KR0134140B1

KR0134140B1 - 조직 배양 기술을 이용한 무병주 씨마늘의 생산 방법

Info

Publication number: KR0134140B1
Application number: KR1019940025775A
Authority: KR
Inventors: 김주학; 정경호
Original assignee: 김희용; 동양물산기업주식회사
Priority date: 1994-10-08
Filing date: 1994-10-08
Publication date: 1998-04-18
Also published as: CN1122647A; ES2109886A1; JPH08205703A; CN1166283C; ES2109886B1; KR960013182A

Abstract

본 발명은 마늘의 생산 수량 감소와 품질의 저하를 초래하는 바이러스 감염문제를 근본적으로 해결하기 위한 방법에 관한 것으로서, 식물 조직배양 기술을 이용하여 바이러스에 감염되지 않은 무병주 인공 씨마늘(microbulb)을 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 무병주 인공 씨마늘의 소규모 생산만 가능한 기존의 무병주 인공 씨마늘 생산 방법과는 다른 획기적으로 개선된 것으로, 본 방법에 따라 저가의 무병주 씨마늘의 대량생산이 가능하다. 본 발명의 방법은 우선 마늘 인편의 정단에서 칼루스를 유도하여 증식시키고, 이로부터 유기한 신초를 재분화시키고, 재분화된 신초로부터 다신초 증식 배지상에서 계대배양에 의해 신호를 대량증식시키고, 대량증식된 신초로부터 인공 씨마늘을 형성시키는 단계로 구성되어 있다. 종래의 방법들에 비하여, 신초의 생산율을 혁신적으로 증대시켰기 때문에 상대적으로 월등히 적은 노동력, 시간 및 경비로 씨마늘을 대량 생산할 수 있게 된다. 또한 현재까지는 높은 생산원가 때문에 우량 품종의 선발 및 산업적 대량증식이 불가능 했었는데, 본 발명의 다신초를 이용한 반영구적인 대량증식 방법을 통해 지금까지는 실용화 측면에서 불가능했던 우량 형질을 갖는 품종의 대량 증식도 가능하게 되어, 새로운 품종의 선발과 육성이 가능하게 되었다.

Description

조직 배양 기술을 이용한 무병주 씨마늘의 생산 방법

제1도는 본 발명의 무병주 씨마늘을 생산하는 방법의 공정도.

제2도는 종래의 무병 씨마늘을 생산하는 방법('정단 배양방법')의 공정도.

제3도는 종래의 무병주 씨마늘을 생산하는 방법('칼루스 배양방법')의 공정도.

제4도는 종래의 무병주 씨마늘을 생산하는 방법('쓰미모또 방법')의 공정도.

제5도는 종래의 무병주 씨마늘을 생산하는 방법('묘조원기법')의 공정도.

제6도는 패트리디쉬(petridish)내의 칼루스(callus)증식 배지 위에서 증식되고 있는 칼루스(callus)의 모습을 나타낸 사진.

제7도는 패트리디쉬(petridish)내의 재분화 배지 위에서 재분화된 신초(shoots)의 모습을 나타낸 사진.

제8도는 패트리디쉬(petridish)내의 다신초(multishoots) 증식 배지 위에서 대량으로 증식되고 있는 다신초(multishoots)의 모습을 나타낸 사진.

제9도는 패트리디쉬(petridish)내의 구 형성(bulb formation) 배지 위에서 형성된 작은 마늘구(씨마늘 : microbulb)의 모습을 나타낸 사진.

제10도는 수확하여 저장중인 마늘구(씨마늘 : microbulb)의 모습을 나타낸 사진.

본 발명은 식물 조직배양 기술을 이용하여 바이러스에 감염되지 않은 무병주 씨마늘(microbulb)을 급속 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

마늘은 백합과의 파속식물로서, 인편(clove)을 통해 번식하는 영양번식 작물이기 때문에 화분수정에 의한 품종의 육성이 불가능하여 현재까지 선발에 의한 품종의 개량이 이루어져 왔다. 현재 우리나라에서는 마늘의 내적·외적인 특징을 이용한 과학적인 방법에 의하여 품종을 구별하고 있지 못한 실정이며, 마늘의 저온처리 시기인 겨울의 길이와 온도에 따라 마늘의 품종을 크게 2종류로 구분하는데, 겨울의 기온이 비교적 높고 짧은 남해안 지역과 제주도에서 재배하는 난지형과 겨울의 기온이 낮고 긴 지역에서 재배하는 한지형으로 구분되고 있으며, 작게는 여러 지역종으로 구분되어 서산마늘, 단양마늘, 의성마늘, 예천마늘등과 같이 마늘 주산단지에 따라 편의적으로 구분되고 있는 형편이다. 또한 재배토지의 형태에 따라 논마늘과 밭마늘로 구분되기도 한다. 이러한 마늘은 양념채소로 많이 사용될 뿐만 아니라, 건강식품 또는 의약품의 원료로 이용되는 중요한 채소작물중의 하나이다.

대부분의 영양번식 작물에서와 같이 마늘에서도 바이러스병에 의한 피해가 심각한데, 국내는 물론 국외에서 재배되고 있는 대부분의 마늘은 GMV(Garlic Mosaic Virus)와 GLV(Garlic Latent Virus)등과 같은 바이러스의 감염에 의한 병이 만연하고 있어 마늘의 수량감소와 품질저하가 초래되고 있는 실정이다. 이러한 바이러스병은 농약에 의하여 해결될 수 없기 때문에 종구의 품질개선에 의한 문제해결을 시도하고 있으며, 현재까지의 결과로는 무병주 인공 씨마늘을 종구로 사용하여 바이러스병 문제를 해결함으로써 단위 면적당 마늘생산이 40-50% 정도 증대될 수 있다는 여러 보고가 있다(최성열, 1992. 충북대학교 원예학과, 박사학위 논문). 이와 같이 바이러스 피해를 줄일 수 있는 방안은 잘 알려져 있으나 무병주 씨마늘을 경제적으로 대량 생산할 수 있는 기술이 현재까지 개발되어 있지 않기 때문에, 효율적인 인공 씨마늘의 대량 생산을 통한 농민보급이 이루어지지 않고 있는 실정이다.

식물 조직배양 기술을 이용하여 무병주 씨마늘을 생산하는 방법으로서, 현재까지 개발된 방법으로는 다음과 같이 네가지로 분류된다고 볼 수 있다 : 첫째로, 마늘 인편(clove)의 정단(shoot meristem; 식물의 생장점)을 적출 배양하여 하나의 시료에서 1개 내지 수개의 신초(shoot)를 유도하는 방법(이하 '정단 배양방법')(1989년 5월 30일자, 루마니아 특허 제96914호), 둘째로, 적출한 마늘 인편의 정단에서 칼루스(callus : 미분화된 식물세포 덩어리)를 유도하고 이 칼루스를 배지에서 대량 증식시킨 다음 마늘 신초를 재분화 시킴과 동시에 증식시키는 방법(아지노모또 가부시끼가이샤의 1989년 11월 21일자 일본 특허출원 제 平1-300771호)(이하 '칼루스 배양방법'), 셋째로, 1993년에 일본의 유수한 케미칼 회사인 쓰미모또 화학에서 발표한 인공 씨마늘 생산방법(Plant Cell Tissue Organ Culture; (1993) 32, 2, 175-83)(이하 '쓰미모또 방법')으로 배양과정이 정단 배양방법과 유사하나, 정단에서 유래한 신초를 계대배양에 의해 증식시키는 단계가 있는 것이 정단 배양방법과 다르며, 넷째로, 신닛본세이떼쯔 가부시끼가이샤에서 특허출원한 방법(1989년 1월 31일자, 일본 특허출원 제 平1-19850호) 즉, 인편의 정단에서 미분화 신초덩어리('묘조원기'라 함)를 유도하여 증식시킨 다음 증식된 묘조원기에서 다수의 신초(shoot; 식물의 '싹')를 유도하고 저온에서 씨마늘을 형성시키는 방법(이하 '묘조원기법')이 있다.

무병주 인공 씨마늘 생산을 위해 개발된 상기 방법들에 대한 특성이나 장·단점들을 비교 분석하면 다음과 같다.

인편의 정단으로부터 신초를 유도해 내어 씨마늘을 형성시키는 단계로 구성된 정단 배양방법(제2도)의 경우, 첫째로 0.3mm 이하의 인편의 정단(shoot meristem)을 현미경하에서 계속적으로 적출해야 하므로 작업 속도가 매우 느리며, 둘째로, 배양초기에 생존율이 낮은 미세한 크기의 정단을 계속적으로 배양해야 한다. 셋째로, 생산된 씨마늘의 수와 비슷한 양의 시료(인편)가 필요하다. 넷째로, 최초의 배양으로부터 씨마늘의 생산기간이 약 8개월 정도로 기간이 많이 소요되며, 다섯째로, 다양한 시료에서 출발하므로 유전적으로 균일한 신초를 생산할 수 없다.

인편의 정단으로부터 유도해낸 칼루스를 대량 증식시킴으로써 이로부터 신초를 재분화함과 동시에 증식시킴으로써 씨마늘을 형성하는 단계로 구성된, 칼루스 배양방법(제3도)의 경우, 첫째로, 충분량의 시료를 확보하기 위해서는 칼루스를 여러번 계대배양을 해야 하지만, 이 방법에 의해서는 계대배양의 횟수가 약 8회 정도로 제약을 받음으로써 계대배양에 의한 신초의 재분화율이 감소하여 생산효율이 급격히 떨어지고, 둘째로, 칼루스에서 신초로의 재분화율이 일정하지 않아 재분화된 신초의 양을 예측하기 어려울 뿐만 아니라, 재분화된 많은 신초가 유리질화(vitrification)될 우려가 있으므로 생산량의 조절이 어렵게 된다. 셋째로, 칼루스의 증식률은 낮은 편이며(4배/월), 넷째로, 칼루스로부터 씨마늘을 생산하는데는 최소한 4단계를 거쳐 8개월 정도로 소요기간이 길다. 다섯째로, 계대배양 횟수가 제약되어 있기 때문에 유전적으로 완전한 동질의 신초를 생산하기는 어려우나 정단 배양방법에 비하면 유전적으로 동질인 신초의 생산이 가능한 편이다. 이 방법은 정단 배양방법보다는 우수하나 씨마늘을 대량 생산하는데는 상기한 바와 같은 여러 가지 제약사항 때문에 문제점이 많다. 현재까지 국내에서는 상기한 두가지 방법에 의해 생산된 소량의 무병주 씨마늘을 노지에서 경작하여 대량 증식하고 있으나, 노지 증식률(5-6배/년)이 낮고 노지 재배때마다 매개층에 의하여 마늘이 점차적으로 바이러스에 감염되므로 진정한 의미의 무병주 씨마늘을 생산하는 방법이라고는 볼 수 없다.

인편의 정단으로부터 유도해낸 신초를 계대배양에 의해 증식시키는 방법으로서 현재까지의 증식방법중 가장 좋은 방법인 것으로 알려진, 쓰미모또 방법(제4도)의 경우, 첫째로, 배양초기에 생존율이 낮은 미세한 크기의 정단을 계속적으로 배양해야 하므로 생산율이 낮고, 둘째로, 신초의 증식률(2.5배/월)이 매우 낮으며, 셋째로, 구 형성을 위한 저온처리기간이 6개월 정도로 비교적 길며, 넷째로, 최초의 배양으로부터 씨마늘을 생산하기까지 소요되는 기간이 길다(12개월). 다섯째로, 다양한 시료에서 출발하므로 유전적으로 균일한 신초를 생산할 수 없다. 이와 같이, 쓰미모또 방법 또한 무병주 씨마늘을 경제적으로 대량 생산하는데는 미비한 점이 많은 것으로 보인다.

인편의 정단으로부터 묘조원기를 유도·증식시켜 이로부터 신초를 유도해내는 묘조원기법(제5도)의 경우, 첫째로, 정단으로부터 묘조원기를 유도·증식하는 단계에서 회전배양을 해야하므로 배양시설의 제약에 의한 대량생산이 어려우며, 둘째로, 묘조원기의 증식률이 낮고(2-5배/월), 셋째로, 구형성을 위해 저온처리(5±2℃)가 요구되며, 넷째로, 최초의 배양으로부터 씨마늘을 생산하기까지 소요되는 기간이 길다(12개월). 다섯째로, 다양한 시료에서 출발하므로 유전적 균일한 신초를 생산할 수 없다. 상기한 바와 같이, 종래의 방법으로서는 대규모의 무병주 씨마늘 생산이 어려우므로 비경제적인 문제점이 있었다.

이상과 같이, 위에서 언급한 모든 방법들의 가장 큰 단점인 동시에 문제점은 생산비용이 너무 높아 무병주 씨마늘의 생산을 산업화할 수 없다는 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 위에서 언급한 여타의 방법들이 가지고 있는 문제점과 제약사항들을 해결하고, 생산단계와 기간을 단축시킴으로써 저가의 무병주 씨마늘을 대량 생산하는 방법을 제공함에 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 목적은 식물 조직 배양 기술을 이용하여 바이러스에 감염되지 않은 무병주 씨마늘을 대량 생산하는 방법을 제공함에 있다.

본 발명의 방법은 무병주 씨마늘을 생산함에 있어, 칼루스(callus)나 정단(shoot meristem)에서 유도된 신초(shoots)나 묘조원기를 증식시켜 씨마늘을 형성시키기 보다는, 칼루스로부터 재분화된 신초를 본 발명의 다신초 유도 및 증식 배지상에서 계대배양하여 얻은 다신초(multishoots; 100여개의 신초가 모여 하나의 덩어리를 이룬 신초덩어리)를 반영구적으로 대량증식시킴으로써, 소규모 생산에 적합한 기존의 방법과는 달리 무병주 씨마늘의 대량생산이 가능하게 된 획기적인 방법이다(제1도에 간략히 도시화 되어 있음). 상기한 쓰미모또 방법의 경우, 신초 덩어리의 숫자는 전체 27주 동안에 2차배양 4세대를 통하여 128배 증가하여 평균 증식률은 한달에 약 2.5배인 반면(Plant Cell Tissue Organ Culture; (1993) 32, 2, 175-83), 본 발명의 경우에는 본 발명의 다신초 유도 및 증식 배지(표 1)가 든 페트리디쉬상에서 다신초(100여개의 많은 신초들로 이루어진 신초덩어리)를 반영구적으로 계대배양함으로써 신초의 증식률(14-15배/월)을 혁신적으로 증대시켰기 때문에 상대적으로 월등히 적은 노동력, 시간 및 경비로 씨마늘을 대량생산할 수 있게 된다. 또한, 현재까지는 높은 생산원가 때문에 우량품종의 선발 및 산업적 대량증식이 불가능 했었는데, 본 발명의 다신초를 이용한 반영구적 대량증식방법을 통해 새로운 품종의 선발과 육성이 가능하게 되었다.

또한, 본 발명은 위에서 언급한 장점들 이외에도 대량으로 생산된 다신초의 장기 저장방법과 기외(in vivo)에서 다신초로부터 종구로 이용할 수 있는 인편 당 무게가 2-3g 되는 중구(中球)를 대량 생산할 수 있는 방법도 개발하였다. 기내(in vitro)에서 다신초로부터 소구(microbulb)를 생산하는데는 비용이 많이 발생하고, 또한 그들의 크기가 0.1-0.3g 정도밖에 안되기 때문에 이들을 노지에서 재배하면 당해년도에 정상적으로 분구된 6쪽 마늘이 형성되지 않고 단rn(單球; 인편이 하나인 구)가 형성된다. 이들 단구를 다음 해에 종구로 이용하게 되는데 이렇게 하는 것은 인편의 증식없이 한번의 토지 재배단계가 필요하므로 비용만 더 발생한다. 다시 말하면, 크기가 2-3g 되는 이들 단구를 다시 노지에서 재배해야만 정상적인 6쪽 마늘이 형성된다. 기내(in vivo)에서 형성된 소구(microbulb)는 저장성이 뛰어나 수개월을 저장할 수 있는 장점이 있는 반면, 위에서 언급한 바와 같이 농민이 종구로 사용할 수 있는 크기의 구를 생산하는데는 기간이 많이 걸리고 비용도 많이 발생하므로 신초를 노지에서 재배하여 당년에 농민이 이용할 수 있는 2-3g 크기의 중구를 생산하는 시스템을 개발했다. 노지 재배에 의한 중구의 대량생산을 위해서는 많은 양의 신초를 일시에 토양으로 이식을 해야되는데 이를 위하여 조직배양에서 연속적으로 생산되는 신초를 저온에서 wj장하면 신초의 변이 없이 최소한 5개월 이상 저장할 수 있다.

이 방법을 이용하여 많은 양의 신초를 확보함으로써 일시에 많은 양의 신초를 토양에 이식함과 동시에 일시에 대량의 중구 수확이 가능하게 된다.

본 발명은 아래와 같은 구성에 의하여 상세히 설명될 것이다.

정단 조직으로부터 칼루스 유도 및 증식

여러 주산단지의 마늘을 수집하여 상토에 식재한 후, 23-26℃의 식물 생장 조절기(growth chamber)내의 상토에서 재배하고, 마늘이 왕성하게 생장하는 시기에 온도를 30-31℃로 높여서 7-10dlfrks, 36-37℃로 높여서 30-40일간 고온 처리하여 마늘 식물체내의 바이러스 활성을 줄인 다음 마늘을 수확하고 지상부와 뿌리 부분을 제거한 후 정단(shoot meristem)이 위치한 부분만을 수집하여 75-80%의 알콜에서 5분간, 표백제(2-3%의 차아염소산 나트륨 용액; NaOCl)로 15-20분간 소독한다. 멸균수로 3-4회 정도 세척한 후 시료의 근경 최상부에 존재하는 정단(0.3mm이하)을 현미경하에서 적출하고 식물 생장조절 물질인 투포디(2,4D : 2,4-dichlorophenoxy acetic acid)0.1-0.2ppm(mg/L)이 들어 있는 무라시게 스쿠그(Murashige and skoog(MS); Murashige, T and F. Skoog, 1962 physiol. plant. 15 : 473-497)고체 배지(이하 '엠에스 배지')에서 2-3개월간 배양하여 칼루스를 유도한다. 칼루스의 유도때와 같은 배지에서 계대배양을 수회 반복하여 칼루스를 증식시킨다. 배양 조건은 낮의 길이가 16-18시간, 밤의 길이가 6-8시간, 광도가 4000-6000룩스(lux), 온도가 밤낮 구별없이 24-26℃일 때 칼루스의 유도 및 증식이 잘된다. 첨부한 도면 제6도는 패트리디쉬내의 칼루스 증식 배지위에서 증식되고 있는 칼루스의 모습을 나타낸 것이다.

칼루스로부터 신초의 재분화

증식된 칼루스로부터 신초를 재분화하기 위해 엠에스(MS) 기본 배지에 슈크로스(sucrose)2-3%, 식물 생장조절 물질 비에이(BA; Benzylamino purine)0.5-3.0mg/L, 한천(Agar) 0.7%를 첨가하여 사용한다. 다른 여러가지 기본 배지를 사용하여도 신초가 재분화되나 그중에서 엠에스(MS)배지를 사용할 때 가장 많고 건강한 신초가 생성된다. 패트리디쉬내의 신초 재분화 배지위에서 재분화된 신초의 모습은 첨부한 도면 제7도에 나타나 있다. 여러 종류의 사이토카이닌과 오옥신을 사용하여 신초를 재분화시키는 경우보다는 0.5-3.0mg/L의 비에이(BA; Benzylamino purine) 단독 또는 0.1mg/L정도의 엔에이에이(NAA : 1-Naphthylacetic acid)를 혼합한 배지가 더욱 효과가 좋다.

신초의 대량 증식

제분화된 신초로부터 대량증식에 알맞은 다신초(multishoots)를 유도하기 위하여, 재분화된 신초를 새로운 다신초 증식 배지(표 1)에 옮겨 배양하면서 증식에 알맞은 다시노를 형성시킨다. 배양 초기에는 다신초의 증식률이 낮으나 2회 이상 계대배양하면 증식 속도가 빨라지며 약 한달간 배양하면 신초의 수가 14-15배 정도 증대되어 표준 패트리디쉬(petridish : 10cm×1.5cm)속에서 약 300여개의 신초들이 자라게 된다. 이를 3 년이상 계대배양을 계속하여도 신초가 퇴화되거나 비정상적으로 되는 변이는 일어나지 않은 것으로 보아 이러한 신초들을 반영구적으로 계대배양을 계속하는 것이 가능함을 알 수 있다. 배지의 성분은 신초 재분화 배지와 비슷하나 엠에스(MS) 기본 배지중 암모니아태 질소의 양을 절반으로 줄이고, 슈크로스의 양을 2-3%, 식물 생장조절 물질 비에이(BA; Benzylamino purine)0.5-2.0mg/L, 엔에이에이(NAA : 1-Naphthylacetic acid)를 0.05-0.2mg/L로 한다. 배양조건은 낮의 길이가 18시간, 밤의 길이가 6시간, 광도가 4000-6000lux, 온도가 밤낮 구별없이 25℃이다. 이와 같이 생산된 다신초는 종래의 방법에 의하여 생산된 다신초에 비하여 다음과 같은 특성을 가진다 : 첫째로, 뿌리의 발달이 양호하고, 둘째로, 반영구적으로 계대배양이 가능하고, 셋째로, 신초덩어리 당 신초의 수가 약 100개 정도로 매우 많으며, 넷째로, 구형성 전에 휴먼타파를 위해 필요한 저온 저장 기간(2개월)이 짧다는 것이다. 특히, 종래의 쓰미모또 방법의 경우에는 신초덩어리 당 신초의 수가 약 10여개 정도인데 비하여, 본 발명의 방법에 의해 생성된 신초덩어리 당 신초의 수는 약 100개 정도로서 신초 증식률이 훨씬 높다. 이는 첨부한 도면 제8도에 나타나 있는 바와 같이, 본 발명의 다신초가 패트리디쉬내의 다신초 증식 배지위에서 왕성하게 대량증식되고 있음으로 보아 이를 잘 알 수 있다.

다신초로부터의 기내(in vitro) 씨마늘(器內小球 : microbulb)의 형성

다신초 증식 배지에서 대량으로 증식된 다신초의 1/15정도는 신초의 재생산을 위해 다신초 증식 배지로 옮겨 계대배양하고, 나머지 다신초의 14/15는 구형성 배지로 옮겨 씨마늘의 생산에 이용한다. 증식된 다신초를 4℃에서 2개월 정도 저장하여 저온 처리를 한 후 구형성 배지에 옮겨 씨마늘을 형성 시킨다. 첨부한 도면 제9도는 페트리디쉬내의 구형성 배지위에서 형성된 작은 마늘구(씨마늘 : microbulb)의 모습을 나타낸 것이다. 구형성 배지는 엠에스(MS)기본 배지에 슈크로스 9%, 엔에이에이(NAA : 1-Naphthylacetic acid)0.1-2.0mg/L로 조성되고 있다. 2개월 정도 배양하여 씨마늘의 무게가 0.2g 정도 되었을때 수확하여 5일 정도 건조시킨 후에 씨마늘을 수확한다. 수확한 씨마늘을 상온에서 오랫동안 저장하기가 어려우므로 마르지 않도록 용기속에 넣어 3-4℃의 냉장고에서 저장한다. 배양조건은 낮의 길이가 16시간, 밤의 길이가 8시간, 광도가 4000-6000lux, 온도가 밤낮 구별없이 25℃이다. 첨부한 도면 제10도는 수확하여 저장중인 마늘구(씨마늘 : microbulb)의 모습을 나타낸 것이다.

다신초로부터의 기외(in vivo) 중구(microbulb)의 형성

증식된 다신초를 하나씩 또는 5-8개의 신초 덩어리로 나누어 가을에 노지에 직접 파종한다. 이때 조직 배양에 의해 대량으로 배양된 신초들은 연약하기 때문에 일반적인 마늘 파종 시기(10월말 내지 11월초)보다 일찍 노지에 이식하여 뿌리가 활착할 기간을 충분히 하면 겨울동안에 동사하는 것을 막을 수 있다. 가을 이식 이후에 생산된 신초들은 겨울동안에 저온에서 저장하였다가 봄에 노지에 이식한다. 만일 겨울동안에 신초를 저온 처리하지 않으면 봄에 이식한 신초에서는 구가 형성되지 않는다.

대량으로 생산된 다신초들의 장기 저장

다신초로부터 기외(in vivo)에서 중구를 생산하기 위하여 증식된 다신초를 몇 개월동안 저온에서 저장하는 것이 필요하다. 왜냐하면 신초의 증식은 배양실내에서 연중 연속적으로 이루어지고 있으나, 이를 토양에 이식하는 것은 일년에 한두번이기 때문이다. 패트리디쉬에 들어있는 300개 정도의 신초를 구형성 배지로 옮긴 후, 저온(4-6℃)에서 낮의 길이 16시간, 밤의 길이 8시간, 광도 500-1000lux로 하여 저장을 하면, 5개월 이상 신초의 변성없이 저장이 가능하다. 이러한 조건하에서 신초들을 장기간 저장을 할 수 있기 때문에 중구의 생산을 위해 노지 재배에 필요한 대량의 신초를 일시에 대량 공급할 수 있다.

바이러스(virus)의 감정

증식된 칼루스, 다신초 및 씨마늘의 조직을 완충용액(buffer solution)속에 넣고 마쇄한 후 압착 추출하여 즙액을 만들고 바이러스 검정방법의 하나인, 항혈청을 이용한 엘라이저(ELISA) 및 웨스턴 블랏팅(western blotting)방법을 이용하여 즙액 속의 바이러스 존재 유무를 검정한다. 현재까지의 검정 결과로 보면, 본 발명의 방법에 의해 생산된 씨마늘에는 바이러스가 거의 없는 것으로 나타난다.

이하, 본 발명을 실시예로서 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 어떤 의미로든 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.

[실시예 1]

정단(shoot meristem)조직으로부터 칼루스의 유도 및 증식

국내 한지형 마늘중 단양, 의성, 예천, 서산등지의 지역종을 수집하여 상토에 식재한 후, 25℃의 식물생장조절기(growth chamber)내에서 재배하였다.

마늘 식물체가 빠르게 생장할 시기에 30℃에서 7일간, 36℃에서 35일간 고온처리를 하여 마늘 식물체내의 바이러스의 활성을 줄였다. 고온처리한 마늘 식물을 수확하고 지상부와 뿌리 부분을 제거한 후, 정단(shoot meristem)이 위치한 부분만을 수집하여 75%의 알콜에서 5분간, 50%의 상업용 표백제(유한락스에서 15분간 소독하였다. 이를 멸균수로 3회 정도 세척한 후, 시료의 근경 최상부에 존재하는 정단(0.3mm이하)을 현미경하에서 적출하였고, 표준 크기(10cm×1.5cm)의 패트리디쉬에 분주된 칼루스 유도배지 위에서 3개월간 배양하여 칼루스를 유도하였다(제6도). 이때 사용된 칼루스 유도 및 증식 배지는 엠에스(MS : Murashige, T and F. Skoog, 1962; Physiol. plant. 15 : 473-497)기본 배지에 슈크로스 2%, 식물생장 조절물질 투포디(2,4D : 2,4-dichlorophenoxy acetic acid) 0.1mg/L, 한천(Ager) 0.7%를 첨가하고, 멸균하기 전에 산도(pH)를 5.8로 맞춘 것이다. 이때의 배양조건은 낮의 길이가 16시간, 밤의 길이가 8시간, 광도가 4000-6000lux, 온도가 밤낮 구별없이 25℃였다. 칼루스가 유도된 후 칼루스 증식 배지에서 계대배양을 2회 이상 하여 칼루스를 증식시킨 다음, 이를 신초의 재분화에 이용하였다. 배양조건은 정단에서 칼루스를 유도할 때와 같도록 하였다.

[실시예 2]

칼루스로부터 신초의 재분화

칼루스 증식 배지에서 증식된 칼루스를 신초 재분화 배지에 옮겨 신초를 재분화 하였다. 이때 사용된 신초 재분화 배지는 엠에스(MS : Murashige, T and F. Skoog, 1962; physiol. Plant. 15 : 473-497)기본 배지에 슈크로스 2%, 식물 생장조절 물질 비에이비에이(BA; Benzylamino purine) 2.0mg/L, 한천(Agar) 0.7%를 첨가하고, 멸균하기 전에 산도(pH)를 5/8로 맞춘 것이다. 칼루스 증식 배지에서 1개월 배양한 칼루스 덩어리를 1/4-1/5로 분할하여 표준크기(10cm×1.5cm)의 패트리디쉬에 분주된 재분화 배지위에 치상하고, 2-3개월간 배양하여 신초를 재분화시켰다(제7도). 배양조건은 낮의 길이가 16시간, 밤의 길이가 8시간, 광도가 4000-6000lux, 온도가 밤낮 구별없이 25℃였다.

[실시예 3]

신초의 대량 증식

재분화된 신초로부터 대량증식에 알맞은 다신초를 유도하기 위하여, 재분화된 신초를 다신초 증식 배지에 옮겨 배양했다. 이때 사용된 다신초 증식 배지는 엠에스(MS) 기본 배지중 암모니아태 질소의 양을 절반으로 줄인 배지에 슈크로스의 양을 2%, 식물 생장 조절 물질인 비에이(BA; Benzylamino purine) 1.0mg/L 및 엔에이에이(NAA : 1-Naphthylacetic acid)를 0.1mg/L, 한천 0.7%를 첨가하고, 멸균하기 전에 pH 5.8로 맞춘 것이다. 다신초 증식 배지의 성분에 대하여는, 아래 표 1에 상세히 기술되어 있다. 배양 초기에 발생한 다신초(multishoots)중에서 대량증식에 알맞는 다신초를 골라서 새로운 배지에 옮겼다. 배양초기에는 다신초의 증식률이 낮았으나 2회이상 계대배양하면 증식 속도가 빨라져 약 한달간 배양하여 신초의 수가 15배 정도로 증식 되었다. 약 한달간 배양하면 표준크기(10cm×1.5cm)의 패트리디쉬 당 300여개의 신초(크기가 0.5cm 이상되는 것만 계산)가 형성되는데(제8도), 이들 신초들을 증식시키기 위해 다시 새로운 다신초 증식 배지로 옮겼다.

다시 말하면, 표준크기(10cm×1.5cm)의 패트리디쉬 속에서 자란 약 300개의 신초들을 작은 신초 덩어리(약 5개의 신초)로 분할하여, 다신초 증식 배지가 담겨져 있는 패트리디쉬에 각각 3-4개의 작은 신초 덩어리들을 옮겨서 배양하였다. 이와 같이, 5주 정도 배양 후 형성된 다신초를 작은 신초 덩어리로 분할하고 계대배양하는 작업을 반복적으로 계속하여 매달 14-15배의 신초 증식이 가능하게 되었으며, 2년이상 반영구적으로 계대배양을 계속하여도 신초가 퇴화하거나 비정상적으로 되는 변이는 일어나지 않았다. 이론상으로 1개의 신초를 1년동안 계속적으로 계대배양을 하게 되면, 1조개 정도의 신초를 생산할 수 있기 때문에, 현실적으로 적어도 3000억개 이상의 신초 생산이 가능하다. 또한, 배양 용기인 플라스틱 패트리디쉬를 10개 정도 쌓아서 계대배양을 할 수 있기 때문에, 6단짜리 배양대(120cm×80cm×180cm)에서 일년에 1500만개 정도의 신초 생산이 가능하다. 배양조건은 낮의 길이가 18시간, 밤의 길이가 6시간, 광도가 4000-6000lux, 온도가 밤낮 구별없이 25℃였다.

[실시예 4]

다신초 증식 배지에서 대량으로 증식된 다신초의 1/15은 신초의 재생산을 위하여 다시 다신초 증식 배지로 옮겨 계대배양하였고, 나머지 다신초의 14/15는 구(bulb)형성 배지로 옮겨 씨마늘의 생산에 이용하였다. 이때 사용되는 구형성 배지는 엠에스(MS) 기본 배지에 슈크로스 9%, 식물 생장조절물질 엔에이에이(NAA : 1-Naphthylacetic acid)를 0.5mg/L, 한천(Agar) 0.7%를 첨가하고, 멸균하기전에 pH를 5.8로 맞춘 것이다. 대량으로 증식된 다신초를 4℃의 생장조절기(growth chamber)속에서 2개월정도 저장하여 저온초리를 한 후에, 구형성 배지에 옮겨 씨마늘을 형성시켰다. 이때 패트리디쉬속에 증식된 신초(약 300개/패트리디쉬)들을 작은 신초 덩어리(약 5개의 신초)로 분할하여 표준 패트리디쉬 속에 들어있는 구형성 배지위에 약 5개 정도의 작은 신초 덩어리들을 옮겨 배양시켰다. 2개월 정도 배양하여, 씨마늘의 무게가 0.2g 정도 되었을 때 패트리디쉬의 뚜껑을 열어 5일 정도 건조시킨 후에 씨마늘을 수확하였다. 수확한 씨마늘을 상온에서 오랫동안 저장하기가 어려우므로 마르지 않도록 용기 속에 넣고 밀봉한 후 4℃의 냉장고에서 저장하였다(제10도). 이때 저장용기의 바닥에 젖은 천이나 종이를 깔은 다음, 그 위에 플라스틱 그물을 설치하고 그물 위에 씨마늘을 넣어 씨마늘이 젖은 천이나 종이에 직접 닿지 않도록 한 다음 저장하여 건조에 의한 문제 발생없이 씨마늘을 8개월 이상 저장할 수 있었다.

배양조건은 낮의 길이가 16시간, 밤의 길이가 8시간, 광도가 4000-6000lux, 온도가 밤낮 구별없이 25℃였다.

[실시예 5]

다신초로부터의 기내(in vitro) 중구(minibulb)의 형성

대량으로 증식된 다신초를 하나씩 또는 5-8개의 신초 덩어리로 나누어 가을에 노지에 직접 파종하였다. 이때 조직 배양에 의해 대량으로 배양된 신초들은 연약하기 때문에, 일반적인 마늘 파종시기(10월말 내지 11월초)보다 이른 10월 중순쯤에 노지에 이식하여 뿌리가 활착할 기간을 충분히 하여 겨울동안에 동사하는 것을 막을 수 있었다. 가을 이식 이후에 생산된 신초들은 겨울동안에 저온에서 저장하였다가 봄에 노지에 이식하였다. 겨울동안에 신초를 저온처리하지 않고 봄에 이식한 신초에게는 구가 형성되지 않았다.

[실시예 6]

대량으로 생산된 다신초들의 장기 저장

다신초를 분할하여 새로운 다신초 증식 배지에서 5주 정도 배양을 하게되면, 첨부한 도면 제8도에 나타나 있는 바와 같이 패트리디쉬당 300개정도의 다신초가 형성된다. 이들 다신초가 들어 있는 패트리디쉬를 새로운 처리없이 4-6℃의 저온에서 낮의 길이가 16시간, 밤의 길이가 8시간, 광도가 500-1000lux의 조건하에서 저장을 하게 되면 5개월 이상 신초의 변성없이 저장이 가능하다. 이러한 조건하에서 신초들을 장기간 저장할 수 있기 때문에, 중구의 생산을 위한 노지 재배에 필요한 대량의 신초를 일시에 공급할 수 있다.

[실시예 7]

바이러스의 검정

증식된 칼루스, 다신초 및 씨마늘의 조직을 완충용액(buffer solution)속에 넣고 마쇄한 후, 압착 추출하여 즙액을 만들고 바이러스 검정 방법의 하나인 항혈청을 이용한 엘라이저(ELISA) 및 웨스턴 블랏팅(western blotting)방법을 이용하여 즙액 속의 바이러스 존재 유무를 검정하였다.

표준 ELISA 분석 방법으로 바이러스의 농도를 측정하기 위해, 미국의 Agdta사에서 판매하고 있는 마늘의 Garlic Mosaic Virus 검정용 ELISA KIT를 이용하여 바이러스를 검정해 본 결과, 405nm의 파장에서 ELISA Reader상의 흡광도는 바이러스가 전혀 없는 대조구(negative control)의 경우를 0으로 하였을때, 본 발명의 경우에는 0-0.002였고, 바이러스에 감염되어 있는 노지 재배한 마늘의 경우에는 1.5이었다.

이와 같은 검정 결과로 보아 본 발명의 방법에 의해 생산된 씨마늘에는 바이러스가 거의 없음을 알 수 있었다.

이상과 같이, 본 발명의 방법에 따라 마늘의 다신초를 반영구적으로 대량 증식시킬 수 있었으며, 생산단계(2단계)dhk 기간(3개월)을 단축시켜 저가의 무병주 씨마늘을 대량생산하는 것이 가능하게 되었다. 위에서 언급한 종래의 방법들과 본 발명의 장·단점들을 비교 요약하면 표 2와 같다.

* 정단, 칼루스 및 묘조원기에서 유도된 신초가 직접 구형성 단계로 가면 3단계 공정이고, 그렇지 못하여 한번 더 신초의 신장을 위한 계대배양을 하면 4단계 공정이 되나 후자의 가능성이 높다.

** 계속 반복되는 최초 단계부터 마지막단계(구형성 완료)까지 필요한 기간.

(신초의 저온처리 기간은 제외)

이하에서는 본 발명의 이러한 사상을 청구할 것인바, 이 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 사상에서 벗어나지 않으면서 이러한 사상에 수정 및 변형을 가할수 있음을 알 수 있을 것이다. 따라서, 이러한 수정 및 변형은 이하의 특허청구의 범위에 포함될 것이다.

Claims

마늘인편의 정단에서 칼루스를 유도하여 증식시키고, 이로부터 유기한 신초를 재분화시키고, 재분화된 신초로부터 다신초 증식 배지상에서 계대배양에 의해 신초를 대량증식시키고, 대량증식된 신초로부터 씨마늘을 형성시키는 단계로 구성되는 조직 배양 기술을 이용한 무병주 씨마늘의 생산 방법.
제1항에 있어서 표준크기의 패트리디쉬 속에서 자란 약 300개의 신초들을 작은 신초 덩어리(약 5개의 신초)로 분할하여 다신초 증식 배지가 담겨져 있는 패트리디쉬에 각각 3-4개의 작은 신초 덩어리들을 옮겨 반영구적으로 계대배양함을 특징으로 하는 조직 배양 기술을 이용한 무병주 씨마늘의 생산방법.
제1항 또는 2항에 있어서, 다신초 중식 배지는 엠에스 기본 배지중 암모니아태 질소의 양을 줄이고, 슈크로스의 양을 2-3%, 식물 생장조절 물질인 비에이(BA; Benzylamino purine)를 0.5-2mg/L, 엔에이에이(NAA : 1-Naphthylacetic acid)를 0.05-0.2mg/L, 한천 0.7%를 첨가하고, 멸균하기전에 pH 5.8로 맞춘것임을 특징으로 하는 조직 배양기술을 이용한 무병주 씨마늘의 생산방법.
제1항에 있어서, 대량증식된 신초를 온도 4℃, 광도 100-500lux에서 2개월간 처리한 후, 구형성 배지에 옮겨 배양함으로써 씨마늘을 형성시킴을 특징으로 하는 조직 배양기술을 이용한 무병주 씨마늘의 생산방법.
제4항에 있어서, 구형성 배지는 엠에스 기본 배지에 슈크로스 9%, 엔에이에이(NAA : 1-Naphthylacetic acid)를 0.1-2.0mg/L로 조성된 것임을 특징으로 하는 조직 배양기술을 이용한 무병주 씨마늘의 생산 방법.
제1항에 있어서, 대량증식된 신초를 구형성 배지가 든 패트리디쉬 속에서 4-6℃의 저온과, 낮의 길이 16시간, 밤의 길이 8시간, 광도 500-1000lux의 조건하에서 장기 저장함을 특징으로 하는 조직 배양기술을 이용한 무병주 씨마늘의 생산 방법.