HU183433B

HU183433B - Process for producing multiplying material of digitalis lanata ehrh in tissue culture

Info

Publication number: HU183433B
Application number: HU130581A
Authority: HU
Inventors: Ildiko Erdei; Eva Dobos; Jenoe Bernath; Csaba Loerincz; Gyoergy Molnar; Szabady Judit Nyaradine; Istvan Zambo; Pal Maliga
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1981-05-12
Filing date: 1981-05-12
Publication date: 1984-05-28
Also published as: NL8201937A; DE3217857A1; GB2099851A; GB2099851B; FR2510354A1; FR2510354B1

Description

A szövettenyésztcses vegetatív mikroszaporítás előnye, hogy

- a fajtaazonosság megőrizhető,

- egyetlen egyed felszaporítása évszaktól és időjárástól függetlenül folyamatosan elvégezhető,

- egyetlen egyedből tetszés szerinti számú homogén növény állítható elő.

A vegetatív mikroszaporítás eszerint felhasználható a gyűszűvirág fajta-fenntartására, a növény nemesítésére, 5 valamint a termesztést szolgáló homogén magállomány előállítására.

A találmány tárgya eljárás gyűszűvirág (Digitális lanata Ehrh.) szaporítóanyag előállítására szövettenyészetben, közelebből megjelölve a találmány nemcsak a steril szövettenyészetben kapott gyűszűvirág steril szaporítóanyagának előállítási eljárására vonatkozik, hanem 15 a találmány kiterjed e steril szaporítóanyagból nyert, a nem steril, szabadföldi körülményekhez szoktatott palánták előállítására is.

A szívglikozidokat tartalmazó gyógyászati szempontból fontos gyűszűvirág termesztése jelenleg úgy történik, 20 hogy a két éves növényről magot fognak és magvetéssel állítják elő a gyógyszeralapanyagot adó egy éves növényt.

A gyógyszeripar igénye magas hatóanyagtartalmú, és azon belül meghatározott összetételű növényi nyers- 25 anyag. A jelenleg termesztett, megfelelő hatóanyagtartalmú növény is már hosszú nemesitői munka eredménye.

Irodalmi adatok szerint a növény örökletes változékonysága igen nagy. A morfológia különféleségének, a hozam és a hatóanyagtartalom ingadozásának oka, hogy 30

- a fajt nem régóta termesztik,

- a kromoszómaszáma változó,

- spontán hibridjei vannak.

[Lungenau, I., Lucrar, Cradin. bot. Bucuresti 37. (1966); Neczypor. W., Pharmazie, 19, 38 (1964); Schick,E. R., 35 Reimann, Philipp, R., Züchter, 27, 7,301 (1957)]

Máthé, Á. szignifikáns különbségeket igazolt Budakalász (Magyarország) környékén a spontán előforduló növényeken végzett mérései során a családok tőátmérő átlaga, levélindexci vonatkozásában, és a hatóanyagtarta- 40 lomban is nagyfokú az ingadozás. [Szívglikozid tartalmú növények alaki, kémiai és ökológiai sajátosságai (Kandidátusi értekezés) (1978), Budakalász.]

Több nemzedéken át tartó beltenyésztés, ami a homogenitást elősegítené, kedvezőtlen, mert az életképes- 45 ség, viruiencia elvész. [Tétényi, P., Herba Hungarica 9,

3,61 (1970).]

A távoli keresztezés nehezen járható út [Michaela,

A. és Silva, F., Herba Hungarica 11, 1,29, (1972)], a fajon belüli keresztezés eredményesebb [Schwerdtfeger, 50 G, Züchter, 31, 5, 202, (1961)], de megoldásra vár a hibridmag citoplazmás hímsterilitással történő előállítása is, ami elkerülhetővé tenné a jelentős kézimunkaerőt igénylő kasztrálást. Schwerdtfeger szerint a hozam és a béltartalom alakulása több gén szabályozása alatt áll, 55 ezen kivül erősen függ a környezettől is. Schwerdtfeger,

G. megállapítja [Züchtungsprobleme bei Digitális lanata Ehrh. Referat: Arzneipflanzencolloquium. Ranischholzhausen, (1975)], hogy a morfológiai homogenitásra való nemesítés során csökken a környezethez való adaptív 60 képesség, ez esetben a hozam, mint nemesítési cél, másodlagossá válik.

Schratz, E. leírta [Kappert, H.—Rudolf, W., Handbuch dér Pfanzenzüchtung. Parey, Berlin-Hamburg,

Bd5, 383. (1961)], hogy a termesztett állományokban 65 feltűnően nagy a levelek és a virágok morfológiai bélyegeinek változékonysága.

Ligeti, G. megfigyelte [Pharmazie, 14, 162, (1959)], hogy a növényekben az egyes glikozidkomponensek aránya nagymértékben változó. Ezt Tétényi, P. adatai is megerősítik [Infraspecifikus kémiai taxonok és a gyógynövények nemesítése. Doktori disszertáció. Budapest (1963)]. Megállapította, hogy a spontán növényanyagnál a lanatozid A és a lanatozid C aránya 1:8-12:1 között ingadozhat. A termesztésbe vont anyagnál ezzel szemben 20:1 arányt is találtak.

A növény termesztése és nemesítése tehát még számos problémát rejt magában, amelyek megoldását elősegítheti egy vegetatív szaporítási módszer, mert az így előállított utódok genetikailag azonosak a kiinduló egyeddel. A hagyományos vegetatív szaporítási módszerek (tőosztás, dugványozás) azonban nem bizonyultak alkalmasnak a gyűszűvirág szaporítására.

Más növényekkel szerzett tapasztalatok alapján célszerűnek látszott a szövettenyésztéses vegetatív mikroszaporítás alkalmazása. A gyűszűvirág (Digitális lanata Ehrh.) esetében azonban a vegetatív mikroszaporítás a publikált ismeretek szerint még nem megoldott. Lui és Staba [Lui, J. H. C. és Staba, E. J.: Phytochemistry 18, 1913, (1979)] Murashige-Skoog féle táptalajon csíráztattak gyűszűvirágot, amelyet azonban csak 12 hetes koráig tudtak felnevelni. Sejtkultúrában vizsgálták a szárazanyagtartalom és digoxin szint alakulását, de tömegszaporítást nem végeztek.

Többen foglalkoztak azzal, hogy gyűszűvirág leveléből kalluszkultúrát, majd szuszpenziós tenyészetet készítsenek és a lombikban történő steril sejttenyésztés során oldják meg a hatóanyagok termelését. [Heimbold,

H., Planta Medica, 33, 3, 280, (1978); Shyr. S. E., and Staba, E. J., Planta Medica 30, 86, 1976)]. A kísérletek során kapott növények digoxin tartalma azonban rendkívül alacsony, gyakorlatilag kinyerhetetlen. A növényi szövetíenyésztés ezen módja, amelynél folyékony tápközegen, szuszpenzióban differenciálatlan egyedi sejteket szaporítanak, nem alkalmas genetikailag azonos, palántázásra felhasználható növény előállitására. Tehát a kiválasztott termelőképességű egyedek tömeges, homogén. generációváltás nélküli felszaporítása a fentiek szerint továbbra is megoldásra vár.

A találmány célkitűzése a gyűszűvirág (Digitális lanata Ehrh.) steril szövettenyészetben történő vegetatív mikroszaporításának megoldása, amelynek során genetikailag azonos, szabadföldi kiültetésre alkalmas szaporítóanyagot (palántát) tetszőleges mennyiségben állítunk elő.

Kísérleteink során azt találtuk, hogy a gyűszűvirág steril tenyészetben történő ismételt szaporítása megoldható, mind a steril mag felhasználásával, mind a szabadföldi növény steril hajtáscsúcsának kultúrába vételével, ha a növény felszaporításához és a kiültetés előkészítéséhez, valamint a szabadföldi körülményekhez történő

183 433 szoktatásához szigorúan megszabott lépésszámot alkalmazunk, szigorúan megszabott sorrend és körülmények (paraméterek) betartása mellett.

A találmány eljárás gyűszűvirág (Digitális lanata Ehrh.) szaporítóanyag (palánta) szövettenyészetben ve- 5 getatív mikroszaporítással történő előállítására a növény magvának vagy a szántóföldi növény hajtáscsúcsának felszíni sterilezése után, azzal jellemezve, hogy

- a steril magból vagy a steril szántóföldi növény hajtáscsúcsából ismert táptalajon néhány, előnyösen 2—3 10 lombleveles steril növényt állítunk elő;

- a néhány, előnyösen 2—3 lombleveles steril növényt adott esetben gyökérmentesítjük, majd auxin(oka)t, citokinin(eke)t és kívánt esetben gibberellinsavat tartalmazó szaporító táptalajra oltjuk át (passzáljuk) és 15 mintegy 20-40 oldalhajtást tartalmazó állapotig szaporítjuk, majd a növényt, előnyösen 2-3 lombleveles levélrózsákra osztjuk szét és kívánt esetben a szaporítást a szükséges növényszám eléréséig ismételjük;

- az előnyösen 2-3 lombleveles steril levélrózsákat 20 auxint vagy auxint és citokinint tartalmazó gyökeresítő táptalajra ültetjük át és 4-8 mm hosszúságú gyökérhossz eléréséig gyökeresedést indukálunk;

- a 4-8 mm hosszúságú gyökérrel rendelkező növényeket auxin(ok)tól és citokinin(ek)től mentes táptala- 25 jón 4-6 cm gyökérhosszig gyökeresítjük és

- kívánt esetben az így kapott szaporítóanyagot (palántát) szabadföldi körülményekhez szoktatjuk.

Az eljárás első lépésében ismert módon fertőtlenített magból, vagy fertőtlenített szántóföldi növény hajtáscsú- 30 csából néhány, előnyösen 2—3 lombleveles steril növényt állítunk elő valamely irodalomból ismert táptalajon. [Linsmaier és Skoog, Phisiol. Plantarum, 18, 100127, (1965); Nítsch és Nitsch, Science, 163, 85-87, (1969)]. 35

A találmány szerint a második lépésben a steril növények előnyösen 2-3 lombleveles hajtásait szaporító táptalajra helyezzük. A szaporító táptalaj feladata, hogy a tenyésztés során minél nagyobb számú oldalhajtást indulkáljon és ezzel tömeges levélrózsát hozzon létre. 40 A szaporító táptalaj lényegileg a fenti idézett két táptalaj valamelyike, kiegészítve azonban auxin(ok), citokinin(ek) és kívánt esetben gibberellinsav megfelelő kombinációjával. Alkalmazható auxin például az indolecetsav 0,1-1,0 ppm. vagy a 2,4-diklórfenoxi-ecetsav 0,01- 45 0,05 ppm koncentrációban. Az auxinnal kombinált citokinin például a benzil-aminopurin 0,1-1,0 ppm mennyiségben. A két komponens aránya 1:1—1:10 között változhat. Ha az auxin, citokinin aránya 1:1, úgy a szövettenyészetben szaporított növények fejlődése 50 abban az esetben kedvezőbb, ha a szaporító táptalajhoz harmadik adalékként 0,1-0,5 ppm mennyiségű gibberellinsavat is adunk. A tenyészeteket 24 C ± 2-on, előnyösen 16 órás nappal és 8 órás éjszakai fotoperiodicitás mellett, 9—14000 lux megvilágítással, 50—80% 55 relatív páratartalom mellett inkubáljuk. A tenyésztési idő 4-6 hét.

A legalább 30 oldalhajtást képző, elágazó töveket - steril körülmények között - 2-3 lombleveles hajtásokra osztjuk szét. és az önálló fejlődésre képes hajtások- 60 kai a fenti paraméterek mellett újabb szaporítófázist indítunk. A szétosztás és a szaporítás tetszőleges számban ismételhető, mindaddig, amíg a célnak megfelelő számú szaporítóanyagot (palántát) elő nem állítunk.

Kellő egyedszáin elérése után, a kiültetés lehetővé 65 tételére a növények gyökeresedését kell indukálni (harmadik lépés). A felszaporított, 2—3 lombleveles növényeket gyökeresítő táptalajra ültetjük át. A gyökeresítő táptalaj a fent idézett Nitsch és Nitsch vagy a Linsmaier-Skoog táptalaj, illetve ezek előnyösen módosított változata, amely(ek) az eredeti táptalaj makroelemeinek felét tartalmazza(k). Mindkét gyökeresítő táptalaj kötelezően auxint vagy auxint és az auxinra számított 1/10 mennyiségű citokinint tartalmaz. Amennyiben az auxin indolvajsav, úgy mennyisége a táptalajban 0,1-0,5 ppm között változhat, auxin-citokinin kombináció esetében például az α-naftilecetsav mennyisége 1 ppm, a kinetin 0,1 ppm. A gyökérképződés gyorsabb és a gyökerek életképessége jobb, ha alacsony hormontartományt alkalmazva a táptalajban levő makroelemek mennyiségét a megelőző fázisban használt táptalajéhoz képest a felére csökkentjük. Rendkívül lényeges, hogy a harmadik lépést csak a gyökeresedés megindulásáig folytassuk.

A 4-8 mm hosszúságú gyökénél rendelkező növényeket - a negyedik lépésben - hormonmentes táptalajra ültetjük át. A hormonmentes gyökeresítő táptalaj makroelem mennyisége azonos az előző lépésben alkalmazottal. Ha a gyökérindukált tenyészeteket hormonmentes táptalajon neveljük tovább, akkor nagy mennyiségű, erős gyökér képződik és a vegetatív részek fejlődése is megfelelő. Az inkubálás körülményei a harmadik és negyedik lépésben azonos az előzőekkel, együttes ideje 4-6 hét, az inkubálás végén a kiültetéshez megfelelő fejlettségű, gyökeres palántákat kapunk.

A találmány szerinti eljárás ötödik, utolsó lépése a palánták hozzászoktatása a nem steril, szabadföldi életkörülményekhez. A palántákat homok: perlit, vagy tőzeg: perlit keverékével töltött cserepekbe ültetjük. A keveréket 70% víztartalomig nedvesítjük, homok Feriit keverék esetében a nedvesítést makro- és mikroelemeket tartalmazó oldattal (módosított KNOPP-oldat) végezzük. Az inkubálás félsteril körülmények között fitoboxban vagy a cél szerinti hő- és páratartalom értékekre szabályozott üvegházban történik. Az alkalmazkodási idő 4-5 hét.

A szövettenyésztéses vegetatív mikroszaporítás előnye, hogy

- a fajtaazonosság megőrizhető,

A vegetatív mikroszaporítás eszerint felhasználható a gyűszűvirág fajta-fenntartására, a növény nemesítésére, valamint a termesztést szolgáló homogén magállomány előállítására.

A találmány szerinti eljárást az alábbi példákkal szemléltetjük, anélkül, hogy igényünket a példákra korlátoznánk.

1. példa db nemesített gyűszűvirág vetőmagot 10 percig Na-hipoklorit 10%-os vizes oldatában felszíni sterilezésnek vetjük alá, majd háromszor steril vízzel öblítjük. A sterilizált magvakat Nitsch-féle Nitsch és Nitsch, Science, 163, 85—87 (1969) táptalajon csíráztatjuk, majd a csíranövényeket 2—3 lombleveles állapotig (3 hét) növesztjük.

A táptalaj összetétele a következő:

KNO₃ 950,0 mg/1

NH₄N0₃ 720,0 mg/1

183 433

CaCl₂*2H₂O	166,0 mg/1
KH₂PO₄	68,0 mg/1
MgSO₄*7H₂O	185,0 mg/1
MnSO₄-H₂O	25,0 mg/1
H₃BO₃	10,0 mg/1
ZnSO₄-4H₂O	10,0 mg/1
Na₂Mo0₄-2H₂0	0,25 mg/1
CuSO₄’5H₂O	0,025 mg/1
Fe(II) EDTA komplex oldat‘5,00 ml/1
biotin	0,05 mg/1
glicin	2,0 mg/1
inozit	100,0 mg/1
nikotinsav	5,0 mg/1
piridoxin	0,5 mg/1
tiamin	0,5 mg/1
fólsav	5,0 mg/1
szaharóz	2000,0 mg/1
agar-agar	1000,0 mg/1

A fenti tápanyagokat tartalmazó táptalaj pH-értékét a sterilezést megelőzően 1 n NaOH oldattal 5,6-ra állítjuk be.

* = A Fe(II) EDTA (vas-etiléndiamin-tetraecetsav) komplex oldatot a következő módon készítjük·.

557 mg FeSÖ₄· 7H₂O-t és 756 mg Na₂EDTA-t öszszemérünk, majd desztillált vízzel 100 ml-re egészítjük ki. Az így nyert oldat 5 ml-e 27,8 mg FeSO₃ ·7Η₂ O-nak, azaz 5,6 mg FE(II)-nek felel meg. A táptalaj 20-20 ml-t kémcsövekbe adagolunk, majd 121 °C-on 20 percig autoklávban steriíezzük.

A magvakat egyenként steril körülmények között a táptalaj felületére helyezzük és kb. 3 hétig (2-3 lombleveles stádium eléréséig) klimatizált viszonyok között tartjuk. (26 ± 1°C hőmérséklet, 65-75%-os relatív páratartalom, 10—11000 lux megvilágítás és 8 órás éjszaka — 16 órás nappal fotoperiódus).

Az így kapott tíz csíranövény növényhajtás részeit a gyökerek eltávolítása után 1 ppm indolecetsav + 1 ppm benzilaminopurin + 0,1 ppm gibberellinsav növekedésszabályozókat tartalmazó - a példa elején ismertetett táptalajra oltjuk. (250 ml-es Erlenmeyer lombikban 100 ml táptalaj van.)

Az indolecetsavat és benzilaminopurint sterilizálás előtt adjuk a táptalajhoz, míg a gibberellinsavat sterilre szűrve, utólag adagoljuk a kb. 40 °C-osra lehűlt táptalajhoz.

A növényeket kb. 4 hétig a fent leírt klimatizált viszonyok között tartjuk, amíg intenzív levélrózsa képződés (oldalhajtás indukció) indul meg.

Az oldalhajtásokat steril körülmények között leválasztjuk és egyenként 1 ppm α-naftilecetsavat + 0,1 ppm kinetint tartalmazó Nitsch-féle táptalajra oltjuk. Kéthetes inkubáció után a 4-8 mm hosszúságú gyökerekkel rendelkező növényeket növekedésszabályozó nélküli táptalajra oltjuk és tovább neveljük. Tíz csiranövényből kiindulva 11-12 hét múlva 145 db gyökeres növényt kapunk.

A steril tenyészetben kb. 4-6 cnt nagyságú gyökérrel rendelkező növényeket homok'.perlit 1:1 arányú, 70% vízkapacitásig telített keverékét tartalmazó cserepekbe ültetjük és fitoboxban, ellenőrzött körülmények között a szabadföldi uszonyokhoz szoktatjuk. A Fitoboxban a levegő relatív páratartalma 70%, a fényerősség 16000 lux. A nappali/éjszakai hőmérsékletváltást 21/15°C-ra állítjuk. A tápanyagutánpótlást makro-, és mikroelemeket tartalmazó oldattal végezzük (módosított Knoppoldat).

Kezdetben a növények 100%-os páratartalmat igényelnek, ezért a cserepeket 4-6 napig üvegburával fedjük.

A fitoboxban a fent leírt körülmények között a növények megerősödnek és szabadföldbe kiültethetök.

Az egy csíranövényből származó utódok morfológiai homogenitását a levélszám, levélhossz, levélszélesség Chi² értékeivel jellemezzük, (χ²). A kapott értékek számértékei kisebbek Sváb, J.; Biometriai módszerek a kutatásban, Mezőgazdasági Kiadó, Budapest 1973. c. könyvében található Weber, E. (1963)-féle táblázatból leolvasott értékeknél. Tehát nincs szignifikáns különbség a levélhossz és levélszélességben az egyes utódok között, azaz az állomány homogén. (1. táblázat)

1. táblázat

Növényszám Levélszám	Levélhossz cm (11 levél átlaga)	Levélszélesség cm (11 levél átlaga)
db	db
1.	14	3,6	1,29
2.	13	3,12	1,26
3.	19	3,25	1,26
4.	12	3,71	1,48
5.	11	3,64	1,25
6,	12	3,77	131
7.	13	3,25	1,45
8.	12	3,34	1,50
9.	11	3,47	1,43 .. .
X² (számított)		20,65	21,23
(táblázatból leolvasott)	39,3	39,3

2. példa

Gyűszűvirág vetőmagot a következő módon felszíni sterilezésnek vetjük alá:

— mosás detergenssel,

- vizes öblítés,

- áztatás 70%-os alkoholban 5 percig, — mosás steril vízben,

- áztatás 5%-os Na-hipoklorit oldatban 5 percig, — mosás háromszori steril vízzel.

A sterilezett magvakat 0,8%-os csapvizes agar-agaron 26 + 1 °C, 70% relatív páratartalom mellett 50 lux megvilágítással 4-5 napig csíráztatjuk. A kikelt csiranövényeket Linsmaier-Skoog-féle táptalajra oltjuk [Linsmaier és Skoog, Physiol. 18, 100—127, 1965)], melynek összetétele a következő:

NH₄N0₃ 1650,0 mg/1

KNO₃ 1900,0 mg/1

CaCl₂-2H_:O 440,0 mg/1

MgSO₄-7H₂O 370,0 mg/1

KH₂PO₄ 170,0 mg/1

Fe(lI) EDTA komplex oldat* 5.0 ml

H₃BO₃ 6,2 mg/1

MnS0₄-H,0 22,3 mg/1

ZnSO₄-4H₂O 8,6 mg/1·

KJ 0.83 mg/1

Na₂Mo0₄-2H₂0 0.25 mg/1

CuSO₄-5H₂O 0,025 mg/1

CoC1₂-6H_:0 0,025 mg/1 inozit 100,0 mg/1

Bi vitamin 1,0 mg/1

183 433 szaharóz 3000,0 mg/1 agar-agar 1000,0 mg/1 *= A Fe(II) EDTA komplex oldatot az 1. példában leírtak szerint készítjük.

A táptalaj pH értékét autoklávozás előtt 1 n NaOH- 5 dal 5,6-ra állítjuk be.

A táptalajból 80—80 ml-t 0,5 1-es befőttes üvegekbe adagolunk és 121 C-on 20 percig autoklávban sterilezzük.

A növényeket 3-4 hétig klímaszobában tartjuk a 8— io 10 cm-es magasság eléréséig (3—4 hét: 26±1°C, 70% relatív páratartalom; 10—12000 lux megvilágítás; fényforrásként AIRAM FLORALUX L65/80 típusú vörösben és kékben gazdag és TUNGSRAM 65W F33 WHITE fehérben gazdag fénycsövek kombinációját alkalmaztuk 15 8 órás éjszaka (16 órás nappal fotoperiódus mellett).

A kifejlett palánták 2—3 lombleveles hajtásait 1 ppm benzilaminopurin + 0,1 ppm indolecetsav tartalmú fenti táptalajra oltjuk és klimaszobában neveljük. 5-6 hét után a képződött levélrózsákat leválasztjuk. 20

A hajtásokat gyökeresités céljából 0,5 ppm indolvajsavat tartalmazó fenti táptalajra oltjuk. 2 hét eltelte után a 4—8 mm hosszúságú gyökérrel rendelkező növényeket növekedésszabályozók nélküli táptalajra oltjuk és a teljes meggyökeresedésig tovább neveljük (2-3 hét). 25

Egyetlen magból kündulva átlagban 20-40 egyedi életre képes növényt nyerünk.

A 4-6 cm-es hosszúságú gyökénél rendelkező növényeket tőzeg:perlit 1:1 arányú elegyébe ültetjük, hidegen nyújtható, átlátszó fóliával (LTE 5228 Borsodi Vegyi 30 Kombinát) egy hétre lefedjük, majd a fólia eltávolítása után kb. 4 hétig üvegházban, kontrollált körülmények között neveljük. (70% relatív páratartalom, természetes megvilágítás, 24/16 °C hőmérsékletváltás.)

A fenti módon előállított és megerősödött növények 35 a szabadföldi kiültetés során 95%-os megeredést mutatnak.

A mikroszaporított vonalak homogenitását a növénymagasság és 1000 magsúly átlagértékekkel az átlag szórásával (S_x-) és a variációs koefficiens értékekkel (cv%) 40 jellemezzük- (2. táblázat)

Vonal	Egyedszám db	2. táblázat Növénymagasság cm átlag±szórás	Variácós koefficiens cv%
1.	7	76,1+4,6	5,9
2.	8	82.2±5,5	6,6
3.	7	82,4+3,0	3,6
4.	7	76.8±4,0	5,2
kontroll	7	73,4+7,2	10,1
Vonal	Egyedszám	1000 magsúly	Variációs
	db	mg	koefficiens
		átlag±szórás	cv%
1.	7	51+0,9	5,0
2.	8	41 ±0,9	6,1
	7	45±1,2	7,2
4.	7	50+1,1	6,0
kontroll	7	47±2,7	15,4

Az alacsony szórás és variációs koefficiens értéke a kontroll mellett teljes homogenitást jeleznek.

3. példa

Nemesített, hatóanyagtartalomra levizsgált szabadföldi gyűszűvirág 6-8 cm-es hajtáscsúcsát kivágjuk és Na65

-hipoklorit 3%-os vizes oldatával 20 percig fertőtlenítjük. A 3-5 mm-es hajtásmerisztémát steril körülmények között kipreparáljuk és az első példában leírt Nitsch-féle táptalajra helyezzük. A 2-3 lombleveles hajtásokat az 1. példában ismertetett szaporító táptalajra helyezzük és az ott megadott körülmények között neveljük, majd 1 hónap után a képződött levélrózsákat leválasztjuk és a továbbiakban is az 1. példa szerint járunk el.

Beltartalmi vizsgálatok igazolják, hogy az összglikozid tartalom, illetve a C-sorbeli glikozidok mennyisége a mikroszaporítás során nem változott, leromlást nem tapasztaltunk.

4. példa

Szántóföldön nevelt gyűszűvirág kifejlett növényekből steril hajtásmerisztémát preparálunk a következőképpen: a hajtásról a 60 mm-nél hosszabb leveleket eltávolítjuk és bőséges folyóvízben történő mosás után 70%-os alkoholban 5 percig áztatjuk. Steril vizes mosás után 5%os Na-hipokloritban 10 percig áztatjuk, majd a felső levelek eltávolítása után a hajtáscsúcsot a 2. példában leírt Linsmaier-Skoog-féle táptalajra helyezzük.

A 2-3 lombleveles hajtást 0,01 ppm 2,4-diklórfenoxiecetsavat + 0,1 ppm benzilaminopurint tartalmazó, fent említett táptalajra oltjuk. 5-6 hét után a képződött levélrózsákat leválasztjuk.

A leválasztott levélrózsákat 2. példában megadott táptalaj olyan módosított változatára oltjuk, melyben a következő komponensek mennyiségét a felére csökkentettük. A módosított komponensek mennyisége a következő:

NH4NO3 825,0 mg/1

KNOj 950,0 mg/1

CaCl₂ ^r2H₂O 220,0 mg/1

MgSO₄'7H₃O 185,0 mg/1

KHjP0₄ 85,0 mg/1

Adalékként a táptalajt 0,1 ppm indolvajsawal egészítjük ki.

A leválasztott levélrózsákat hét hétig 2. példában megadott körülmények között tartjuk, majd a gyökerek megjelenése után a fenti, módosított, de indolvajsavat nem tartalmazó táptalajon 5-6 cm hosszúságú gyökerek megjelenéséig tovább neveljük a teljes kifejlődésig. A növényeket a 2. példában leírt módon a szántóföldi körülményekhez szoktatjuk.

A mikroszaporított palántáról nevelt növények összglikozid tartalma és a C-sorbeli glikozidok mennyisége az anyanövényekhez képest szignifikáns különbséget nem mutat.

5. példa

Az 1. és 3. példában leírt eljárást úgy módosítjuk, hogy az oldalhajtásképződést indukáló táptalajon (1 ppm indolecetsav + 1 ppm benzilaminopurin + 0,1 ppm gibberellinsav) képződött ievélrózsákat nem gyökeresitjük meg, hanem ismételten szaporítótáptalajra helyezzük, amelyen négy hetes inkubáció után újabb levélrózsa képződést tapasztalunk. Az eljárást háromszor ismételjük, majd a növényeket az 1. példában leírt módon meggyökereztetjük. Tíz csíranövényből kiindulva ezen a módon összesen 3000 gyökeres palántát nyerünk. A palánták előkészítése a szántóföldi kiültetéshez megegyezik az 1. példában leírt módszerrel.

6. példa

A 2. és 4. példában leírt eljárást úgy módosítjuk, hogy a növekedésszabályozókat tartalmazó Linsmaier-Skoog-

183 433 féle táptalajon (1 ppm benzilaminopurin + 0,1 ppm indolecetsav) képződött levélrózsákat nem gyökeresítjük meg, hanem ismételten szaporítótáptalajra oltjuk, majd 5—6 hét eltelte után a képződött levélrózsákat leválasztjuk. Az eljárást a kívánt növényszám eléréséig ismételjük. Egyetlen magból, vagy hajtásból kiindulva kb. 5 hónap alatt kb. 27000 növényt állítunk elő.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás gyűszűvirág (Digitális lanata Ehrh.) szaporítóanyag (palánta) szövettenyészetben vegetatív mikroszaporítással történő előállítására a növény magvának vagy a szántóföldi növény hajtáscsúcsának felszíni sterilezése után, azzal jellemezve, hogy

- a steril magból vagy a steril szántóföldi növény hajtáscsúcsából ismert táptalajon néhány, előnyösen 2-3 lombleveles steril növényt állítunk elő;

- a néhány, előnyösen 2-3 lombleveles steril növényt adott esetben gyökérmentesítjük, majd auxin(oka)t, citokinin(eke)t és kívánt esetben gibberellinsavat tartalmazó szaporító táptalajra oltjuk át (passzáljuk) és mintegy 20—40 oldalhajtást tartalmazó állapotig szaporítjuk, majd a növényt, előnyösen 2-3 lombleveles levélrózsákra osztjuk szét és kívánt esetben a szaporítást a szükséges növényszám eléréséig ismételjük;

- az előnyösen 2-3 lombleveles steril levélrózsákat auxint vagy auxint és citokinint tartalmazó gyökeresítő táptalajra ültetjük át és 4-8 mm hosszúságú gyökérhossz eléréséig gyökeresedést indukálunk;

- a 4-8 mm hosszúságú gyökérrel rendelkező növényeket auxin(ok)tól és citokinin(ek)től mentes táptalajon 4-6 cm gyökérhosszig gyökeresítjük és

- kívánt esetben az így kapott szaporítóanyagot (palántát) szabadföldi körülményekhez szoktatjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja. azzal jellemezve, hogy a sterilezett magból vizes agar-agaron csíranövényt állítunk elő, majd a csíranövényt ismert táptalajra ültetjük át és néhány, előnyösen 2-3 lombleveles állapotig tovább növesztjük.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a néhány, előnyösen 2—3 lombleveles steril növényt a steril magból vagy a steril szántóföldi növény hajtáscsúcsából 24±2°C hőmérsékleten, 50-80% relatív páratartalom, 9-14000 lux megvilágítás és előnyösen 8/16 éjszaka/nappal fotoperiódus mellett állítjuk elő.
4. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a csíranövényt a steril magból 24±2°C hőmérsékleten, 50—80% relatív páratartalom, 50-100 lux megvilágítás és előnyösen 8/16 éjszaka/nappal fotoperiódus mellett állítjuk elő, majd a kapott csíranövényt ismert táptalajra oltjuk át (passzáljuk).
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a szaporító táptalaj auxin :citokinin arányát 1:1 — 1:10 közé állítjuk be.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezre, hogy az auxint és citokinint 1:1 arányban tartalmazó táptalajhoz 0,1-0,5 ppm mennyiségű gibberellinsavat adunk.
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy auxinként

5 indolecetsavat vagy 2,4-diklórecetsavat alkalmazunk.
8. Az 1—7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy citokininként benzilaminopurint alkalmazunk.
9. Az 1—8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás 10 foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a gyökeresítést 24±2°C hőmérsékleten, 50-80% relatív páratartalom, 9-14000 lux megvilágítás és előnyösen 8/16 éjszaka/nappal fotoperiódus mellett végezzük.
10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás 15 foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a gyökeresítést indukáló táptalaj auxint vagy auxint és citokinint tartalmaz.
11. Az 1. vagy 10. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a gyökeresítést

20 indukáló táptalaj auxinként 0,1-0,5 ppm indolvajsavat vagy 0,8-1,5 ppm α-naftilecetsavat tartalmaz.
12. Az 1. vagy 10. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a-naftilecetsav auxin alkalmazása esetén a táptalaj citokininként az

25 α-naftilecetsavra számított 1/10 mennyiségű kimetínt tartalmaz.
13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a gyökeresítést indukáló- és/vagy a gyökeresítő táptalaj előnyö30 sen az ismert táptalajok makroelem komponenseinek fele mennyiségét tartalmazzák.
14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a gyökeresítést 24±2°C hőmérsékleten, 50-80% relatív páratar35 talom, 9—14000 lux megvilágítás és előnyösen 8/16 éjszaka/nappal fotoperiódus mellett végezzük.
15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a szaporító anyagok (palánták) szabadföldi kísérletekhez való

40 szoktatását 60-80% nedvességtartalmú tőzeg-perlit vagy 60—80% nedvességtartalmú homok-perlit keverékében végezzük, azzal a megszorítással, hogy ha a keverék homok-perlit keveréke, abban az esetben a tápanyag utánpótlást makro- és mikroelemeket tartalmazó oldattal

45 végezzük.
16. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a szaporító anyagok (palánták) szabadföldi körülményekhez történő szoktatását fitoboxban 12-16 000 lux megvilágítás

50 15/21 °C éjszaka/nappal hőmérséklet és 8/16 éjszaka/ nappal fotoperiódus mellett 1-8 napig 100%-, majd ezt követően mintegy 21 napig 50—80% relatív páratartalom mellett végezzük.
17. 1—15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a szaporító anyagok (palánták) szabadföldi körülményekhez történő szoktatását üvegházban, természetes megvilágítás mellett 15—25°C hőmérsékleten 1—8 napig 100%-, majd ezt követően mintegy 21 napig 50-80% relatív páratartalom mellett végezzük.