CN116267608B - 一种南京椴无性繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种南京椴无性繁殖方法，属于植物无性繁殖技术领域，包括：采集南京椴植株上未成熟的果实，进行清洗和消毒处理；剥离心形胚至子叶前期胚，接种于胚性愈伤组织诱导培养基中，并取部分流体状胚乳半覆盖于幼胚之上；外植体接入愈伤组织诱导培养基中培养得到早期胚性愈伤组织；将早期胚性愈伤组织，转入增殖培养基中，得到胚性愈伤组织；将获得的胚性愈伤组织转入体胚诱导培养基中培养，得到子叶胚；将获得的子叶胚转移至固体MS培养基中培养形成完整的植株。本发明以南京椴合子胚发育初期的心形胚至子叶胚为外植体，通过愈伤组织的诱导和增殖扩繁获得大量的胚性愈伤组织，进而诱导体胚发生及萌发，实现南京椴较高繁殖系数的增殖。
Description
技术领域
本发明涉及一种南京椴无性繁殖方法，属于植物无性繁殖技术领域。
背景技术
南京椴（Tilia miqueliana），中国特有种，锦葵科椴树属落叶乔木，曾经广泛分布于江苏、安徽、浙江和江西等地。但南京椴种群自然更新能力差，群体较小，且彼此间隔，呈岛状分布，残存个体受到巨大的环境和人为压力，个体数目锐减。依据近期的野外群落的调研，南京椴大于30株的种群仅有牛首山、宝华山和皇藏峪3个（最大群体个数不超过100株），野生资源受严重威胁，保护工作已迫在眉睫。
南京椴作为我国华东地区重要的乡土树种，具有良好的生态适应性和应用开发价值。南京椴适应性及抗逆性强，在生态林业的建设中具有巨大的潜在优势。采用乡土植物南京椴构建本土植物群落，有利于控制造林成本，增加森林的蓄积量，优化森林结构，降低生态风险,形成区域内特色的森林群落景观。同时，南京椴木材致密通直，色白轻软，绢丝光滑，易于加工，可供多种用材使用；韧皮纤维发达，出麻率达 39.6%，可做编织和绳索用，同时也是良好的造纸材料；泌蜜量高，气味芬芳，结晶细腻，深受国内外人士亲睐；花和叶中含有类黄酮、内酯类和芳香油等，具有治愈呼吸道疾病和促进消化等药用功能；树形优美，寿命长，花香馥郁，对烟尘和有害气体吸附能力强。因此，为了推动南京椴资源的保护和开发利用，积极开展繁殖技术的探索与革新成为现阶段工作的热点。
随着南京椴资源关注度的逐渐提升，南京椴已然成为国内苗木市场的新宠。近十年来，南京椴相关研究主要集中在繁殖技术方面。南京椴种子的发芽率已由5.23%提高至90%以上，嫩枝扦插的成活率达85%，嫁接成活率高达90%以上，茎段离体培养增殖率达6~11倍，生根率为80%，成活率可达95%。 但是种子繁殖存在较大的遗传分化，难以保存品系的优良性状。嫁接及扦插等无性繁殖技术受季节影响较大，同时种质会随着繁殖时代的增加而退化。茎段的离体培养克服了季节的限制，实现了全年种苗的生产，但是繁殖系数较小、生根较低，成本较高的缺点，难以实现大规模的工厂化育苗。
体细胞胚胎发生技术是植物规模化、工厂化化快速繁殖和基因转化再生植株的重要手段。体细胞发生技术是在特定的条件下，非经细胞融合和通过与合子胚类似的途径发育出新个体的形态发生过程。成熟的体胚诱导技术有繁殖效率高，系数大，不受自然条件制约，可作为基因工程的受体系统等优点，在繁殖周期相对较长的木质植物繁育和改良工作中，具有广阔的应用前景。目前，国内外尚无关于南京椴体细胞胚胎发生技术的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种南京椴无性繁殖方法，以南京椴合子胚发育初期的心形胚至子叶胚为外植体，通过愈伤组织的诱导和增殖扩繁获得大量的胚性愈伤组织，进而诱导体胚发生及萌发，最终实现南京椴较高繁殖系数的增殖。
为解决上述技术问题，本发明提供一种南京椴无性繁殖方法，包括：
采集南京椴植株上未成熟的果实，进行清洗和消毒处理；
剥离心形胚至子叶前期胚，接种于愈伤组织诱导培养基中，并取部分流体状胚乳半覆盖于幼胚之上；
外植体接入愈伤组织诱导培养基中，进行暗培养30~40天，环境温度控制在22~25℃，得到早期胚性愈伤组织；
将诱导获得的早期胚性愈伤组织，在无菌的条件下，转入增殖培养基中， 22~25℃黑暗条件下培养，每21天继代一次，继代1~2次后得到胚性愈伤组织；
将上述获得的胚性愈伤组织在无菌的条件下，转入体胚诱导培养基中，在22~25℃黑暗的条件下，培养25~35天，得到子叶胚；
将上述获得的子叶胚转移至固体MS培养基中，光照条件2000~3000lx，光周期光照/黑暗为16h/8h，控温23～25℃，培养40~45天，长出真叶形成完整的植株。
进一步地，所述清洗和消毒处理的具体方法为：用砂纸去除绿色肉质外果皮，保留内部木质果皮；处理后果实经流水冲洗8~10h后，转移至超净工作台；经70~75%酒精消毒1分钟后，转入5%的次氯酸钠溶液处理20分钟后，用无菌水清洗5次，每次5分钟。
进一步地，采集所述南京椴植株上未成熟果实的时间为南京椴花凋谢后的20~30天。
进一步地，所述愈伤组织诱导培养基为：3/4MS+2,4-D（2，4-二氯苯氧乙酸） 3.0 ~6.0 mg/L +6-BA（6-苄氨基嘌呤） 0.1 ~1.0 mg/L培养基，培养基中同时添加VC 10 g/L，水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0~3.5g/L，pH5.6~5.8。
进一步地，所述增殖培养基为：3/4MS+2,4-D 2.0 ~3.0 mg/L +BA 0.2 ~0.5 mg/L，同时添加VC 10 g/L，水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0~3.5g/L，pH 5.6~5.8。
进一步地，所述体胚诱导培养基为3/4MS+2,4-D 0.5 mg/L+BA 0.5 mg/L，同时添加VC 10 g/L，水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0~3.5g/L，pH 5.6~5.8。
进一步地，所述子叶胚萌发培养基为MS基本培养基添加VC 10 g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0~3.5g/L，pH 5.6~5.8。
培养基中各组分的功能为：3/4MS基本培养基是将Murashige & Skoog基本培养基中的大量元素减少到3/4，微量元素、铁盐及有机组分保持不变，为植物体胚诱导及发育过程中提供必需的无机元素及有机物。植物生长调节剂2,4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）主要是促进植物组织的脱分化，诱导较高分化状态的组织脱分化形成具有较强分裂及分化能力的分生组织；植物生长调节剂6-BA（6-苄氨基嘌呤）主要是促进植物的分生组织的分化发育，同时在愈伤组织的诱导和培养中，加入一定量的6-BA可以降低植物玻璃化的风险，从而推动分生愈伤组织向胚性转化。培养基中的水解酪蛋白主要是离体组织提供活性更高的有机氮源，有助于胚性愈伤组织的形成。VC为抗氧化剂，在体胚诱导的过程中具有防止组织褐变的功能。蔗糖主要是为离体的组织提供有机的碳源，维持植物组织异养状态下正常的生命活动。植物凝胶主要是起到支持的作用，维持培养基处于软硬适中的状态。
暗培养在南京椴胚性愈伤组织诱导、增殖及体胚的诱导的三个阶段至关重要。暗培养可以显著的降低外植体的褐变率，改变光敏性激素的极性分布，模拟了合子胚形成的环境条件，推动胚性愈伤组织的诱导、增殖和体胚的诱导。但子叶胚的萌发阶段，完整胚结构的形成，适当的光照（2000~3000lx）推动了植株叶绿素的合成并自养阶段转化，有利于植株地上及地下部分的建成。22~25℃，是植物细胞分裂及分化的最适温度，过高的温度会导致外植体的褐变及死亡，过低的温度不利于细胞的生长和分化，因此在南京椴体胚发育的过程中，选取22~25℃的培养温度。
本发明所达到的有益效果：本发明以南京椴合子胚发育初期的心形胚至子叶胚为外植体，通过愈伤组织的诱导和增殖扩繁获得大量的胚性愈伤组织，进而诱导体胚发生及萌发，最终实现南京椴较高繁殖系数的增殖。本发明南京椴体细胞胚胎发生及植株再生技术的建立，不仅可以推动南京椴规模化育苗产业的发展，而且推动良种选育及基因工程育种工作的进程。
附图说明
图1是南京椴果实样本处理及外植体胚胎发育时期的图；
图2是未成熟胚诱导出的早期胚性愈伤组织的图；
图3是胚性愈伤组织的增殖与维持阶段的图；
图4是诱导出的早期体细胞胚胎的图；
图5是体细胞胚胎发育至子叶胚阶段的图；
图6 是子叶胚萌发形成完整植株的图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
本发明提供了一种南京椴高效无性繁殖方法，以南京椴合子胚发育初期的心形胚至子叶胚为外植体，通过愈伤组织的诱导和增殖扩繁获得大量的胚性愈伤组织，进而诱导体胚发生及萌发，最终实现南京椴较高繁殖系数的增殖。
实施例1 果实采样时期的比较
（1）分别于南京椴花凋谢后20天、25天和30天，采集南京椴植株上未成熟的100粒果实，用砂纸去除绿色肉质外果皮，保留内部木质果皮；处理后果实经流水冲洗8~10h后，转移至超净工作台；经70~75%酒精消毒1分钟后，转入5%的次氯酸钠溶液处理20分钟后，用无菌水清洗5次，每次5分钟；
（2）在超净工作台上，采用灭菌的枝剪沿果实的横径剪开（图一），在体式显微镜下，在近种柄端剥离心形胚（图1A）至子叶前期胚（图1B），环境温度控制在22℃~25℃，暗培养，分别统计花后20天、25天和30天中每个阶段胚的数量（表1）。
表1 花凋谢后不同时间果实内不同合子胚类型统计
结果表明花后25天和30天，果实中含胚率为90%以上，其中25天中心形胚占比较高为51%，因此，在以合子胚为外植体进行体胚诱导的过程中，选择花谢后25天为南京椴果实的最佳采收期。
实施例2 合子胚发育阶段对早期胚性愈伤组织诱导率的影响
（1）于南京椴花凋谢后25天，采集南京椴植株上未成熟的果实，用砂纸去除绿色肉质外果皮，保留内部木质果皮；处理后果实经流水冲洗8~10h后，转移至超净工作台；经70~75%酒精消毒1分钟后，转入5%的次氯酸钠溶液处理20分钟后，用无菌水清洗5次，每次5分钟；
（2）在超净工作台上，采用灭菌的枝剪沿果实的横径剪开（图一），在体式显微镜下，在近种柄端剥离心形胚（图1A）至子叶前期胚（图1B），分别将心形胚（图1A）至子叶前期胚（图1B）接种于胚性愈伤组织诱导培养基中，并取部分流体状胚乳半覆盖于幼胚之上，每皿接种外植体8~10枚，各5皿。环境温度控制在22℃~25℃，暗培养。愈伤组织诱导培养基选用 3/4MS+2,4-D 4.0 mg/L+BA 0.5 mg/L，培养基中同时添加VC 10 g/L，水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0~3.5g/L，pH5.6~5.8。分别于30~40天统计外植体个数、愈伤组织及胚性愈伤组织的诱导率（表2）。其中白色，质地紧密且表面球形凸起的愈伤组织即为早期胚性愈伤组织（图2）。
表2 不同发育阶段合子胚的30-40天后愈伤组织诱导率
结果表明：心形胚及子叶胚前期胚在愈伤诱导培养基中均能较好的诱导出愈伤组织，诱导率在50%以上，其中心形胚早期胚性愈伤组织的诱导效率更高，为17.8%。
实施例3 不同的植物生长调节剂浓度对早期胚性愈伤组织诱导率的影响
（1）于南京椴花凋谢后25天，采集南京椴植株上未成熟的果实，用砂纸去除绿色肉质外果皮，保留内部木质果皮；处理后果实经流水冲洗8~10h后，转移至超净工作台；经70~75%酒精消毒1分钟后，转入5%的次氯酸钠溶液处理20分钟后，用无菌水清洗5次，每次5分钟；
（2）在超净工作台上，采用灭菌的枝剪沿果实的横径剪开（图一），在体式显微镜下，在近种柄端剥离心形胚，分别接种于3种胚性愈伤组织诱导培养基中，并取部分流体状胚乳半覆盖于幼胚之上，每皿接种外植体8~10枚，各接5皿。愈伤组织诱导阶段选用的采用3/4MS+2,4-D（2，4-二氯苯氧乙酸） 3.0 mg/L+6-BA（6-苄氨基嘌呤） 0.1 mg/L;3/4MS+2,4-D 4.0 mg/L+BA 0.5 mg/L和3/4MS+2,4-D 6.0 mg/L+BA 1.0 mg/L 3种培养基，培养基中同时添加VC 10 g/L，水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0~3.5g/L，pH5.6~5.8。
（3）外植体接入胚性愈伤组织诱导培养基中，进行暗培养，环境温度控制在22℃~25℃，暗培养，接种后40天分别统计不同培养基中外植体个数、愈伤组织及胚性愈伤组织的诱导率（表3）。其中白色，质地紧密且表面球形凸起的愈伤组织即为早期胚性愈伤组织（图2）。
表3 植物生长调节剂浓度对胚性愈伤及愈伤组织诱导率的影响
结果表明： 3/4MS+2,4-D 6.0 mg/L+BA 1.0 mg/L培养基外植体愈伤组织的诱导效率最高为64.0%。同时3/4MS+2,4-D 4.0 mg/L+BA 0.5 mg/L和3/4MS+2,4-D 6.0 mg/L+BA1.0 mg/L 两种培养基早期胚性愈伤组织的诱导效率均具有较高水平，为17%~18%。
实施例4 不同的植物生长调节剂浓度对胚性愈伤保持与增殖的影响
（1）于南京椴花凋谢后25天，采集南京椴植株上未成熟的果实，用砂纸去除绿色肉质外果皮，保留内部木质果皮；处理后果实经流水冲洗8~10h后，转移至超净工作台；经70~75%酒精消毒1分钟后，转入5%的次氯酸钠溶液处理20分钟后，用无菌水清洗5次，每次5分钟；
（2）在超净工作台上，采用灭菌的枝剪沿果实的横径剪开（图一），在体式显微镜下，在近种柄端剥离心形胚，分别接种于胚性愈伤组织诱导培养基中，并取部分流体状胚乳半覆盖于幼胚之上，每皿接种外植体8~10枚，共20皿。愈伤组织诱导培养基组分为3/4MS+2,4-D 4.0 mg/L+BA 0.5 mg/L，培养基中同时添加VC 10 g/L，水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0~3.5g/L，pH5.6~5.8。
（3）外植体接入胚性愈伤组织诱导培养基中，进行暗培养，环境温度控制在22℃~25℃， 接种后40天，选取白色，质地紧密且表面球形凸起的早期胚性愈伤组织，在无菌的条件下，分别转入2种增殖培养基中，23℃黑暗条件下培养，21天后观察愈伤组织的颜色，并统计增殖情况（表4）。淡黄色，质地紧密的愈伤组织组织即为胚性愈伤组织，具有体胚诱导和发育的能力。增殖培养基选用3/4MS+2,4-D 2.0 mg/L+BA 0.2 mg/L; 3/4MS+2,4-D 3.0mg/L+BA 0.5 mg/L，同时添加VC 10 g/L，水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0~3.5g/L，pH 5.6~5.8。
表4 植物生长调节剂浓度对胚性愈伤组织状态及增殖的影响（21d）
结果表明：2种培养基均能较好的维持愈伤组织的胚性状态，其中3/4MS+2,4-D3.0 mg/L+BA 0.5 mg/L培养基21d愈伤植株的增殖效率为200%。
实施例5 体细胞胚胎诱导阶段
（1）于南京椴花凋谢后25天，采集南京椴植株上未成熟的果实，用砂纸去除绿色肉质外果皮，保留内部木质果皮；处理后果实经流水冲洗8~10h后，转移至超净工作台；经70~75%酒精消毒1分钟后，转入5%的次氯酸钠溶液处理20分钟后，用无菌水清洗5次，每次5分钟；
（2）在超净工作台上，采用灭菌的枝剪沿果实的横径剪开（图一），在体式显微镜下，在近种柄端剥离心形胚，分别接种于胚性愈伤组织诱导培养基中，并取部分流体状胚乳半覆盖于幼胚之上，每皿接种外植体8~10枚，共20皿。愈伤组织诱导培养基组分为3/4MS+2,4-D 4.0 mg/L+BA 0.5 mg/L，培养基中同时添加VC 10 g/L，水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0~3.5g/L，pH5.6~5.8。
（3）外植体接入胚性愈伤组织诱导培养基中，进行暗培养，环境温度控制在22℃~25℃， 接种后40天，选取白色，质地紧密且表面球形凸起的早期胚性愈伤组织，在无菌的条件下，分别转入增殖培养基中，23℃黑暗条件下培养，21天后观察愈伤组织的颜色，其中淡黄色，质地紧密的愈伤组织即为胚性愈伤组织，具有体胚诱导和发育的能力。每21天继代一次，将淡黄色，质地紧密的胚性愈伤组织继代一次（图3）。增殖培养基选用3/4MS+2,4-D 3.0mg/L+BA 0.5 mg/L，同时添加VC 10 g/L，水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0~3.5g/L，pH 5.6~5.8。
（4）将步骤（3）获得的其中淡黄色，质地紧密的胚性愈伤组织50枚，在无菌的条件下，转入体胚诱导培养基中，在23℃黑暗的条件下，培养25~35天。体胚诱导培养基为3/4MS+2,4-D 0.5 mg/L+BA 0.5 mg/L, 同时添加VC 10 g/L，水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0~3.5g/L，pH 5.6~5.8。分别于25天、30天和35天，统计体胚性愈伤组织表面形成胚性结构发育阶段，并计算各阶段的百分率（表5）。
表5 诱导时间对体胚发育阶段的影响
结果表明：体胚诱导30d~35d后，50%以上的胚性愈伤组织发育至子叶胚后期，其中培养35天子叶后期的外植体数量占总数的78%。
实施例6 体细胞胚胎萌发阶段
（1）于南京椴花凋谢后25天，采集南京椴植株上未成熟的果实，用砂纸去除绿色肉质外果皮，保留内部木质果皮；处理后果实经流水冲洗8~10h后，转移至超净工作台；经70~75%酒精消毒1分钟后，转入5%的次氯酸钠溶液处理20分钟后，用无菌水清洗5次，每次5分钟；
（2）在超净工作台上，采用灭菌的枝剪沿果实的横径剪开（图一），在体式显微镜下，在近种柄端剥离心形胚，分别接种于胚性愈伤组织诱导培养基中，并取部分流体状胚乳半覆盖于幼胚之上，每皿接种外植体8~10枚，共20皿。愈伤组织诱导培养基组分为3/4MS+2,4-D 4.0 mg/L+BA 0.5 mg/L，培养基中同时添加VC 10 g/L，水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0~3.5g/L，pH5.6~5.8。
（3）外植体接入胚性愈伤组织诱导培养基中，进行暗培养，环境温度控制在25℃，接种后40天，选取白色，质地紧密且表面球形凸起的早期胚性愈伤组织，在无菌的条件下，分别转入增殖培养基中，25℃黑暗条件下培养，21天后观察愈伤组织的颜色，其中淡黄色，质地紧密的愈伤组织即为胚性愈伤组织，具有体胚诱导和发育的能力。每21天继代一次，将淡黄色，质地紧密的胚性愈伤组织继代一次（图3）。增殖培养基选用3/4MS+2,4-D 3.0 mg/L+BA 0.5 mg/L，同时添加VC 10 g/L，水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0~3.5g/L，pH 5.6~5.8。
（4）将步骤（3）获得的其中淡黄色，质地紧密的胚性愈伤组织50枚，在无菌的条件下，转入体胚诱导培养基中，体胚诱导培养基为3/4MS+2,4-D 0.5 mg/L+BA 0.5 mg/L, 同时添加VC 10 g/L，水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0~3.5g/L，pH 5.6~5.8。
（5）在23℃黑暗的条件下，培养35天后，剥离发育至子叶胚后期的体胚，在无菌的条件现接种于子叶胚萌发培养基，培养基的配方为MS基本培养基添加VC 10 g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0~3.5g/L，pH 5.6~5.8。
（6）分别置于黑暗条件和光照条件（光照2000~3000lx，光周期光照/黑暗为16h/8h）下，温度23～25℃下，两种光照条件下各放置50个外植体，分别于40~45天统计成苗率（表6）。
表6 不同光照条件对子叶胚诱导的影响
结果表明，光照条件下，接种45天后，85%子叶胚可以萌发形成真叶，发育为完整植株。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种南京椴无性繁殖方法，其特征在于，包括：
采集南京椴植株上未成熟的果实，进行清洗和消毒处理；
剥离心形胚至子叶前期胚，接种于愈伤组织诱导培养基中，并取部分流体状胚乳半覆盖于幼胚之上；
外植体接入愈伤组织诱导培养基中，进行暗培养30~40天，环境温度控制在22~25℃，得到早期胚性愈伤组织；
将诱导获得的早期胚性愈伤组织，在无菌的条件下，转入增殖培养基中， 22~25℃黑暗条件下培养，每21天继代一次，继代1~2次后得到胚性愈伤组织；
将上述获得的胚性愈伤组织在无菌的条件下，转入体胚诱导培养基中，在22~25℃黑暗的条件下，培养25~35天，得到子叶胚；
将上述获得的子叶胚转移至子叶胚萌发培养基中，光照条件2000~3000lx，光周期光照/黑暗为16h/8h，控温23～25℃，培养40~45天，长出真叶形成完整的植株；
所述愈伤组织诱导培养基为：3/4MS+2,4-D（2，4-二氯苯氧乙酸） 3.0 ~6.0 mg/L +6-BA（6-苄氨基嘌呤） 0.1 ~1.0 mg/L+VC 10 g/L+水解酪蛋白0.5g/L+蔗糖30g/L+植物凝胶3.0~3.5g/L，pH5.6~5.8；
所述增殖培养基为：3/4MS+2,4-D 2.0 ~3.0 mg/L +BA 0.2 ~0.5 mg/L+VC 10 g/L+水解酪蛋白0.5g/L+蔗糖30g/L+植物凝胶3.0~3.5g/L，pH 5.6~5.8；
所述体胚诱导培养基：为3/4MS+2,4-D 0.5 mg/L+BA 0.5 mg/L+VC 10 g/L+水解酪蛋白0.5g/L+蔗糖30g/L+植物凝胶3.0~3.5g/L，pH 5.6~5.8；
所述子叶胚萌发培养基为：MS基本培养基+VC 10 g/L+蔗糖30g/L+植物凝胶3.0~3.5g/L，pH 5.6~5.8。
2.根据权利要求1所述的南京椴无性繁殖方法，其特征在于，所述清洗和消毒处理的具体方法为：用砂纸去除绿色肉质外果皮，保留内部木质果皮；处理后果实经流水冲洗8~10h后，转移至超净工作台；经70~75%酒精消毒1分钟后，转入5%的次氯酸钠溶液处理20分钟后，用无菌水清洗5次，每次5分钟。
3.根据权利要求1所述的南京椴无性繁殖方法，其特征在于，采集所述南京椴植株上未成熟果实的时间为南京椴花凋谢后的20~30天。
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