CN113826550A - 一种樟树体细胞胚胎发生与组织培养的方法 - Google Patents

一种樟树体细胞胚胎发生与组织培养的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种樟树体细胞胚胎发生与组织培养的方法，属于植物组织培养技术领域。该方法包括以下步骤：采集未成熟的果实作为外植体，经消毒后，切开果实，取出未成熟的合子胚；经体细胞胚和胚性愈伤组织的诱导培养，体细胞胚和胚性愈伤组织的增殖、成熟与萌发、体胚苗的繁育培养和生根培养得到种苗；体细胞胚和胚性愈伤组织的增殖、成熟与萌发是通过体胚增殖、成熟和萌发通用培养基在同一阶段实现樟树体细胞胚和胚性愈伤组织转化生成体胚苗。本发明提供的体胚增殖、成熟和萌发通用培养基可在3‑4个月实现樟树胚性愈伤组织转化生成体胚苗，约6个月便可获得大量生根樟树体胚苗，具有操作工序节省、效率高、使用简便的优点。

Description

一种樟树体细胞胚胎发生与组织培养的方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种樟树体细胞胚胎发生与组织培养的方法。
背景技术
樟树(Cinnamomum camphora)属樟科(Lauraceae)樟属植物，又名香樟，常绿高大乔木，是我国国家二级重点保护野生植物。樟树是珍贵的阔叶树生物资源，对于全球的经济和生态系统都具有非常重要的作用。樟树是我国亚热带常绿阔叶林中重要组成树种，也是我国重要的材用和特种经济树种。樟木是我国四大名木之一，其木材质优，色泽明亮，纹理交错，兼具特殊的芳香气味，抗虫蛀，耐水湿，保存期长等优点，在家具，雕刻，建筑等领域的用材方面扮演着重要的角色。樟树富含精油，也是重要的香料工业原料林树种，其根、木材、枝、叶、及种子均可以提取樟油，是医药、日用化工及香精香料工业的原料。樟树枝叶繁茂、树形优美，能吸烟滞尘，固土防风是城市园林绿化的优良树种，广泛作为行道树、遮阴树及防风林等，其次樟树所散发的芳香性气味，有净化空气的能力，常被用于城市及矿区绿化。
植物体细胞胚胎发生(Somatic embryogenesis)是指在离体培养条件下，双倍或单倍的体细胞未经性细胞融合而通过与合子胚发生类似的途径发育成新植株的形态发生过程。体细胞胚胎发生是植物现代生物技术中一种无性繁殖的方法，能够用于珍稀种质资源的冷冻保存和基因编辑在内的遗传转化。现有技术从樟树体胚的诱导到体胚萌发通过5个阶段：(1)体胚的诱导；(2)体胚或胚性愈伤组织的增殖；(3)樟树体胚或胚性愈伤组织的成熟培养；(4)樟树体胚的萌发；(5)体胚的生根。目前，体细胞胚胎发生用于大规模繁育优质阔叶树种的实践应用关键步骤在于胚胎的成熟、萌发以及幼苗转换阶段。成熟的体细胞胚胎发生技术有繁殖系数高、速度快、结构完整、再生率高、不受季节限制，可发育成母本性状相同的植株等优点，现已成为林木无性快繁的一种重要生物技术手段。
在现有樟树体胚再生技术中：杜丽等(2006)以未成熟幼胚为外植体，经2年对初生胚的继代培养获得胚性愈伤组织，其MS培养基添加的植物外源激素为1.0mg/L BA、0.1mg/L2，4-D；将胚性愈伤组织转入培养基2[MS+1000mg/L ME(麦芽提取物)+1.0mg/LNAA，蔗糖30g/L，琼脂粉为7.5g/L]进行体胚诱导，6周之后将培养物转入促使其发育的培养基3(MS+0.1mg/L NAA+3.0mg/L BA+1mL/L Km-8p有机物)，4周之后将长大的体胚转入培养基4(MS+0.1mg/L NAA+1.0mg/L BA+1.0mg/L GA3)诱导不定芽的生长。培养4周之后将诱导出的不定芽切离母体转入培养基5(MS+0.1mg/L NAA+0.5mg/L BA+0.5mg/L GA3)诱导其生长，之后将茎切段(长度为2～3cm)转入培养基6(MS+1.0mg/L IBA)诱导生根，形成完整植株。培养温度为(24±2)℃，每天光照16h，光照强度为1000lx左右。
Shi等2009年对樟树体胚再生体系进行了优化：未成熟合子胚为外植体经蔗糖溶液高渗体细胞胚诱导3-4周获得初生胚；初生胚在含0.5mg/L NAA的MS培养基中以次生胚发生的方式快速增殖；次生胚难以萌发，需先用含0.5mg/L ABA的MS培养基进行成熟诱导2月，然后再转入萌发培养基(MS+0.1mg/L TDZ+0.2mg/L IBA)培养2个月获得体胚苗。
申请号为2019112839284公开了一种浙江樟体胚发生与植株再生方法，但其仍需经过上述几个阶段，过程复杂。
植物激素体细胞发生的诱导作用在理论和实践方面占据重要的地位，培养基中外源激素的种类、浓度和处理时间对体细胞的诱导及进一步的发育都产生很大的影响，因此添加适宜的植物外源激素是植物体胚转苗发育过程的关键影响因素。现有樟树体胚发生技术中，通过胚性愈伤组织增殖、诱导成熟体细胞胚、萌发成体胚苗存在过程复杂，所需时间长，技术尚不成熟，胚性愈伤组织和体胚易褐化、畸形胚多，转苗率低等问题。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种樟树体细胞胚胎发生与组织培养的方法。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种樟树体细胞胚胎发生与组织培养的方法，包括以下步骤：采集未成熟的果实作为外植体，经消毒后，切开果实，取出未成熟的合子胚；经体细胞胚和胚性愈伤组织的诱导培养，体细胞胚和胚性愈伤组织的增殖、成熟与萌发、体胚苗的繁育培养和生根培养得到种苗；体细胞胚和胚性愈伤组织的增殖、成熟与萌发是通过体胚增殖、成熟和萌发通用培养基在同一阶段实现樟树体细胞胚和胚性愈伤组织转化生成体胚苗。
进一步的，体胚增殖、成熟和萌发通用培养基是以MS为基本培养基，添加有6-苄基腺嘌呤0.2mg/L、噻苯隆0.1mg/L、吲哚丁酸0.2mg/L、活性炭0.6g/L、蔗糖30g/L和卡拉胶6.5g/L；培养基pH值为6.0。
进一步的，樟树体细胞胚胎发生与组织培养的方法，具体包括以下步骤：
1)外植体的采集与消毒：采集未成熟的果实作为外植体，经消毒后，切开果实，取出未成熟的合子胚；
2)体细胞胚和胚性愈伤组织的诱导培养：将消毒后的未成熟合子胚置于0.5M蔗糖灭菌溶液，4℃冷处理72h；然后接种于体胚诱导培养基，得到体细胞胚和胚性愈伤组织；体胚诱导培养基以MS为基本培养基，添加有6-苄基腺嘌呤、2，4D-二氯苯氧乙酸、水解酪蛋白、活性炭、蔗糖和卡拉胶；
3)体细胞胚和胚性愈伤组织的增殖、成熟与萌发：将步骤2)得到的体细胞胚和胚性愈伤组织分别置于体胚增殖、成熟与萌发通用培养基上直至萌发出体胚苗，其中，胚性愈伤组织每隔2周接种一次实现胚性愈伤组织的保持与增殖，培养6-8周实现体胚的成熟诱导，并萌发出体胚苗；子叶期的体细胞胚每隔3周接种一次实现次生胚的增殖，培养6-8周萌发出体胚苗；体胚增殖、成熟与萌发通用培养基是以MS为基本培养基，添加有6-苄基腺嘌呤、噻苯隆、吲哚丁酸、活性炭、蔗糖和卡拉胶；
4)体胚苗繁育培养：将步骤3)得到的体胚苗置于芽增殖培养基上培养得到长势良好的不定芽，芽增殖培养基是以MS为基本培养基，添加有6-苄基腺嘌呤、噻苯隆、萘乙酸、活性炭、蔗糖和卡拉胶；
5)体胚苗的生根培养：将长势良好的不定芽置于生根培养基中诱导生根得到种苗，生根培养基是以1/2MS为基本培养基，添加有吲哚丁酸、萘乙酸、活性炭、蔗糖和卡拉胶。
步骤1)中，外植体的采集与消毒的步骤具体为：采集未成熟的果实作为外植体，自来水冲洗15-20min后，移至超净工作台上；75％的酒精侵泡45秒，用无菌水冲洗2次，0.1％升汞消毒7分钟，无菌水冲洗4次后，切开果实，取出未成熟合子胚，要注意保持合子胚的完整性。
步骤2)中，体胚诱导培养基以MS为基本培养基，添加有6-苄基腺嘌呤1mg/L、2，4D-二氯苯氧乙酸0.2mg/L、水解酪蛋白600mg/L、活性炭0.6g/L、蔗糖30g/L和卡拉胶6.5g/L，培养基pH值为6.0。
步骤3)中，体胚增殖、成熟与萌发通用培养基是以MS为基本培养基，添加有6-苄基腺嘌呤0.2mg/L、噻苯隆0.1mg/L、吲哚丁酸0.2mg/L、活性炭0.6g/L、蔗糖30g/L和卡拉胶6.5g/L；培养基pH值为6.0。
步骤4)中，芽增殖培养基是以MS为基本培养基，添加有6-苄基腺嘌呤1.2mg/L、噻苯隆0.02mg/L、萘乙酸0.2mg/L、蔗糖30g/L和卡拉胶6.5g/L，培养基pH值为6.0。
步骤5)中，生根培养基是以1/2MS为基本培养基，添加有吲哚丁酸2mg/L、萘乙酸0.1mg/L、活性炭0.6g/L、蔗糖30g/L和卡拉胶6.5g/L，培养基pH值为6.0。
步骤2)至步骤5)中，培养基的培养条件为：培养温度为25-26℃，光照强度1200lux，光照周期为12h光照/12h黑暗。
步骤2)至步骤5)中，MS为植物用培养基，其配方为：
Figure BDA0003245028680000041
Figure BDA0003245028680000051
在获得种苗后进行炼苗移栽，将种苗室温条件下室内炼苗3-5天，洗净根部的培养基，移栽置灭菌后的蛭石∶珍珠岩∶泥炭土为1∶1∶1的基质中，罩上薄膜，2周后去膜，培养2个月后，移栽至大棚进行管理。
有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：
1)在现有技术中，樟树体胚的增殖，体胚的成熟，体胚的萌发三个阶段是通过3种不同的培养基进行培育的，从愈伤组织到获得体胚萌发需要6-8个月的时间，再经过体胚苗增殖和生根培养，最终获得生根苗所需时间约1年。与现有技术相比，本发明提供的体胚增殖、成熟和萌发通用培养基可在3-4月实现樟树胚性愈伤组织转化生成体胚苗，约6个月便可获得大量生根樟树体胚苗，具有操作工序节省、效率高、使用简便的优点。
2)在本发明提供的樟树胚胚增殖、成熟及萌发通用培养基培，是在MS基本培养基中同时添加了3中一定浓度植物外源激素：细胞分裂素6-BA和TDZ及生长素IBA，可同时实现体胚或胚性愈伤组织的增殖、成熟及萌发，简化了樟树体胚再生体系的操作流程，缩短了组培时间，大大提高了效率。
附图说明
图1为樟树体胚的增殖、萌发与体胚苗扩繁图；图中，A：胚性愈伤组织的增殖与萌发；B：次生胚的增殖与萌发；C：体胚苗的扩繁。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。以下实施例中如无特殊说明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
1、外植体的采集与消毒
未成熟的果实作为外植体，自来水冲洗15-20min后，移至超净工作台上；75％的酒精侵泡45秒，用无菌水冲洗2次，0.1％升汞消毒7分钟，无菌水冲洗4次后，切开果实，取出未成熟合子胚(注意保持合子胚的完整性)。
2、体细胞胚和胚性愈伤组织的诱导
将上述合子胚放入0.5M蔗糖灭菌溶液，4℃冷处理72h；然后接种于体胚诱导培养基上30天左右诱导出体细胞胚，60天左右诱导出胚性愈伤组织。培养温度为25-26℃，光照强度1200lux，光照周期为12h/12h(光/暗)。体胚诱导培养基以MS为基本培养基，添加植物激素包括：6-苄基腺嘌呤(6-BA)1mg/L、2，4D-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.2mg/L。添加水解酪蛋白600mg/L、活性炭0.6g/L。蔗糖和卡拉胶的浓度分别为30g/L和6.5g/L。培养基pH值为6.0。
3、体细胞胚和胚性愈伤组织的增殖、成熟与萌发：
将步骤2得到的体细胞胚和黄色颗粒状的胚性愈伤组织分别置于体胚增殖、成熟与萌发通用培养基上。胚性愈伤组织通过每隔2周接种一次可实现胚性愈伤的保持与增殖；胚性愈伤组织培养6周-8周左右实现体胚的成熟诱导，并萌发出体胚苗(图1)。同样，子叶期的体细胞胚通过每隔3周接种一次可实现次生胚的增殖；体细胞胚培养6-8周左右得到体胚苗。体胚增殖、成熟与萌发通用培养基是以MS为基本培养基，添加植物激素6-BA 0.2mg/L、噻苯隆(TDZ)0.1mg/L、吲哚丁酸(IBA)0.2mg/L，活性炭0.6g/L，蔗糖和卡拉胶的浓度分别为30g/L和6.5g/L。培养基pH值为6.0。培养温度为25-26℃，光照强度1200lux，光照周期为12h/12h(光/暗)。
4、体胚苗繁育培养：
将步骤3得到的体胚苗置于芽增殖培养基上得到大量的不定芽。芽增殖培养基是以MS为基本培养基，添加植物激素6-BA 1.2mg/L、噻苯隆(TDZ)0.02mg/L、萘乙酸(NAA)0.2mg/L。添加，蔗糖30g/L和卡拉胶6.5g/L。培养基pH值为6.0。培养温度为25-26℃，光照强度1200lux，光照周期为12h/12h(光/暗)。
5、体胚苗的生根培养：
将步骤4得到的长势良好的不定芽置于生根培养基中诱导生根。生根培养基是以1/2MS为基本培养基，添加植物激素IBA 2mg/L、NAA 0.1mg/L。添加活性炭0.6g/L，蔗糖30g/L和卡拉胶6.5g/L。培养基pH值为6.0。培养温度为25-26℃，光照强度1200lux，光照周期为12h/12h(光/暗)。得到的种苗健壮，生根率在95％以上。
6、炼苗移栽：
将步骤5得到的长势良好的生根苗(约4cm高)室内炼苗3-5天，温度25℃左右。洗净根部的培养基，移栽置灭菌后的蛭石∶珍珠岩∶泥炭土为1∶1∶1的基质中，罩上薄膜。2周后去膜，培养2个月后，移栽至大棚进行管理。
本申请可在3-4月实现樟树胚性愈伤组织转化生成体胚苗，约6个月便可获得大量生根樟树体胚苗，具有操作工序节省、效率高、使用简便的优点。

Claims (10)

1.一种樟树体细胞胚胎发生与组织培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：采集未成熟的果实作为外植体，经消毒后，切开果实，取出未成熟的合子胚；经体细胞胚和胚性愈伤组织的诱导培养，体细胞胚和胚性愈伤组织的增殖、成熟与萌发、体胚苗的繁育培养和生根培养得到种苗；所述体细胞胚和胚性愈伤组织的增殖、成熟与萌发是通过体胚增殖、成熟和萌发通用培养基在同一阶段实现樟树体细胞胚和胚性愈伤组织转化生成体胚苗。
2.根据权利要求1所述的樟树体细胞胚胎发生与组织培养的方法，其特征在于，所述体胚增殖、成熟和萌发通用培养基是以MS为基本培养基，添加有6-苄基腺嘌呤0.2mg/L、噻苯隆0.1mg/L、吲哚丁酸0.2mg/L、活性炭0.6g/L、蔗糖30g/L和卡拉胶6.5g/L；培养基pH值为6.0。
3.根据权利要求1所述的樟树体细胞胚胎发生与组织培养的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1)外植体的采集与消毒：采集未成熟的果实作为外植体，经消毒后，切开果实，取出未成熟的合子胚；
2)体细胞胚和胚性愈伤组织的诱导培养：将消毒后的未成熟合子胚置于0.5M蔗糖灭菌溶液，4℃冷处理72h；然后接种于体胚诱导培养基，得到体细胞胚和胚性愈伤组织；所述体胚诱导培养基以MS为基本培养基，添加有6-苄基腺嘌呤、2，4D-二氯苯氧乙酸、水解酪蛋白、活性炭、蔗糖和卡拉胶；
3)体细胞胚和胚性愈伤组织的增殖、成熟与萌发：将步骤2)得到的体细胞胚和胚性愈伤组织分别置于体胚增殖、成熟与萌发通用培养基上直至萌发出体胚苗；其中，胚性愈伤组织每隔2周接种一次实现胚性愈伤组织的保持与增殖，培养6-8周实现体胚的成熟诱导，并萌发出体胚苗；子叶期的体细胞胚每隔3周接种一次实现次生胚的增殖，培养6-8周萌发出体胚苗；所述体胚增殖、成熟与萌发通用培养基是以MS为基本培养基，添加有6-苄基腺嘌呤、噻苯隆、吲哚丁酸、活性炭、蔗糖和卡拉胶；
4)体胚苗繁育培养：将步骤3)得到的体胚苗置于芽增殖培养基上培养得到长势良好的不定芽，所述芽增殖培养基是以MS为基本培养基，添加有6-苄基腺嘌呤、噻苯隆、萘乙酸、活性炭、蔗糖和卡拉胶；
5)体胚苗的生根培养：将长势良好的不定芽置于生根培养基中诱导生根得到种苗，生根培养基是以1/2MS为基本培养基，添加有吲哚丁酸、萘乙酸、活性炭、蔗糖和卡拉胶。
4.根据权利要求3所述的樟树体细胞胚胎发生与组织培养的方法，其特征在于，步骤1)所述的外植体的采集与消毒的步骤具体为：采集未成熟的果实作为外植体，自来水冲洗15-20min后，移至超净工作台上；75％的酒精侵泡45秒，用无菌水冲洗2次，0.1％升汞消毒7分钟，无菌水冲洗4次后，切开果实，取出未成熟合子胚。
5.根据权利要求3所述的樟树体细胞胚胎发生与组织培养的方法，其特征在于，步骤2)中，体胚诱导培养基以MS为基本培养基，添加有6-苄基腺嘌呤1mg/L、2，4D-二氯苯氧乙酸0.2mg/L、水解酪蛋白600mg/L、活性炭0.6g/L、蔗糖30g/L和卡拉胶6.5g/L，培养基pH值为6.0。
6.根据权利要求3所述的樟树体细胞胚胎发生与组织培养的方法，其特征在于，步骤3)中，体胚增殖、成熟与萌发通用培养基是以MS为基本培养基，添加有6-苄基腺嘌呤0.2mg/L、噻苯隆0.1mg/L、吲哚丁酸0.2mg/L、活性炭0.6g/L、蔗糖30g/L和卡拉胶6.5g/L；培养基pH值为6.0。
7.根据权利要求3所述的樟树体细胞胚胎发生与组织培养的方法，其特征在于，步骤4)中，芽增殖培养基是以MS为基本培养基，添加有6-苄基腺嘌呤1.2mg/L、噻苯隆0.02mg/L、萘乙酸0.2mg/L、活性炭0.6g/L、蔗糖30g/L和卡拉胶6.5g/L，培养基pH值为6.0。
8.根据权利要求3所述的樟树体细胞胚胎发生与组织培养的方法，其特征在于，步骤5)中，所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，添加有吲哚丁酸2mg/L、萘乙酸0.1mg/L、活性炭0.6g/L、蔗糖30g/L和卡拉胶6.5g/L，培养基pH值为6.0。
9.根据权利要求3所述的樟树体细胞胚胎发生与组织培养的方法，其特征在于，步骤2)至步骤5)中，培养基的培养条件为：培养温度为25-26℃，光照强度1200lux，光照周期为12h光照/12h黑暗。
10.根据权利要求3所述的樟树体细胞胚胎发生与组织培养的方法，其特征在于，在获得种苗后进行炼苗移栽，将种苗室温条件下室内炼苗3-5天，洗净根部的培养基，移栽置灭菌后的蛭石∶珍珠岩∶泥炭土为1∶1∶1的基质中，罩上薄膜，2周后去膜，培养2个月后，移栽至大棚进行管理。
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