NL8201937A - Werkwijze voor de bereiding van het vermenigvuldigingsmateriaal van vingerhoedskruid (digitalis lanata ehrh.) in weefselcultuur. - Google Patents

Description

N/30.937-Kp/Pf/vdM , ? * > - 1 - i

Werkwijze voor de bereiding van het vermenigvuldigingsmate- i riaal van vingerhoedskruid (Digitalis Lanata EHRH.) in weefselcultuur.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de bereiding van het vermenigvuldigingsmateriaal van vingerhoedskruid (Digitalis Lanata Ehrh.) in weefselcul-tuur. Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op 5 een werkwijze voor de bereiding van het steriele vermenigvul-digingsmateriaal van vingerhoedskruid, verkregen in een steriele weefselcultuur, alsmede op de bereiding van niet-steriele zaailingen, aangepast aan open-luchtomstandigheden, die uit het steriele vermenigvuldigingsmateriaal zijn verkre-10 gen.

Vingerhoedskruid is een waardevol ruw materiaal voor de farmaceutische industrie, omdat het hartglycosi-de bevat, en wordt gekweekt door zaden die van de twee jaar oude planten zijn verzameld te zaaien en de 4én jaar oude 15 planten, die uit de zaden zijn öpgekomen en geschikt zijn voor farmaceutische doeleinden,te oogsten.

De farmaceutische industrie heeft een plantaardig ruw materiaal nodig met hoog gehalte aan actieve stof en een constante samenstelling. De planten met geschikt gehal-20 te aan actieve stof, die thans worden geteeld, zijn reeds het resultaat van een langdurige veredeling.

Volgens literatuurgegevens is het genetische mutatievermogen van de plant zeer hoog. De morfologische variaties en de schommeling in opbrengst en gehalte aan actieve 25 stof kunnen worden toegeschreven aan het feit dat - de soort pas gedurende een relatief korte periode wordt geteeld, - het chromosomenaantal varieert en - de plant spontane hybriden heeft.

30 ^Lungenau, I., Lucrar. Cradin. Bot. Bucuresti 37 (1966);

Neczypor W., Pharmazie Γ9, 38 (1964); Schick, E.R., Reimann, P.R., Züchter 27, 7, 301 (1957)__7-

Op basis van metingen die werden uitgevoerd op. in het wild in het gebied van Budakalasz (Hongarije) 8201937 • »

V

- 2 - v groeiende vingerhoedskruidsoorten nam A. Mathë significante verschillen waar in de gemiddelde stengeldiameter en bladner-ven van de families en vond hij een even grote schommeling in het gehalte aan actieve stof ^Morphological, Chemical and 5 Oecological Properties of Plants with Cardiac Glycoside Contents; CSC-these, Budakalasz (1978)_7-

Inteelt gedurende verscheidene generaties, welke de homogeniteit zou bevorderen, is ongunstig, aangezien het biopotentiëel van de plant verloren zou gaan ^Tétényi P., 10 Herba Hungarica S_, 3, 61, (1970)

Kruising tussen niet verwante soorten is moeilijk uit te voeren ^Michaela, A., Silva, P.: Herba Hungarica _ll, 1, 29 (1972) J, terwijl kruising binnen de soort doelmatiger is ^Schwerdtfeger, G., Züchter _31, 5, 202 (196l)_/. In 15 dit geval moeten ook hybridezaden met cytoplasmatische andro-steriliteit geproduceerd worden, die de sterk arbeidsintensieve kastratie overbodig maken. Zoals voorgesteld door Schwerdt-feger worden de opbrengst en de interne samenstelling geregeld door verscheidene genen en hangen deze ook in sterke mate af 20 van de omgevingsomstandigheden. Schwerdtfeger vermeldt tevens dat bij verbetering van de plant wat betreft morfologische homogeniteit het aanpassingsvermogen aan de omgeving afneemt en zo de opbrengst als doel van de verbetering van secundair belang wordt /Züchtungsprobleme bei Digitalis lanata Ehrh., 25 Referat: Arznei-pflanzencolloquium, Ranischholzhausen (1973)_7· E. Schratz heeft aangetoond, dat op cultuur-plaatsen het variatievermogen van de morfologische kenmerken van bladeren en bloemen opmerkelijk hoog is /Kappert, H., Rudolf, W., Handbuch der Pflanzenzüchtung; Paray, Berlin-30 Hamburg, Vol. 5, blz. 383 (1961)_7- G. Ligeti nam waar dat de onderlinge verhouding van de individuele glycosidecomponenten in de planten in grote mate varieert ^Pharmazie X4, 162 (1959)J. Dit wordt ook bevestigd door de gegevens van P.Tétényi /ïntraspecific Chemi-35 cal Taxines and Improvement of Drug Plants? DSC-these, Budapest (1963)_7· Laatst genoemde auteur vond een schommeling van 1 : 8 tot 12 : 1 in de verhouding van lanatoside A tot lanatoside C bij in het wild groeiende planten, terwijl een verhouding van 8201937 *· ♦ - 3 - zelfs 20 : 1 ook werd gevonden bij gekweekt vingerhoedskruid.

Zo brengt de kweek en verbetering van vingerhoedskruid nog verscheidene problemen met zich meer die opgelost zouden kunnen worden door middel van een vegetatieve 5 vermenigvuldigingswerkwijze, aangezien de op deze wijze verkregen nakomelingen genetisch identiek zijn aan de voorzaten waarvan wordt uitgegaan. De gebruikelijke werkwijzen voor vegetatieve vermenigvuldiging (stengelsplitsing, snijden) ' bleken echter ongeschikt te zijn voor de vermenigvuldiging van 10 vingerhoedskruid.

Op basis van ervaring verkregen bij andere planten leek vegetatieve microreproductie door weefselkweek een aangewezen weg te zijn. Volgens literatuurgegevens echter is de vegetatieve microreproductie van vingerhoedskruid (Digita-15 lis lanata Ehrh.) nog steeds een onopgelost probleem. Lui en Staba /Phytochemistry ^18, 1915 (1979) J hebben vingerhoedskruid geënt op een Murashigo-Skoog-kweekmedium, maar zij konden de planten slechts gedurende 12 weken kweken. Deze auteurs onderzochten het gehalte droge stof en het digoxineniveau in 20 celculturen, maar zij hebben geen massavermenigvuldiging uitgevoerd.

Verscheidene auteurs hebben gepoogd de actieve stoffen van het vingerhoedskruid te produceren door een "callus"-cultuur en vervolgens een suspensiecultuur van vinger-25 hoedskruidbladeren te bereiden en de cultuur te onderwerpen aan steriele celkweek onder in-vitro-omstandigheden /Helmbold, H., Planta Medica 33_, 3, 280 (1978)? Shyr, S.E. en Staba, H.

J., Planta Medica ^0/ 86 (1976)__7- Het gehalte aan digoxine van de verkregen planten was echter uiterst laag en in de 30 praktijk niet te isoleren. Deze manier van plantenweefselkweek waarbij niet gedifferentiëerde individuele cellen vermenigvuldigd worden in suspensie op een vloeibaar kweekmedium, is niet geschikt voor de produktie van genetisch identieke planten, die bruikbaar zijn als zaailingen voor verdere teelt.

35 Dientengevolge is de massavermenigvuldiging van homogene, genetisch stabiele eenheden met geselecteerde produktiecapaci-teiten nog steeds een onopgelost probleem.

De uitvinding beoogt de uitwerking van een 8201937 ♦ · - 4 - werkwijze voor de vegetatieve microvermenigvuldiging van vingerhoedskruid (Digitalis lanata Ehrh.) in een steriele weefselcultuur, welke genetisch identiek vermenigvuldigings-materiaal (zaailingen) oplevert, dat geschikt is voor de 5 teelt in de open lucht in iedere gewenste hoeveelheid.

Gevonden werd dat de herhaalde vermenigvuldiging van vingerhoedskruid in steriele kweek opgelost kan worden door zowel gebruik te maken van steriele zaden als door de steriele scheutuiteinden van planten die onder open-lucht-10 omstandigheden zijn geteeld op te kweken, wanneer een strikt bepaald aantal trappen in strikt bepaalde volgorde toegepast wordt voor de vermenigvuldiging van de planten, voor de voorbereiding van het planten in de open lucht en voor de aanpassing van de plant aan de open-lucht-omstandigheden, waarbij 15 strikt bepaalde arbeidsparameters worden nageleefd.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de bereiding van het vermenigvuldigingsmateriaal (zaailing) van vingerhoedskruid (Digitalis lanata Ehrh.) in weefselcultuur, onder vegetatieve microvermenigvuldiging door 20 de zaden of de stengeltoppen van in de open lucht geteelde planten te onderwerpen aan oppervlakte-sterilisatie. Volgens de uitvinding gaat men als volgt te werk: a) een steriele plant met enige, bij voorkeur 2-3, bladeren wordt opgekweekt uit het steriele zaad of de 25 steriele stengeltop van een in de open lucht geteelde plant op een bekend kweekmedium, b) de steriele plant met enige, bij voorkeur 2-3, bladeren wordt eventueel ontworteld en vervolgens overge-ent (overgebracht) op een vermenigvuldigingskweekmedium, dat 30 auxine(n), cytokinine(n) en evt. gibberellinezuur, bevat, de plant wordt daar opgekweekt totdat een stadium van 20-40 zij-scheuten is bereikt, waarop de plant wordt gesplitst in bladerkransen van bij voorkeur 2-3 bladeren elk, en indien gewenst wordt de vermenigvuldiging herhaald totdat het gewenste 35 aantal planten is verkregen, c) de steriele bladerkransen met bij voorkeur 2-3 bladeren, worden overgeplant op een wortelingskweekmedium, dat een auxine of een auxine met een cytokinine bevat en het 8201937 « c - 5 - wortelschieten wordt geïnduceerd totdat wortels met een lengte i van 4-8 mm zich hebben ontwikkeld, d) de planten met wortels met een lengte van 4-8 mm worden verder geworteld op een kweekmedium, dat vrij 5 is van auxine(n) en cytokinine(n), totdat een wortellengte van 4-6 cm is bereikt en e) indien gewenst wordt het verkregen verme-nigvuldigingsmateriaal (zaailing) aangepast aan de open-lucht-omstandigheden.

10 In de eerste trap van de boven genoemde werk wijze worden steriele planten met bij voorkeur 2-3 bladeren opgekweekt uit zaden die op een op zich bekende wijze zijn gedesinfecteerd of uit gedesinfecteerde stengeltoppen van in de open lucht groeiende planten op een kweekmedium als beschreven 15 in de literatuur ^Linsmaier and Skoog, Physiol. Plantarum, _18 100-127 (1965); Nitsch and Nitsch, Science, 163, 85-87 (1969)J.

In de tweede trap van de werkwijze volgens de uitvinding worden de scheuten van steriele planten met bij voorkeur 2-3 bladeren, overgebracht op een vermenigvuldigings-20 kweekmedium. Het vermenigvuldigingskweekmedium moet de vorming van zoveel mogelijk zij scheuten induceren, waardoor een massale bladerkransontwikkeling teweeg wordt gebracht. Het vermenigvuldigingskweekmedium is in wezen één van de twee boven genoemde media, maar aangevuld met een geschikte combinatie 25 van auxine(n), cytokinine(n) en indien gewenst gibberelline-zuur. Als auxine kan bijv. 0,1-1,0 ppm indoolazijnzuur of 0,01-0,05 ppm 2,4-dichloorfenoxyazijnzuur worden toegepast.

Het met het auxine te combineren cytokinine kan bijvoorbeeld benzylaminopurine zijn, in een concentratie van 0,1-1,0 ppm.

30 De verhouding van de twee componenten kan variëren tussen 1 : 1 en 1 ï 10. Wanneer de auxine/cytokine-verhouding 1 : 1 bedraagt, is ook de ontwikkeling van de in de weefselkweek vermenigvuldigde planten gunstiger wanneer tevens gibberelline-zuur wordt toegevoegd aan het vermenigvuldigingskweekmedium 35 als een derde additief in een concentratie van 0,1-0,5 ppm.

De cultuur wordt geïncubeerd bij 24+2°C onder een relatieve vochtigheid van 50-80 %, onder belichting met 9.000-14.000 lux gedurende belichtingsperioden van bij voorkeur 16 h daglicht 8201937 « - 6 - en 8 h duisternis. De kweek neemt ca. 4-6 weken in beslag.

De getakte stengels met tenminste 50 zijscheuten, worden gesplitst onder steriele omstandigheden tot scheuten (bladerkransen) met 2-3 bladeren en een nieuwe vermenig-5 vuldigingstrap wordt begonnen onder de boven genoemde parameters, waarbij de scheuten uit zichzelf tot verdere ontwikkeling in staat zijn. Splitsing en vermenigvuldiging kunnen naar willekeur worden herhaald totdat de gewenste hoeveelheid vermenigvuldigingsmateriaal (zaailingen) geproduceerd is.

10 Wanneer het vereiste aantal planten bereikt is moet het wortelschieten geïnduceerd worden bij de aparte planten, teneinde hun uitplanting te vergemakkelijken. In deze derde trap van de werkwijze volgens de uitvinding worden de vermenigvuldigde planten met 2-3 bladeren overgeplant op een 15 wortelingscultuurmedium. Dit wortelingsmedium kan een medium zijn van het Nitsch-and-Nitsch-type, of van het Linsmeier-Skoog-type als boven besproken, maar op geschikte wijze gemodificeerde varianten ervan, welke slechts de helft van de macro-elementen van het originele medium bevatten, kunnen ook 20 met voordeel worden toegepast. De cultuurmedia moeten altijd hetzij een auxine hetzij een auxine te zamen met 10 % van een cytokinine, berekend op de aanwezige hoeveelheid auxine, bevatten. Wanneer indoolboterzuur als auxine wordt gebruikt, kan de hoeveelheid ervan in het kweekmedium tussen 0,1 en 0,5 ppm 25 liggen. Wanneer een combinatie van een auxine en een cytokinine wordt toegepast, kan het kweekmedium bijv. 1 ppm a-naftyl-azijnzuur te zamen met 0,1 ppm kinetine bevatten. Het wortelschieten verloopt sneller en de gevormde wortels zijn levenskrachtiger wanneer er een lage hormoonconcentratie wordt toe-30 gepast en het gehalte aan macro-elementen van het kweekmedium verlaagd wordt tot de helft van het in de vorige trap gebruikte gehalte. Het is van wezenlijk belang dat de derde trap slechts wordt voortgezet totdat de planten wortel beginnen te schieten.

35 In de vierde trap van de werkwijze volgens de uitvinding worden de planten met wortels van 4-8 mm lengte overgeplant op een kweekmedium zonder hormonen. Het gehalte aan macro-elementen van dit hormoonvrije kweekmedium is iden- 8201937 - 7 - tiek aan dat van het medium dat in de voorgaande trap werd gebruikt. Wanneer de culturen met geïnduceerde worteling ver-der gekweekt worden op een hormoonvrij medium, worden talloze sterke wortels ontwikkeld en is ook de ontwikkeling van de 5 vegetatieve delen van de plant geschikt. De incubatie-omstan-digheden in de derde en vierde trap zijn identiek aan die welke in de voorgaande werden toegepast. De twee laatste trappen nemen te zamen 4-6 weken in beslag en aan het eind van deze periode worden gewortelde zaailingen, die zich op juiste 10 wijze hebben ontwikkeld uit planten, verkregen.

In de vijfde en laatste trap van de werkwijze volgens de uitvinding worden de zaailingen aangepast aan niet-steriele kweekomstandigheden in de open lucht. In deze trap worden de zaailingen geplant in potten die gevuld zijn met een 15 mengsel van zand en perliet, of turf en perliet. Het mengsel wordt benat tot 70 % van zijn wateradsorptieniveau; wanneer een mengsel van zand en perliet wordt gebruikt wordt het be-natten uitgevoerd met een oplossing, die macro- en micro-elementen (gemodificeerde Knopp-oplossing) bevat. De zaai-20 lingen worden onder semi-steriele omstandigheden geïncubeerd in een plantenkist of in een broeikas met op juiste wijze geregelde temperatuur en vochtigheidsomstandigheden. De periode van aanpassing duurt ca. 4-5 weken.

De belangrijkste voordelen van de vegetatieve 25 microvermenigvuldiging in weefselcultuur zijn als volgt: - de homogeniteit van de soort (identiteit van orde) kan behouden worden, - de vermenigvuldiging van een individuele plant kan continu, onafhankelijk van de seizoen- en weersomstandigheden worden 30 uitgevoerd, - iedere gewenste hoeveelheid homogene planten kan uit een enkele individuele plant geproduceerd worden.

Op basis hiervan kan vegetatieve microvermenigvuldiging benut worden voor het in stand houden van de 35 vingerhoedskruidsoort, voor de verbetering van de plant en voor de produktie van een voor de kweek benodigde homogene zaadvoorraad.

De uitvinding wordt in detail toegelicht met 8201937 - 8 - behulp van de volgende niet beperkende voorbeelden.

VOORBEELD I

Tien te zaaien zaadjes van het vingerhoedskruid werden gedurende 10 min onderworpen aan oppervlakte-5 sterilisatie in een 10 % waterige oplossing van natriumhypo-chloriet en daarop werden de zaadjes drie maal gespoeld met steriel water. De steriele zaadjes werden gekiemd op een kweekmedium van het Nitsch-type /Nitsch and Nitsch, Science, 163, 85-87 (1969)J, en de kiemende planten liet men zich ont-10 wikkelen totdat deze het ontwikkelingsstadium van 2-3 bladeren hadden bereikt (3 weken).

Het gebruikte kweekmedium had de volgende samenstelling: KNO3 950,0 mg/1 15 NH4N03 720,0 mg/1

CaCl2.2H20 166,0 mg/1 KH2P04 68,0 mg/1

MgS04.7H20 185,0 mg/1

MnS04.H20 25,0 mg/1 20 H3B°3 1Ö,0 mg/1

ZnS04.4H20 10,0 mg/1

Na2Mo04.2H20 0,25 mg/1

CuS04.5H20 0,025 mg/1

Fe(II)-EDTA-complexoplossing* 5,00 mg/1 25 biotine 0,05 mg/1 glycine 2,0 mg/1 inositol 100,0 mg/1 nicotinezuur 5,0 mg/1 pyridoxine 0,5 mg/1 30 thiamine 0,5 mg/1 folinezuur 5,0 mg/1 saccharose 2000,0 mg/1 agar 1000,0 mg/1

De pH van het boven genoemde kweekmedium 35 werd gesteld op 5,6 met IN natriumhydroxi- de-oplossing voorafgaande aan sterilisatie.

* De Fe(II)-EDTA (ijzerethyleendiaminetetra-azijnzuur)-complexoplossing werd als volgt 8201937 - 9 - bereid: 557 mg FeS04.7H20 werd vermengd met 756 mg Na2EDTA en hèt volume van het mengsel werd gebracht op 100 ml met gedestilleerd water. 5 ml van de verkregen 5 oplossing is equivalent aan 27,8 mg

FeS0^.7H20, d.w.z. aan 5,6 mg Fe(II).

Porties van 20 ml van het boven genoemde kweekmedium werden gebracht in reageerbuizen en in een autoclaaf gedurende 20 min bij 121°C gesteriliseerd.

10 De zaden werden één voor één onder steriele omstandigheden op het oppervlak van het kweekmedium geplaatst en vervolgens onder geklimatiseerde omstandigheden (temperatuur: 26+l°C, relatieve vochtigheid: 65-75 %, belichtingsin-tensiteit: 10.000-11.000 lux; nacht/dagbelichtingsperioden: 15 8/16} gehouden gedurende ca. 3 weken, d.w.z. totdat de planten het ontwikkelingsstadium van 2-3 bladeren hadden bereikt.

De wortels van de zo verkregen 10 jonge plantjes werden verwijderd en vervolgens werden de planten overgeplant op een kweekmedium met de boven beschreven samenstelling 20 plus 1 ppm indoolazijnzuur, 1 ppm,benzylaminopurine en 0,1 ppm gibberellinezuur als de plantengroei regelende stoffen (100 ml kweekmedium werd gebracht in een 250 ml-Erlenmeier).

Indoolazijnzuur en benzylaminopurine werden voor de sterilisatie aan het kweekmedium toegevoegd, terwijl 25 gibberellinezuur dat door filtratie was gesteriliseerd, met het kweekmedium werd vermengd toen het laatste reeds was afgekoeld tot ca. 40°C.

De planten werden onder de boven beschreven geklimatiseerde omstandigheden gehouden totdat een sterke in-30 ductie van zijscheuten inzette (ca. 4 weken).

De zijscheuten werden afgescheiden onder steriele omstandigheden en vervolgens individueel geënt op een kweekmedium van het Nitsch-type, dat tevens 1 ppm a-naftyl-azijnzuur en 0,1 ppm kinetine bevatte. Na 2 weken van incuba-35 tie werden de verkregen planten met wortels van 4-8 mm overgeplant op een kweekmedium, dat geen plantengroei regelende stoffen bevatte en werd de kweek voortgezet. Uitgaande van 10 jonge planten werden 145 gewortelde zaailingen binnen ca.

8201937 - 10 - 11-12 weken verkregen.

De zaailingen met wortels van 4-6 cm, die onder steriele omstandigheden waren gekweekt, werden daarop uitgeplant in potten die gevuld waren met een 1 : 1 mengsel 5 van zand en perliet (het mengsel was verzadigd tot aan 70 % van zijn watercapaciteit) en in een plantenkist onder geregelde omstandigheden aangepast aan de omstandigheden in de open lucht. De relatieve luchtvochtigheid werd ingesteld op 70 % in de plantenkist en de belichtingsintensiteit was 16.000 lux. De 10 temperatuursverandering van dag op nacht werd gesteld op 21/ 15°C. De planten werden bewaterd met een gemodificeerde Knopp-oplossing (een oplossing van macro- en micro-elementen) teneinde de voedingsstoffen aan te vullen.

Aangezien aanvankelijk de planten een omgeving 15 met 100 % luchtvochtigheid nodig hebben, werden de potten gedurende 4-6 dagen bedekt met een glazen klok.

De onder de boven genoemde omstandigheden in plantenkisten gehouden zaailingen wonnen aan kracht en konden dan ook later uitgezet worden.

20 De morfologische homogeniteit van de nakome lingen van één en dezelfde jonge plant wordt gekarakteriseerd 2 door de X -waarden van het aantal, de lengteen de breedte van de bladeren. De resultaten worden opgesomd in tabel A. De getallen zijn lager dan die welke worden gegeven in de tabel 25 van E. Weber /Zie Svab, J.: Biometric Methods in Research Work (in het Hongaars), Mezogazdasagi Kiadö, Budapest, 1973/. Dit betekent dat er geen significante verschillen tussen de aparte nakomelingen zijn wat betreft lengte en breedte van de bladeren, d.w.z. de groep is homogeen.

30 8201937 - 11 -

TABEL A

lengte van de breedte van de no. aantal bladeren, cm bladeren, cm plant bladeren (gemiddelde waarden voor 11 bladeren) 51 14 3,6 1,29 2 13 3,12 1,26 3 19 3,25 1,26 4 12 3,71 1,48 5 11 3,64 1,25 10 6 12 3,57 1,31 7 13 3,25 1,45 8 12 3,34 1,50 9 11 3,47 1,43.

X2 (berekend) 20,65 21,23 15 (gegeven in de tabel van Weber) 39,5 39,3

VOORBEELD II

Zaaizaden van vingerhoedskruid werden als volgt aan oppervlaktesterilisatie onderworpen: 20 - wassen met een detergens, - spoelen met water, - weken gedurende 5 min in 70 % alcohol, - wassen met steriel water, - weken gedurende 5 min in een 5 % waterige natriumhypochlo-25 rietoplossing, - drie maal wassen met steriel water.

De gesteriliseerde zaden werden gedurende 4-5 dagen gekiemd op leidingwater, dat 0,8 % agar bevatte, waarbij de volgende omstandigheden: temperatuur: 2l+l°C, relatieve 30 vochtigheid: 70 %, belichtingsintensiteit: 50 lux. Daarna werden de jonge planten geënt op een Linsmeier-Skoogcultuurmedium /Physiol. 18, 100-127 (1965)J met de volgende samenstelling: NH4N03 1650,0 mg/1 KN03 1900,0 mg/1 35 CaCl2.2H20 440,0 mg/1 8201937 - 12 -

MgS04.7H20 370,0 mg/1 KH2P04 170,0 mg/1

Fe (II)-EDTA-complexoplossing* 5,0 ml H^BO^ 6,2 mg/1 5 MnS04.H20 22,3 mg/1 % ZnS04.4H20 8,6 mg/1 KI 0,83 mg/1

Na2Mo04.2H20 0,25 mg/1

CuS04.5H20 0,025 mg/1 10 CoC12.6H20 0,025 mg/1 inositol 100,0 mg/1 vitamine 1,0 mg/1 saccharose 3000,0 mg/1 agar 1000,0 mg/1 15 De Fe(II)-EDTA-complexoplossing werd bereid als be schreven in voorbeeld I.

De pH van het kweekmedium werd voorafgaande aan sterilisatie gesteld op 5,6 met behulp van een IN natrium-hydroxide-oplos s ing.

20 Porties van 80 ml van het kweekmedium werden gebracht in jampotjes met een inhoud van 0,5 1 en gedurende 20 min bij 121°C in een autoclaaf gesteriliseerd.

De planten werden in een geklimatiseerde ruimte gehouden totdat deze een hoogte van 8-10 cm hadden bereikt. 25 De omstandigheden in deze ruimte waren: temperatuur: 26+l°C, relatieve vochtigheid: 70 %, lichtintensiteit: 10.000-12.000 lux (Airam Floralux I165/80-type electrische ontladingslampen met een spectrum rijk aan rode en blauwe componenten en Tungsram 65 w F33 white-type electrische ontladingslampen met een 30 spectrum rijk aan witte componenten werden in combinatie gebruikt als lichtbronnen), belichtingsperiode: 8 h donker en 16 h belichting.

De spruiten van de ontwikkelde jonge planten, welke 2-3 bladeren droegen, werden geënt op een kweekmedium 35 met .de boven genoemde samenstelling, dat tevens 1 ppm benzyl-aminopurine en 0,1 ppm indoolazijnzuur bevatte en de planten werden in een geklimatiseerde ruimte verder' gekweekt. Na 5-6 weken incubatie werden de zo verkregen bladerkransen (zij- 8201937 -13- scheuten) afgescheiden en werden de aparte scheuten geënt op een kweekmedium met de boven genoemde samenstelling, dat tevens 0,5 ppm indoolboterzuur bevatte teneinde wortelschieten te bewerkstelligen. Na 2 weken werden de planten met wortels 5 van 4-8 mm lengte overgeplant op een kweekmedium zonder de groeiregulerende stoffen en daarop gekweekt totdat de worteling voltooid was (2-3 weken).

20-40 levensvatbare individuele planten werden gemiddeld uit een enkel zaadje verkregen.

10 De zaailingen met wortels met een lengte van 4-6 cm werden uitgeplant in een 1 : 1-mengsel van turf en per-liet, bedekt met een transparant, koud rekbaar folie (LTE 5228, vervaardigd door Borsodi Vegyi Kombinat, Hongarije) gedurende één week, waarop het folie werd verwijderd en de plan-15 ten in een broeikas onder geregelde omstandigheden gedurende ca 4 weken werden gekweekt (natuurlijke belichting, 70 % relatieve vochtigheid, dag/nacht-temperatuursverandering 24/16°C).

De aangesterkte planten werden vervolgens uitgezet, waarna 95 % van de zaailingen begon te groeien.

20 De homogeniteit van de micro-vermenigvuldigde takken wordt gekarakteriseerd door de gemiddelde waarden van planthoogte en gewicht per 1000 zaden, de standaarddeviaties van deze gemiddelden (S ) en de variatiecoëfficiënt (cv, %).

ark

De gegevens worden opgesomd in tabel B.

25 TABEL B

aantal planthoogte, cm gewicht per 1000 zaden individuele gemiddeld in mg tak planten + S cv, % gem.+ S cv, % 1 7 76,1+4,6 5,9 51+0,9 5,0 30 2 8 82,2+5,5 6,6 41+0,9 6,1 3 7 82,4+3,0 3,6 45+1,2 7,2 4 7 76,8+4,0 5,2 504^,1 6,0 controle 7 73,4+7,2 10,1 47+2,7 15,4

De lage standaarddeviatie en variatiecoëffi-35 ciënten, vergeleken met de controle geven een volledige homogeniteit aan.

8201937 - 14 -

VOORBEELD III

De stengeltop van een verbeterde vingerhoeds-kruidplant, die onder omstandigheden in de open luoht was opgekweekt en op zijn gehalte aan actieve stof was onderzocht, 5 werd met een lengte van 6-8 cm afgesneden en gedurende 20 min in een 3 % waterige natriumhypochlorietoplossing gesteriliseerd. Het meristeem van de scheut werd met een lengte van 3-5 mm onder steriele omstandigheden afgescheiden en gebracht op een Nitsch-type kweekmedium met een samenstelling als be-10 schreven in voorbeeld I. De scheuten met 2-3 bladeren werden geplaatst op een vermenigvuldigingskweekmedium met de samenstelling als beschreven in voorbeeld I en onder de in dat voorbeeld gegeven omstandigheden verder gekweekt. Na een kweekduur van éên maand werden de bladerkransen afgescheiden 15 en vervolgens verder behandeld als beschreven in voorbeeld I.

Zoals aangetoond door de analytische gegevens veranderden noch het totale gehalte aan glycoside noch de hoeveelheid glycosiden van de C-serie bij micro-vermenigvuldi-ging en geen teken van degeneratie kon worden waargenomen.

20 VOORBEELD IV

Steriele stengelmeristemen werden verkregen uit volgroeide vingerhoedskruidplanten, die op bouwland waren gekweekt, waarbij als volgt te werk werd gegaan: de bladeren langer dan 60 mm werden van de stengel verwijderd, de stengel 25 werd gewassen met een rijkelijke hoeveelheid stromend water, gedurende 5 min in 70 % alcohol geweekt, gewassen met steriel water en vervolgens gedurende 10 min in 5 % waterige natriumhypochlorietoplossing geweekt. Daarna werden de bovenste bladeren verwijderd en werd de stengeltop gebracht op een 30 cultuurmedium van het Linsmaier-Skoog-type met de samenstelling als beschreven in voorbeeld II.

De stengel met 2-3 bladeren werd geënt op hetzelfde kweekmedium, dat tevens nog 0,01 ppm 2,4-dichloor-fenoxyazijnzuur en 0,1 ppm benzylaminopurine bevatte. Na een 35 kweekduur van 5-6 weken werden de bladerkransen afgescheiden.

De bladerkransen werden geënt op een gemodificeerde variant van het kweekmedium, dat is beschreven in voorbeeld II, waarbij de hoeveelheid van bepaalde componenten wer 8201937 - 15 - den verlaagd tot de helft. Deze hoeveelheden en hun componenten waren de volgende: NH4N03 825,0 mg/1 KN03 950,0 mg/1 5 CaCl2.2H20 220,0 mg/1

MgS04.7H20 185,0 mg/1 KH2P04 85,0 mg/1 0,1 ppm indoolboterzuur werd tevens toegevoegd aan het kweek-medium als additief.

10 De bladerkransen werden gedurende 2 weken op het kweekmedium gekweekt onder de in voorbeeld II aangegeven omstandigheden en vervolgens werden na het verschijnen van wortels, de planten overgeplant op een gemodificeerd kweekmedium met de boven genoemde samenstelling, dat echter geen 15 indoolboterzuur bevatte. De planten werden daarop tot aan volledige ontwikkeling gekweekt, d.w.z. totdat de wortels een lengte van 5-6 cm'hadden bereikt. Daarna werden de planten aangepast aan bouwlandomstandigheden, zoals beschreven in voorbeeld II.

20 Noch het totale gehalte aan glycoside, noch de hoeveelheid glycosiden van de C-serie als waargenomen in de planten die uit de micro-vermenigvuldigde zaailingen waren opgekomen, wijkt in significante mate af van die welke in de ouderplant waren gemeten.

25 VOORBEELD V

Men ging tewerk als in de voorbeelden I en III beschreven, met het verschil dat de bladerbogen die waren gevormd op het kweekmedium dat zijscheutontwikkeling induceerde (een kweekmedium bevattende 1 ppm indoolazijnzuur, 1 ppm ben-30 zylaminopurine en 0,1 ppm gibberellinezuur) niet direct werden geworteld, maar opnieuw op een vermeningvuldigingskweekmedium werden geplaatst en daar gedurende 4 weken werden geïncubeerd, waarop een volgende generatie van bladerkransen werd gevormd. Deze procedure werd drie maal herhaald, en daarop werden de 35 planten geworteld als beschreven in voorbeeld I. Uitgaande van 10 jonge planten werden volgens deze methode 3000 gewortelde zaailingen verkregen. De zaailingen werden aangepast aan akkerlandomstandigheden, zoals beschreven in voorbeeld I.

8201937 - 16 -

VOORBEELD VI

Men ging tewerk als beschreven in voorbeelden II en IV, met het verschil dat de bladerkransen, die waren gevormd op het kweekmedium van het Linsmaier-Skoog-type, dat 5 tevens 1 ppm benzylaminopurine en 0,1 ppm indoolazijnzuur bevatte, niet direct werden geworteld, maar opnieuw op een vermenigvuldigingskweekmedium werden geplaatst en na een kweekduur van 5-6 weken de gevormde bladerkransen werden afgescheiden. Deze procedure werd herhaald totdat de gewenste hoe-10 veelheid planten was verkregen. Op deze manier werden, uitgaande van één enkel zaadje of scheut, binnen ca. 5 maanden ca. 27.000 planten verkregen.

15 8201937

Claims (17)

1. Werkwijze voor de' bereiding van vermenig-vuldigingsmateriaal (zaailing) van vingerhoedskruid (Digitalis lanata Ehrh.) onder vegetatieve microvermenigvuldiging in een 5 weefselcultuur door de zaden of de stengeltoppen van openluchtplanten te onderwerpen aan oppervlaktesterilisatie, met het kenmerk, dat a) een steriele plant met enige, bij voorkeur 2-3, bladeren geproduceerd wordt uit het steriele zaadje of de 10 steriele stengeltop van een open-luchtplant op een bekend kweekmedium, b) de steriele plant met enige, bij voorkeur 2-3, bladeren eventueel ontworteld wordt en vervolgens over-geënt wordt (overgebracht) op een vermenigvuldigingskweek- 15 medium, bevattende auxine(n), cytokinine(n) en eventueeel gibberellinezuur, de plant daar wordt opgekweekt totdat een stadium van 20-40 zijscheuten is bereikt, vervolgens de plant gesplitst wordt in bladerkransen van bij voorkeur 2-3 bladeren elk en desgewenst het opkweken wordt herhaald totdat het ge- 20 wenste aantal planten is verkregen, c) de steriele bladerkransen met bij voorkeur 2-3 bladeren, worden overgeplant op een wortelingskweekmedium, bevattende een auxine of een auxine met een cytokinine en wortelschieten wordt geïnduceerd totdat wortels met een lengte 25 van 4-8 mm zijn ontwikkeld, d) de planten met wortels met een lengte van 4-8 mm geworteld worden op een kweekmedium zonder auxine(n) en cytokinine(n), totdat een wortellengte van 4-6 cm is bereikt en 30 e) desgewenst het verkregen vermenigvuldigings- materiaal (zaailing) wordt aangepast aan omstandigheden in de open lucht.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat een jonge plant geproduceerd 35 wordt uit het steriele zaadje op waterig agar, de jonge plant vervolgens wordt overgeplant op een kweekmedium met bekende samenstelling en verder wordt opgekweekt tot de ontwikkeling van enige,.bij voorkeur 2-3, bladeren. 8201937 r - 18 -

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de steriele plant met enige, bij voorkeur 2-3, bladeren geproduceerd wordt uit het steriele, zaadje of de steriele stengeltop van een plant die onder om-5 standigheden in de open lucht is gekweekt, door het uitgangsmateriaal bij 24+2°C en een relatieve vochtigheid van 50-80 % onder belichting met een intensiteit van 9.000-14.000 lux en bij voorkeur onder toepassing van een nacht/dagbelichtingspe-riode van 8/16 h te enten.

4. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de jonge plant uit het gesteriliseerde zaadje geproduceerd wordt bij 24+2°C en een relatieve vochtigheid van 50-80 % onder belichting met een intensiteit van 50-100 lux en bij voorkeur onder toepassing van een nacht/ 15 dagbelichtingsperiode van 8/16 h en de verkregen jonge plant overgeënt (overgebracht) wordt op een kweekmedium met bekende samenstelling.

5. Werkwijze volgens een der conclusies 1-4, met het kenmerk, dat de verhouding van auxine 20 tot cytokinine van het vermenigvuldigingskweekmedium gesteld wordt tussen 1 : 1 en 1 : 10.

6. Werkwijze volgens een der conclusies 1-5, met het kenmerk, dat 0,1-0,5 ppm gibberelline-zuur tevens wordt toegevoegd aan het kweekmedium, dat een 25 auxine en een cytokinine in een verhouding van 1 : 1 bevat.

7. Werkwijze volgens een der conclusies 1-6, met het kenmerk, dat indoolazijnzuur of 2,4-dichloorfenylazijnzuur als auxine wordt toegepast.

8. Werkwijze volgens een der conclusies 1-7, 30. e t het kenmerk, dat benzylaminopurine als cytokinine wordt toegepast.

9. Werkwijze volgens een der conclusies 1-8, met het kenmerk, dat het wortelschieten geïnduceerd wordt bij 24+2°C en een relatieve vochtigheid van 50- 35 80 % onder belichting met een intensiteit van 9.000-14.000 lux en bij voorkeur onder toepassing van een nacht/dagbelichtings-periode van 8/16 h.

10. Werkwijze volgens een der conclusies 1-9, 8201937 - 19 - -met het kenmerk, dat het kweekmedium dat het wortelschieten induceert een auxine of een auxine en een cyto-kinine bevat.

11. Werkwijze volgens conclusie 1 of 10, 5met het kenmerk, dat het kweekmedium dat het wortelschieten induceert 0,1-0,5 ppm indoolboterzuur of 0,8- 1,5 ppm α-naftylazijnzuur als auxine bevat.

12. Werkwijze volgens conclusie 1 of 10, met het kenmerk, dat wanneer a-naftylazijnzuur 10 als auxine gebruikt wordt, 10 % kinetine, berekend op de hoeveelheid α-naftylazijnzuur, wordt toegevoegd aan het kweekmedium als cytokinine.

13. Werkwijze volgens een der conclusies 1-12, met het kenmerk, dat het kweekmedium voor het 15 induceren van het wortelschieten en/of het kweekmedium voor het bewerkstelligen van het wortelschieten bij voorkeur de helft van de hoeveelheid macro-elementen bevat, die aanwezig is in de bekende kweekmedia.

14. Werkwijze volgens een der conclusies 1-13, 20 met het kenmerk, dat het wortelen bewerkstelligd wordt bij 24+2°C en een relatieve vochtigheid van 50-80% onder belichting met een intensiteit van 9.000-14.000 lux en bij voorkeur onder toepassing van een nacht/dagbelichtingspe-riode van 8/16 h.

15. Werkwijze volgens een der conclusies 1-14, met het kenmerk, dat het vermenigvuldigings-materiaal (zaailingen) aangepast wordt aan omstandigheden in de open lucht in een turf/perlietmengsel met een 60-80 % vochtigheid of in een zand/perlietmengsel met een 60-80 % 30 vochtigheid en wanneer een zand/perlietmengsel wordt gebruikt, de voedingsstoffen worden aangevuld met een oplossing van macro- en micro-elementen.

16. Werkwijze volgens een der conclusies 1-15, met het kenmerk, dat het vermenigvuldigings-35 materiaal (zaailingen) wordt aangepast aan de omstandigheden in de open lucht in een plantenkist onder belichting met een intensiteit van 12.000-16.000 lux, onder toepassing van een nacht/dagbelichtingsperiode van 8/16 h en een nacht/dagtempe- 8201937 ** V - 20 - ratuursverandering van 15/21°C en onder instelling van de relatieve vochtigheid gedurende 1-8 d op 100 % en vervolgens gedurende nog eens 21 d op 50-80 %.

17. Werkwijze volgens een der conclusies 1-15, 5met het kenmerk, dat het vermenigvuldigings-materiaal (zaailingen) wordt aangepast aan de omstandigheden in de open lucht in een broeikas onder natuurlijke belichting gedurende 1-8 d bij 15-25°C en een relatieve vochtigheid van 100 % en vervolgens gedurende nog eens 21 d bij een relatieve 10 vochtigheid van 50-80 %. 8201937