CN116420616A - 一种欧洲小叶椴体细胞胚胎发生的方法 - Google Patents
一种欧洲小叶椴体细胞胚胎发生的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116420616A CN116420616A CN202310189570.9A CN202310189570A CN116420616A CN 116420616 A CN116420616 A CN 116420616A CN 202310189570 A CN202310189570 A CN 202310189570A CN 116420616 A CN116420616 A CN 116420616A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- embryo
- culture medium
- somatic
- embryogenic callus
- callus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 241000328973 Tilia miqueliana Species 0.000 title claims abstract description 18
- 230000030118 somatic embryogenesis Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims abstract description 69
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 claims abstract description 66
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 58
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 47
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 44
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 43
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims abstract description 20
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 claims abstract description 6
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 20
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 18
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 18
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 18
- 235000002168 Tilia europaea Nutrition 0.000 claims description 14
- 240000006909 Tilia x europaea Species 0.000 claims description 14
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims description 13
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims description 13
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims description 13
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- HFCYZXMHUIHAQI-UHFFFAOYSA-N Thidiazuron Chemical compound C=1C=CC=CC=1NC(=O)NC1=CN=NS1 HFCYZXMHUIHAQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 11
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 claims description 11
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 11
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 claims description 9
- 239000002363 auxin Substances 0.000 claims description 9
- 230000035784 germination Effects 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 claims description 7
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 claims description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N Kinetin Natural products N=1C=NC=2N=CNC=2C=1N(C)C1=CC=CO1 FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 5
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229960001669 kinetin Drugs 0.000 claims description 5
- OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 2,4-D Chemical compound OC(=O)COC1=CC=C(Cl)C=C1Cl OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 claims description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 4
- 230000031877 prophase Effects 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000793823 Tilia amurensis Species 0.000 claims 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 8
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 abstract description 6
- 230000007547 defect Effects 0.000 abstract description 5
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 abstract description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004161 plant tissue culture Methods 0.000 abstract description 2
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 6
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 6
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 240000007313 Tilia cordata Species 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 2,4-Dichlorophenoxyaceticacid Chemical compound OC(=O)C(Cl)OC1=CC=C(Cl)C=C1 HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 241000219071 Malvaceae Species 0.000 description 2
- 241000907897 Tilia Species 0.000 description 2
- 235000015450 Tilia cordata Nutrition 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000000442 meristematic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- -1 wherein VC is 10g/L Substances 0.000 description 2
- OVSKIKFHRZPJSS-DOMIDYPGSA-N 2-(2,4-dichlorophenoxy)acetic acid Chemical compound OC(=O)[14CH2]OC1=CC=C(Cl)C=C1Cl OVSKIKFHRZPJSS-DOMIDYPGSA-N 0.000 description 1
- COBRSSFPARGBIY-UHFFFAOYSA-N 6,7-dihydrodipyrido[1,2-b:1',2'-e]pyrazine-5,8-diium;1-methyl-4-(1-methylpyridin-1-ium-4-yl)pyridin-1-ium Chemical compound C1=C[N+](C)=CC=C1C1=CC=[N+](C)C=C1.C1=CC=[N+]2CC[N+]3=CC=CC=C3C2=C1 COBRSSFPARGBIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000010692 aromatic oil Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000002657 fibrous material Substances 0.000 description 1
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 1
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 1
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000006151 minimal media Substances 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005648 plant growth regulator Substances 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000025366 tissue development Effects 0.000 description 1
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 1
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 1
- 239000000341 volatile oil Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/002—Culture media for tissue culture
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P60/00—Technologies relating to agriculture, livestock or agroalimentary industries
- Y02P60/40—Afforestation or reforestation
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了一种欧洲小叶椴体细胞胚胎发生的方法，属于植物植物组织培养高效繁殖技术领域，包括：以欧洲小叶椴心形胚至早期子叶胚为外殖体，接入胚性愈伤组织诱导培养基中诱导出胚性愈伤组织，继而转入维持和增殖培养基中诱导获得增殖的胚性愈伤组织，随后接入体胚诱导培养基诱导出成熟的体胚，最后将成熟的子叶胚转移至基本培养基，萌发形成完整植株。本发明不仅可以克服现有茎段培养技术繁殖系数低、生根困难等不足，实现大规模优良品系的快繁；而且体胚发生体系的建立为后续采用基因工程的手段实现种质的遗传改良提供了技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及一种欧洲小叶椴体细胞胚胎发生的方法，属于植物无性繁殖技术领域。
背景技术
欧洲小叶椴(Tilia cordata)是锦葵科椴树属落叶乔木，原产于欧洲，具有树体高大、树冠茂密、花香迷人、适应性强且病虫害少发，在欧美地区具有悠久的园林栽培历史，是“世界四大阔叶行道树之一”。此外，欧洲小叶椴木材白软、不易开裂，是上等的雕刻材料；韧皮纤维发达，是良好的纤维材料；椴树花是列入《欧洲药典》的药用成分，内含类黄酮类、内酯类等成分，具有治疗呼吸道疾病和促进消化等药用和保健功能，是制作保健花茶的原料；花中富含芳香油，被广泛用于化妆品和精油制造；椴花蜜香气扑鼻，富含丰富的单糖和酶类，可提高人体免疫力，是优质上等蜜。欧美国家在繁育及栽培的基础上，依据观赏性状已选育出38个欧洲小叶椴品种，成为具有优良品种最多的椴树属物种。自20世纪90年代，国内北京、大连及青岛等省市陆续开展欧洲小叶椴的引种驯化工作，现已应用于我国多个城市的园林绿化建设。因此为保证品系优良性状的稳定遗传，积极探索高效无性繁殖技术已成为现今该研究的热点。
无性繁殖技术主要包括：扦插、嫁接和组织培养等方法。欧洲小叶椴为高达乔木，扦插繁殖繁殖生根率低，对环境条件要求严苛并未大规模推广。欧洲小叶椴嫁接繁殖成活率较高，目前是欧洲小叶椴优良品系普遍采用的繁殖方式。但是嫁接繁殖存在成本高，受季节影响大，繁殖系数低的缺点，因此积极探索欧洲小叶椴组织培养技术势在必行。目前，欧洲小叶椴组织培养技术组培繁育体系已经建立，但是外殖体材料为带芽茎段，培养过程未经脱分化过程，直接诱导腋芽和茎段的增殖，繁殖效率低(约为6.23)且成本高，难以大规模推广应用。
体细胞胚胎发生技术是指植物组织在外源刺激的推动下，由体细胞经历脱分化，获得胚性后继续增殖分化，最终形成完整胚胎的过程。体细胞胚胎发生是植物离体再生的重要途径，是目前林木植物繁殖效率最高、最具产业化推广的组织培养方式。目前，国内外尚无关于欧洲小叶椴体细胞胚胎发生技术的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种欧洲小叶椴体细胞胚胎发生的方法，可以克服现有茎段培养技术繁殖系数低、生根困难等不足，实现大规模优良品系的快繁。
为解决上述技术问题，本发明提供一种欧洲小叶椴体细胞胚胎发生的方法，包括：以欧洲小叶椴心形胚至早期子叶胚为外殖体，接入胚性愈伤组织诱导培养基中诱导出胚性愈伤组织，继而转入维持和增殖培养基中诱导获得增殖的胚性愈伤组织，随后接入体胚诱导培养基诱导出成熟的体胚，最后将成熟的子叶胚转移至基本培养基，萌发形成完整植株。
进一步地，具体包括：
6月下旬至7月上旬，采集欧洲小叶椴母株上未成熟的果实，剥除果皮后获得未成熟的种子；种子经流水冲洗后，转移至超净工作台；经70～75％酒精和5％次氯酸钠溶液处理后，用无菌水洗净；
在无菌条件下，于体式显微镜下，剥离心形胚至子叶前期胚，接种于愈伤组织诱导培养基中；接种后于22～25℃暗培养一个月，得到白色、质地紧密、表面球状凸起的早期胚性愈伤组织；
在无菌的条件下，将获得的早期胚性愈伤组织，转接入愈伤组织增殖培养基中，在22～25℃黑暗条件下，每18～21天继代一次，继代2～3次之后，得到淡黄色、质地紧密的胚性愈伤组织；
在无菌的条件下，将获得的胚性愈伤组织转入体胚诱导固体培养基中，22～25℃暗培养，20～30d，诱导体细胞胚的发育；
取发育成熟的子叶胚后期，将成熟的子叶胚转移到胚萌发固体固体培养基中，光照1500～30001x，光照时间光照/黑暗为16h/8h，控温22～25℃，30～45天萌发长成完整的植株。
进一步地，所述愈伤组织诱导培养基成以MS为基本培养基，添加不同浓度的生长素类：2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)2.0～6.0mg/L，NAA(萘乙酸)0～2.0mg/L和TDZ(噻苯隆)0～0.1mg/L；细胞分裂素类：6-BA(6-苄氨基嘌呤)0～1.0mg/L和KT(6-糠基氨基嘌呤)0～1.0mg/L；同时添加VC 10g/L，水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0～3.5g/L，pH5.6～5.8。
进一步地，所述愈伤组织增殖培养基成分为：MS培养基中添加2，4-D 1.0～3.0mg/L和6-BA0.2～0.5mg/L，VC 10g/L，水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0～3.5g/L，pH 5.6～5.8。
进一步地，所述体胚诱导培养基为：MS培养基中添加2，4-D 0.5～2.0mg/L和6-BA0.5～1.0mg/L，VC 10g/L，水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0～3.5g/L，pH 5.6～5.8。
进一步地，所述胚萌发固体培养基为：MS基本培养基，添加VC 10mg/L；蔗糖30g/L；植物凝胶3.0～3.5g/L，pH 5.6～5.8。
外植体取材时期和状态是植物体胚发生过程中最为重要的因素，取材时间过晚，合子胚发育趋近于成熟，难以通过脱分化进而发育成为具有胚性的愈伤组织。MS基本培养基为植物离体培养过程中提供必要的无机物、有机物及铁盐等组分。2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸，NAA(萘乙酸)和TDZ(噻苯隆)组分为生长素类，主要促进植物的脱分化过程，诱导出具有较强分生生能力的组织。6-BA(6-苄氨基嘌呤)和KT(6-糠基氨基嘌呤)主要促进植物分生组织的分化发育，推动胚性组织的形成。VC的添加主要是为了防止离体组织的褐化，维持细胞正常的功能。蔗糖和水解酪蛋白分别为离体的异养组织提供碳源和有机氮源。植物凝胶在植物组织培养的过程中起到支撑的作用，PH值在是维持组织正常的渗透压，在组织培养中起重要作用。
在欧洲小叶椴胚性愈伤组织的诱导、增殖及体胚诱导的过程中，暗培养有助于防止植物褐变，改变外植体的极性，推动植物未成熟胚脱分化形成具有胚性的细胞团和胚性结构。在体细胞胚发育阶段，中低强度的光照有利于植株幼苗的形态建成，降低畸形胚发育的发生率。22～25℃是离体植物的细胞团和组织发育的最适温度，过高的温度会导致外植体的褐变及死亡，过低的温度降低植物的分化发育进程。
本发明所达到的有益效果：本发明不仅可以克服现有茎段培养技术繁殖系数低、生根困难等不足，实现大规模优良品系的快繁；而且体胚发生体系的建立为后续采用基因工程的手段实现种质的遗传改良提供了技术支撑。
附图说明
图1外植体离体合子胚的最佳取样状态—心形胚至子叶胚形态；
图2是未成熟胚诱导出的早期胚性愈伤组织及其解剖结构图；
图3是未成熟胚诱导出的胚性愈伤组织图；
图4是胚性愈伤组织诱导出的早期胚结构图；
图5是体萌发细胞胚形成完整植株图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
本发明公布了一种欧洲小叶椴体细胞胚胎发生的方法，以欧洲小叶椴心形胚至早期子叶胚为外殖体，接入胚性愈伤组织诱导培养基中诱导出胚性愈伤组织，继而转入维持和增殖培养基中诱导获得大量增殖的胚性愈伤组织，随后接入体胚诱导培养基诱导出成熟的体胚，最后将成熟的子叶胚转移至基本培养基，萌发形成完整植株。
具体方法包括以下步骤：
(1)6月下旬至7月上旬，采集欧洲小叶椴母株上未成熟的果实，剥除果皮后获得未成熟的种子；种子经流水冲洗后，转移至超净工作台；经70～75％酒精和次氯酸钠溶液处理后，用无菌水洗净后；在无菌条件下，于体式显微镜下，剥离心形胚至子叶前期胚(图1)，接种于胚性愈伤组织诱导培养基中。
(2)诱导培养基成以MS为基本培养基，添加不同浓度的生长素类：2,4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)2.0～6.0mg/L，NAA(萘乙酸)0～2.0mg/L和TDZ(噻苯隆)0～0.1mg/L；细胞分裂素类：6-BA(6-苄氨基嘌呤)0～1.0mg/L和KT(6-糠基氨基嘌呤)0～1.0mg/L；同时添加VC 10g/L，水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0～3.5g/L，pH5.6～5.8。接种后于23℃暗培养一个月左右，可观察到白色，质地紧密，表面球状凸起的胚性愈伤组织(图2)。
(3)在无菌的条件下，步骤(2)中获得的早期胚性愈伤组织，转接入愈伤组织增殖培养基中，在23度黑暗条件下，每18～21天继代一次，继代2～3次之后，会出现淡黄色，质地紧密的胚性愈伤组织(图3)。愈伤组织增殖培养基成分为：MS培养基中添加2,4-D 1.0-3.0mg/L和6-BA 0.2-0.5mg/L，VC 10g/L，水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0-3.5g/L，pH 5.6-5.8。
(4)在无菌的条件下，将步骤(3)中获得的胚性愈伤组织转入体胚诱导固体培养基中，23℃暗培养，20-30d，诱导体细胞胚的发育(图4)。取发育成熟的子叶胚后期(图4)，将成熟的子叶胚转移到胚萌发固体固体培养基中，光照30001x，光照时间为16h/8h(光照/黑暗)，控温23～25℃，30天左右萌发长成完整的植株(图5)其中体胚诱导培养基为：MS培养基中添加2,4-D 0.5～2.0mg/L和6-BA 0.5～1.0mg/L，VC 10g/L，水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0-3.5g/L，pH 5.6-5.8。胚萌发固体培养基为：MS基本培养基，添加VC10mg/L；蔗糖30g/L；植物凝胶3.0-3.5g/L，pH 5.6～5.8。
实施例1欧洲小叶椴果实的采集
于6月下旬至7月上旬，每隔3至5天，采集欧洲小叶椴优良品系的自然授粉半同胞家系的果实，置于4℃保存；各时间采集的果实经过观察，分别处于心形胚至子叶胚的各个阶段。
表1不同采集时间下未成熟胚诱导愈伤组织状态统计
| 采集时间 | 未成熟胚接种数量 | 诱导出愈伤数量 | 诱导率 | 愈伤组织状态 |
| 6.23 | 100 | 19 | 19.00％ | 白色，紧密，表面球状 |
| 6.28 | 98 | 17 | 17.35％ | 白色，紧密，表面球状 |
| 7.3 | 102 | 42 | 41.18％ | 白的，疏松，水渍状 |
| 7.8 | 97 | 51 | 52.58％ | 淡黄色，疏松，水渍状 |
经观察发现欧洲小叶椴胚发育的过程十分迅速，往往经过15-20天，即可有球形胚发育至成熟子叶胚。因此，分别于表1所述的时间点接种欧洲小叶椴未成熟胚，结果发现：虽然6月23日和6月28日进行采集的外殖体的愈伤诱导效率较低，但是愈伤的生长状态优于7月3日和7月8日采集的外植体。因此确定外植体的最佳采样时期为6月下旬，此时合子胚的发育状态如图1所示。
实施例2外殖体的消毒及未成熟合子胚的剥离
用解剖刀剥去外部绿色果皮，获得完整的白色种子；种子在流水下冲洗8～12h后；转移至超净工作台上，经75％乙醇浸泡30～60s，然后用2％次氯酸钠溶液消毒10～20分钟，最后用无菌水冲洗3遍；随后在无菌的条件下，于解剖镜下，将未成熟的心形胚至前期子叶胚接种至诱导培养基中，每培养皿接种8～10枚。
实施例3胚性愈伤组织的诱导
将采用实施例2步骤中的外殖体，在无菌的条件下接种至以下三种培养基中，每种7～8皿。诱导培养基以MS、WPM和3/4MS为基本培养基，添加2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)2.0mg/L；6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.5mg/L；水解乳蛋白(LH)0.5g/L；谷氨酰胺(Gln)0.5g/L；维生素C(Vc)10mg/L；蔗糖30g/L；植物凝胶3g/L，pH调节为5.6-5.8。统计三种基本培养基中胚性愈伤组织的诱导率，见表2。
表2基本培养基的筛选及早期胚性愈伤组织诱导率统计
| 基本培养基及激素组分(单位：mg/L) | 胚性愈伤诱导率 |
| MS+2，4-D 2.0+6-BA 0.5 | 11.58％ |
| WPM+2，4-D 2.0+6-BA 0.5 | 2.04％ |
| 3/4MS+2，4-D 2.0+6-BA 0.5 | 2.97％ |
研究结果表明：以MS培养基为基本培养基的愈伤组织诱导培养基具有较高的胚性愈伤组织诱导率，其诱导率为11.58％，优于以WPM和3/4MS为基本培养基添加相同激素及其他组分的诱导培养基。
采用MS为基本培养基，附加不同浓度的生长素类：2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)2.0～6.0mg/L，NAA(萘乙酸)2.0mg/L和TDZ(噻苯隆)0.05～0.1mg/L；细胞分裂素类：6-BA(6-苄氨基嘌呤)0～1.0mg/L和KT(6-糠基氨基嘌呤)0～1.0mg/L；VC 10g/L，水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0～3.5g/L，pH5.6～5.8。外植体接种后30天后观察并记录外殖体及愈伤组织状态，并统计愈伤诱导率，见表3。
表3不同激素类型及浓度对欧洲小叶椴早期胚性愈伤组织诱导的影响
研究结果表明：在早期愈伤组织的诱导阶段，生长素类2，4-D对早期胚性愈伤组织的诱导效率，优于NAA和TDZ，且外殖体的褐化率较低。在生长素浓度相同2，4-D 2.0mg/L的情况下，对比细胞分类素的作用，结果表明在添加6-BA 0.2mg/L明显优于添加KT 0.2mg/L，6-BA在早期胚性愈伤组织诱导的过程中更为有效。当2，4-D的浓度增加时，愈伤组织的诱导率呈现先升高后降低的过程，同时伴随着褐化率的增加，其中2，4-D浓度为5.0mg/L是诱导率最佳。综合诱导率和褐化率指标表明等外源植物生长调节剂为2，4-D 2.0mg/L+6-BA0.2mg/L及2，4-D 3.0mg/L早期胚性愈伤组织的诱导效果最佳。
实施例4胚性愈伤组织维持与增殖阶段
在无菌条件下，将步骤3中诱导获得的胚性愈伤组织转入维持和增殖固体培养基中，23℃暗培养。其中增殖培养基以MS培养基为基本培养基，添加生长素(2，4-D 1.0～3.0mg/L)和细胞分裂素(6-BA 0.2～0.5mg/L)以及VC 10g/L，水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0～3.5g/L，pH 5.6～5.8。
表4不同激素种类及浓度对欧洲小叶椴胚性愈伤组织增殖的影响
继代培养20天后，观察愈伤组织的状态及增殖情况。研究结果表明：当2，4-D浓度为2.0～3.0mg/L及6-BA浓度为0.2～0.5mg/L的培养基中愈伤组织增殖速度较快，且能保持良好的胚性状态。此步骤获得的愈伤组织，每隔18～20天继代一次，进而获得大量具有胚性愈伤组织。
实施例5体细胞胚的诱导与萌发
在无菌条件下，将实施例4中获得的胚性愈伤组织转入含有不同激素浓度的体胚诱导培养基中，30d后观察子叶胚成熟的数量及发育状态(表5)。其中体胚诱导培养基以MS培养基为基本培养基，添加生长素(2，4-D 0.5～2.0mg/L)和细胞分裂素(6-BA 0.5～1.0mg/L)以及VC 10g/L，水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0～3.5g/L，pH 5.6～5.8。
表5不同激素种类及浓度对欧洲小叶椴体胚诱导的影响
接种30～45天内，观察子叶胚发育的状态及发育数量，研究结果表明在2，4-D浓度为0.5～2.0mg/L，6-BA浓度为0.5～1.0mg/L的培养基中子叶胚均能正常发育，其中在2，4-D浓度较低0.5～1.0mg/L时，子叶叶胚发育数量较多。
在无菌的条件下，将上一步骤中获的发育至后期的子叶胚，转移至胚萌发固体培养基。培养基组分为MS基本培养基，添加VC 10mg/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0～3.5g/L，pH5.6～5.8。30～45天后发现，80～85％以上的植株科发育出具有真叶的植株幼苗。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种欧洲小叶椴体细胞胚胎发生的方法，其特征在于，包括：以欧洲小叶椴心形胚至早期子叶胚为外殖体，接入胚性愈伤组织诱导培养基中诱导出胚性愈伤组织，继而转入维持和增殖培养基中诱导获得增殖的胚性愈伤组织，随后接入体胚诱导培养基诱导出成熟的体胚，最后将成熟的子叶胚转移至基本培养基，萌发形成完整植株。
2.根据权利要求1所述的一种欧洲小叶椴体细胞胚胎发生的方法，其特征在于，具体包括：
6月下旬至7月上旬，采集欧洲小叶椴母株上未成熟的果实，剥除果皮后获得未成熟的种子；种子经流水冲洗后，转移至超净工作台；经70~75%酒精和5%次氯酸钠溶液处理后，用无菌水洗净；
在无菌条件下，于体式显微镜下，剥离心形胚至子叶前期胚，接种于愈伤组织诱导培养基中；接种后于22~25℃暗培养一个月，得到白色、质地紧密、表面球状凸起的早期胚性愈伤组织；
在无菌的条件下，将获得的早期胚性愈伤组织，转接入愈伤组织增殖培养基中，在22~25℃黑暗条件下，每18~21天继代一次，继代2~3次之后，得到淡黄色、质地紧密的胚性愈伤组织；
在无菌的条件下，将获得的胚性愈伤组织转入体胚诱导固体培养基中，22~25℃暗培养，20~30d，诱导体细胞胚的发育；
取发育成熟的子叶胚后期，将成熟的子叶胚转移到胚萌发固体固体培养基中，光照1500~30001x，光照时间光照/黑暗为16h/8h，控温22～25℃，30~45天萌发长成完整的植株。
3.根据权利要求2所述的一种欧洲小叶椴体细胞胚胎发生的方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基成以MS为基本培养基，添加不同浓度的生长素类：2,4-D（2，4-二氯苯氧乙酸） 2.0~6.0 mg/L，NAA（萘乙酸）0~2.0 mg/L和TDZ（噻苯隆） 0~0.1 mg/L；细胞分裂素类：6-BA（6-苄氨基嘌呤）0~1.0 mg/L和KT（6-糠基氨基嘌呤）0~1.0 mg/L；同时添加VC 10g/L，水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0~3.5g/L，pH5.6~5.8。
4.根据权利要求2所述的一种欧洲小叶椴体细胞胚胎发生的方法，其特征在于，所述愈伤组织增殖培养基成分为：MS培养基中添加2,4-D 1.0~3.0mg/L和6-BA 0.2~0.5mg/L，VC10 g/L，水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0~3.5g/L，pH 5.6~5.8。
5.根据权利要求2所述的一种欧洲小叶椴体细胞胚胎发生的方法，其特征在于，所述体胚诱导培养基为：MS培养基中添加2,4-D 0.5~2.0 mg/L和6-BA 0.5~1.0 mg/L，VC 10 g/L，水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0~3.5g/L，pH 5.6~5.8。
6.根据权利要求2所述的一种欧洲小叶椴体细胞胚胎发生的方法，其特征在于，所述胚萌发固体培养基为：MS基本培养基，添加VC 10mg/L；蔗糖30g/L；植物凝胶3.0~3.5g/L，pH5.6~5.8。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310189570.9A CN116420616B (zh) | 2023-03-02 | 2023-03-02 | 一种欧洲小叶椴体细胞胚胎发生的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310189570.9A CN116420616B (zh) | 2023-03-02 | 2023-03-02 | 一种欧洲小叶椴体细胞胚胎发生的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116420616A true CN116420616A (zh) | 2023-07-14 |
| CN116420616B CN116420616B (zh) | 2024-01-09 |
Family
ID=87082208
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310189570.9A Active CN116420616B (zh) | 2023-03-02 | 2023-03-02 | 一种欧洲小叶椴体细胞胚胎发生的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116420616B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113057099A (zh) * | 2021-05-08 | 2021-07-02 | 江苏省中国科学院植物研究所 | 一种简化的欧洲小叶椴组织培养方法 |
| CN113826550A (zh) * | 2021-09-03 | 2021-12-24 | 江西省科学院生物资源研究所 | 一种樟树体细胞胚胎发生与组织培养的方法 |
-
2023
- 2023-03-02 CN CN202310189570.9A patent/CN116420616B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113057099A (zh) * | 2021-05-08 | 2021-07-02 | 江苏省中国科学院植物研究所 | 一种简化的欧洲小叶椴组织培养方法 |
| CN113826550A (zh) * | 2021-09-03 | 2021-12-24 | 江西省科学院生物资源研究所 | 一种樟树体细胞胚胎发生与组织培养的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| VLADIMIR CHALUPA等: "Plant regeneration by somatic embryogenesis from cultured immature embryos of oak (Quercus robur L.) and linden (Tilia cordata Mill.)", PLANT CELL REPORTS, pages 1 - 2 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116420616B (zh) | 2024-01-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101946702B (zh) | 一种草莓茎尖组培专用培养基及其生产脱毒苗的方法 | |
| Lai et al. | Somatic embryogenesis in longan [Dimocarpus longan Lour.] | |
| CN109479715B (zh) | 利用组培苗叶片快速繁育大花绣球无尽夏的方法 | |
| CN108782241B (zh) | 椰子体细胞胚性愈伤组织诱导培养基和椰子体细胞胚胎发生与植株再生的方法 | |
| CN111492973A (zh) | 普通油茶通过体细胞胚胎发生方式获得再生植株的方法 | |
| CN104885948A (zh) | 一种油茶子叶节直接再生植株的方法 | |
| CN110313403B (zh) | 一种白桦胚性愈伤组织诱导培养基、诱导胚性愈伤组织的方法及组培苗的培育方法 | |
| CN117652414B (zh) | 一种秋石斛胚性愈伤组织诱导及再生的组培方法 | |
| CN116569842B (zh) | 利用胚尖组织快速获得乌菜再生苗的方法 | |
| CN111134019B (zh) | 一种齿叶冬青体细胞胚胎直接发生和植株再生的方法 | |
| Agnihotri et al. | In vitro cloning of female and male Carica papaya through tips of shoots and inflorescences | |
| CN104823861B (zh) | 油茶胚根不定芽诱导获得再生植株的方法 | |
| CN113575422B (zh) | 菠萝叶片高效离体再生方法 | |
| CN116420616B (zh) | 一种欧洲小叶椴体细胞胚胎发生的方法 | |
| CN113016622B (zh) | 一种红花蕉组织培养优质种苗快速繁殖方法 | |
| CN112616675B (zh) | 一种舞花姜组织培养快速繁殖方法 | |
| CN115191355A (zh) | 一种元宝枫胚性愈伤组织的诱导方法 | |
| CN109729979B (zh) | 一种促进百子莲体胚萌发同步化率的方法 | |
| Naz et al. | Somatic embryogenesis and plantlet formation in different varieties of sugarcane (Sacchrum officinarum L.) HSF-243 and HSF-245 | |
| CN108552059B (zh) | 一种促进马铃薯幼苗壮根的植物组织培养方法 | |
| CN116267608B (zh) | 一种南京椴无性繁殖方法 | |
| KR20160010064A (ko) | 생물반응기 액체배양을 통한 배발생 캘러스 급속증식 및 고체 배지에서의 재분화를 통한 튤립 자구 대량생산 방법 | |
| CN114467753B (zh) | 一种银鹿枫香的组织培养方法 | |
| CN116171863B (zh) | 一种蝴蝶花高效再生的方法 | |
| CN115836645B (zh) | 一种建立羽扇豆再生体系的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |