FR2510354A1 - Procede de preparation de la matiere de propagation de la digitale (digitalis lanata ehrh.) dans une culture de tissus - Google Patents

Abstract

PROCEDE DE PREPARATION DE JEUNES PLANTS DE DIGITALE PAR MICROPROPAGATION VEGETATIVE DANS UNE CULTURE DE TISSUS, PAR STERILISATION SUPERFICIELLE DES GRAINES OU DES EXTREMITES DE POUSSES DE PLANTS DE PLEINE TERRE. CE PROCEDE CONSISTE A PRODUIRE UN PLANT STERILE A PARTIR DE LA GRAINE OU DE L'EXTREMITE DE POUSSE STERILE D'UNE PLANTE DE PLEINE TERRE, DANS UN MILIEU DE CULTURE; PUIS ON TRANSINOCULE CE PLAN DANS UN MILIEU DE CULTURE DE PROPAGATION, IL EST CULTIVE JUSQU'AU STADE DES 20 A 40 POUSSES LATERALES; LE PLANT OBTENU EST DIVISE EN RAMEAUX DE FEUILLES QUI SONT TRANSPLANTEES DANS UN MILIEU DE CULTURE INDUISANT LA FORMATION DE RACINES, PUIS ENSUITE, DANS UN MILIEU DE CULTURE DANS LEQUEL LES RACINES ATTEIGNENT UNE LONGUEUR DE 4 A 6CM ET ENFIN, LA MATIERE DE PROPAGATION (JEUNE PLANT) EST EVENTUELLEMENT ADAPTEE AUX CONDITIONS DE LA PLEINE TERRE. OBTENTION D'UNE POPULATION HOMOGENE ET GENETIQUEMENT STABLE DE DIGITALE.

Description

La présente invention est relative à un procédé

pour la préparation de la matière de propagation de la digi-

tale (Digitalis lanats Ehrh) dans une culture de tissus La présente invention est plus particulièrement relative à un procédé de production de matière stérile de propagation de la digitale, obtenue dans une culture stérile de tissus, ainsi qu'à la production de jeunes plants nonstériles,aptes à supporter les conditions de pleine terre, obtenus à partir

de cette matière stérile de propagation.

La digitale, qui est une matière première de grande valeur dans l'industrie pharmaceutique en raison de sa teneur en glycosides actifs à l'égard des troubles cardiaques, est cultivée de telle manière que des semences recueillies à partir de plantes agées de deux ans sont semées et que les plantes âgées d'un an, issues de ces graines et utilisables

dans des buts pharmaceutiques, sont ensuite récoltées.

L'industrie pharmaceutique nécessite une matière première végétale présentant une teneur élevée en constituants actifs et une composition stable Les plantes présentant une teneur convenable en constituants actifs cultivés actuellement,

résultent déjà de travaux d'amélioration auxquels les cher-

cheurs s'adonnent depuis de longues années.

Selon les données de la littérature, l'aptitude à la mutation génétique de cette plante est très élevée Les variations morphologiques et la fluctuation durendement et de la teneur en constituants actifs peuvent être attribuées aux faits suivants: l'espèce a été cultivée pendant une période de temps relativement brève, le nombre de chromosomes varie, et la plante présente des hybrides spontanés /Lungenau, I, Lucrar Cradin 'bot Bucuresti 37 ( 1966) Neczypor W, Pharmazie 19, 38 ( 1964); Schick, E R, Reimann,

P.R Z Uchter 27, 7, 301 ( 1957)lJ.

A partir des mesures réalisées sur des digitales poussant spontanément dans la région de Budakalasz (Hongrie), A Mathé a observé des différences significatives entre les diamètres moyens des tiges et les indices de foliation des familles et a constaté une forte fluctuation analogue de la teneur en constituants actifs Z Morphological, Chemical and Oecological Properties of Plants with Cardiac Glycoside Contents; CSC Thesis, Budakal 1 sz ( 1978) 7. La reproduction à l'intérieur d'une même espèce

pendant plusieurs générations, qui devrait faciliter l'homo-

généité, n'est pas favorable, attendu que le potentiel biotique de la plante serait perdu -Tétényi P, Herta Hungarica 9, 3,

61 ( 1970 l 7.

L'hybridation indirecte est difficile à réaliser lMichaela, A, Silva, P: Herba Hungarica 11, 1, 29 ( 1972)3, tandis qu'une hybridation intraspecifique est plus efficace lSchwerdtfeger, G, Z Uchter 31, 5, 202 ( 1961 _ Dans ce cas on obtiendrait également des semences d'hybrides présentant une androstérilité cytoplasmatique, qui rendrait superflue une castration nécessitant un important travail à la main, comme le montre Schwerdtfeger, le rendement et la composition interne sont contrôlés par plusieurs gènes et dépendent, en

outre, fortement des conditions de l'environnement Schwerdt-

feger établit également, qu'en améliorant la plante du point

de vue de l'homogénéité morphologique, on constate une dimi-

nution de l'aptitude à l'adaptation à l'environnement, et ainsi, le rendement en tant que but d'amélioration devient d'importance secondaire ( Z Uchtungsprobleme bei Digitalis

lanata Ehrh, Referat: Arzneipflanzencolloqium, Ranischhol-

zhausen ( 1973) E Schratz a montré que dans les récoltes de plantes cultivées, la variabilité des marques morphologiques des feuilles et des fleurs est remarquablement élevée Z Kappert,

H., Rudolf, W, Handbuch der Pflanzenz Uchtung; Paray, Berlin-

Hamburg, Vol 5, p 383 ( 1961) J. G Ligeti a observé que le rapport des composants glycosides individuels dans les plantes, varie dans une mesure importante e Pharmazie 14; 162 ( 1959) Ceci est aussi vérifié par les données présentées par P Tétényi f Intraspecific Chemical Taxines and Improvement of Drug Plants"; DSC Thesis, Budapest ( 1963) > Ce dernier Auteur a trouvé une variation de 1:8 à 12:1 dans le rapport entre le lanatoside A et le lanatoside C, chez des plantes poussant spontanément, tandis qu'un rapport atteignant 20:1 a été constaté aussi chez la digitale cultivée. Ainsi, la culture et l'amélioration de la digitale impliquant encore de nombreux problèmes, qui pourraient être résolus par une méthode végétative de reproduction, puisque les rejetons ainsi obtenus sont génétiquement identiques au

plan de départ Les méthodes classiques de reproduction végé-

tative (division de la tige, bouture) s'avèrent cependant

inadéquates pour la reproduction de la digitale.

A partir d'expériences réalisées par la Demanderesse

sur d'autres plantes, cette dernière en est venue à la conclu-

sion qu'uremicroreproduction végétative par culture de tissus, semble constituer une méthode appropriée Selon des données de la littérature, cependant, la microreproduction végétative de la digitale (Digitalis lanata Ehrhj reste encore un problème non résolu Lui et Staba lPhytochemistry 18, 1915, ( 1979)_ 7 g-tfait germer de la digitale sur un milieu de culture de

Murashigo-Skoog, mais ils n'ont pu élever la plante que pen-

dant 12 semaines; Ces Auteurs ont étudié la teneur en subs-

tance sèche et le taux de digoxine dans des cultures de cellu-

les, ils n'ont cependant pas pu réaliser une propagation en

masse.

Plusieurs Auteurs ont essayé de produire les consti-

tuants actifs de la digitale en préparant une culture de calus et ensuite une culture en suspension à partir de feuilles de digitales et en soumettant la culture à une culture stérile des cellules dans des conditions in vitro Z Helmbold, H, Planta Medica 33, 3, 280 ( 1978): Shyr, S E et Staba, H J Planta Medica 30, 86 ( 1976) 1 La teneur en digoxine des plantes

obtenues est cependant extrêmement faible et n'est pas isola-

ble en pratique Cette méthode de culture de tissu végétal, dans laquelle des cellules individuelles non-différenciées se reproduisent en suspension sur un milieu de culture liquide, ne convient pas pour la production des plantes génétiquement identiques, utilisables en tant que jeunes plants pour une culture ultérieure En conséquence, la reproduction en masse d'entités homogènes, génétiquement stables, présentant des capacités de production sélectionnées, constitue encore un

problème non résolu.

La présente invention a pour but la mise au point d'une méthode de micropropagation végétative de la digitale (Digitalis lanata Ehrh) dans une culture de tissu stérile,

qui fpurnit une matière (jeunes plants) de propagation géné-

tiquement identique, convenable pour une culture en pleine

terre, en n'importe quelle quantité désirée.

La Demanderesse a mis en évidence que la propagation répétée de la digitale en culture stérile peut être résolue à la fois en utilisant des graines stériles et en cultivant les extrémités des pousses stériles de plantes cultivées en

pleine terre, lorsqu'on réalise un nombre d'étapes stricte-

ment déterminé selon un ordre strictement déterminé pour effectuer la propagation de la plante, pour la préparation de la plantation en pleine terre et pour l'adaptation de la plante aux conditions de la culture en pleine terre, en

maintenant des paramètres opérationnels strictement déterminés.

La présente invention a pour objet un procédé pour la préparation de la matière de propagation (jeune plant) de la diaitale (Digitalis lanata Ehrh) dans une culture de tissus par micropropagation végétative, selon lequel on soumet les graines ou les extrémités des pousses de plantes de pleine terre à une stérilisation superficielle Conformément à la présente invention, on procède de la façon suivante: a) une plante stérile portant quelques feuilles de préférence 2-3, est produite à partir d'une graine stérile ou de l'extrémité d'une pousse stérile d'une plante cultivée en pleine terre, sur un milieu de culture connu, b) la plante stérile portant quelques feuilles, de préférence 2-3, est éventuellement débarrasée de ses racines

et ensuite trans-inoculée ( repiquée) sur un milieu de cul-

ture de propagation contenant une ou plusieurs auxines, cytokinines et éventuellement de l'acide gibberellique, sur t S 10354 lequel la plante est propagée jusqu'à ce qu'on ait atteint le stade des 20 à 40 pousses latérales, puis l'on divise la

plante en rameaux de feuilles portant de préférence 2-3 feuil-

les chacun et, si on le désire, on répète la propagation jus-

qu'à ce que l'on ait obtenu le nombre désiré de plantes, c) les rameaux des feuilles stériles portant de préférence 2-3 feuilles, sont transplantés sur un milieu de culture pour la formation de racines contenant une auxine, ou une auxine et une cytokinine et l'enracinement est induit jusqu'à ce que des racines de 4 à 8 mm de longueur se soient développées, d) les plantes portant des racines de 4 à 8 mm de

longueur, sont repiquées et enracinées sur un milieu de cultu-

re dépourvue d'auxine(s) et de cytokinine(s) jusqu'à ce que la longueur des racines atteigne 4 à 6 cm, et

e) si on le désire, on adapte la matière de propaga-

tion résultante (jeunes plants) aux conditions de la pleine terre. Dans la première étape du procédé ci-dessus, des plantes stériles portant de préférence 2 à 3 feui 3 les, sont produites à partir de graines désinfectées, d'une manière connue en elle-même ou à partir d'extrémités de pousses désinfectées de plantes de pleine terre, sur un milieu de culture tel que

décrit dans la littérature L Linsmaier et Skoog, Ph siol.

Plantarum, 18, 100-127 ( 1965); Nitsch et Nitsch, Science,

163, 85-87 ( 1969) 7.

Dans la deuxième étape de la méthode conforme à la présente invention, les pousses de plantes stériles portant de préférence 2-3 feuilles, sont repiquées sur un milieu de culture de propagation Celui-ci doit induire la formation de la plus grande quantité possible de rejetons latéraux, formant ainsi un développement en masse de rameaux de feuilles Le milieu de culture de propagation est essentiellement l'un des

milieux décrits plus haut, complété cependant par une combinai-

son appropriée d'auxine(s), de cytokinine(s) et éventuellement

d'acide gibberellique L'auxine peut, par exemple, être consti-

tuée par 0,1 à 1,0 ppm d'acide indoleacétique ou par 0,01 à

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0,05 ppm d'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique La cytokinine devant être associée à l'auxine, peut être, par exemple, de

la benzylaminopurine à une concentration de 0,1 à 1,0 ppm.

Le rapport des deux composants peut varier entre 1:1 et 1:10 Lorsque le rapport auxine/cytokinine est de 1:1, le développement des plantes qui se propagent dans la culture de tissus est plus favorable si de l'acide gibberellique est également ajouté au milieu de culture de propagation en tant

que troisième additif, à une concentration de 0,1 à 0,5 ppm.

La culture est incubée à 24 + 2 C à une humidité relative de -80 %, avec un éclairage de 9000 à 14000 lux pendant des photopériodes, comprenant de préférence 16 heures de lumière du jour et 8 heures d'obscurité La culture dure de 4 à 6 semaines. Les tiges ramifiées portant au moins 50 pousses latérales sont divisées dans des conditions stériles, en pousses (rameaux de feuilles) comprenant 2-3 feuilles et une nouvelle étape de propagation est amorcée avec les mêmes

paramètres, avec les pousses capables de se développer d'elles-

mêmes La division et la propagation peuvent être répétées à volonté, jusqu'à ce que la quantité requise de matière de

propagation (jeunes plants) soit produite.

Lorsque le nombre requis de plantes est obtenu, l'enracinement ou formation de racines doit être induit sur chaque plante, afin de faciliter leur plantation Dans

cette troisième étape du procédé conforme à la présente inven-

tion, les plantes multipliées, portant 2-3 feuilles, sont

transplantées sur un milieu de culture d'enracinement Celui-

ci peut-être des types Nitsch et Nitsch ou Linsmeier-Skoog,

tels que décrits plus haut; cependant, des variantes conve-

nablement modifiées de ceux-ci, qui contiennent seulement la moitié des macroëlements du milieu d'origine, peuvent aussi être utilisées avec profit Les milieux de culture doivent toujours contenir, soit une auxine, soit une auxine avec 10 % d'une cytokinine, calculés par rapport à la quantité d'auxine présente Lorsque de l'acide indolebutyrique est utilisé à titre d'auxine, sa quantité peut varier entre 0,1 et 0,5 ppm dans le milieu de culture Lorsqu'une association is 10354 d'une auxine et d'une cytokinine est mise en oeuvre, le milieu de culture peut contenir, par exemple, 1 ppm d'acide c C-naphtylacétique conjointement avec 0,1 ppm de kinétine La formation de racines se réalise plus rapidement et des racines plus viables sont produites lorsqu'une faible concentration d'hormone est mise en oeuvre et que la teneur en macroéléments du milieu de culture est réduite à la moitié de celle qui est utilisée dans l'étape précédente Il est essentiel que la troisième étape soit poursuivie uniquement jusqu'au moment ot

les plantes commencent à présenter des racines.

Dans la quatrième étape du procédé conformément à la présente invention, les plantes pourvues de racines de 4 à 8 mm de longueur, sont transplantées sur un milieu de culture dépourvu d'hormones La teneur en macroéléments de ce milieu de culture dépourvue d'hormones, est identique à celle du milieu qui est utilisé dans l'étape précédente Lorsqu'on poursuit la culture des plantes dont l'enracinement a été induit, sur un milieu dépourvu, d'hormones, il se développe des racines vigoureuses et abondantes et la croissance des parties végétatives est également convenable Les conditions d'incubation dans les troisième et quatrième étapes sont

identiques à celles qui sont mises en oeuvre dans l'étape pré-

cédente Les deux dernières étapes prennent ensemble de 4 à 6 semaines et à la fin de cette période, on obtient de jeunes plants avec des racines convenablement développées pour

permettre leur plantation.

Dans la cinquième et dernière étape du procédé confor me à la présente invention, les jeunes plants sont adaptés

aux conditions non stériles de la culture en pleine terre.

Au cours de cette étape, les jeunes plants sont plantés dans des pots remplis d'un mélange de sable et de perlite ou de tourbe et de perlite Le mélange est humidifié jusqu'à 70 % de son taux d'adsorption d'eau; lorsqu'on utilise un mélange de

sable et de perlite, on réalise l'humidification avec une solu-

tion contenant des macro et des microélements (solution de Knopp modifiée) Les jeunes plants sont incubés dans des condir tions semi-stériles dans une "phytobotte" ou dans une st:r'z dans des conditions convenablement ajustées de température et

d'humidité La période d'adaptation demande 4-5 semaines envi-

ron. Les principaux avantages de la micropropagation végétative dans une culture de tissus, sont les suivants l'homogénéité de l'espèce (identité de l'ordre peut être conservée,

la propagation d'un individu unique peut être réali-

sée en continu, indépendamment de la saison et des conditions climatiques, n'importe quelle quantité désirée de plants homogènes

peut être produite à partir d'un individu unique.

Sur cette base, la micropropagation végétative peut être utilisée pour l'entretien de l'espèce "digitale", pour l'amélioration de la plante et pour la production d'une lignée

de semences homogène, qui est requise pour la culture.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la

description qui va suivre.

L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément

de description qui va suivre qui se réfère à des exemples de

mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention.

Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples de mise en oeuvre sont donnés uniquement à titre d'illustration -de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune

manière une limitation.

Exemple 1

On soumet les semences de digitale à une stérilisation superficielle pendant 10 minutes dans une solution aqueuse à 10 % d'hypochlorite de sodium, puis on rince les graines à trois reprises avec de l'eau stérile On fait germer les grains stériles sur un milieu de culture de type Nitsch (-Nitsch et Nitsch, Science, 163, 85-87 ( 1969) 3 et on laisse se développer les plantes en germination jusqu'à ce qu'elles atteignent le

stade de développement des 2 à 3 feuilles ( 3 semaines).

Le milieu de culture mis en oeuvre présente la composition suivante: KNO 3 950,0 mg/1 NH 4 NO 3 720,0 mg/1 Ca C 12,2 H 20 166,0 mg/1 KIH 2 PO 4 68, 0 mg/1 Mg SO 4,7 H 20 185,0 mg/i Mn SO 4,H 20 25,0 mg/1 H 3 B 03 10,0 mg/1 Zn SO 4,4 H 20 10,0 mg/1 Na 2 Mo O 4,2 H 20 0,25 mg/1 Cu SO 4,5 H 20 0,025 mg/1 Solution du complexe de Fe(II)EDTA 5,00 ml/1 biotine 0,05 mg/1 glycine 2,0 mg/l inositol 100,0 mg/1 acide nicotinique 5,0 mg/1 pyridoxine 0,5 mg/1 thiamine 0,5 mg/1 acide folique 5,0 mg/l saccharose 2000,0 mg/1 agar-a ar 1000,0 mg/1 Le p H du milieu de culture ci-dessus est ajusté à 5,6 avec une solution 1 N d'hydroxyde de sodium, avant

stérilisation.

* La solution de complexe de Fe (II)EDTA (fer-acide éthylènediamine tétracétique) est préparée de la façon suivante: on mélange 557 mg de Fe SO 4, 7 H 20 avec 756 mg de Na 2 EDTA et l'on ajuste le volume du mélange à 100 ml avec de l'eau distillée 5 ml de la solution résultante sont équivalents à

27,8 mg de Fe SO 4, 7 H 20, c'est-à-dire à 5,6 mg de Fe(II).

Des fractions de 20 ml du milieu de culture ci-dessus sont introduitesdans des tubes à essais et stérilisées dans

un autoclave à 121 C pendant 20 minutes.

Les graines sont déposées une par une sur la surface du milieu de culture dans des conditions stériles et maintenues ensuite dans des conditions climatisées (température: 26 t 10 C, humidité relative: 65-75 %, intensité de l'éclairage: 000 à Il 000 lux; photopériodes: nuit/jour de 8/16) pendant environ 3 semaines, c'est-à-dire jusqu'à ce que les

plants atteignent le stade de développement des 2-3 feuilles.

Les racines des 10 très jeunes plants résultants sont enlevées et les plants sont transplantés sur un milieu

de culture présentant la composition indiquée plus haut, addi-

tionnée de 1 ppm d'acide indoleacétique, de 1 ppm de benzyla-

minopurine et de 0,1 ppm d'acide gibberellique à titre de substances de régulation de la croissance végétale ( 100 ml du milieu de culture sont introduits dans une fiole conique dont

le volume est de 250 ml).

L'acide indoleacétique et la benzylaminopurine sont ajoutés au milieu de culture avant stérilisation, tandis que l'acide gibberellique, qui est stérilisé par filtration, est mélangé au milieu de culture lorsque celuici a déjà été

refroidi à environ 40 'C.

Les plantes sont maintenues dans les conditions cli-

matisées décrites plus haut, jusqu'à ce que s'établisse une

intense induction de pousses latérales (environ 4 semaines).

Les pousses latérales sont séparées dans des condi-

tions stériles, puis inoculées individuellement sur un milieu de culture de type Nitsch, contenant également 1 ppm d'acide i, -naphtylacétique et 0,1 ppm de kinetrine Après deux semaines d'incubation, les plantes résultantes présentant des racines de 4 à 8 mm de long, sont transplantées sur un milieu de culture ne contenant aucune substance de régulation de la croissance végétale et la culture est poursuivie A partir de très jeunes plants, on a ainsi obtenu 145 jeunes plants

comportant des racines, en environ 11-12 semaines.

Les jeunes plants pourvus de racines de 4 à 6 cm de long et cultivés dans des conditions stériles, sont ensuite plantés dans des pots remplis d'un mélange 1:1 de sable et de perlite (le mélange est saturé d'eau à 70 % de sa capacité d'absorption d'eau) et adaptés aux conditions de culture en

pleine terre dans une phytobotte, dans des conditions contrô-

lées L'humidité relative de l'air est ajusté à 70 % dans la

phytoboite et l'intensité de l'éclairage est de 16 000 lux.

Le changement de température entre le jour et la nuit est ajusté à 21/15 C Les plantessont arrosées avec une solution de Knopp modifiée (une solution de macro-et de microéléments)

afin de compléter l'apport en éléments nutritifs.

Comme initialement, les plantes demandent un envi-

ronnement a 100 % d'humidité relative, les pots sont recouverts

d'une cloche de verre pendant 4 à 6 jours.

Ainsi maintenus dans les phytoboîtes dans les condi-

tions ci-dessus, les jeunes plants deviennent vigoureux et

peuvent alors être dépotés.

L'homogénéité morphologique des rejetons d'une seule et même très jeune plante, est caractérisée par les valeurs

X 2 du nombre, de la longueur et de la largeur des feuilles.

Les résultats sont rassemblés dans le tableau 1 ci-après Les nombres indiqués sont inférieurs à ceux qui sont fournis dans le tableau de E Weber rvoir Svàb, J: Biometric Methods in Research Work (en Hongrois), Mezbgazdasàgi Kiado, Budapest,

1973 Cela signifie qu'il n'existe aucune différence signifi-

cative entre les rejetons individuels, en ce qui concerne la largeur et la longueur des feuilles, c'est-à-dire que la

lignée est homogène.

Tableau 1

Nonbre de Nombre de Longueur çes feuilles Largeur des feuilles plantes feuilles (cm) (cm) moyenne pour 11 feuilles

1 14 3,6 1,29

2 13 3,12 1,26

3 19 3,25 1,26

4 12 3,71 1,48

11 3,64 1,25

6 12 3,57 1,31

7 13 3,25 1,45

8 12 3,34 1,50

9 11 3,47 1,43

c 2 (calculé) 20,65 21,23 (donné dans le tableau39,5 39,3 de Weber

Exemple 2

Des semences de dgitale sont soumises à une sté-

rilisation superficielle dans les conditions suivantes: lavage avec un détergent, rinçage à l'eau, trempage dans de l'acool à 70 % pendant 5 minutes, lavage à l'eau stérile,

trempage dans une solution aqueuse à 5 % d'hypo-

chlorite de sodium, pendant 5 minutes,

lavage à trois reprises avec de l'eau stérile.

La germination des graines stérilisées se développe pendant 4-5 jours sur de l'eau du robinet contenant 0,80 % d'agar-agar, dans les conditions suivantes: température: 21 + 1 C, humidité relative: 70 %, intensité de l'éclairage: 50 lux Les très jeunes plants sont ensuite inoculés sur un

milieu de culture de Linsmeier-Skoog (Physiol 18, 100-

127 ( 1965) 7 dont la composition est la suivante: NH 4 NO 1650,0 mg/1 KNO 3 1900,0 mg/1 Ca C 12,2 H 20 440,0 mg/l Mg SO 4,7 H 2 O 370,0 mg/i KH 2 PO 4 170,0 mg/i Solution de complexe de RF(II)EDTA 5,0 ml H 3 BO 3 6,2 mg/l Mn SO 4,H 20 22,3 mg/1 Zn SO 4,4 H 2 o 8,6 mg/1 KI 0,83 mg/1 Na 2 Mo O 4,2 H 20 0,25 mg/l Cu SO 4,5 H 20 0,025 mg/l Co C 12,6 H 20 0,025 mg/l inositol 100,0 mg/1 vitamine Bl 1,0 mg/i saccharose 3000,0 mg/1 agar-agar 1000,0 mg/1 t La solution de complexe de Fe(II)-EDTA est préparée

de la façon indiquée dans l E Koemple 1.

Le p H du milieu de culture est ajusté à 5,6 à l'aide

d'une solution 1 N d'hydroxyde de sodium avant stérilisation.

Des fractions de 80 ml du milieu de culture sont introduites dans des bocaux à fruits de 0,5 litre de capacité et

sont stérilisées dans un autoclave pendant 20 minutes à 121 OC.

Les plantes sont maintenues dans une pièce climati-

sée jusqu'à ce qu'elles atteignent une hauteur de 8-10 cm.

Les conditions régnant dans cette pièce sont les suivantes température: 26 + 10 C, humidité relative: 70 %, intensité de l'éclairage: 10 000 12 000 lux (des lampes à décharge électrique de type Airam Floralyx L 65/80, transmettant une lumière riche en composants rouges et bleus et des lampes à

décharge électrique du type Tungsram 65 W F 33 White, transmet-

tant une lumière riche en composant blanc sont utilisées en association comme sources de lumière); photopériode: 8

heures d'obscurité et 16 heures d'éclairage.

Les pousses des très jeunes plantes développées, portant 2-3 feuilles, sont inoculées sur un milieu de culture présentant la composition indiquée plus haut, additionnée de 1 ppm de benzylaminopurine et de 0,1 ppm d'acide indoleacétique

et les plantes sont cultivées dans une pièce climatisée.

Après 5-6 semaines d'incubation,les rameaux des feuilles résultants (pousses latérales) sont séparés et les pousses individuelles sont inoculées sur un milieu de culture ayant la composition indiquée plus haut, additionné de 0,56 ppm

d'acide indolebutyrique pour réaliser la formation de racines.

Deux semaines plus tard, les plantes portant des racines de 4-8 mm de long sont transplantées sur un milieu de culture dépourvu de substances de régulation de la croissance et cultivées dans ce milieu jusqu'à ce que la formation de

racines soit achevée ( 2-3 semaines).

On obtient 20 à 40 plantes individuelles viables

en moyenne à partir d'une seule graine.

Les jeunes plants pourvus de racines de 4 à 6 cm de long, sont plantés dans un mélange 1:1 de tourbe et de perlite, recouverts d'une feuille transparente, étirable à froid

(LTE 5228, fabriqué par Borsodi,Vegyi Kombinat, Hongrie) pen-

dant une semaine; puis la feuille est enlevée et les plantes sont cultivées dans une serre dans des conditions contrôlées (éclairage naturel, 70 % d'humidité relative, variation des

températures jour/nuit: 24/16 C) pendant environ 4 semaines.

Les plantes plus vigoureuses sont alors dépotées,

après quoi 95 % des jeunes plants commencent à croître.

L'homogénéité des lignées micropropagées est carac-

térisée par les valeurs moyennes de la hauteur de la plante, du poids de 1000 graines, les écarts types de ces moyennes (Sx) et le coefficient de variation (cv %) Les données sont

rassemblées dans le tableau 2 ci-dessous.

Tableau 2

Ncrbre Hauteur de la plante Poids de 1000 graines Lignée d'individus (can) (mng) Moyenne + cv % Moyenne + cv % sxs Sx Sx 1 7 76,l + 4,6 5,9 51 + 0, 9 5,0

2 8 82,2 + 5,5 6,6 41 + 0,9 6,1

3 7 82,4 + 3,0 3,6 45 + 1,2 7,2

4 7 76,8 + 4,0 5,2 50 + 1,1 6,0

Tmoin 7 73,4 + 7,2 10,1 47 + 2,7 15,4 Les faibles écarts-types et coefficients de variation et par rapport aux valeurs fournies par le témoin, indiquent

une homogénéité complète.

Exemple 3

On examine la teneur en constituants actifs de l'ex-

tremité des pousses d'un plant de digitale amélioré, cultivé dans des conditions de pleine terre Pour cela, on découpe une

longueur de 6-8 cm de cette extrémité de pousse et on la stéri-

lise pendant 20 minutes dans une solution aqueuse à 3 % d'hypo-

chlorite de sodium Le méristème de la pousse, long de 3 à 5 mm est séparé dans des conditions stériles et placé sur un milieu de culture de type Nitsch, ayant la composition indiquée dans l'exemple 1, Les pousses portant 2-3 feuilles sont placées sur un milieu de culture de propagationayant la composition indiquée dans l'exemple 1 et cultivées dans les conditions décrites dans cet exemple Apres un mois de culture, les rameaux de feuilles sont séparés, puis traités selon la

procédure de l'exemple 1.

Ainsi que le montrent les données analytiques, ni la teneur totale en glycosides, ni la quantité de glycosides de la série C ne varient au cours de la micropropagation; aucun

signe de dégénération n'a pu être observé.

Exemple 4

Des méristèmes de pousses stériles sont obtenus à partir de plants adultes de digitale, cultivés dans une terre labourée, de la façon suivante: les feuilles de plus de 60 mg sont éliminées de la pousse, celle-ci est lavée avec une grande quantité d'eau courante, trempée pendant 5 minutes dans de l'alcool à 70 %, lavée avec de l'eau stérile, puis trempée dans une solution aqueuse à 5 % d'hypochlorite de sodium pendant 10 minutes Ensuite,les feuilles supérieures sont éliminées et l'extrêmité de la pousse est placée sur un miliet de culture de type Linsmaier-Skoog ayant la composition

indiquée dans l'exemple 2.

La pousse portant 2-3 feuilles est inoculée sur le même milieu de culture, contenant en outre 0,01 ppm d'acide

2,4-dichlorophénoxyacétique et 0,1 ppm de benzylaminopurine.

Après 5 à 6 semaines de culture, les rameaux de feuilles sont Eséparés. Les rameaux de feuilles sont inoculés dans une variantc modifiée du milieu de culture décrit dans l'exemple 2, dans lequel les quantités de certains composants sont réduites de moitié Ces composants et leurs quantités sont les suivantes: NH 4 NO 3 825,0 mg/l KNO 3 950,0 mg/l Ca C 12,2 H 20 220,0 mg/1 Mg SO 417 H 2 O 185,0 m/l KH 2 PO 4 85,0 mg/l On Ajoute en outre O 1 ppin d'acide indolebutyrique au milieu de culture, comme additif, Les rameaux des feuilles sont cultivés sur le milieu de culture pendant 2 semaines, dans les conditions indiquées dans l'exemple 2; puis, après l'apparition des racines, -les plants sont transplantés dans un milieu de culture modifié ayant la composition ci-dessus, mais dépourvu d'acide indolebutyrique Les plants sont cultivés sur ce

milieu jusqu'à ce que leur développement soit achevé, c'est-

à-dire jusqu'à ce que les racines atteignent une longueur de -6 cm Ensuite, les plantes sont adaptées aux conditions

de la terre labourée, de la façon indiquée dans l'exemple 2.

On constate que ni la teneur totale en glycosides, ni la quantité de glycosides de la série C observées dans les plantes provenant de jeunes plants micropropagés, ne diffèrent notablement de celles que l'on observe chez l

plante parent.

Exemple 5

On procède de la façon décrite dans les exemples 1

et 3, à la différence près que l'on n'induit pas directe-

ment des racines chez les rameaux de feuilles formés sur le milieu de culture induisant le développement de pousses latérales (un milieu de culture contenant 1 ppm d'acide indoleacétique, 1 ppm de benzylaminopurine et 0,1 ppm d'acide gibberellique) mais qu'on les place à nouveau dans un milieu de culture de propagation et qu'on les incube dans celui-ci pendant 4 semaines, si bien qu'une autre génération de rameaux de feuilles se développe Cette procédure est répétée à trois reprises, puis les plantes sont enracinées de la façon qui est décrite dans l'exemple 1 A partir de très jeunes plantes, on obtient par cette méthode, 3000 jeunes plants pourvus de racines Ces jeunes plants sont adaptés aux conditions de la terre labourée de la façon

décrite dans l'exemple 1.

Exemple 6

On procède selon la méthode qui est décrite dans les exemples 2 et 4, à la différence près que l'on ne forme pas directement des r Aci nes sur les rameaux de feuilles obtenus sur un milieu de culture de type Linsmaier-Skoog contenant en outre, 1 ppm de benzylaminopurine et 0,1 ppm d'acide indoleacétique, mais qu'on les place à nouveau sur un milieu de culture de propagation et qu'après 5 à 6 semaines de culture, l'on sépare les rameaux de feuilles qui se sont formés Cette procédure est répétée jusqu'à l'obtention de la quantité désirée de plantes De cette façon, à partir d'une seule graine ou pousse, on recueille environ 27000

plantes, en environ 5 mois.

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de

la portée, de la présente invention.

OEVEND ICATIONS

1 Procédé pour la préparation de la matière de propagation (jeune plant) de la digitale (Digitalis lanata Ehrh) par micropropagation végétative dans une culture de tissus, en soumettant les graines ou les extrémités de pousses de plantes de pleine terre à une stérilisation superficielle, lequel procédé est caractérisé en ce que a) une plante stérile portant quelques feuilles, de préférence 2 à 3, est produite à partir de la graine stérile ou de l'extrémité de pousse stérile d'une plante de pleine terre, sur un milieu de culture connu, b) la plante stérile portant quelques feuilles, de préférence 2-3, est éventuellement débarrassée de ses racines, puis, trans-inoculée (repiquée) sur un milieu de culture de propagation contenant une ou des auxine(s), une ou des cytokinine(s) et éventuellement de l'acide gibberellique;

la plante se propage dans ce milieu jusqu'à ce qu'elle attei-

gne un stade de 20 à 40 pousses latérales, puis la plante est divisée en rameaux de feuilles portant de préférence 2 à 3 feuilles et, si on le désire, la propagation est répétée jusqu'à l'obtention du nombre désiré de plants,

c) les rameaux de feuilles stériles, portant de pré-

férence 2-3 feuilles, sont transplantés sur un milieu de culture de formation de racines, contenant une auxine ou une auxine et une cytokinine et la formation des racines est induite jusqu'à un développement des racines de 4 à 8 mm de long, d) les plantes pourvues de racines de 4 à 8 mm de longueur, sont repiquées dans un milieu de culture dépourvu d'auxine(s) et de cytokinine(s) jusqu'à obtention d'une longueur de racines de 4 à 6 cm, et,

e) si on le désire, la matière de propagation résul-

tante (jeune plant) est adaptée aux conditions de pleine terre. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'une très jeune plante est produite à partir de la graine stérilisée, sur de l'agar-agar en solution aqueuse; en ce que la très jeune plante est ensuite transplantée sur un milieu de culture ayant une composition connue et est cultivée jusqu'au développement de quelques feuilles,

de préférence 2-3.

3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la plante stérile portant quelques feuilles et de préférence 2-3, est produite à partir de la graine stérile ou de l'extrémité de pousse stérile d'une plante cultivée dans des conditions de pleine terre, par incubation de la matière de départ à 24 + 2 C, à une humidité relative de 50 à %, sous un éclairage ayant une intensité de 9000 à 14000 lux et en appliquant de préférence une phot Dpériode nuit/jour

de 8/16 heures.

* 4 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la très jeune plante est produite à partir de la graine stérilisée, à 24 + 2 C, avec une humidité relative de -80 %, un éclairage dont l'intensité est de 50 à 100 lux et en appliquant de préférence une photopériode nuit/jour de 8/16 heures et en ce que la très june plante résultante est

transinoculée (repiquée) sur un milieu de culture de composi-

tion connue.

Procédé selon l'une quelconque des revendications

1 à 4, caractérisé en ce que le rapport auxine/cytokinine dans le milieu de culture de propagation est ajusté à une valeur

comprise entre 1:1 et 1:10.

6 Procédé selon l'une quelconque des revendications

1 à 5, caractérisé en ce qu'on ajoute en outre, 0,1 à 0,5 ppm d'acide gibberellique au milieu de culture contenant une auxing

et une cytokinine dans un rapport 1:1.

7 Procédé selon l'une quelconque des revendications

1 à 6, caractérisé en ce que l'on met en oeuvre l'acide indoleacétique ou l'acide 2,4-dichlorophénylacétique, en tant qu'auxine.

8 Procédé selon l'une des revendications 1 à 7,

caractérisé en ce que l'on met en oeuvre la benzylarinopurine

appliquée en tant que cytokinine.

9 Procédé selon l'une quelconque des revendica-

tions 1 à 8, caractérisé en ce que la formation des racines est induite à 24 2 C, à une humidité relative de 50 à 80 % sous un éclairage de 9000 à 14000 lux, en appliquant de préférence une photopériode nuit/jour de 8/16 heures.

Procédé selon l'une quelconque des revendica-

tions 1 à 9, caractérisé en ce que le milieu de culture qui induit la formation de racines, contient une auxine ou une

auxine et une cytokinine.

11 Procédé selon l'une des revendications 1 ou 10,

caractérisé en ce que le milieu de culture qui induit la forma-

tion des racines contient de 0,1 à 0,5 ppm d'acide indolebuty-

rique ou 0,8 à 1,5 ppm d'acide q C -naphtylacétique en tant qu'auxine.

12 Procédé selon la revendication 1 ou 10, caracté-

risé en ce que, dans le cas o l'acide O(-naphtylacétique est utilisé en tant qu'auxine, on ajoute au milieu de culture % de kinétrine, calculés pour la quantité d'acide

C-naphtylacétique, en tant que cytokinine.

13 Procédé selon l'une quelconque des revendications

1 à 12, caractérisé en ce que le milieu de culture pour l'in-

duction des racines et/ou le milieu de culture pour la forma-

tion des racines, contient de préférence la moitié de la quantité de macroéléments présents dans les milieux de culture

connus.

14 Procédé selon l'une quelconque des revendications

1 à 13, caractérisé en ce que la formation de racines est réalisée à 24 2 C, à une humidité relative de 50 à 80 %, sous un

éclairage dont l'intensité est de 9000 à 14000 lux, en appli-

quant de préférence une photopériode nuit/jour de 8/16 heures.

Procédé selon l'une quelconque des revendications

1 à 14, caractérisé en ce que les matières de propagation (jeunes plants) sont adaptées aux conditions de pleine terre dans un mélange de tourbe/perlite à 60-80 % d'humidité relative

ou dans un mélange de sable/perlite à 60-80 % d'humidité rela-

tive et en ce que, dans le cas o l'on utilise le mélange de sable/perlite, les éléments nutritifs sont complétés par une

solutiorn de macro-et de microélemnts.

16, Procédé selon l'une quelconque des revendications

1 à 15,caractérisé en ce que les matières de propagation (jeunes plants) sont adaptées aux conditions de la pleine terre dans une phytobo Ute sous un éclairage de 12000 à 16000 lux, en appliquant une photopériode nuit/jour de 8/16 heures,

une variation des températures nuit/jour de 15/21 C et -

l'ajustement de l'humidité relative à 100 % pendant 1 à 8

jours, puis à 50-80 % pendant environ 21 jours supplémentaires.

17 Procédé selon l'une quelconque des revendications

1 à 15, caractérisé en ce que les matières de propagation (jeunes plants) sont adaptées aux conditions de la pleine terre, dans une serre sous un éclairage naturel, à 15-25 C, pendant 1 à 8 jours à une humidité relative de 100 %, puis à une humidité relative de 50 à 80 % pendant environ 21 jours

supplémentaires.