CN114711146A - 一种紫花苜蓿组培快速分化植株的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种紫花苜蓿组培快速分化植株的筛选方法，包括步骤：(1)选取紫花苜蓿种子，灭菌消毒后移入种子培养基，诱导种子萌发至长出两片子叶；(2)切下子叶移入诱导培养基诱导产生愈伤组织；(3)将(2)中愈伤组织移入丛生诱导培养基，诱导产生丛生芽；(4)将(3)中诱导产生的丛生芽移入生根培养基，诱导其分化生成完整植株；(5)移栽分化所需时间最短的完整植株。本发明获得的组培苗材料能使紫花苜蓿组培繁殖周期从常规的6～7个月缩短到4个月，且分化能力强，能在短时间内得到大量优质的紫花苜蓿植株。
Description
技术领域
本发明涉及植物组培技术领域，尤其是涉及一种紫花苜蓿组培快速分化植株的筛选方法。
背景技术
紫花苜蓿是优质的多年生豆科牧草，产草量高、营养丰富、蛋白含量高、抗性强、适应性广，被誉为“牧草之王”，在现代畜牧业及奶业发展中具有举足轻重的地位。紫花苜蓿还能够固氮增肥、改良土壤及保持水土，具备的生态功能在农业可持续发展方面也具有重要价值。近年来尽管我国紫花苜蓿种植面积逐步扩大，但总产草量仍不能满足国内需求，畜牧业和奶业的发展严重依赖苜蓿商品草的进口。为摆脱苜蓿产业发达国家对我国苜蓿草产业的控制，发展我国苜蓿产业，开展提高紫花苜蓿的产量和品质的研究势在必行。紫花苜蓿组织培养的方法体系，是进行遗传育种、突变体诱变和农杆菌介导的遗传转化等研究实验使用最为广泛和重要的技术过程。紫花苜蓿组培苗获得的时间、质量和效率，直接影响甚至限制了相关研究的开展。参照目前常规的技术方法，紫花苜蓿组培苗的完整获得时间为6～7个月，实验周期长、分化慢、速率低，导致试验投入的时间长、人力和组培成本耗费大，限制了紫花苜蓿分子遗传育种和基因分子功能等方面的研究发展。
中国专利CN102499094A公开了一种提高紫花苜蓿组织培养效率的方法，重点对培养步骤中种子消毒和愈伤组织形成与分化两大技术节点进行改进与创新，通过采用升汞与双氧水复合消毒法，实现既消毒效果彻底，污染率低，又对种子损伤最小的目的，最终解决当前外植体污染严重的问题；同时，首次采用TDZ+6-BA配合使用的方法，不仅可以显著提高愈伤诱导率、形成速率，提高愈伤质量，而且还最大限度保留了愈伤组织的分化能力，促进胚状体芽的形成，从而获得高效、省时、低毒、低褐化的苜蓿组培新技术方法。但是其采用了多种无机化学试剂，易对生物材料紫花苜蓿本身以及对环境产生污染，尤其是其使用了含汞物质，毒性很强，不利于紫花苜蓿材料的生长和利用。
发明内容
针对上述背景中的问题，本发明提供一种紫花苜蓿组培快速分化植株的筛选方法，筛选得到的紫花苜蓿材料组织培养周期从6～7个月缩短到4个月，并且愈伤组织诱导分化能力强，质量好，速度快，以解决紫花苜蓿组织培养周期长、速度慢等问题。
本发明的紫花苜蓿组培快速分化植株的筛选方法，包括以下步骤：
(1)将若干紫花苜蓿种子灭菌消毒，移入种子培养基中，在25℃的培养箱中暗培养2天后，移入光照16h/24℃，黑暗8h/20℃，光照强度4000～4200lx的培养箱培养4～5天，使种子萌发出子叶；
(2)将子叶切下移入诱导培养基诱导产生愈伤组织，在25℃的培养箱中暗培养27～40天，得到愈伤组织；
(3)将得到的愈伤组织移入丛生诱导培养基诱导产生丛生芽，在光照16h/24℃，黑暗8h/20℃，光照强度4000～4200lx的培养箱中培养14～15天，得到丛生芽；
(4)将得到的丛生芽移入生根培养基，在光照16h/24℃，黑暗8h/20℃，光照强度4000～4200lx的培养箱中培养60～77天，得到完整植株；
(5)将(4)中最快分化出的完整植株移栽至营养土中，盖保鲜膜在光照16h/22℃，黑暗8h/20℃，光照强度6700～7500lx的温室中炼苗2天，之后揭掉保鲜膜继续在相同环境中培养。
本发明所述的方法，其中所述紫花苜蓿种子优选的是采用中苜4号种子，在组培时，尽量采用大批量的种子如1000粒来进行，更为容易筛选出分化最快的组培苗材料。
本发明所述的方法，其中优选地，所述种子培养基是1/2MS培养基。所述诱导培养基是SH3a培养基。所述丛生诱导培养基是MSBK培养基。所述生根培养基是SH9生根培养基。
本发明利用紫花苜蓿种子，将其萌发幼苗的子叶进行组织培养，筛选出分化最快的组培苗材料，将紫花苜蓿完整组培周期缩短到4个月，具备愈伤组织形成快、分化及繁殖能力强的特点，最终获得若干组培速率提高的紫花苜蓿材料，为紫花苜蓿组织培养及遗传转化提供了重要的初始技术和材料。本发明的组培方法能使紫花苜蓿组织培养周期从6～7个月缩短到4个月，并且愈伤组织诱导分化能力强，质量好，速度快。
附图说明
图1为紫花苜蓿于1/2MS培养基平板上无菌播种6天，长出2片子叶；
图2为紫花苜蓿子叶被诱导产生愈伤组织；
图3为紫花苜蓿愈伤组织被诱导产生丛生芽；
图4为紫花苜蓿丛生芽分化出完整植株。
具体实施方式
下面，结合实施例对本发明做进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护之中。
实施例1：一种紫花苜蓿组培快速分化植株的筛选方法，包括以下步骤：
(1)将1000粒紫花苜蓿中苜4号的种子灭菌消毒后，移入1/2MS培养基，在25℃的培养箱中暗培养2天后，移入光照16h/24℃，黑暗8h/20℃，光照强度4000～4200lx的培养箱培养4～5天，使种子萌发出2片子叶；
(2)将子叶切下移入SH3a培养基诱导产生愈伤组织，在25℃的培养箱中暗培养27～40天(优选为27天)，得到愈伤组织；
(3)将得到的愈伤组织移入MSBK培养基诱导产生丛生芽，在光照16h/24℃，黑暗8h/20℃，光照强度4000～4200lx的培养箱中培养14～15天(优选为14天)，得到丛生芽；
(4)将得到的丛生芽移入SH9生根培养基，在光照16h/24℃，黑暗8h/20℃，光照强度4000～4200lx的培养箱中培养60～77天(优选为60天)，得到完整植株；
(5)将(4)中最快分化出的完整植株移栽至营养土中，盖保鲜膜在光照16h/22℃，黑暗8h/20℃，光照强度6700～7500lx的温室中炼苗2天，之后揭掉保鲜膜继续在相同环境中培养。
实施例2：实施例1的方法得到的紫花苜蓿材料：
本实施例使用实施例1获得的紫花苜蓿材料叶片。将剪取的紫花苜蓿叶片置于干净的锥形瓶中，在超净台中用10％的次氯酸钠进行灭菌消毒10min，倒掉10％的次氯酸钠溶液，用灭菌的超纯水清洗6次。将清洗干净的叶片移入SH3a培养基中，25℃条件下暗培养27天，叶片脱分化形成愈伤组织。在诱导的190片叶片中，除了12片被污染的，其余均诱导形成愈伤组织(详见表1)。
表1 190片本发明紫花苜蓿材料叶片被诱导情况汇总
因此，本实施例紫花苜蓿叶片愈伤组织的诱导成功率为93.7％。
将诱导成功的178个愈伤组织分别接种到MSBK培养基中，在光照16h/24℃，黑暗8h/20℃，光照强度4000～4200lx的培养箱中培养15天，愈伤组织分化成不定芽和丛生芽，除了4个被污染的，统计不定芽分化率为97.8％。
将分化的不定芽和丛生芽移入SH9生根培养基中，分化具有多个不定芽的丛生芽分割后再分别移入SH9生根培养基中，在光照16h/24℃，黑暗8h/20℃，光照强度4000～4200lx的培养箱中培养60天，得到完整植株，生根率为100％。
将完整植株移栽至营养土中，盖保鲜膜在光照16h/22℃，黑暗8h/20℃，光照强度6700～7500lx的温室中炼苗2天，之后揭掉保鲜膜继续在相同环境中培养1个月，统计成活率，温室成活率为100％。
在本实施例中，诱导愈伤组织所用时间为27天，诱导愈伤组织分化成不定芽和丛生芽所用时间为14天，诱导不定芽分化成完整植株所用时间为60天。
表2给出了本发明实施例1和实施例2中的紫花苜蓿种子被诱导情况的汇总，从表中可以看出，经过上述方法筛选出的材料种子再进行组培时，具有稳定的组培周期，将紫花苜蓿组织培养周期从6～7个月缩短到4个月以内，并且愈伤组织诱导分化能力强，质量好，速度快。
表2
本发明权利要求书和说明书中涉及的描述“光照16h/24℃，黑暗8h/20℃”指的是在24℃条件下光照16小时，接着在20℃条件下避光黑暗8小时，其他类似的描述是一样的意思，特此说明。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (7)
1.一种紫花苜蓿组培快速分化植株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将若干紫花苜蓿种子灭菌消毒，移入种子培养基中，在25℃的培养箱中暗培养2天后，移入光照16h/24℃，黑暗8h/20℃，光照强度4000～4200lx的培养箱培养4～5天，使种子萌发出子叶；
(2)将子叶切下移入诱导培养基诱导产生愈伤组织，在25℃的培养箱中暗培养27～40天，得到愈伤组织；
(3)将得到的愈伤组织移入丛生诱导培养基诱导产生丛生芽，在光照16h/24℃，黑暗8h/20℃，光照强度4000～4200lx的培养箱中培养14～15天，得到丛生芽；
(4)将得到的丛生芽移入生根培养基，在光照16h/24℃，黑暗8h/20℃，光照强度4000～4200lx的培养箱中培养60～77天，得到完整植株；
(5)将(4)中最快分化出的完整植株移栽至营养土中，盖保鲜膜在光照16h/22℃，黑暗8h/20℃，光照强度6700～7500lx的温室中炼苗2天，之后揭掉保鲜膜继续在相同环境中培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述紫花苜蓿种子是中苜4号种子。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述种子培养基是1/2MS培养基。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述诱导培养基是SH3a培养基。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述丛生诱导培养基是MSBK培养基。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述生根培养基是SH9生根培养基。
7.权利要求1-6任一项所述的方法筛选得到的紫花苜蓿材料。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220708 |
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