CN116250482B

CN116250482B - 一种椰子组织培养快繁的方法

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Publication number: CN116250482B
Application number: CN202310517387.7A
Authority: CN
Inventors: 穆治华; 罗杰; 肖勇; 杨壮; 夏薇; 刘贤青; 徐航; 周骏杰; 徐冉; 李娇龙; 李凤梅
Original assignee: Sanya Nanfan Research Institute Of Hainan University
Current assignee: Sanya Nanfan Research Institute Of Hainan University
Priority date: 2023-05-10
Filing date: 2023-05-10
Publication date: 2023-08-04
Anticipated expiration: 2043-05-10
Also published as: CN116250482A

Abstract

本发明公开了一种椰子组织培养快繁的方法，属于植物组织培养技术领域。该方法包括外植体预培养、愈伤诱导培养、体胚诱导培养和组培苗的炼苗移栽步骤。本发明采用Y3、MW基本培养基的部分成分和铁盐组合成基础培养基，并补入生长调节剂及其他附加成分，优选出以Y3、MW部分成分及铁盐组合的培养基为基础的椰子胚芽预培养培养基、愈伤诱导培养基和体胚诱导培养基，并结合外植体表面消毒、愈伤组织诱导、体胚萌发，组培小苗大量增殖、大苗生根炼苗等过程建立了椰子组培快繁体系，可显著提高愈伤组织诱导率、出胚率、出苗率和成活率，并显著缩短培养周期，为椰子转基因及遗传转化体系建立了基础。

Description

一种椰子组织培养快繁的方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，特别是涉及一种椰子组织培养快繁的方法。

背景技术

椰子是世界上最重要的棕榈科植物之一，是一种高经济价值的多年生单子叶乔木。作为一种热带油料作物和食品原料，椰子在全球93个国家和地区均有分布。目前椰子种植业面临严重的威胁，如种苗种果短缺等。作为最难以在体外繁殖的植物之一，传统营养繁殖手段，如扦插、压条、嫁接等很难用于椰子的培育繁殖。但是利用组织培养技术，通过多种外植体诱导能够大批量获得椰子的再生苗。目前澳大利亚昆士兰大学等研究机构已经开发出通过合子胚进行组织培养的技术，但还未在世界范围内广泛普及。因此，开发更高效率的椰子组培技术，尤其是探索通过体胚发生途径生产大量优良品种椰子苗的技术是极为重要的。为此，本发明提供一种椰子组织培养快繁的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种椰子组织培养快繁的方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的组培快繁方法显著提高椰子胚外植体的愈伤组织诱导率、球形体细胞胚出胚率、组培苗出苗率和移栽成活率，并显著缩短培养周期，为椰子转基因及遗传转化体系建立了基础。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种椰子组织培养快繁的方法，包括以下步骤：

（1）外植体预培养：将椰子胚芽外植体置于预培养培养基中培养至新生胚芽出现；

其中，每升所述预培养培养基由Y3培养基大量营养素10-12mL、Y3培养基微量营养素10-15mL、MW培养基维生素1-1.5mL、植物组培铁盐1-1.5 mL、6-BA 5-8 μmol、Gelzan冷结胶3-3.5 g、蔗糖30-50g及活性炭2.5-3 g组成；

（2）愈伤诱导培养：将步骤（1）收获的新生胚芽置于愈伤诱导培养基培养至形成愈伤组织和新生胚芽；

其中，每升所述愈伤诱导培养基由Y3培养基大量营养素10-15mL、Y3培养基微量营养素10-11mL、MW培养基维生素1-1.2mL、植物组培铁盐0.8-1 mL、6-BA 5-10 μmol、蔗糖40-50 g、Gelzan冷结胶3-3.5 g、活性炭2.5-3 g及2，4-D 300-400 μmol组成；

（3）体胚诱导培养：将步骤（2）收获的愈伤组织和新生胚芽接种于体胚诱导培养基进行继代培养，直至形成球形体细胞胚和发芽胚，之后光照处理，形成组培苗；

其中，每升所述体胚诱导培养基由Y3培养基大量营养素8-10mL、Y3培养基微量营养素7-10mL、MW培养基维生素0.8-1mL、植物组培铁盐1-1.2 mL、蔗糖30-50 g、Gelzan冷结胶3-3.5 g、活性炭2.5 g、2，4-D 5-10 μmol及6-BA 200-400 μmol组成；

（4）组培苗的炼苗移栽：对组培苗进行降糖、光照、二氧化碳处理，之后移入移栽基质中培养。

进一步地，在步骤（1）中，所述椰子胚芽外植体的提取方法为：先从椰子果实中提取含有胚的胚乳块，之后从胚乳块中取出大小为0.5mm的胚芽，将其进行消毒处理后即可。

进一步地，所述Y3培养基大量营养素包括KCl 15000mg/L、KNO₃20000mg/L、NH₄Cl5400mg/L、NaH₂PO₄·2H₂O 3000mg/L、CaCl₂·2H₂O 3000mg/L和MgSO₄·7H₂O 2500mg/L；所述Y3培养基微量营养素包括MnSO₄·4H₂O 115mg/L、KI 84mg/L、ZnSO₄·7H₂O 73mg/L、H₃BO₃32mg/L、CuSO₄·5H₂O 2.6mg/L、CoCl₂·6H₂O 2.5mg/L、NaMoO₄·2H₂O 2.5mg/L和NiCl·6H₂O 0.25mg/L；所述MW培养基维生素包括维生素B6 0.50mg/L、维生素B1 0.50mg/L、维生素B3 0.50mg/L、维生素B5 0.50mg/L、维生素H 0.50mg/L、维生素B12 0.50mg/L和甘氨酸0.1mg/L；所述植物组培铁盐包括Fe₂SO₄·7H₂O 420mg/L和Na₂EDTA 560.0mg/L。

进一步地，在步骤（1）中，所述培养具体为暗培养7-21d，培养温度为25-29℃。

进一步地，在步骤（3）中，所述继代培养期间，将接种于体胚诱导培养基的愈伤组织和新生胚芽置于顶部用透气膜封闭的培养容器中，并进行氧气处理，氧气浓度为30-70%。

进一步地，所述光照处理的时间为14-16h/d，光照强度为25-50μmol·m^-2·s^-1。

进一步地，在步骤（4）中，所述降糖、光照、二氧化碳处理具体为：将组培苗接种于Y3含糖液体培养基继代培养，调整CO₂浓度为750-1500 μmol·mol^-1，进行12-16h/d光照处理；所述继代培养的次数为2-3次。

进一步地，所述Y3含糖液体培养基为Y3基础培养基+80-150 μM NAA+30-50 g/L蔗糖；所述降糖处理为：组培苗在含糖量为30-50g/L的培养基中进行第一次继代培养，后续继代培养所用培养基逐步降糖至0g/L。

进一步地，所述光照处理采用LED红色光和蓝色光处理，光照强度为50 μmol·m^-2·s^-1；其中所述LED红色光和蓝色光的光照强度比值为（1-3）：（1-2）。

进一步地，在步骤（4）中，所述移栽基质为生物活性炭和泥炭土以（1-2）：1质量比复配的混合基质。

本发明公开了以下技术效果：

本发明优化了椰子胚芽组织快繁过程中所使用的培养基，采用Y3、MW基本培养基的部分成分以及植物组培铁盐组合成基础培养基，并补入生长调节剂及其他附加成分，优选出以Y3、MW培养基部分成分和铁盐组合的培养基为基础的椰子胚预培养培养基、愈伤诱导培养基和体胚诱导培养基，并结合外植体表面消毒、愈伤组织诱导、体胚萌发，组培小苗大量增殖、大苗生根炼苗等过程建立了椰子组织培养快速繁殖体系，该组培方法显著提高椰子胚芽外植体的愈伤组织诱导率、球形体细胞胚出胚率、组培苗出苗率和移栽成活率，并显著缩短培养周期，为椰子转基因及遗传转化体系建立了基础，具有向椰子产业提供大量具有优质形状组培苗的能力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为胚芽置于愈伤诱导培养基诱导培养1个月的照片；

图2为胚芽置于愈伤诱导培养基诱导培养3个月的照片；

图3为胚芽置于愈伤诱导培养基诱导培养4个月的照片；

图4为在体胚诱导培养阶段的照片；

图5为在体胚诱导培养结束后形成的组培小苗照片。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

下述实施例中采用部分Y3以及MW(Morel and Wetmore)培养基成分作为基础培养基，具体配方如表1：

表1 基础培养基配方

下述实施例所使用的培养基都是在使用前3天制备的，所有化学品均购自Sigma-Aldrich，且为组织培养级化学品。所有培养基在使用前均在121℃下高压灭菌30 min。

实施例1

1 材料与方法

1.1 材料处理

在干净环境中，将新鲜收获的10个月的椰子老果剥去外、中果皮，然后从中劈开。使用椰子专用钻孔器（用75% (v/v)乙醇溶液消毒）从果实中提取含有胚的胚乳块。将取出的胚乳块放入新鲜的无菌容器中并置于超净工作台中，首先用75% (v/v)乙醇摇洗150 s取出。然后使用镊子和手术刀，在显微镜下取出胚芽（大小仅为0.5mm左右），然后放入无菌玻璃罐中。接下来用75% (v/v)乙醇摇洗已分离的胚芽60 s，然后在2.1% (v/v)次氯酸钠(NaOCl)中连续摇洗12 min，然后用无菌蒸馏水洗涤3次，并移至无菌滤纸上沥干6 min，直至表面完全无菌干燥，获得椰子胚芽外植体。

1.2 椰子胚芽预培养

将获得的椰子胚芽在预培养培养基中暗培养至新生胚芽出现并长至2mm，培养温度27℃。待新生胚芽出现后，用解剖刀刀片逐层切割胚，直至分离出胚芽本体，将其带胚芽外皮挖出；

其中，每升预培养培养基由基础培养基中的Y3培养基大量营养素10mL、Y3培养基微量营养素10mL，MW维生素1mL、植物组培铁盐1 mL、5 μmol 6-苄氨基嘌呤（6-BA），Gelzan冷结胶3.5 g、蔗糖50g，活性炭2.5 g组成，并调节至pH至5.7。

1.3 愈伤诱导培养

将胚芽伤口向下，置于愈伤诱导培养基表面。图1为胚芽置于愈伤诱导培养基诱导培养1个月的照片；图2为诱导培养3个月的照片；图3为诱导培养4个月的照片，从图中可以看出，愈伤组织已形成；

其中，每升愈伤诱导培养基由基础培养基中的Y3培养基大量营养素10mL、Y3培养基微量营养素10mL、MW维生素1mL和植物组培铁盐1 mL、6-BA 5 μmol、蔗糖50 g、Gelzan冷结胶3.5 g，活性炭2.5 g及2，4-D 300 μmol组成。

1.4 体胚诱导培养

将已形成的愈伤组织和新生胚芽在体胚诱导培养基上进行继代，然后每月继代到同种新鲜体胚诱导培养基上，此阶段持续2到3个月，在此阶段，将外植体放置于顶部敞开的培养容器中，进行O₂处理。装有培养物的培养容器用透气膜（22 µm耐高温密封膜）封闭，允许环境气体进入试管但外植体不会污染，腔室连接到O₂工业氧气发生器。期间将腔室中的O₂浓度保持在60%，通过将培养物保存在封闭的、不透光的盒子中来进行暗处理，直至形成球形体细胞胚。紧接着，将球形胚胎和发芽胚胎暴露于光处理下，时间为14/10小时（白天/晚上）光周期，使用强度50 μmol m^-2s^-1，在27℃下持续1.5个月；

其中，每升体胚诱导培养基由基础培养基中的Y3培养基大量营养素10mL、Y3培养基微量营养素10mL、MW维生素1mL和植物组培铁盐1 mL、蔗糖50 g、Gelzan 3.5 g，活性炭2.5 g，及2，4-D 5 μmol和6-BA 200 μmol组成。图4为在体胚诱导培养阶段的照片；图5为在体胚诱导培养结束后形成的组培小苗照片。

1.5 组培苗的炼苗、移栽

待形成组培小苗后，进行降糖、光照、二氧化碳处理工序，以便加快得到小苗的速度。将5个月大椰子幼苗（10cm长左右）转移到位于组培室中的炼苗箱，每个箱内含有液体培养基（Y3基础培养基，含80 μM NAA和30 g/L蔗糖）。然后每12小时检查一次，并在必要时调整腔室内的的CO₂浓度（1500 μmol·mol^-1）。然后使用16/8小时光周期进行LED红色和蓝色(50/50%)光处理（光强50 μmol·m^-2·s^-1），温度保持在27℃，此步骤一个月。在此后两次继代中，其他环境、培养基保持不变，培养基中糖的含量由30g/L降低到0g/L（第一次继代30减到15g/L，第二次继代15减到0g/L）。

三个月后，组培小苗长为组培大苗，此时将组培苗取出，换入其他玻璃瓶，套透明塑料袋并扎紧，培养基从无糖培养基更换为生物活性炭与泥炭土的1：1混合物，添加无糖ms液体培养基作为肥料。同时在叶片上喷打商用食品级人工果蜡，减少水分流失。两周后，取掉塑料袋，并放入高湿度人工气候箱（90%相对湿度），每周下降10%湿度，直至与当地空气湿度相同。

实施例2

同实施例1，区别在于，

1.2中，每升预培养培养基由基础培养基中的Y3培养基大量营养素12mL、Y3培养基微量营养素15mL，MW维生素1.5mL、植物组培铁盐1.5 mL、8 μmol 6-苄氨基嘌呤（ 6-BA），Gelzan冷结胶3 g、蔗糖30g，活性炭3 g组成，并调节至pH至5.7。

1.3中，每升愈伤诱导培养基由基础培养基中的Y3培养基大量营养素15mL、Y3培养基微量营养素11mL、MW维生素1.2mL和植物组培铁盐0.8 mL、6-BA 10 μmol、蔗糖40 g、Gelzan冷结胶3 g，活性炭3 g及2，4-D 400 μmol组成。

1.4中，每升体胚诱导培养基由基础培养基中的Y3培养基大量营养素8mL、Y3培养基微量营养素7mL、MW维生素0.8mL和植物组培铁盐1.2 mL、蔗糖30 g、Gelzan 3 g，活性炭2.5 g，及2，4-D 10 μmol和6-BA 400 μmol组成。

对比例1

同实施例1，区别仅在于，将基础培养基调整为Y3基本培养基，则：

每升预培养培养基由Y3基本培养基中的大量营养素（10mL）、微量营养素（10mL）、维生素（1mL）和铁盐（1 mL），及5 μmol 6-BA，Gelzan冷结胶3.5 g、蔗糖50g，活性炭2.5 g组成，并调节至pH至5.7；

每升愈伤诱导培养基由Y3基本培养基中的大量营养素（10mL）、微量营养素（10mL）、维生素（1mL）和铁盐（1 mL），及6-BA (5 μmol)、蔗糖（50 g)、Gelzan冷结胶3.5 g，活性炭2.5 g及2，4-D（300 μmol）组成；

每升体胚诱导培养基由Y3基本培养基中的大量营养素（10mL）、微量营养素（10mL）、维生素（1mL）和铁盐（1 mL），以及蔗糖（50 g）、Gelzan (3.5 g)，活性炭(2.5 g)，2，4-D（5 μmol）和6-BA (200 μmol)组成。

对比例2

同实施例1，区别仅在于，将基础培养基调整为MW基本培养基，则：

每升预培养培养基由MW基本培养基中的大量营养素（10mL）、微量营养素（10mL）、维生素（1mL）和铁盐（1 mL），及5 μmol 6-BA，Gelzan冷结胶3.5 g、蔗糖50g，活性炭2.5 g组成，并调节至pH至5.7；

每升愈伤诱导培养基由MW基本培养基中的大量营养素（10mL）、微量营养素（10mL）、维生素（1mL）和铁盐（1 mL），及6-BA (5 μmol)、蔗糖（50 g)、Gelzan冷结胶3.5 g，活性炭2.5 g及2，4-D（300 μmol）组成；

每升体胚诱导培养基由MW基本培养基中的大量营养素（10mL）、微量营养素（10mL）、维生素（1mL）和铁盐（1 mL），以及蔗糖（50 g)、Gelzan (3.5 g)，活性炭(2.5 g)，2，4-D（5 μmol）和6-BA (200 μmol)组成。

对比例3

同实施例1，区别仅在于，1.1 材料处理中：在干净环境中，将新鲜收获的10个月的椰子老果剥去外、中果皮，然后从中劈开。使用椰子专用钻孔器（用75% (v/v)乙醇溶液消毒）从果实中提取含有完整胚的固体胚乳块。将取出的胚乳块放入无菌玻璃罐中，接下来用75% (v/v)乙醇摇洗60 s，然后在2.1% (v/v)次氯酸钠(NaOCl)中连续摇洗12 min，然后用无菌蒸馏水洗涤3次，并移至无菌滤纸上沥干6 min，直至表面完全无菌干燥，获得椰子整胚外植体。

对比例4

同实施例1，区别仅在于，1.4体胚诱导培养中，省略装有培养物的培养容器用透气膜（22 µm耐高温密封膜）封闭步骤。

对比例5

同实施例1，区别仅在于，1.5组培苗的炼苗、移栽中，待形成组培小苗后，省略降糖处理工序。

最终统计实施例1-2、对比例1-5中椰子胚外植体的愈伤组织诱导率、球形体细胞胚出胚率、组培苗出苗率、移栽成活率及培养周期。结果见表2：

表2 不同处理对椰子组培快繁的影响

从表2可以看出，不同外植体（整胚、胚芽）提取方法、培养基对愈伤诱导、出芽、出胚诱导率存在显著差异，而基本培养基组分、植物激素浓度最适宜浓度等在实施例1-2所描述的区间较好。结果表明，本发明以椰子胚芽为外植体，经组织培养，愈伤诱导率、出胚率、出苗率和成活率均可达到80%左右，愈伤诱导率最高可达到85.4%，体胚诱导率最高可达到80.9%，移栽成活率最高可达到97.1%。

而对比例3以整胚为外植体进行培养，相比于实施例1的胚芽，活性不高，成功率低，植物激素不能充分渗透进入胚芽，影响后续的组培效果。本发明是经前期大量的创造性劳动后发现，椰子胚芽（大小仅为0.5mm左右）相比于其它组培部位，其组培活性最高，是最适合进行组培的外植体。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种椰子组织培养快繁的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）外植体预培养：将椰子胚芽外植体置于预培养培养基中培养至新生胚芽出现并长至2mm，之后逐层切割胚，直至分离出胚芽本体；

所述椰子胚芽外植体的提取方法为：先从椰子果实中提取含有胚的胚乳块，之后从胚乳块中取出大小为0.5mm的胚芽，将其进行消毒处理后即可；

（2）愈伤诱导培养：将步骤（1）收获的胚芽本体伤口向下置于愈伤诱导培养基表面，培养至形成愈伤组织和新生胚芽；

其中，每升所述愈伤诱导培养基由Y3培养基大量营养素10-15mL、Y3培养基微量营养素10-11mL、MW培养基维生素1-1.2mL、植物组培铁盐0.8-1 mL、6-BA 5-10 μmol、蔗糖40-50g、Gelzan冷结胶3-3.5 g、活性炭2.5-3 g及2，4-D 300-400 μmol组成；

（4）组培苗的炼苗移栽：对组培苗进行降糖、光照、二氧化碳处理，之后移入移栽基质中培养；

所述降糖、光照、二氧化碳处理具体为：将组培苗接种于含糖量为30-50g/L的Y3含糖液体培养基继代培养，调整CO₂浓度为750-1500 μmol·mol^-1，进行12-16h/d光照处理；所述继代培养的次数为2次，第一次继代培养所用培养基含糖量由30g/L减到15g/L，第二次继代培养所用培养基含糖量由15g/L减到0g/L；

所述光照处理采用LED红色光和蓝色光处理，光照强度为50 μmol·m^-2·s^-1；其中所述LED红色光和蓝色光的光照强度比值为（1-3）：（1-2）；

所述Y3培养基大量营养素包括KCl 15000mg/L、KNO₃ 20000mg/L、NH₄Cl 5400mg/L、NaH₂PO₄·2H₂O 3000mg/L、CaCl₂·2H₂O 3000mg/L和MgSO₄·7H₂O 2500mg/L；

所述Y3培养基微量营养素包括MnSO₄·4H₂O 115mg/L、KI 84mg/L、ZnSO₄·7H₂O 73mg/L、H₃BO₃ 32mg/L、CuSO₄·5H₂O 2.6mg/L、CoCl₂·6H₂O 2.5mg/L、NaMoO₄·2H₂O 2.5mg/L和NiCl·6H₂O 0.25mg/L；

所述MW培养基维生素包括维生素B6 0.50mg/L、维生素B1 0.50mg/L、维生素B30.50mg/L、维生素B5 0.50mg/L、维生素H 0.50mg/L、维生素B12 0.50mg/L和甘氨酸0.1mg/L；

所述植物组培铁盐包括Fe₂SO₄·7H₂O 420mg/L和Na₂EDTA 560.0mg/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述培养具体为暗培养7-21d，培养温度为25-29℃。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述继代培养期间，将接种于体胚诱导培养基的愈伤组织和新生胚芽置于顶部用透气膜封闭的培养容器中，并进行氧气处理，氧气浓度为30-70%。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述光照处理的时间为14-16h/d，光照强度为25-50μmol·m^-2·s^-1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Y3含糖液体培养基为Y3基础培养基+80-150 μM NAA+30-50 g/L蔗糖。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（4）中，所述移栽基质为生物活性炭和泥炭土以（1-2）：1质量比复配的混合基质。