CN1166283C - 利用植物组织培养技术生产无病毒种蒜的方法 - Google Patents

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Abstract

一种通过植物组织培养技术大规模生产无病毒的大蒜(Allium sativum L.)微鳞茎和小鳞茎的新方法，它包括：由大蒜小鳞茎的顶端分出组织衍生得到愈伤组织；由愈伤组织再生出苗；由再生苗增殖成丛生苗；通过反复继代培养扩增丛生苗；通过植物组织培养形成无病毒的微鳞茎；和最后通过将丛生苗种植于露天农田中来形成无病毒的小鳞茎。由此，随着步骤的减少，苗扩增率的提高和培养容器中苗密度的提高，可使产量大幅度提高。

Description

利用植物组织培养技术 生产无病毒种蒜的方法
                               技术领域
本发明主要涉及一种利用植物组织培养技术大规模生产无病毒大蒜的微鳞茎和小鳞茎的方法，尤其涉及一种提高产量的方法。
                               背景技术
大蒜(Allium sativum L.)是一种重要的有用蔬菜，它不仅被大量用作调味品，还被开发用于健康食品和药物。大蒜是一种通过小鳞茎进行无性繁殖的蔬菜。所以，发展大蒜新品只可能通过选育，因为杂交育种是不可能的。
和其它通过无性繁殖的植物一样，大蒜遭受严重的病毒病的侵袭。例如，大蒜很容易被导致产量和品质下降的病原体如大蒜花叶病毒(GMV)和大蒜潜伏病毒所感染。现有的农业化学药品还无法治愈这些病毒。所以，人们做过许多尝试欲通过改进种子鳞茎来解决病毒问题。到目前为止，无病毒的种蒜被认为是克服病毒病问题的最好方法。由于大蒜病毒的感染，韩国的大蒜产量减少了40～50％。
虽然利用无病毒的种蒜是一种减少病毒损害的有效方法，但是因为还没有一种能高效而经济地大量生产无病毒种蒜的方法，农民们还不能真正地利用这一技术。
为了解决病毒病问题，植物组织培养技术可被用来生产无病毒的种蒜。现在已经开发出几种利用植物组织培养技术生产无病毒种蒜的方法，它们可分为以下四种类型：第一种，由一个大蒜的小鳞茎分离得到顶端分生组织后在适宜的培养基上培养，使它衍生出一到几个苗，如1989年5月30日接受的罗马尼亚专利No.96914所述(本文中引用为“顶端分生组织培养方法”)；第二种，由顶端分生组织分离得到愈伤组织，使它增殖并分化成大蒜苗，如由Aginomoto K.K于1989年11月21日申请的日本专利申请号No.平成1-300771中所述(本文中引用为“愈伤组织培养方法”)；第三种，Sumitomo法，由日本Sumitomo Chemical公司报导于PlantCell Tissue Organ Culture 32，2，175-183(1993)，此法与顶端分生组织培养方法相似但进一步包含了通过继代培养由顶端分生组织增殖产生一个苗，(本文中引用二“Sumitomo法”)；第四种，如Nippon Seitetsu K.K公司于1989年1月31日申请的申请号为平成1-19850的日本专利所述，其中，由大蒜小鳞茎的顶端分生组织分离得到一个称作苗原基的非分化苗块，然后增殖发生成苗(本文中引用为“苗原基法”)。
为了更好地理解本发明的特征，以下结合附图进一步说明上述技术。
参见图2，这是一张表明顶端分生组织培养方法的流程图。如此流程图所示，由小鳞茎的顶端分生组织衍生出苗，然后形成微鳞茎。这一方法有几方面的缺点。首先，为获取大量的苗需要连接地对只有0.3mm或更小的小鳞茎的顶端分生组织在显微镜下进行分离，工作进程非常慢。其次，分离得到的苗分生组织在早期的存活力很弱。顶端分生组织培养法的另一个显著缺点是，所需的小鳞茎的量与欲生产的鳞茎的量一样多。此外，此方法耗时太多。例如，由分离出的苗分生组织的起始培养至形成微鳞茎需要8个月。而且，由于来源于不同的外植体，也不可能得到在遗传上同源的微鳞茎。
参见图3，这是一张愈伤组织培养方法的说明图，与苗分生组织培养方法相比，它是一次重要的改进。如图所示，此方法的主要步骤有，从大蒜小鳞茎的顶端分生组织分离得到愈伤组织，通过反复继代培养扩增愈伤组织，由此愈伤组织再生苗，然后由这些苗形成大蒜微鳞茎。同样，这一方法也有一些缺点。首先，由于继代培养次数的限制，它的生产效率较低。也就是说，为了获取足够多的愈伤组织必须进行多次的愈伤组织的继代培养，但是因为当继代培养达8次以上时，再生率显著下降，所以继代培养的次数不能超过8次。另一个重要缺点是，由于再生率的波动和相当大一部分再生的苗易于玻璃化，所以很难估计再生苗的数量。还有一个缺点是，愈伤组织的扩增率很低(4倍/月)。在本方法中由顶端分生组织分离到形成大蒜微鳞茎至少需要4个步骤和一般很长的时间，约8个月。此外，愈伤组织培养方法也难以获得在遗传上同源的再生苗。
利用以上两种方法，茎苗分生组织培养和愈伤组织培养，只能生产有限数量的无病毒大蒜微鳞茎。用少量的无病毒大蒜微鳞茎在露天农田进行种植来大规模生产大蒜。但是，在露天农田环境中大蒜的扩增率很低(5～6倍/年)，而且，一旦种植于露天农田鳞茎还是会通过昆虫煤介逐渐被病毒侵染。
参见图4，是一张Sumitomo法的流程图，此法被认为是现有的最好方法。如图所示，Sumitomo法包括由大蒜小鳞茎的苗分生组织衍生出苗，然后对苗进行几次继代培养以使苗增殖形成微鳞茎。虽然Sumitomo法可能是最好的方法，和其它方法一样，它仍有几个缺点。首先，由于外型细小而且早期存活力很低的苗分生组织必须进行连续培养，所以导致产量很低。Sumitomo法的另一个主要缺点是苗的扩增率仍很低(2.5倍/月)。再者，为了增强由苗向微鳞茎的形成必需一个很长的低温处理时间(约6个月)。从起始培养到形成微鳞茎所需的时间还是太长(12个月)。此外，不同的外植体使得此法很难得到在遗传上同源的苗。由此看出，Sumitomo法对于大规模生产无病毒的大蒜微鳞茎来说并非很经济。
现在看图5，这是苗原基法的方框图。它包括由大蒜，小鳞茎的顶端分生组织衍生出苗原基，苗原基的增殖和形成大蒜微鳞茎。在进行苗原基的诱导和增殖步骤时必须进行旋转培养。由于旋转培养设备的限制，此方法不可能大规模生产苗原基。此外，苗原基的增殖率很低(2～5倍/月)。在形成微鳞茎时必需一个低处理过程(5±2℃)。此法的另外一个主要缺点是从起始培养到形成微鳞茎的时间很长(12个月)。而且，由于来源于不同的外植体，所以不可能获得在遗传上同源的苗。
如上所述，传统的方法还无法大幅地生产无病毒大蒜微鳞茎，因而从经济上说很不合适。换句话说，利用传统的方法进行无病毒大蒜微鳞茎的工业化生产，其生产成本太高了。
                               发明内容
针对上述情况，本发明的一个主要目的是提出一种可以避免上述现有技术中的相关缺点，利用植物组织培养技术大规模生产无病毒的大蒜微鳞茎的新方法。
本发明的另一个目的是提供一种可大幅度提高产量并减少生产步骤的大规模生产无病毒大蒜微鳞茎的方法，如图1所示。
根据发明者深入而彻底的研究，上述目的可通过包括以下步骤的一种大规模生产无病毒的大蒜微鳞茎的方法来实现：由大蒜小鳞茎的顶端分生组织分离愈伤组织并进行愈伤组织的增殖；由愈伤组织再生苗；通过重复的继代培养增殖丛生苗；再由丛生苗形成无病毒的微鳞茎。
参照图1，这是一张说明根据本发明利用植物组织培养技术大规模生长无病毒大蒜微鳞茎的方法的方框流程图。如流程图所示，首先由一个大蒜小鳞茎的顶端分生组织衍生得愈伤组织并再生成苗，然后此苗再分化成丛生苗，每丛包含约100根苗。然后，丛生苗半永久性繁殖并进行形成微鳞茎。
如前所述，传统的方法适于小规模生产无病毒的大蒜微鳞茎。相反，本发明适于工业化生产无病毒的大蒜微鳞茎。对Sumitomo法来说，丛生苗的数量在2 7星期中经过4次继代培养后增至128倍，平均每月2.5倍(见，Plant Cell Tissue OrganCulture，上文)。与传统方法相反，根据本发明，通过在一个培养皿中进行丛生苗的继代培养，苗的扩增率可有大幅度提高(14～15倍/月)。因此，可利用较少的劳动力，时间和成本消耗进行无病毒大蒜微鳞茎的大规模生产。由于本发明中大规模增殖方法的改进，使得工业化大规模增殖大蒜的代良变种成为可能，而这一点由于高生产成本通过利用传统方法是不可能实现的。
体外生产真工用作种子鳞茎的小鳞茎(2～3g/球)成本很高。即使可体外大规模生产微鳞茎(0.1～0.3g/球)，但由于将它们种植于露天农田时，它们并不产生常规的鳞茎(终产物：由6～8个小鳞茎构成)而是可用作种子鳞茎的小鳞茎，将它们用作真正的种子鳞茎太小了。所以，微鳞茎的体外生产需要一个不增加小鳞茎数目的农田培养附加步骤。即，为获取常规的大蒜鳞茎，微鳞茎先在露天的农田中培养至重量达到2至3g，然后再在露天的农田中进行培养。体外生产的微鳞茎具有较好的耐受性，可以保存几个月。但是，由体外生产的微鳞茎形成种子鳞茎耗时太长，耗资也太大。
现在又发展了一个可以克服微鳞茎以上述限制的改进方法。根据本发明，通过将苗直接移栽入土壤并在露天农田中进行培养，可在一年内获取能够用作种子鳞茎的小鳞茎。为了通过在露天农田大规模培养生产小鳞茎，必须同时在土壤中种植大量的苗。为此，如果根据本发明通过植物细胞组织培养连续生产的苗被低温保存，它们可以保存至小8个月而不发生变异。由此可见，通过低温保存可以收集足够多的苗来进行向土壤中的同步移植，从而收获大量的小鳞茎。
通过以下说明将进一步阐明本发明。
由顶端分生组织分离愈伤组织及愈伤组织的扩增
各种韩国大蒜被种植入24～26℃的生长室内的土壤中，并在其中进行培养。在大蒜的生长旺盛期，在30～31℃培养7到10天，然后在36～37℃培养30到40天，以灭活植株中已有的病毒。在热处理之后，植株的气生部分和根部被去除。然后，只收集含有顶端分生组织的那一部分并用75～80％酒精灭菌5分钟，然后用漂白剂(2～3％的次氯酸钠溶液：NaOCl)处理15～20分钟。在用无苗水漂洗3或4次后，在显微镜下切割含顶端分生组织的部分以分离位于根系上部的顶端分生组织(约0.3mm或更小)。为了由顶端分生组织得到愈伤组织，将这些顶端分生组织培养在Murashige and Skoog因体培养基中(本文中引用为“MS培养基”)(参见，Murashige T.and F.Skoog，Physiol.Plant 15：473-497(1962))，其中含0.1至0.2ppm(mg/L)的2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)，一种植物生长调节因子，培养2到3个月。在与愈伤组织衍生的相同培养基中，通过多次继代培养进行愈伤组织的增殖。不论白天或是夜晚，愈伤组织衍生和增殖的适宜温度为24至26℃。
图6是生长于含有0.1mg/L的2，4-D的MS培养基的培养皿中愈伤组织的照片。
                            由愈伤组织再生苗
用于由愈伤组织再生苗的培养基(本文中引用为“苗再生培养基”)为加入了2～3％的庶糖，0.3～3.0mg/L的苄基腺嘌呤(BA)和0.7％的琼脂的MS基础培养基。在所测试的几种基础培养基中，MS培养基最适于产生出茂盛而健康的苗。图7显示了在一个培养皿中由愈伤组织再生的苗。只含有0.3～3.0mg/L的苄基腺嘌呤(BA)或同时还含有0.1mg/L的α-萘乙酸(NAA)的培养基比其它含有各种细胞分裂素和植物生长素的培养基更适于由愈伤组织组织再生苗。
苗的扩增
用于苗扩增的培养基的组成见表I。再生出的苗被转移入培养基中培养，以得到丛生苗。丛生苗的扩增率在初期很低但在继代培养2次或2次以上后变高。苗的数量在一个月内增加14～15倍，以致在一个10cm×15cm的标准培养皿中可以生长400根苗。因为苗的继代培养可连续进行3年以上而不产生任何退化或玻璃化，所以丛生苗显然可以进行半永久性继代。
用于苗扩增的培养基组成与苗再生的培养基相似，只是铵基氮的量减至MS培养基的一半，并且，同时含有0.3～3.0mg/L的苄基腺嘌呤(BA)和0.05～0.2mg/L的α-奈乙酸。
继代培养条件保持于24～26℃，4000～600(lux)勒克司光照，光照周期为16小时光/8小时暗。无论白天或夜昭，温度都保持在24～26℃。
与用传统方法生产出的苗相比，由本发明法所得到的丛生苗具有以下多方面的优良特性：第一，这些丛生苗具有发育完全的根系；第二，它们可以进行半永久性继代；第三，它们具有很高的苗密度，每培养皿约400根；最后，形成鳞茎前必需的低温保存时间短(约2个月)。尤其是，本发明与苗原基法相比在丛生苗的增殖率上尤具优势，因为利用本发明中的方法增殖出苗的数量约为每丛10根而利用苗原基法所得到的每丛只有10根。
图8是根据本发明在苗扩增培养基活跃增殖的丛生苗的照片。
由丛生苗体外形成微鳞茎
取培养基上扩增出的丛生苗的1/15，转移到另一个新鲜的苗扩增培养基中继代培养，以产生苗。其余的，即丛生苗的14/15被转移至一个用于形成大蒜微鳞茎的培养基中。在4℃贮存2个月后，将丛生苗移入培养基并形成微鳞茎。
参见图9，这是一张在一培养皿中用于形成鳞茎的在培养基上所形成的微鳞茎的照片。
用于由苗形成鳞茎的培养基(文中引用为“鳞茎形成培养基”)为加有9％的庶糖，0.1～2.0mg/L的α-乙酸，和0.7％琼脂的MS基础培养基。培养2个月后，如果每个微鳞茎的重量达到0.2g或0.2g以上就可以收获了。收获的微鳞茎需要干燥5天。将微鳞茎放入容器内以防萎缩，然后于4～5℃冰箱内保存。
培养条件维持在24～26℃，4000～6000(lux)勒克司光照，光照周期为16小时光/8小时暗。
图10显示的是保存的微鳞茎。
由丛生苗形成小鳞茎
含有100根苗的繁殖出的一大丛丛生苗被分割成每丛约含5根的小丛，然后将它们在秋天植入露天农田。在此，由于体外繁殖出的苗比较弱质，为了保证有足够的时间让它们发育根系，它们的种植时间比一般大蒜的播种期要早(10月底至11月初的几日)。在秋天经农田种植后产生的苗被低温保存过冬后在春天种入露天农田。如果不经过3个月的低温处理，春天种植的苗将不会形成微鳞茎。
大规模生产的丛生苗的长期保存
为了在露天农田中由丛生苗生产小鳞茎，因为苗在全年中连续繁殖而土壤种植每年只有1或2次，所以必须将丛生苗保存数月。丛生苗在由苗扩增培养基转移入鳞茎形成培养基后，可以在500～1500(lux)勒克司光照和16小时光/8小时暗的光周期的条件下于4至6℃低温保存至少5个月不变质。通过苗的长期保存，就可以一次使用大量的在露天农田培养生产小鳞茎时所必需的苗。
病毒测试
使用压碎的愈伤组织，丛生苗，和微鳞茎的提取物做病毒测试。利用ELSA分析法检测样品中是否含有病毒。这些分析显示，用本发明方法生产的微鳞茎，愈伤组织和丛生苗中含有极少量或不含病毒。
                                附图说明
在以下结合附图所进行的详细说明中，本发明的上述目的，其他特点和优点将得到更充分的展现，其中：
图1是说明根据本发明的大规模生产无病毒的大蒜微鳞茎方法的方框流程图，(丛生苗法)；
图2是说明被称作苗分生组织培养法的传统的生产无病毒大蒜微鳞茎方法的方框流程图；
图3是说明另一个被称作愈伤组织培养法的传统的生产无病毒大蒜微鳞茎方法的方框流程图；
图4是说明另一个被称作Sumitomo法的传统的生产无病毒大蒜微鳞茎方法的方框流程图；
图5是说明另一个称作苗原基法的传统的生产无病毒大蒜微鳞茎方法的方框流程图；
图6是根据本发明在培养皿中培养基上增殖的愈伤组织的照片；
图7是根据本发明在一培养皿中培养基上再生的苗的照片；
图8是根据本发明在一培养皿中培养基上增殖的丛生苗的照片；
图9是根据本发明在一培养皿中培养基上形成的大蒜微鳞茎的照片；和
图10是根据本发明所保藏的大蒜微鳞茎的照片。
                            具体实施方式
以下实施例将进一步阐明本发明，而不限定本发明的范围。
实施例I
           由顶端分生组织衍生愈伤组织及其扩增
各种韩国大蒜被种植入25℃的生长室内的土壤中，并在其中进行培养。在大蒜生长旺盛期，大蒜植株在30～31℃培养7至10天，然后在36～37℃培养30至40天，以灭活已经存在于植株中的病毒。热处理之后，去除植株的气生部分和根部。只收集包含了顶端分生组织的部分并用70％的酒精灭菌5分钟。然后，用5％的商品漂白剂(次氯酸钠，NaOCl，“Yuhan RaxR”Yuhan Yanghang Co.Ltd.Koreov生产)处理15分钟。用无苗水漂洗3次之后，在显微镜下切割含顶端分生组织部分以分离位于根系上部的顶端分生组织。为了能衍生出愈伤组织，这些顶端分生组织在一个10cm×1.5cm的培养皿中，于适宜的培养基中培养3个月(图6)。用于衍生愈伤组织的培养基为加有2％的庶糖，0.1mg/L的2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)，和0.7％琼脂的MS基础培养基，并且在灭菌前调节至一个酸性pH5.8。苗再生条件为：25℃，4000～6000(lux)勒克司光照，16小时光/8小时暗的光照周期。
通过在与愈伤组织衍生培养基相同的培养基上进行至少2次继代培养来扩增愈伤组织。继代培养条件与由顶端分生组织衍生愈伤组织的培养条件相同。
如下所述，扩增的愈伤组织被用来分化形成苗。
实施例II
                           由愈伤组织再生苗
用于由愈伤组织再生苗的培养基为加有2～3％蔗糖，1.0mg/L的苄基腺嘌呤和0.7％琼脂的MS基础培养基。一丛由实施例1获得的愈伤组织被切割成大小均一的小丛。它们被转移于再生苗培养基上培养2～3月以再生成如图7所示的苗。苗再生条件为：25℃，4000～6000(lux)勒克司光照，16小时光/8小时暗的光周期。
实施例III
                               苗的扩增
用于苗扩增的培养基组成如表1所示，同样的培养基还被用于由实施例II所获得的苗发育成丛生苗。苗扩增培养基与MS基础培养基相同，除了铵基氮的含量减至MS培养基的一半，而且它也含有2％的庶糖，1mg/L的苄基腺嘌呤(BA)，0.1mg/L的α-萘乙酸(NAA)和0.7％的琼脂。
在丛生苗发育早期选择合适的丛生苗移入新鲜的培养基。在初期，丛生苗的扩增率很低但在继代培养2次以上后会提高。一个月内苗的数量增至15倍，所以如图8所示，在一个10cm×1.5cm的培养皿中可生长400根(计数0.5cm或更大的)苗。
为了高倍数的扩增苗需重复进行继代培养。更详细地说，含100根苗的一丛被分割成含5根的许多小丛。3或4小丛被移入一个新鲜的扩增培养基中培养5星期，再培养最后发育成为丛生苗。因为扩增率为15倍/月所以从理论上说，只需5至6次重复的继代培养，就可从一根苗获得几百万根苗。即使连续重复继代培养2年以上，苗也不会退化和出现异常。
培养条件为：25℃，4000～6000(lux)勒克司光照和16小时光/8小时暗的光照周期。
                   表1用于丛生苗增殖的培养基
  成份                                     浓度
大量元素
硝酸钾                                   18.8mM
硝酸铵                                   10.3mM
氯化钙                                   3.0mM
硫酸镁                                   1.5mM
磷酸二氢钾                               1.3mM
硫酸亚铁                                 1.3mM
[乙二胺四乙酸二钠]
微量元素
硫酸锰                                   0.1mM
硼酸                                     0.1mM
硫酸锌                                   30.0μM
碘化钾                                   5.0μM
钼酸钠                                   1.0μM
硫酸铜                                   0.1μM
氯化钴                                   0.1μM
有机物和维生素
肌醇                                     0.56mM
甘氨酸                                   26.64μM
烟酸                                     4.06μM
维生素B6盐酸盐                          2.43μM
维生素B1                                  0.30μM
生长调节素
BA(苄基腺嘌呤)                             1.0ppm(mg/
                                           L)
NAA(α-萘乙酸)                             0.1ppm(mg/
                                           L)
实施例IV
                        由丛生苗体外形成微鳞茎
取在扩增培养基上增殖的丛生苗的1/15转移至另一个新鲜的扩增培养基中培养以再增殖苗。其余的，即丛生苗的14/15移入一个用于形成大蒜微鲜茎的培养基中。用于由苗形成微鳞茎的培养基为含有9％的蔗糖，0.5mg/L的α-萘乙酸(NAA)和0.7％的琼脂的MS培养基。
4℃保存2个月后，增殖的丛生苗被移入培养基中培养，形成微鳞茎。当微鳞茎长至2g重时，将它们干燥5天。干燥的微鳞茎为防其萎缩而放入一个密封容器中，然后在4～5℃冰箱内保存。(图10)。
培养条件为：25℃，4000～6000(lux)勒克司光照和16小时光/8小时暗的光照周期。
实施例V
                       由丛生苗形成小鳞茎
将含100根苗的一大丛丛生苗分割成含5根的小丛，将小丛于秋天植入露天农田。在此，由于通过组织培养的方法增殖出的苗比较弱质，为确保有充分的时间让它们发育根系，所以它们在露天农田的植入时间比一般的大蒜插种期要早(10月底至11月初的几天)。在秋天种植后长出的苗经低温保存过冬在春天植入露天农田。如果不经过低温处理，春天种植的苗将不能形成小鳞茎。
实施例VI
               大规模生产的丛生苗的长期保存
由实施例IV获得的丛生苗被分割成小份，然后在含有新鲜的适于丛生苗增殖的培养基的培养皿中培养5周。结果，每个培养皿中可形成400根苗。在下述条件下，无需新的处理，这些培养皿至少可保存5个月：在4,000至6,000(lux)勒克司的光强度下光照16小时，温度维持在4至6℃。通过苗的长期保存，可以一次使用大量的在露天农田中培养生产小鳞茎所需的苗。
实施例VII
                               病毒测试
使用压碎的愈伤组织，丛生苗和微鳞茎进行病毒测试。利用ELISA分析法检测样品中有无病毒。
用购自Agdia Co.Ltd.，U.S.A.的ELISA试剂盒检查大蒜花叶病毒。分析显示，将不含病毒的负对照设至为0时，用本发明方法生产的微鳞茎在405nm波长处，由ELISA读数器显示的吸收数值为0至0.002。作为比较，在露天农田中培养的一般大蒜的该值为1.5，表明存在严重的病毒感染。
如前所述，根据本发明中的方法，大蒜的苗可以半永久性地大规模增殖。此外，本发明可以将生产步骤与周期相应减至2步和3个月。由此，就可以低成本地大规模生产无病毒的大蒜微鳞基。
以下将本发明方法与传统方法的主要区别概括如表2。
                               表2
方法            基因同源性  增殖中间体 扩增率   继代培养    步骤数    培养周期
                                       (倍/月)   次数限制              (月)1
对端分生        不同源      无          -        -           3-4        8
组织培养
愈伤组织培养    可能同源    愈伤组织   4-5       受限制      3-4        8
                                                 (～8次)
Sumitomo        不同源      苗         2-5       受限制      3-4        12
                                                 (～4次)
苗原基法        可能同源    苗原基     2-5       -           3-4
本发明          同源        丛生苗     14-15     半永久性    2          3
1.指重复的起始步骤至最终步骤(不包括冷处理周期)所需的时间。
在阅读本文之后通过一般技术的实施，本发明的其它特点，优点和实施方法将是显而易见的。因此，虽然详细描述了本发明的特定实施方法，但就这些方法的改变与修改也是有效的，且并不违背本发明的说明及权利要求中的精神与范围。

Claims (6)

1.一种生产无病毒的大蒜(Allium sativum L.)的微鳞茎和小鳞茎的方法，所述方法包括：
由大蒜的顶端分生组织衍生得到愈伤组织；
由愈伤组织再生出苗；
由再生苗扩增出丛生苗；
通过重复的继代培养扩增丛生苗；以及
由继代培养的丛生苗通过植物组织培养形成无病毒微鳞茎或通过在露天农田培养形成无病毒小鳞茎；
所述微鳞茎的重量为0.1-0.3g/球，所述小鳞茎的重量为2-3g/球。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征还在于，其中的植物组织培养技术包括：将含100根苗的大丛分割成含5根的小丛，将4小丛移入扩增培养基，并在该培养基上培养，以及通过以三个月为周期为期两年的重复继代培养来扩增苗。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征还在于，其中的苗扩增培养基与MS基础培养基相同，但铵基氮含量减至MS培养基的一半，而且还含有2～3％重量的蔗糖，0.3～3.0mg/L的苄基腺嘌呤，和0.05～0.2mg/L的α-萘乙酸。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征还在于，其中以在500～1500勒克司光强度和4℃下预处理丛生苗2个月来促进微鳞茎的形成。
5.根据权利要求要求4所述的方法，其特征在于，其中用于鳞茎形成的培养基以MS基础培养基为基础，还含有9％重量的蔗糖和0.1～2.0mg/L的α-萘乙酸。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征还在于，它还包括：在形成微鳞茎这一步骤，在4-6℃，500～1000勒克司光照，光照周期为16小时光/8小时暗的条件下，于一个含有鳞茎形成培养基的培养容器中将丛生苗保存2个月这一步骤。
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