
tcaagacggg tcagtacaag ccgttgtggc aggacctatt tcctcaggcc agtttactgt 1260
tttgaaggga gattctacca gaaggcaggg ctttctccca actgactcca gcaaaatgag 1320
acctggtcct gccctttaac tatgaaatcc cgatagagtg ccattacatc gtagcagcta 1380
gccaataacg tacattacta ctacgagctg gttcctcaca tcggttgctt catagctaac 1440
ataaatccac ttgtactgct tcctcctcaa cgatttcaag tcttttaacc ctcttttcaa 1500
agttcttttc acctttcctt cacagtactt gttcgctatc ggtttcccat agatatttag 1560
ctttagaaga agtttatctc ccatttaggg ctgcaatccc aaacaacccg actcttagat 1620
aaataacatt cggttcaatg gaagctacat acgggatttt caccctctat gatgtcctgt 1680
tccaaggaac ttatgcttcc aaatcccctg ttgttactca ctttagatta caattcgaaa 1740
accgagacgg cctccgattc taaacttgag ctattgccgc ttcactcgcc gctactgagg 1800
caatcttcgt ga 1812
<210> 2
<211> 1713
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggaaccatgt cacttctcct tcctctagtg ataaggttta cttctattcc cacgatcggg 60
tcaagcccgg ccacggtcct ttaggttcac cggaccactc aaaatcggta ggagcgacgg 120
gcggtgtgta caaagggcag ggacgtaatc agcacaagct gatgacttat gcttactagg 180
aattcctcgt tcaagatcta taattccaaa gatctatccc tagcacgaca tacattatac 240
aagattaccc gtactcttcc gagacaggaa agtaaagctt gttgcatatg tcagtgtagc 300
gcgcgtgcgg cccaggacat ctaagggcat cacagacctg ttattgcctc aaacttcctt 360
gtgcttgcac acaaagtccc tctaagaagt tagcctccta tttacataga agtaactagt 420
tagcaggtta aggtctcgtt cgttaacgga attaaccaga caaatcactc caccaactaa 480
gaacggccat gcaccaccac ccatagaatc aagaaagagc tttcaatctg tcaatcctaa 540
ctatgtctgg acctggtaag tttccccgtg ttgagtcaaa ttaagccgca ggctccactc 600
ctggtggtgc ccttccgtca attcctttaa gtttcagcct tgcgaccata ctccccccag 660
aacccaaaga ctttgatttc tcataaggtg ctgatgaggc ttaagaaacc tcaccaatcc 720
ctagtcggta tagtttatgg ttaagactag gacggtatct gatcgtcttt gatcccctaa 780
ctttcgttct tgattaatga aaacatcctt ggcaaatgct ttcgcataag ttcgtcttta 840
ataaatccaa gaatttcacc tctgacaatt aaatacggat gcccccaact gtccctatta 900
atcattactt tgacctcaag aaaccaacaa ataggtcaaa gtcctattcc attattccat 960
gctgcagtat ccaagcaatt gcctgcctga aacactctaa ttttttcaaa gtaaagtgta 1020
tgatccacta gccgaccact gaaggacgtg ctagcttccc atacggatga ccaggctcct 1080
gaaccgactg cgagagccgt gaacagcgcc ggccagaaat tcaactacga gctttttaac 1140
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tacgcgcctg ctgccttcct tagatgtggt agccatttct caggctccct ctccggaatc 1380
gaaccctaat tccccgttac ccgtgatcgc catggtagtc caatacacta ccatcgaaag 1440
ctgatagggc agaaacttga acgattcgtc gcggcgaggc cgcgatccgc tcagttatta 1500
tgaatcatca ctatcctgtt gccagggtta gtttaatatc taataaatac aacccttccg 1560
aaaagtcagg tttgacagca tgtattagct ctagaattac tacggttatc catgtagaag 1620
aaaataatcg aataaactat aactgtttta atgagccatt cgcagtttcg ctgtatataa 1680
cttatactta gacatgcagg cgtagtcata gcc 1713
Claims (5)
1.一种纤毛虫，其特征在于，所述的纤毛虫为肾形虫(Colpoda sp.)，保藏编号为CCTCCNO：C202229。
2.权利要求1所述的纤毛虫在制备微生物肥料中的应用。
3.一种微生物肥料，其特征在于，所述的微生物肥料中包含有权利要求1所述的纤毛虫。
4.权利要求1所述的纤毛虫在促进植物种子萌发和/或生长中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的植物为拟南芥。
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| CN202210648748.7A CN114933969B (zh) | 2022-06-09 | 2022-06-09 | 一株具有促进植物种子萌发和幼苗生长作用的纤毛虫原生动物 |
| US18/330,402 US20240002307A1 (en) | 2022-06-09 | 2023-06-07 | Ciliated protozoan with the effect of promoting plant seed germination and seedling growth |
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