CN114586687A - 一种咖啡体胚培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种咖啡体胚培养基。所述咖啡体胚培养基包括分化成熟培养基、萌发培养基；所述的分化成熟培养基以每升计算，其制备方法为：在WPM培养基母液加入2.26～4.52μmol的NAA、7.76～9.84μmol的6‑BA、1.33～4.65μmol的GA3和30～90g的蔗糖后用水定容至于一升，调节PH值为5.8～6.0后加入3～9g的卡拉胶；所述萌发培养基以每升计算，其制备方法为在WPM培养基母液加入4.92～12.76μmol的KT和30g的蔗糖后用水定容至于一升，调节PH值为5.8～6.0后加入0～3g的活性炭和3g的卡拉胶。本发明所述的咖啡体胚培养基具有在咖啡体胚培养再生过程中降低体胚畸形率、提高体胚成熟率和萌发成苗率的优点。

Description

一种咖啡体胚培养基
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术，具体涉及一种用于改良咖啡体胚质量的咖啡体胚培养基。
背景技术
咖啡为茜草科咖啡属多年生常绿灌木或小乔木，是世界三大饮料作物之一，其在全球的消耗量约比可可大三倍，比茶叶大四倍；且在国内市场上，随着东西方文化的相互渗透及人民生活水平的日益提高，国内的咖啡消费量增长至10多万吨/年，而生产量仅占消费量的20％，所以逐步发展优质咖啡种植业具有广阔的市场前景。
商业栽培的咖啡品种主要包括小粒种和中粒种。其中小粒种咖啡是自花授粉植物，优良株系可通过种子进行繁殖，但品种选育周期长，繁育效率低。中粒种咖啡为异花授粉植物，其后代变异性大。目前，咖啡优良的繁殖主要以扦插繁殖为主，而扦插繁殖不仅容易导致病毒迭代累积，而且插条材料只能选用未木栓化的直生嫩枝，且咖啡树单株直生枝数量较少，进而导致优良咖啡品种无法满足市场需求，因此迫切需要找到一种能快速、高效生产咖啡种苗的途径和方法。
植物组织培养是近几十年发展起来的一项无性繁殖技术，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞等，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
近年，虽然已有利用咖啡叶片通过间接体胚发生方式成功诱导产生胚性细胞的相关报道，但在诱导体胚成熟和萌发过程中存在的体胚畸形率高、萌发成苗率低等限制咖啡高效繁育再生植株的问题仍然存在。
发明内容
基于此，本发明的目的在于，提供一种咖啡体胚培养基，其具有在咖啡体胚成熟阶段降低体胚畸形率和提高体胚成熟率，并在咖啡体胚萌发成苗阶段提高体胚萌发率和体胚成苗率的优点。
本发明提供一种咖啡体胚培养基，包括分化成熟培养基和萌发培养基，其中：
所述的分化成熟培养基以每升计算，其制备方法为：在WPM培养基母液加入2.26～4.52μmol的NAA、7.76～9.84μmol的6-BA、1.33～4.65μmol的GA3和30～90g的蔗糖后用水定容至一升，调节PH值为5.8～6.0后加入3～9g的卡拉胶；
所述的萌发培养基以每升计算，其制备方法为：在WPM培养基母液加入4.92～12.76μmol的KT和30g的蔗糖后用水定容至一升，调节PH值为5.8～6.0后加入0～3g的活性炭和3g的卡拉胶。
本发明中，所述NAA是1-萘乙酸的简称；所述6-BA是6-苄氨基嘌呤的简称；所述GA3是赤霉素的简称；所述KT是6-糠氨基嘌呤的简称。本发明中，所述WPM培养基是适用于木本植物的培养基，其配方为硝酸铵(NH4NO3)400mg/L、硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O)556mg/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)170mg/L、七水合硫酸镁(MgSO4·7H2O)370mg/L、硫酸钾(K2SO4)990mg/L、无水氯化钙(CaCl2)72.47mg/L、硫酸锰(MnSO4·4H2O)22.3mg/L、七水合硫酸锌(ZnSO4·7H2O)8.6mg/L、碘化钾(KI)0.83mg/L、硼酸(H3BO3)6.2mg/L、钼酸钠(NaMoO4·2H2O)0.25mg/L、氯化钴(CoCl2·6H2O)0.025mg/L、硫酸铜(CuSO4)0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠盐(Na2-EDTA)37.3mg/L、七水合硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)27.8mg/L、烟酸VB5 0.5mg/L、盐酸硫胺素VB10.1mg/L、盐酸吡哆醇VB6 0.5mg/L、甘氨酸2mg/L、肌醇100mg/L。
与现有技术相比，本发明所述的咖啡体胚培养基，通过在咖啡体胚分化成熟阶段调整培养基中蔗糖和卡拉胶的浓度对培养基的渗透压进行调控，达到降低体胚畸形率和提高体胚成熟率的目的，并通过在咖啡体胚萌发培养阶段调整吸附剂活性炭的浓度以提高体胚萌发率。
进一步地，所述分化成熟培养基以每升计算，其制备方法为：在WPM培养基母液加入4.52μmol的NAA、9.84μmol的6-BA、4.65μmol的GA3和30～90g的蔗糖后用水定容至一升，调节PH值为5.8～6.0后加入3～9g的卡拉胶；所述的萌发培养基以每升计算，其制备方法为：在WPM培养基母液加入4.92μmol的KT和30g的蔗糖后用水定容至一升，调节PH值为5.8～6.0后加入0～3g的活性炭和3g的卡拉胶。
进一步地，所述分化成熟培养基中以每升计算，添加蔗糖的量优选为45～75g，更优选为60～75g/。
进一步地，所述分化成熟培养基中以每升计算，添加卡拉胶的量优选为6～9g，更优选为6g。
进一步地，所述萌发培养基中以每升计算，添加活性炭的量优选为1～3g，更优选为2～3g。
进一步地，所述咖啡体胚培养基还包括成苗培养基，所述的成苗培养基以每升计算，其制备方法为：在WPM培养基母液加入30g的蔗糖后用水定容至一升，调节PH值为5.8～6.0后加入0～3g的活性炭和3g的卡拉胶。
进一步地，所述成苗培养基中以每升计算，添加活性炭的量优选为1～3g，更优选为2～3g。
附图说明
为使本发明的技术方案更清楚明白，本发明提供如下附图说明：
图1为小粒种咖啡组织培养再生的不同阶段，其中a是作为外植体的小粒种咖啡叶片，b是初级愈伤组织诱导阶段，c为胚性愈伤组织诱导阶段，d是胚性愈伤组织悬浮培养阶段，e是体胚分化成熟阶段，f是体胚萌发阶段。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
基础实施例：
一种咖啡组织悬浮培养再生的方法，包括以下步骤：
(1)咖啡体胚分化成熟培养
本实施例以小粒种咖啡叶片作为外植体材料，按常规方法诱导得到胚性愈伤组织后悬浮培养，并以悬浮细胞诱导分化出的球形胚作为本发明的起始材料。
以所述球形胚为材料，将其接种到分化成熟培养基上，置于25℃，光周期8/16h，光照强度20μmol·m-2s-1的条件下进行培养。
所述分化成熟培养基以每升计算，其制备方法为：在WPM培养基母液加入4.52μmol的NAA、9.84μmol的6-BA、4.65μmol的GA3和30～90g的蔗糖后用水定容至一升，调节PH值为5.8后加入3～9g的卡拉胶
(2)咖啡体胚萌发培养
将步骤(1)中得到的成熟体胚为材料，将其接种到萌发培养基上，置于25℃，光周期12/12h，光照强度60μmol·m-2s-1的条件下培养。
所述萌发培养基以每升计算，其制备方法为：在WPM培养基母液加入4.92μmol的KT和30g的蔗糖后用水定容至一升，调节PH值为5.8后加入0～3g的活性炭和3g的卡拉胶。
(3)咖啡体胚成苗培养
将步骤(2)中得到的萌发且两片子叶完全展开的体胚转接到成苗培养基上，置于25℃，光周期12/12h，光照强度60μmol·m-2s-1的条件下培养。
所述的成苗培养基以每升计算，其制备方法为：在WPM培养基母液加入30g的蔗糖后用水定容至一升，调节PH值为5.8后加入0～3g的活性炭和3g的卡拉胶。
具体通过调整基础实施例中的蔗糖、卡拉胶和活性炭的用量，得到实施例1～9，并检验其效果。具体如表1～3所示。以下表格中的“Y”指使用此培养基，“N”指未使用此培养基。
在步骤(1)咖啡体胚成熟培养阶段，根据分化成熟培养基中蔗糖浓度不同以及卡拉胶浓度不同，分别设置表1中的实施例1～4和表2中的实施例5～6，并设置对照例1。
所述表1和表2中每个实施例及对照例以咖啡愈伤组织悬浮细胞诱导分化出的球形胚为材料接种于所述分化成熟培养基上，每例接种3皿，每皿接种20个球形胚。按照基础实施例中步骤(1)所述的条件培养30日后，观察并记录各实施例和对照例中体胚的生长发育情况，计算体胚成熟率和体胚畸形率。
其中，本发明中对成熟体胚的定义为子叶形态明显，呈乳白色或浅黄绿色，且具伸长的下胚轴。
其中，本发明中对畸形体胚的定义为体胚发育过程中发育异常的胚状体，且根据其形态大致可将其分为以下几类，如两个或多个体胚的胚轴、子叶、胚根等部位粘连在一起的连体胚；子叶发育不良、无子叶、子叶增生呈簇状或子叶连合呈喇叭状的子叶畸形胚；子叶、胚轴、胚根或整个体胚再次脱分化形成愈伤的体胚；呈半透明水渍状的玻璃化体胚；无茎尖、根尖生长点或有多个茎尖、根尖生长点的生长点畸形的体胚。
统计中，无论体胚是否按上述成熟体胚的定义被统计为成熟体胚，只要其形态特征符合畸形体胚的定义，均计入畸形体胚数内。
所述体胚成熟率(％)＝(成熟体胚数/供试体胚总数)×100。
所述体胚畸形率(％)＝(畸形体胚数/供试体胚总数)×100。
表1
Figure BDA0003586795460000041
Figure BDA0003586795460000051
表2
Figure BDA0003586795460000052
表1中对比例1和实施例1～4的对比显示，在分化成熟培养基中卡拉胶浓度同为3g/L的情况下，实施例1～4与对比例相比较，其体胚成熟率和体胚畸形率均随蔗糖浓度提高而上升。其中，蔗糖浓度为30g/L的对比例1，虽然体胚畸形率最低，但其体胚成熟率只有35％，且该处理下部分体胚呈透明状，水渍化严重，并从顶端开始逐渐褐化死亡。而在蔗糖浓度为90g/L的实施例4中，体胚成熟率最高，为76.6％，但子叶畸形胚的发生率也随之上升，体胚畸形率达到36.7％，此类体胚最终因无法继续发育而逐渐褐化死亡。因此，在综合平衡体胚成熟率和体胚畸形率的情况下，可得分化成熟培养基中添加蔗糖的较佳浓度范围为45～75g/L，其中优选为60～75g/L。
表2中的对比例1和实施例5～6显示，在分化成熟培养基中蔗糖浓度同为30g/L的情况下，卡拉胶的浓度分别为3g/L、6g/L和9g/L。其中，随卡拉胶浓度的增加，体胚成熟率呈现先上升后降低的趋势，而体胚畸形率则呈先降低后上升的趋势，但实施例5和6相对于对比例均具有较高的体胚成熟率和较低的体胚畸形率。其中在卡拉胶用量为6g/L的实施例5中，体胚成熟率为65.5％，为三组中最高，而体胚畸形率为6.67％，为三组中最低。因此，可见分化成熟培养基中添加卡拉胶的较佳浓度范围为6～9g/L，其中最佳浓度为6g/L。
综上可知，在分化成熟培养基中添加75g/L蔗糖和6g/L卡拉胶时，体胚成熟率和体胚畸形率可获得最佳的平衡。
在基础实施例的步骤(2)咖啡体胚萌发培养和步骤(3)咖啡体胚成苗培养阶段，根据萌发培养基和成苗培养基中添加的活性炭浓度不同，分别设置表3中的实施例7～9，并设置对照例2。
所述表3中的每个实施例及对照例均以分化成熟培养过程中得到的子叶形态明显的成熟体胚为材料，接种于萌发培养基上，每例接种3皿，每皿接种20个体胚。按照基础实施例步骤(2)所述的条件培养30日后，观察并记录各实施例和对照例中体胚的生长发育情况，统计体胚萌发率，并将每例中已萌发的体胚转移至成苗培养基上，按照基础实施例步骤(3)所述的条件培养20日后，统计体胚成苗率。
其中，本发明对体胚萌发的定义为初生根和芽均出现。
其中，本发明对成苗的定义为两片绿色真叶对称长出，基部可见胚根。
体胚萌发率(％)＝(萌发的体胚数/供试体胚总数)×100
体胚成苗率(％)＝(成苗数/供试的萌发体胚总数)×100
表3
Figure BDA0003586795460000061
Figure BDA0003586795460000071
表3中的对比例和实施例显示，在体胚萌发培养阶段和体胚成苗培养阶段，在控制萌发培养基和成苗培养基中卡拉胶的浓度为3g/L以及蔗糖浓度为30g/L时，体胚萌发率和体胚成苗率均随培养基中活性炭用量增加而上升，其中在活性炭浓度为3g/L时，体胚萌发率和体胚成苗率最高。同时，观察体胚萌发情况发现，未添加活性炭处理的培养基中，体胚较小，部分体胚胚根形成较短，且少数体胚玻璃化致使子叶呈翠绿色卷曲状；而添加3g/L活性炭处理的培养基中，体胚呈深绿色，胚根明显伸长，且发育形成两片真叶和顶芽。因此，可见萌发培养基和成苗培养基中分别添加活性炭的浓度范围为1～3g/L时可获得较高的体胚萌发率和体胚成苗率，其中活性炭浓度为3g/L时，可得到最高的体胚萌发率和体胚成苗率。

Claims (7)

1.一种咖啡体胚培养基，包括分化成熟培养基、萌发培养基，其特征在于：
所述的分化成熟培养基以每升计算，其制备方法为：在WPM培养基母液加入2.26～4.52μmol的NAA、7.76～9.84μmol的6-BA、1.33～4.65μmol的GA3和30～90g的蔗糖后用水定容至一升，调节PH值为5.8～6.0后加入3～9g的卡拉胶；
所述的萌发培养基以每升计算，其制备方法为：在WPM培养基母液加入4.92～12.76μmol的KT和30g的蔗糖后用水定容至一升，调节PH值为5.8～6.0后加入0～3g的活性炭和3g的卡拉胶。
2.根据权利要求1所述的咖啡体胚培养基，其特征在于：
所述的分化成熟培养基以每升计算，其制备方法为：在WPM培养基母液加入4.52μmol的NAA、9.84μmol的6-BA、4.65μmol的GA3和30～90g的蔗糖后用水定容至一升，调节PH值为5.8～6.0后加入3～9g的卡拉胶；
所述的萌发培养基以每升计算，其制备方法为：在WPM培养基母液加入4.92μmol的KT和30g的蔗糖后用水定容至一升，调节PH值为5.8～6.0后加入0～3g的活性炭和3g的卡拉胶。
3.根据权利要求1或2所述的咖啡体胚培养基，其特征在于：所述分化成熟培养基中以每升计算，加入蔗糖的量为45～75g。
4.根据权利要求1或2所述的咖啡体胚培养基，其特征在于：所述分化成熟培养基中以每升计算，加入卡拉胶的量为6～9g。
5.根据权利要求1或2所述的咖啡体胚培养基，其特征在于：所述萌发培养基中以每升计算，加入活性炭的量为1～3g。
6.根据权利要求1或2所述的咖啡体胚培养基，其特征在于：还包括成苗培养基；
所述的成苗培养基以每升计算，其制备方法为：在WPM培养基母液加入30g的蔗糖后用水定容至一升，调节PH值为5.8～6.0后加入0～3g的活性炭和3g的卡拉胶。
7.根据权利要求6所述的咖啡体胚培养基，其特征在于：所述成苗培养基中以每升计算，加入活性炭的量为1～3g。
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